DE3586333T2

DE3586333T2 - Expressionsvektoren fuer hirudin, transformierte zellen und verfahren zur herstellung von hirudin.

Info

Publication number: DE3586333T2
Application number: DE8585400598T
Authority: DE
Inventors: Michael Courtney; Richard Harvey; Jean-Pierre Lecocq; Paul Tolstoshev
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1984-03-27
Filing date: 1985-03-27
Publication date: 1992-12-10
Anticipated expiration: 2005-03-28
Also published as: WO1985004418A1; DK547185A; EP0158564B1; CA1341417C; ATE78294T1; DK175217B1; CA1341414C; DE3586333D1; EP0158564A1; DK547185D0; US5824505A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Klonierungs- und Expressions-Vektoren für die DNA-Sequenz, die für ein Hirudin oder Hirudinanaloga codiert, durch diese Vektoren transformierte Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung eines Hirudins sowie das dabei erhaltene Hirudin.
Die Antikoagulans-Aktivität, die in den Speicheldrüsen von medizinischen Blutegeln, Hirudo medicinalis, zu finden ist, stammt von einem kleinen Polypeptid, das man Hirudin nennt. Dieser sehr spezifische und sehr wirksame Inhibitor für das Thrombin wurde in den letzten Jahren sehr intensiv untersucht, denn er stellt möglicherweise ein sehr interessantes therapeutisches Agens dar. Die extreme Schwierigkeit und die Kosten seiner Isolierung und seiner Reinigung haben jedoch verhindert, daß er in größerem Umfange verwendet wurde oder sogar daß er in klinischem Maßstab untersucht werden konnte; die Materialkosten liegen in der Größenordnung von 1300 bis 1600 Französische Francs (1983) für 2000 Einheiten (U).
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Weg zur Herstellung von Hirudin durch Klonierung der Gene und ihre Expression mittels der DNA-Rekombinanten-Technik in eine heterologe Wirtszelle, wobei eine große Menge Polypeptid mit den biologischen Eigenschaften des Hirudins erhalten wird.
Das aus den Blutegel-Speicheldrüsen gewonnene Polypeptid mit einer Antithrombin-Aktivität wurde zum ersten Mal in der Jahresmitte 1950 isoliert (1,2). Dieses Protein, als Hirudin bezeichnet, gewonnen aus Blutegel-Köpfen, wurde etwa 650 mal gereinigt, wobei man eine spezifische Aktivität von 8500 Einheiten pro mg erhielt.
Danach wurde das Molekulargewicht des Proteins zu etwa 16 000 geschätzt, wobei dieses Protein gegen Denaturierung durch Wärme stabil war und einen isoelektrischen Punkt von 4,8 aufwies. Bei einer Elektrophorese auf Papier wandert das gereinigte Produkt in Form einer einzigen Bande und die Aminosäure-Analyse zeigt an, daß das Material sehr reich an den Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure ist.
Durch komplementäre Reinigungsstufen (3) wird die spezifische Aktivität erhöht bis auf 10 400 U/mg und das Isoleucin wurde als N-terminale Aminosäure identifiziert (3,4).
Es konnte gezeigt werden, daß die Aktivität des Hirudins gegen die Digestion (Verdauung) mit proteolytischen Enzymen : Plasmin, Chymotrypsin A und Trypsin, beständig war, daß sie jedoch empfindlich war gegenüber der Digestion (Verdauung) durch Papain, Pepsin und Suptilopeptidase A (3).
Das geschätzte Molekulargewicht ist heute etwas niedriger als in den anfänglichen Dokumenten angegeben, man nimmt an, daß dieses Molekulargewicht in der Größenordnung von 10 000 Dalton liegt und die erste Abschätzung der Dissoziationskonstanten des Thrombin/Hirudin (1:1)-Komplexes (0,8 x 10&supmin;¹&sup0;) deutet auf eine extrem starke Assoziation zwischen diesen Molekülen hin (5). Aus praktischen Gründen kann der nicht-kovalente Komplex zwischen diesen beiden Molekülen als in vivo nicht dissoziierbar angesehen werden.
Der Mechanismus der Wirkung des Hirudins als Antikoagulans beginnt erst verstanden zu werden (5). Das Substrat für die Fixierung des Hirudins ist das Thrombin, bei dem es sich um ein proteolytisches Enzym handelt, das durch Aktivierung (durch den aktivierten Faktor X), aus seiner zymogenen (gärungserregenden) Form, dem Prothrombin, das Fibrinogen in dem Kreislauf zerlegt (kupiert), um es in Fibrin umzuwandeln, das für die Bildung des Blutgerinnsels erforderlich ist.
Das Hirudin ist ein sehr spezifischer Inhibitor für das Thrombin und reagiert schneller mit dem Thrombin als das Fibrinogen. Außerdem ist es nicht erforderlich, daß andere Koagulationsfaktoren oder andere Bestandteile des Plasmas vorhanden sind. Die Wechselwirkung zwischen den beiden Molekülen ist mindestens zum Teil zurückzuführen auf ihre ionische Wechselwirkung, weil durch die Acetylierung der freien Aminogruppen des Thrombins ein Verlust an Hirudin-Fixierung entsteht. Außerdem wird das Hirudin an den gleichen Stellen fixiert, die von dem Fibrinopeptid besetzt sind, und nicht an den aktiven Stellen des Thrombins, weil das acetylierte Thrombin seine Esterase-Aktivität behält, die durch das Hirudin nicht inhibiert wird, und weil das mit DFP (Diisopropylfluorophosphat) behandelte Thrombin, das die aktiven Zentren des Serins in dem Thrombin phosphoryliert, weiterhin das Hirudin fixiert (festhält).
Die weitere Entwicklung in der Erforschung des Hirudins war die Entwicklung eines Verfahrens zum Extrahieren des Hirudins aus dem gesamten Blutegel (16) anstelle des sehr delikaten Verfahrens, das darin besteht, den Kopf des Tieres zu sezieren. Das bei diesem Verfahren erhaltene Endprodukt weist eine biologische Aktivität auf, die ähnlich derjenigen des aus den Köpfen erhaltenen Hirudins ist, es weist jedoch eine spezifische Aktivität von 6 500 Einheiten Antithrombin pro mg auf.
Die geschätzte Größe dieser Verbindung, die durch Sedimentation im Gleichgewicht bestimmt wurde, beträgt 12 000, der große Unterschied zwischen diesem Präparat und den obengenannten Präparaten ist jedoch, daß man als N- terminale Aminosäure das Valin anstelle des Isoleucins, das ursprünglich gefunden worden war, identifiziert hat. Der Grund für diese Differenz war scheinbar erklärt, als man nachweisen konnte, daß das zweite Element des N-terminalen Endes, wie gefunden wurde, das Valin war; da das Dansyl-Dipeptid val-val gegen saure Hydrolyse beständig ist, hat man zunächst gedacht (7), daß das anfängliche N- terminale Ende mit einem Dipeptid val-val verwechselt worden war mit dem Isoleucin-Derivat, weil diese Komponenten bei der angewendeten chromatographischen Trennung nicht gut voneinander getrennt (aufgelöst) werden.
Es wurde ein Hirudin-Präparat aus dem Gesamttier verwendet zur Bestimmung der Aminosäuresequenz des Proteins (8,9), die in der Fig. 1 dargestellt ist. Es scheint, daß es kein an Hirudin gebundenes Kohlenhydrat gibt, daß jedoch der Thyrosin-Rest in der Position 63 durch eine O- Sulfatestergruppe modifiziert ist.
Die Funktion dieser Modifizierung ist nicht bekannt, es ist jedoch bezeichnend, daß eine ähnliche Modifizierung auch in dem Fibrinopeptid B einer großen Anzahl von Tierarten auftritt (9).
Eine neuere Untersuchung (10) hat gezeigt, daß dann, wenn man den Sulfatester vollständig verschwinden läßt, die Aktivität auf nur 55 % der anfänglichen Aktivität des Hirudins abnimmt.
Das Problem bezüglich der Natur des N-Endes von Hirudin stellte sich erneut in den Untersuchungen (12, 13), die anzudeuten scheinen, daß zwei unterschiedliche Formen des Hirudins existieren. Eine Form mit einer geringen Aktivität, als Pseudo-Hirudin bezeichnet, von der angenommen wird, daß sie aus Blutegel-Körpern extrahiert wurde, mit der Sequenz val-val am N-terminalen Ende; unbd eine in den Köpfen vorherrschende Form, die sehr aktiv ist und die an ihrem N-terminalen Ende einen Isoleucinrest aufweist.
Die spezifische und sehr starke Antithrombin-Aktivität des Hirudins zeigt unmittelbar eine klinische Anwendung an, d.h. diejenige eines Antikoagulans.
Das Hirudin wurde beim Tier sehr genau auf seine Antikoagulationseigenschaften hin untersucht. Die detaillierteste Untersuchung (14) beschreibt die Aktivität des Hirudins in bezug auf die Verhinderung von Venenthrombosen, Gefäßverschlüssen und verstreuten intravasculären Koagulationen (DIC) bei der Ratte. Das Hirudin wird von den Ratten, den Hunden, den Kaninchen und den Mäusen gut vertragen, wenn es in einer sehr reinen Form vorliegt und auf intravenösem Wege injiziert wird. Die DL&sub5;&sub0; bei Mäusen liegt oberhalb 500 000 U/kg Körpergewicht (d.h. 60 mg/kg). Eine andere Untersuchung (15) gibt an, daß die Mäuse Dosen bis zu 1 g pro kg vertragen und daß die Kaninchen sowohl intravenös als auch subcutan bis zu 10 mg/kg vertragen. Bei den Mäusen führen wiederhole Injektionen während einer Zeitdauer von 2 Wochen nicht zu Sensibilisierungsreaktionen. Zwei andere unabhängige Untersuchungen, von denen in der einen Hunde verwendet werden (16) und in der anderen (17) die Aktivität des Hirudins bei der Prävention der DIC bei Ratten zeigt, stimmen mit den positiven Ergebnissen von Marwkardt und seinen Mitarbeitern überein.
Es konnte auch gezeigt werden, daß das Hirudin den Endotoxinen vorbeugt, die durch die DIC bei Schweinen induziert werden und somit eine potentielle Lösung für die sehr ernsten Probleme darstellt, die durch die Endotoxinämien auftreten, die zu einer erhöhten Sterblichkeit bei den Schweinen führen. Außerdem wird das Hirudin bei dem Versuchstier schnell eliminiert (Halbwertszeit in der Größenordnung von 1 Stunde) in einer noch biologisch aktiven Form durch die Nieren.
Diese Untersuchung läßt vermuten, daß das Hirudin ein interessantes klinisches Agens als Antikoagulans darstellen kann. Außerdem wird die Vorphase der Blutkoagulation nicht beeinflußt wegen der hohen Spezifität der Wirkung des Hirudins, die Antithrombin-Aktivität ist abhängig von der Dosis und der Effekt des Hirudins ist schnell reversibel wegen seiner schnellen Eliminierung durch die Niere. Es konnte nachgewiesen werden, daß das Hirudin dem Heparin in bezug auf die Behandlung der DIC weit überlegen ist (14, 17), wie dies zu erwarten war angesichts der Tatsache, daß die DIC von einer Abnahme des Antithrombins III (einem Kofaktor, der für die Wirkung des Heparins erforderlich ist) und einer Aussalzung des Blutplättchenfaktors 4, der ein sehr wirksames Antiheparin-Agens ist, begleitet ist.
Eine der Untersuchungen hat die Möglichkeit aufgezeigt, daß das Hirudin durch die Haut von Menschen absorbiert werden kann (19), obgleich die dabei erhaltenen Ergebnisse etwas schwierig zu interpretieren sind.
Handelsübliche Präparate, die aus rohen Blutegeln extrahiert worden sind, stehen zur Verfügung (Hirucreme, Exhirut-Blutgel), es sind jedoch ergänzende Tests mit höheren Dosen eines hochreinen Materials erforderlich, um zu zeigen, daß es sich dabei um einen interessanten Verabreichungsweg handelt.
Allgemein sind die bevorzugten Verabreichungswege die intravenösen, intramuskulären und perkutanen Verabreichungswege. Andere Verabreichungswege, über die für Hirudin berichtet worden ist, sind insbesondere der orale Verabreichungsweg (BSM-3 792 M).
Dieses Produkt kann auch in Kombination mit anderen Komponenten bei der Behandlung der Psoriasis und anderen Hautstörungen des gleichen Typs verwendet werden, wie in der DE-OS 21 01 393 beschrieben.
Das Hirudin kann außerdem als Antikoagulans in klinischen Labortests und als Forschungsmaterial verwendet weden. Hier kann die hohe Spezifität für eine einzige Stufe bei der Koagulation des Blutes einen beträchtlichen Vorteil darstellen gegenüber den allgemeiner verwendeten Koagulantien mit einer Wirkung, die viel weniger spezifisch ist.
Außerdem kann das Hirudin sehr nützlich sein als Antikoagulans in extrakorporalen Kreisläufen und in Dialyse- Systemen, in denen es beträchtliche Vorteile bieten kann gegenüber anderen Antikoagulantien, insbesondere wenn es in der aktiven Form an der Oberfläche dieser künstlichen Kreislaufsysteme immobilisiert werden kann.
Schließlich kann die Verwendung von markiertem Hirudin eine einfache und wirksame Methode zur Messung der Thrombin- und Prothrombin-Gehalte darstellen.
Insgesamt weist das Hirudin eine große Anzahl von möglichen Anwendungen auf:
1) als Antikoagulans unter kritischen thrombotischen Bedingungen für die Prophylaxe und die Prävention der Ausbreitung bereits vorhandener Thrombosen;
2) als Antikoagulans zur Verminderung der Hämatome und der Schwellungen nach mikrochirurgischen Eingriffen, bei denen ein beträchtlicher Gebrauch gemacht wird von lebenden Blutegeln;
3) als Antikoagulans in extrakorporalen Kreislaufsystemen und als Antikoagulans zum Verkleiden (Einwachsen) von synthetischen Biomaterialien;
4) als Antikoagulans in den klinischen Tests von Blutproben in Laborversuchen;
5) als Antikoagulans bei der klinischen Forschung über die Koagulation und als experimentelles Material;
6) als mögliches topisches Agens für die Kutan-Application bei der Behandlung von Hämorrhoiden, Krampfadern und Ödemen;
7) als Komponente (Bestandteil) bei der Behandlung von Psoriasis und anderen verwandten Störungen.
Schließlich kann das Hirudin dazu verwendet werden, das Thrombin in den Milieus zu fixieren, in denen es stört (z.B. Dosierung, Experiment oder behandeltes Blut). Insbesondere erlaubt es das Hirudin, die Koagulationen in extrakorporalen Kreisläufen zu begrenzen.
Markiertes Hirudin kann außerdem zum Nachweis der Bildung von Gerinnseln verwendet werden. Die Bildung von Gerinnseln beruht nämlich auf der Umwandlung des im Kreislauf befindlichen Prothrombins in Thrombin, an dem das Hirudin selektiv fixiert wird; der Nachweis einer Anreicherung von markiertem Hirudin an einem Punkt des Körpers des Patienten erlaubt es, die Bildung eines Gerinnsels sichtbar zu machen.
Trotz dieser zahlreichen Vorteile als Antikoagulans wurde das Hirudin bis heute nicht in großem Umfange verwendet, auch nicht in der klinischen Forschung. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß das natürliche Material in reiner Form sehr schwierig erhältlich ist und daß es vor allem besonders teuer ist, sogar um klinische Versuche zu beginnen, um eine potentielle Verwendbarkeit aufzuzeigen. Obgleich geeignete Reinigungsverfahren existieren (20, 21) zur Herstellung von sehr reinen Proben, bleibt die Schwierigkeit der Zugänglichkeit des Ausgangsmaterials (der Blutegel) in ausreichender Menge ein großes Hindernis.
Obgleich das Hirudin von verschiedenen Firmen im Handel verkauft wird (Sigma, Plantorgan, Pentopharm), weisen solche Präparate eine Aktivität auf, die stark variieren kann, und sie besitzen sehr variable Reinheiten.
Dies ist der Grund, warum die Hirudin-Produktion durch die DNA-Rekombinanten-Technologie eine besonders attraktive Lösung ist, um dieses Material in großer Menge zu vernünftigen Kosten herzustellen, um es zu ermöglichen, diesen Produkt-Typ zu testen und zu verwenden.
Nachstehend wird größtenteils die Terminologie "das Hirudin" angewendet. Angesichts der vorstehenden Ausführungen und anderer Elemente, die bei der vorliegenden Untersuchung aufgetreten sind, ist es jedoch klar, daß mehrere Formen von Hirudin existieren und daß daher die Terminologie "ein Hirudin" korrekter wäre.
Dies ist der Grund, warum nachstehend unter dem Ausdruck "Hirudin" eine beliebige der Formen des natürlichen oder synthetischen Hirudins, d.h. ein Produkt mit der gleichen in vivo-Aktivität wie das Hirudin, das manchmal als "Analogon von Hirudin" bezeichnet wird, zu verstehen ist.
Darüber hinaus sei bemerkt, daß die als "Analoga von Hirudin" bezeichneten Produkte, die aus Bakterien gewonnen werden, frei von der O-Sulfatester-Funktion sind, daß hingegen aber das "bakterielle Hirudin" am N-terminalen Ende eine Methionin-Aminosäure aufweisen kann, die in dem nativen Hirudin nicht auftritt. Selbstverständlich sind unter dem Ausdruck "Analogon von Hirudin" auch die Produkte biologischen Ursprungs zu verstehen, die nach ihrer Herstellung bzw. Gewinnung insbesondere durch chemische Reaktion oder enzymatische Reaktion modifiziert worden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Klonierungs- und Expressionsvektoren in einer Wirtszelle für Hirudin oder ein Hirudin-Analogon, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aufweisen das Gen, das für das Hirudin oder ein Analogon von Hirudin codierte und die Expressionselemente dieses Gens in der genannten Wirtszelle.
Die Natur der Expressionselemente kann variieren je nach Art der Wirtszelle. So weisen die Expressionselemente in Bakterienzellen mindestens einen Bakterien-Promotor und eine Fixierungsstelle für Ribosomen auf (die das darstellt, was manchmal als Bereich bezeichnet wird, der für die Initiierung der Translation codiert).
Allgemein umfassen die erfindungsgemäßen Vektoren außer dem Gen, das für das Hirudin codiert:
- den Replikationsursprung eines Bakterien-Plasmids,
- einen Promotor, insbesondere die Gesamtheit oder einen Teil eines Promotors des Bakteriophagen λ : PL, PR oder P'R;
- einen Bereich, der codiert für die Initiierung der Translation, der enthält das ATG entweder am 5'-Ende des Gens von Hirudin oder am 5'-Ende des Gens von Hirudin, das in 5' fusioniert ist mit einem anderen Protein; der Grund für diese Fusion ist es, die Expression eines Proteins mit hohem Molekulargewicht zu erlauben, das in E. coli weniger abgebaut wird.
Die Anwesenheit eines Replikationsursprungs für ein Plasmid ist wesentlich, um die Replikation des Vektors in den entsprechenden Bakterienzellen zu erlauben, insbesondere im Falle von E. coli verwendet man vorzugsweise den Replikationsursprung des Plasmids pBR322. Das Plasmid pBR322 bietet nämlich den Vorteil, daß es eine große Anzahl von Kopien ergibt und auf diese Weise die Menge der Plasmide, die das gewünschte Protein bilden, erhöht.
Unter den Promotoren des Bacteriophagen λ verwendet man vorzugsweise den Haupt-Links-Promotor λPL. PL ist ein Promotor, der für die vorzeitige Transkription von λ verantwortlich sein kann.
Es ist auch möglich, andere Promotoren des Bacterophagen λ zu verwenden, insbesondere den Rechts-Promotor PR oder den zweiten Rechts-Promotor P'R.
Obgleich es möglich ist, sehr verschiedene Sequenzen der Initiierung der Translation zu verwenden, verwendet man vorzugsweise die gesamte oder einen Teil der Stelle der Fixierung der Ribosomen des Proteins cII des Bacteriophagen λ, nachstehend als λ cIIrbs bezeichnet.
Wie nachstehend gezeigt, ist es auch möglich, synthetische Sequenzen zu verwenden, insbesondere die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenz:
ATAACACAGGAACAGATCT
Der betreffende Vektor umfaßt außerdem vorzugsweise eine Transkriptions-Antiterminierungs-Funktion, die beispielsweise durch das Gen N von λ, als λ N bezeichnet, codiert ist. In Gegenwart des Transkriptionsprodukts des Gens N setzt sich die Transkription, ausgehend von PL über den größten Teil der Stopp-Signale hinaus fort.
Dies beseitigt die Probleme, die bei einem vorzeitigen Stopp der Transkription auftreten, die entstehen können, wenn die klonierten Fremd-Gene derartige Stopp-Signale aufweisen. Außerdem wurde gezeigt, daß die Expression, ausgehend von PL, in einer Umgebung N&spplus; verbessert ist.
Um die Probleme der Toxizität und der Instabilität des Wirt-Vektor-Systems im Falle der kontinuierlichen Herstellung von großen Mengen eines Fremd-Proteins zu lösen, ist es erforderlich, die Kontrolle (Steuerung) der Aktivität des Promotors vorzusehen, indem man ihm die Gesamtheit oder einen Teil eines induzierbaren, insbesondere wärmeinduzierbaren Expressionssystems zuordnet.
Vorzugsweise wird die Kontrolle (Steuerung) der Synthese des Fremd-Proteins durch die Temperatur im Bereich der Transkription mittels eines wärmeempfindlichen Repressors bewirkt, der in dem Wirts-Bakterium codiert ist, beispielsweise cI857, der die Aktivität von PL bei 28ºC dämpft (unterdrückt), der jedoch bei 42ºC inaktiviert wird. Der Repressor wirkt auf den Operator OL, der benachbart zum Promotor PL angeordnet ist. Obgleich im obigen Falle ein Teil des wärmeinduzierbaren Expressionssystems ein integrierender Bestandteil des Wirtsbakteriums ist, ist es möglich, vorzusehen, daß dieses System einen Teil des Vektors selbst bildet.
Der betreffende Vektor kann auch ein Resistenz-Gen gegenüber einem Antibiotikum, wie beispielsweise Ampicillin im Falle von pBR322, aufweisen, es können aber auch andere Resistenz-Gene verwendet werden mit einer Resistenz gegenüber Tetracyclin (Tetr) oder gegenüber Chloramphenicol (Cmr).
Die Einarbeitung eines solchen Markers ist erforderlich für die Selektion der Bakterien, welche die Transformanden-Träger des erfindungsgemäßen Plasmids während der Klonierungsversuche enthalten.
Die Einarbeitung eines Resistenz-Gens erlaubt die Erhöhung der Stabilität des Plasmids durch Erzeugung eines Selektionsdruckes bei der Fermentation und außerdem erleichtert sie die Isolierung der Transformanden.
Für die Klonierung ist es vorteilhaft, über ein System zu verfügen, welches den Nachweis der Insertion in ein Plasmid einer Fremd-DNA erlaubt.
So ist es beispielsweise möglich, in der Klonierungszone das N-terminale Fragment der β-Galactosidase von E. coli (lacZ') vorzusehen, indem man es mit dem Bereich der Initiierung der Translation, der von λ cII stammt, fusioniert, wodurch die Translation des Fragments α unter die Kontrolle der Sequenzen von cII gestellt wird.
Das Fragment α wird komplementiert durch die Expression des C-terminalen Fragments ω, das in dem Wirt codiert ist, was zu einer β-Galactosidase-Aktivität in den Zellen führt. Diese β-Galactosidase-Aktivität erzeugt blaue Kolonien in Gegenwart eines chromophoren Substrats, der 5- Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactosidase.
Bei 28ºC wird der Promotor PL inaktiviert, das Fragment α wird nicht synthetisiert und die Kolonien bleiben weiß. Wenn die Temperatur auf 42ºC erhöht wird, wird der Promotor PL aktiviert, das Fragment α wird synthetisiert und die Kolonien werden blau.
Die Insertion der Fremd-DNA in die Klonierungsstellen, die in diesem Nachweissystem angeordnet sind, verhindert die Synthese der β-Galactosidase und führt dann zu weißen Kolonien sowohl bei 28ºC wie auch bei 42ºC. Es ist auch möglich, das Gen lacZ' durch andere Gene zu ersetzen, die einen Nachweis erlauben. Unter den verschiedenen Hirudinen, die erfindungsgemäß hergestellt werden können, können genannt werden:
a) das Hirudin, das einer Modifikation der Variante 2 entspricht, in der die N-terminale Sequenz val-val durch ilethr ersetzt worden ist;
b) das Hirudin, das der Variante 1 (genannt HV2) entspricht, dessen Struktur derjenigen entspricht, wie sie in der Fig. 18b dargestellt ist.
Die Struktur der entsprechenden Gene kann von denjenigen der Aminosäuren abgeleitet werden, wie dies in den Beispielen gezeigt werden wird; diese Gene können nach einem beliebigen der bekannten Verfahren zur Herstellung von synthetischen DNA synthetisiert werden.
Vorzugsweise verwendet man das Hirudin, dessen N-terminale Struktur ile-thr entspricht; verschiedene Strukturen des entsprechenden Gens treten in den Beispielen auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Zellen, insbesondere die Bakterien, insbesondere die Stämme von E. coli, die durch die erfindungsgemäßen Vektoren nach bekannten Methoden transformiert worden sind und unter denen an bestimmte in den Beispielen erinnert wird.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Hirudin oder seinen Analoga, bei dem man auf einem Kulturmedium transformierte Bakterien kultiviert, wie weiter oben beschrieben, und aus dem man anschließend das gebildete Hirudin oder das gebildete Analogon abtrennt (gewinnt).
Die eingesetzten Kulturmedien sind dem Fachmann bekannt und müssen an jeden kultivierten Stamm angepaßt werden. Die Kultivierung wird vorzugsweise in Gegenwart des Antibiotikums durchgeführt, gegenüber dem der transformierte Stamm resistent geworden ist.
Das Hirudin oder seine Analoga können gereinigt oder vorgereinigt werden, ausgehend von dem Fermentationsgemisch, durch Erwärmen bei saurem pH-Wert, insbesondere auf 50 bis 80ºC bei einem pH-Wert zwischen 1 und 3, insbesondere auf 70ºC bei pH 2,8, und durch Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit, in der sich das Hirudin befindet.
Es ist auch möglich, die Affinität des Hirudins gegenüber dem Thrombin auszunutzen unter Verwendung eines Harzes, an dem das Thrombin fixiert ist, wobei man durch das Laufenlassen der das Hirudin enthaltenden Mischung über ein solches Harz das Hirudin fixiert, das anschließend mit einer Lösung, die ein Konkurrenzagens zum Hirudin enthält, eluiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich das Hirudin oder seine Analoga, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, d.h. das Hirudin oder seine Analoga bakteriellen Ursprungs, aber auch die Hirudine oder Analoga, die aus bakteriellen Produkten erhalten werden durch chemische oder enzymatische Reaktion, beispielsweise durch chemische oder enzymatische Spaltung oder auch durch chemische oder enzymatische Reaktion, die dazu bestimmt ist, den Rest -SO&sub3;H zu fixieren, mit Ausnahme des Hirudins, das durch Kultivierung einer transformierten Zelle durch einen Vektor erhalten wird, der ein Gen des Hirudins enthält, das identisch mit demjenigen ist, das in dem Plasmid pTG726 enthalten ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Peptide, die ganz oder teilweise die folgende Formel aufweisen:
Dieses Peptid (HV2) ist dargestellt mit der entsprechenden codierenden Sequenz, die nicht Teil des Peptids ist.
Die Erfindung betrifft auch die Varianten des Hirudins HV2, wie sie in der Fig. 18 dargestellt sind.
Die Erfindung betrifft schließlich pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Hirudin oder seine Analoga als aktives Prinzip (Wirkstoff) enthalten.
Diese Zusammensetzungen können auf intraperitonealem, intravenösem, intramuskulärem oder subcutanem Wege, auf oralem Wege oder auf topisch-cutanem Wege verabreicht werden.
Diese Zusammensetzungen enthalten die auf diesem Gebiet bekannten Exzipienten und gegebenenfalls weitere Wirkstoffe (aktive Prinzipien).
Die vorliegende Erfindung umfaßt selbstverständlich auch andere Aspekte, insbesondere bestimmte Plasmide, wie sie in den Beispielen beschrieben werden, sowie ihre Mutanten und Derivate und allgemein die Verfahren zur Fermentation der transformierten Bakterien sowie die dabei erhaltenen Produkte.
Weitere Charakteristiken und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der Lektüre der nachfolgenden Beispiele und den beiliegenden Zeichnungen hervor, wobei zeigen:
Fig. 1 die Aminosäuresequenz des aus dem Gesamt- Blutegel extrahierten Hirudins,
Fig. 2 die Oligonucleotid-48-mer-Sonde, die für die Sichtung (criblage) konzipiert worden ist,
Fig. 3 die Hirudin-Sequenz des Klons pTG717,
Fig. 4 eine Autoradiographie des Hybridisierungsgemisches zwischen der markierten Sonde und verschiedenen Restriktionen von pTG717,
Fig. 5 die Restriktionskarte des Inserts in pTG717,
Fig. 6 das Detail der Konstruktion der beiden Expressionsvektoren des Hirudins pTG718, abgeleitet von pTG927, und pTG719, abgeleitet von pTG951,
Fig. 7 die Graphik der Entwicklung der Hirudin-Aktivität von E. coli-Extrakten als Funktion der Zeit für die beiden Vektoren,
Fig. 8 die Analyse von markierten E. coli-Extrakten, welche die Hirudin-Aktivität enthalten,
Fig. 9 die Analyse der gleichen Extrakte wie die Fig. 8, jedoch nach der Behandlung durch Wärme bei saurem pH- Wert.
Es sei darauf hingewiesen, daß die unterschiedlichen Nucleotid-Sequenzen, die in den Zeichnungen auftreten, ausdrücklich als Teil der vorliegenden Beschreibung angesehen werden müssen, wobei diese Sequenzen in dem Text der Beschreibung nicht wiedergegeben sind, um ihn nicht unnötig damit zu belasten.
Der größte Teil der in den Beispielen angewendeten Techniken sind dem Fachmann bekannt und bestimmte davon sind in den beiliegenden Literaturstellen beschrieben. Nur spezielle Techniken sind in der Beschreibung beschrieben. Die Charakteristiken der eingesetzten Stämme sind nur als generelle Lehren angegeben.

a) Bakterienstämme

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Bakterienstämme sind die folgenden:
- TGE900, bei dem es sich um einen Stamm von E. coli mit den folgenden Charakteristiken handelt:
su&supmin;F&supmin;his ilv bio (λcI857ΔBamΔHI)
- N6437, ein Stamm von E. coli mit den folgenden Charakteristiken: F&supmin;his ilv gal&spplus; Δ8proC&spplus; : tn10 lacΔm15 (λcI857ΔBamΔHI).
- Jm103, bei dem es sich um einen Stamm von E. coli mit den folgenden Charakteristiken handelt: Δ(lac-pro) supE thi endA sbc15 sttA rK&supmin; nK&spplus; / F¹ traD36 proAB&spplus; lacia lacZΔm15.
Die obengenannten Stämme wurden verwendet, weil sie verfügbar waren, selbstverständlich ist es aber auch möglich, andere Stämme in dem Maße zu verwenden, in dem sie bestimmte wesentlichen Charakteristiken aufweisen, an die im Verlaufe der detaillierten Beschreibung erinnert wird.
Die nachfolgenden Beispiele umfassen im wesentlichen die folgenden Stufen:
1) die Herstellung der mRNA und die Konstitution einer Bank von cDNA;
2) die Realisierung einer Sonde;
3) die Selektion aus der Bank mittels dieser Sonde und die Identifizierung eines Plasmids, das die für das Hirudin codierende Sequenz trägt;
4) die Realisierung eines Expressionsvektors des Gens, das für das Hirudin codiert;
5) die Untersuchung der erhaltenen Ergebnisse.

Herstellung der RNA

Lebende Blutegel der Art Hirudo medicinalis werden aus dem Gebiet von Bordeaux in Frankreich entnommen. Man läßt sie mindestens vier Wochen lang fasten, dann werden sie enthauptet und die Köpfe werden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die RNA der gesamten Köpfe wird durch Vermahlen der Köpfe zu einem feinen Pulver in flüssigem Stickstoff extrahiert. Zu 1 g dieses Pulvers gibt man 5 ml eines Puffers NETS (10 mM Tris HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % SDS) und 5 ml zweimal destilliertes Phenol zu, die beide auf 95ºC vorerwärmt worden sind. Die Lösung wird anschließend durch Verwirbeln durchgemischt, bei 30 000 g zentrifugiert, die wäßrige Phase wird mit 1 ml Puffer NETS rückextrahiert und die vereinigten wäßrigen Phasen werden mit 5 ml frischem Phenol rückextrahiert. Die RNA wird durch Zugabe von 2 Volumenteilen Ethanol ausgefällt und nach mehr als 4-stündigem Stehenlassen bei -20ºC durch Zentrifugieren gesammelt. Der dunkelbraune Rückstand wird in 2,5 ml destilliertem Wasser gelöst, es werden 2,5 ml 5 M LiCl zugegeben und nach dem Mischen wird die Lösung eine Nacht lang bei 4ºC stehen gelassen. Die Lösung wird anschließend mit 5 ml 3 M LiCl überschichtet und 10 min lang bei 4ºC mit 20 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird eliminiert und der klare Rückstand von RNA wird in 1 ml H&sub2;O wieder aufgenommen. Man nimmt in 0,25 M NaCl auf und die RNA wird mit 2 Volumenteilen Ethanol ausgefällt. Der End-Rückstand von RNA wird durch Zentrifugieren abgetrennt und dann wieder aufgelöst und aufbewahrt bei -80ºC in destilliertem Wasser. Die Konzentration der RNA wird durch ihre Absorption bei 260 nm gemessen.
Polyadenylierte Messager-RNA wird hergestellt, indem man eine Oligo dT-Cellulose verwendet und ein Standardverfahren anwendet (22). Die Ausbeute an mRNA macht etwa 2 bis 5 % der gesamten Ausgangs-RNA aus.

Herstellung der Komplementär-DNA und Konstruktion der cDNA-Bank in dem Plasmidvektor pBR 322

Der angewendete Prozeß ist genau der gleiche wie derjenige, der zur Konstruktion der mRNA-Bank von Humanleber führt, wie er in der Literaturstelle 23 beschrieben ist. Die mRNA von Blutegel-Köpfen werden in Form der DNA kopiert unter Verwendung eines Oligo dT-"Primers" und des Enzyms Umkehr-Transkriptase. Ein zweiter DNA-Strang wird synthetisiert unter Verwendung von DNA-Polymerase, die Haarnadel ist offen mit der Nuclease S1 und der cDNA-Doppelstrang wird an einem Saccharose-Gradienten gereinigt. Die cDNA mit einer vorgegebenen Größe werden am 3'-Ende mit kleinen dC-Verlängerungen terminiert unter Verwendung des terminalen Enzyms Deoxytransferase, dann werden sie vereinigt mit einem Vektor pBR322 mit einem durch Pstl geschnittenen PolyG-Ende. Die erhaltenen Plasmide werden zur Transformation der Stämme von E. coli (Stamm 1106) verwendet und die Tetracyclin-resistenten Transformanden (die mit einem Wirkungsgrad zwischen 500 und 1000 pro ng cDNA- Doppelstrang erhalten werden) werden auf L-Agar-Platten wachsen gelassen, die 15 µg/ml Tetracyclin enthalten. Die Klon-Bank von cDNA, die 43 000 einzelne Transformanden repräsentiert, wird errichtet, die Zellen werden durch Abkratzen aus den Kolonien gewonnen und in einer L-Bouillon, die das Tetracyclin enthält, suspendiert. Die Suspendierung erfolgt in 50 %igem Glycerin und sie wird bei -20ºC gelagert.

Herstellung der DNA-Sonde für die Sichtung (criblage) der Bank

Angesichts der Tatsache, daß die für das Hirudin publizierte Aminosäuresequenz (Fig. 1) kein Methionin oder Tryptophan aufweist, d.h. die Aminosäuren, die für einen neuartigen Codon codiert sind, weist die Protein-Sequenz keine besonders vorteilhaften Bereiche für die Herstellung von besonders kurzen Oligonucleotid-Sonden auf, die nach einer allgemeinen Regel die für die Identifizierung der klonierten DNA-Sequenzen angewendete Strategie darstellt (24). Deshalb wurde entschieden, die andere Technik einer ziemlich großen, jedoch einzigartigen Oligonucleotid-Sonde anzuwenden, die insbesondere die Isolierung des Klons der cDNA für den Humankoagulations-Faktor IX erlaubte (23). Bei dieser Strategie wird der Aminosäuresequenz-Bereich, für den die Redundanz der Codons auf die Auswahl der dritten Base beschränkt ist, selektioniert (d.h. man entfernt das Arginin, das Leucin und das Serin) und man selektioniert die dritte Base. Die für die Auswahl der dritten Base dieses Codons in Betracht gezogenen Parameter sind bekannt, es handelt sich dabei darum, die Möglichkeit der G/T-Wechselwirkung zu maximieren und die Haarspangen und die Palindrome in der Sequenz der Sonde zu entfernen und selbstverständlich den für die Blutegel bekannten Gen-Sequenzen Rechnung zu tragen.
Da keine Genfrequenz für die Blutegel publiziert worden war, mußte Gebrauch gemacht werden von den Kenntnissen über die Lebewesen, die den Blutegeln in der Evolution am nächsten stehen und über die zahlreiche publizierte DNA- Sequenzen vorliegen, d.h. von den Insekten. Alle für die DNA codierenden Sequenzen von Insenkten wurden analysiert und es wurde eine Tabelle der Codons aufgestellt, die am häufigsten zu finden sind. Diese wurde zusammen mit anderen Parametern dazu verwendet, ein Oligonucleotid einer Länge von 48 Basen, entsprechend 16 Aminosäuren, von der Position 34 bis zur Position 49 in der Hirudin-Sequenz zu entwerfen. Dieser Sequenzbereich weist eine Redundanz nur in der Position 3 jedes Codons auf.
Dieses in der Fig. 2 dargestellte Oligonucleotid wurde chemisch synthetisiert nach der Phosphodiester-Methode auf einem festen anorganischen Träger (25), die bereits beschrieben worden war für ein 52-mer in der Literaturstelle (23).

Sichtung (criblage) der cDNA-Bank mit dem Oligonucleotid 48-mer

Die cDNA-Bank, aufgestellt ausgehend von den mRNA von Blutegelköpfen, wurde auf Agar-L-Platten, die 15 µg Tetracyclin/ml enthielten, mit einer Kolonie-Dichte von etwa 4 000 Kolonien pro Platte von 13 cm ausgestrichen und die Kolonien wurden bis zu einer Größe im Durchmesser von 1 bis 2 mm bei 37ºC wachsen gelassen. Von den Kolonien werden dann Abstriche auf Nitrocellulose-Filter vorgenommen. Die Kolonien der aufrechterhaltenen Platten werden wachsen gelassen, dann werden die Platten bei 4ºC gelagert. Die Filter werden auf die L-Agar-Platten, enthaltend 170 µg Chloramphenicol/ml, aufgebracht und eine Nacht lang bei 37ºC inkubiert, um die Plasmide in den Bakterienkolonien zu vergrößern (zu verstärken). Die Filter werden anschließend nach dem Standard-Verfahren behandelt, um die Bakterienkolonien aufzulösen und die DNA auf der Nitrocellulose zu fixieren. Die Filter werden danach sehr gründlich gewaschen, dann in einem Volumen von 100 ml von 6 x SSC (1 x SSC = 0,15 % NaCl, 0,015 M Trinatriumcitrat), 5 x Denhardts (1 x Denhardts-Lösung = 0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon, 0,02 % Rinderserumalbumin), 100 µg/ml RNA von einer Hefeübertragung und 0,05 % Natriumpyrophosphat vorhybridisiert.
Ein Aliquot (30 pMol) des Oligonucleotids 48-mer wird mit [³²P] an seinem 5'-Ende durch Inkubation mit γ[³²P] ATP in Gegenwart von 15 Einheiten Polynucleotid-Kinase markiert. Die markierte Sonde wird von freiem γ[³²P] ATP gereinigt durch Passierenlassen über Cellulose-DEAE.
Die markierte Sonde wird auf dem Filter mit einer Dosis von 20 ml von 6 x SSC, 1 x Denhardts, 100 µg/ml Hefe- tRNA, 0,05 % Natriumpyrophosphat bei 42ºC unter schwachem Rühren für 16 Stunden hybridisiert.
Die Filter werden dann gewaschen in 6 x SSC, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) bei einer Temperatur von 37ºC, 42ºC, 50ºC, dann einer Endwaschung unterzogen mit 2 x SSC, 0,1 % SDS bei 50ºC während 10 Minuten. Die Filter werden danach getrocknet und auf Röntgenfilmen ausgebreitet. Die Kolonien, die positive Ergebnisse liefern, werden bestimmt, ausgehend von markierten Platten, durch Vergleich der positiven Flecken auf dem Röntgenfilm mit den Plattenmatrices. Einer dieser Klone, dessen Plasmid als pTG700 bezeichnet wird, wird als positiv bestätigt durch eine zweite Hybridisierung mit der markierten Sonde und in Masse kultiviert und die Plasmid-DNA wird unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt.

Identifizierung von pTG700 als ein solches, das die für Hirudin codierende Sequenz enthält

Das cDNA-Insert von pTG700 repräsentiert etwa 235 Basenpaare. Dieses DNA-Fragment wird isoliert und in den Phagenvektor m13 mp8 transferiert und die DNA-Sequenz des Inserts wird durch Kettenterminierung bestimmt (26). Ein Teil dieser Sequenz codiert für eine Proteinsequenz, die sehr ähnlich derjenigen des Hirudins ist. Dieser Sequenzbereich entspricht der Zone der Sonde, die in der Fig. 2 dargestellt ist. In der Fig. 2 gilt folgendes:
(a) entspricht der Hirudin-Sequenz, die in der Literaturstelle 2 auftritt von glu 49 bis gly 34,
(b) entspricht der Sequenz der Sonde 48-mer, die synthetisiert und verwendet wurde für die Hybridisierung,
(c) entspricht der Sequenz des Klons pTG700 in diesem Bereich, wobei die Punkte die Homologien anzeigen,
(d) entspricht der codierten Aminosäuresequenz in diesem Bereich von pTG700.
Es sei darauf hingewiesen, daß die cDNA-Sequenz in pTG700 unvollständig ist, daß sie nur 28 der C-terminalen Aminosäuren des Hirudins codiert, abgesehen von der nicht übertragenen 3'-101 Basen-Sequenz der ein Stopp-Codon in Phase vorangeht. Einer der Unterschiede in bezug auf die für das Hirudin publizierte Proteinsequenz ist in diesem Klon festzustellen, weil die Glutaminsäure das Glutamin in der Position 49 ersetzt.

Isolierung von größeren cDNA-Klonen von Hirudin

Da die DNA-Sequenz bestätigt, daß das Insert von pTG700 für das Hirudin codiert, wird dieses Insert radioaktiv gemacht mit [³²P] nach dem bekannten "Nick-Translations-Verfahren" und für einen neuen Test der cDNA-Bank verwendet. Es werden mehrere weitere positive Kolonien gefunden und eine unter ihnen umfaßt ein Plasmid, als pTG717 bezeichnet, das ein Insert einer Länge von etwa 450 Basenpaaren enthält. Die Restriktionsanalyse dieses Inserts zeigt die Anwesenheit einer in der Nähe des Zentrums angeordnete Restriktionsstelle Taql an.
Deshalb wird das Fragment gereinigt und mit Taql digestiert (verdaut) und die resultierenden 5'- und 3'-Fragemente werden in dem Sequenzierungs-Vektor m13, der mit PstI/AccI gespalten worden ist, vereinigt. Der Aufbau des m13 enthält jedes der Fragmente, die identifiziert und der Sequenzanalyse unterzogen werden können. Das Ergebnis dieser Analyse ist in der Fig. 3 angezeigt. Die DNA-Sequenz des Inserts von pTG717 abzüglich der während der Klonierung des Verfahrens am Ende eingeführten PolyG/C-Enden ist 379 Basen lang, von denen 219 für ein Peptid codieren, dessen Sequenz sehr ähnlich derjenigen der publizierten Hirudin-Sequenz ist.
In dieser Sequenz müssen verschiedene Punkte beachtet werden:
1. die durch das Fragment codierte Aminosäuresequenz ist nicht identisch mit derjenigen der für natives Hirudin publizierten Proteinsequenz. Es gibt 9 unterschiedliche Aminosäuren zwischen der aus dem PTG717 isolierten Hirudinsequenz und der publizierten Hirudinsequenz. Es sei auf die folgenden Modifikationen hingewiesen:
Dies stellt eine größere Veränderung in der Sequenz dar, weil 7 dieser Modifikationen eine Ladungsänderung mit sich bringen. Die Homologie zwischen der klonierten codierenden Sequenz und der publizierten Proteinsequenz ist somit 46/65, d.h. etwa 70 %.
Es gibt zwei mögliche Gründe für die zwischen den beiden Aminosäuresequenzen beobachteten Unterschiede:
1. - man kann Arten, Unterarten und sogar Variationen der Einzeltiere zwischen der genauen Sequenz des Hirudinmoleküls feststellen. Dies kann nicht festgestellt werden, wenn die in dieser Untersuchung verwendeten Blutegel genau der gleichen Art oder Unterart sind wie diejenigen, die zur Publizierung der Aminosäuresequenz verwendet wurden. Außerdem ist es möglich, daß unter den Blutegeln nicht nur eine, sondern unterschiedliche Hirudin-Formen mit einer ähnlichen biologischen Aktivität, jedoch mit Variationen in den Grund-Aminosäuresequenzen vorliegen. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, auf die Unterschiede in den Ergebnissen in der Literatur hinzuweisen, betreffend die N-endständigen Aminosäuren des Hirudins (am Ursprung wurde ile gefunden in dem Material aus den Köpfen, dann wurde val gefunden in dem Gesamttier, während kürzlich erneut auf ile für das aus den Köpfen stammende Material hingewiesen wurde. Isoleucin findet sich in der Sequenz von pTG717 in der entsprechenden Position an dem N-terminalen Ende des reifen Proteins.
Das Konzept der verschiedenen Hirudin-Formen wird gestützt von den vorläufigen Untersuchungen in bezug auf die DNA. Wenn die gesamte DNA der Blutegel extrahiert wird aus nach Standardverfahren zerkleinerten eingefrorenen Blutegeln, die durch verschiedene Restriktionsenzyme, die mittels Elektrophorese auf Agarosegel behandelt worden sind, digeriert, darin auf Nitrocellulose übertragen und hybridisiert worden sind mit dem Insert pTG717 als Sonde, stellt man eine große Menge von Fragmenten fest, die sich hybridisieren.
Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse der Fig. 4 sind die folgenden:
- 10 µg der gesamten DNA von Blutegeln werden mit Restriktionsenzymen digeriert und einer Elektrophorese auf einem 1 %-igen Agarose-Gel unterzogen, auf Nitrocellulose-Filter übertragen und hybridisiert mit einem Insert PstI, das mit [³²P] von pTG717 markiert worden ist. Die Filter werden dann gründlich gewaschen (0,1 x SSC, 0,1 % SDS, 65ºC) und die hybridisierten Banden werden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Reihe 1 - DNA digeriert mit EcoRI
Reihe 2 - DNA digeriert mit HindIII
Reihe 3 - DNA digeriert mit BamHI
Reihe 4 - DNA digeriert mit BglII
Die Dimension der Fragmente EcoRI in kb ist rechts angegeben.
Mit den Digerierungsfragmenten EcoRI können 6 Fragmente mit insgesamt 40 kb unter sehr harten Waschbedingungen sichtbar gemacht werden. Selbst wenn es theoretisch möglich ist, daß dieses Schema ein sehr breites Mosaik-Gen repräsentiert, ist es wenig wahrscheinlich, daß eine einzige kleine Sequenz, die für weniger als 400 Basen codiert, auf 40 kb des Genoms verteilt ist. Außerdem lassen vorläufige Versuche mit Sonden, die Fragmente mit einem partiellen Insert enthalten, vermuten, daß dies nicht der Fall ist.
Es wurde auch beobachtet, daß in den Sequenzen in verschiedenen Hirudin-Klonen, die aus der gleichen cDNA- Bank isoliert wurden, eine Differenz vorlag. So befindet sich beispielsweise in pTG700 ein lys in der Position 47 (Fig. 2) wie in der publizierten Aminosäuresequenz, während in pTG717 ein asn in dieser Position vorliegt.
Dies ist der Grund, warum alle diese Informationen übereinstimmen mit dem Konzept der Gene von Hirudin mit unterschiedlicher Struktur und multiple Formen in bezug auf das Protein aufweisen.
Ein schließlich noch wichtiger Grund ist, daß die gesamte Sequenz der mRNA von Hirudin mit Sicherheit nicht in pTG717 enthalten ist. Die offene Ablesung setzt sich nämlich fort bis zu dem 5'-Ende des Klons und es gibt kein Methionin in diesem Bereich. Da das Hirudin ein Protein ist, das aus Zellen der Speicheldrüsen abgeschieden wird, kann man annehmen, daß an seinem N-terminalen Ende eine "Leader-Sequenz" (die für die Sekretion erforderlich ist) und wahrscheinlich auch eine Prosequenz vorliegen. Das fertige aktive Molekül wird dann gebildet, wie dies für zahlreiche Zymogene und Vorläufer der Fall ist, durch proteolytische Spaltungsstufen.
Es wurde die Größe der mRNA von Hirudin bestimmt und es wurde bestätigt, daß der Klon pTG717 nicht eine vollständige Kopie davon ist. Die RNA der Köpfe von Gesamthirudin wurde der Elektrophorese auf einem denaturierten Formaldehydagarosegel (27) zugeleitet, das auf Nitrocellulose übertragen worden war, und mit einem Insert von pTG717 hybridisiert. Es wurde eine Art eines neuartigen RNA-Hybrids mit 640 Basenpaaren beobachtet. Wenn man annimmt, daß das pTG717 die gesamte 3'-mRNA-Sequenz (ein Abschnitt Poly A ist zu beobachten) sowie zwei Additionsstellen von Poly A, die aus dem Poly A etwa 20 Basen rückbilden, enthält, sieht man einen nicht-übertragenen 3'-Bereich von 160 bp (Fig. 3). Diesem Klon von cDNA fehlen 160 Basenpaare am 5'-Ende. Er umfaßt den Rest des N-terminalen Endes des Proteins, das Methionin des Initiators und einen nicht-übertragenen 5'-Bereich der mRNA. Es ist nicht ausgeschlossen, daß das Hirudin ab dem Ende C abgeschnitten wird in Form eines wichtigeren Vorläufers, der für andere biologisch aktive Peptide codieren kann, obgleich die maximale Größe des hypothetischen Vorläufers mindestens 110 bis 120 Aminosäuren (d.h. etwa das Doppelte der Größe des reifen Hirudins) wäre.
Es war nicht möglich, die Klone von cDNA einer größeren Länge als diejenige von pTG717 zu erzeugen und man nimmt an, daß eine sekundäre Struktur in dem 5'-Ende der mRNA die umgekehrte Transkription der mRNA über diesen Punkt hinaus verhindert. Die Analyse der Genomsequenz des Hirudins müßte Informationen über das 5'-Ende dieses Gens liefern.
Die Aminosäuresequenz des Hirudins, die durch den Klon pTG717 codiert ist, wurde so adaptiert, um sich in die Zellen von E. coli zu exprimieren, wie nachstehend beschrieben.

Expression von Hirudin in E. coli

Aufgrund der Restriktionsanalyse von pTG717 (Fig. 5) ist es klar, daß die Gesamtheit der Sequenz, die für die Aminosäure codiert, enthalten ist in Form eines Fragments von 225 bp HinfI/AhaIII. Dieses Fragment wird durch Restriktion isoliert und in die Plasmid-Expressionsvektoren pTG951 und pTG927 inseriert unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotid-Adapter-Molekülen. Die Adapter stellen die 7 Aminosäuren dar, die von dem N-terminalen Ende durch die Restriktion HinfI eliminiert wurden und man fügt das Fragment Initiatormethionin und die Stelle für die Restriktions-Endonucleasen NdeI oder BglII hinzu, die erforderlich sind für die Insertion in die Expressionsvektoren.
Die beiden Aminosäuren nach dem Initiator met werden ersetzt, d.h. das Fragment ile-thr, das in dem cDNA-Klon pTG717 auftritt, wird durch val-val der publizierten Hirudin-Proteinsequenz ersetzt.
Obgleich der cDNA-Klon pTG717 die Sequenz ile/thr anstelle der Sequenz val-val der für das Hirudin publizierten Sequenz enthält, wurde ursprünglich entschieden, das Molekül mit einer Sequenz val-val am N-terminalen Ende zu exprimieren. Es gibt zwei Gründe für diese Wahl:
- der cDNA-Klon ist sicherlich unvollständig mit wahrscheindlich einer Sekundärstruktur in der mRNA, welche die Transkription verhindert. Dies macht es möglich, daß das 5'-Ende der cDNA-Sequenz inkorrekt ist wegen der Transkription und der Klonierung von "Artefakten",
- im allgemeinen nimmt man an, daß das N-terminale Ende des aktiven Hirudinmoleküls, das aus dem vollständigen Tier extrahiert worden ist, mit val-val beginnt (8,11).
Der Expressionsvektor pTG951 ist ein Plasmid-Expressionsvektor, der dazu bestimmt ist, das Interferon-Gen zu exprimieren, an dessen Synthese am Ende der vorliegenden Beschreibung erinnert wird.
In der Praxis enthält er im wesentlichen den Links- Promotor des Bacteriophagen PL, der durch einen Repressor gesteuert (kontrolliert) wird, der durch den wärmeempfindlichen Wirt C1857 codiert ist, gefolgt von dem N-Gen von λ, das intakt or verkürzt (verstümmelt) ist. Anschließend findet man eine Stelle zur Fixierung der synthetischen Ribosomen, die konzipiert wurde, um eine optimale Ribosomenfixierung zu ergeben. Man findet eine einzige (neuartige) Restriktionsstelle BglII, die zwischen der Ribosomenfixierungsstelle und dem ATG der für das Interferon γ codierenden Sequenz angeordnet ist. Dieser Vektor wird der Digestion unterworfen an der Stelle BglII und an der einzigen (neuartigen) Stelle PvuI stromabwärts von der für das Interferon γ codierenden Sequenz, dann wird er durch Elektrophorese auf einem Agarosegel abgetrennt. Dieses Vektorfragment wird kombiniert mit einer Einheit aus einem Adapteroligonucleotid und der Hirudinsequenz, die das Fragment HinfI/AhaIII enthält, wie in der Fig. 6 beschrieben.
Der Expressionsvektor pTG927 ist eng verwandt mit dem am Ende der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Expressionsbvektor pTG908. Er unterscheidet sich nur dadurch, daß er ein zusätzliches Fragment SalI-PvuII enthält, das aus dem Gen des Tetracyclins von pBR322 stammt. Der Expressionsvektor pTG927 enthält den Promotor PL, ein intaktes Gen N und die Ribosomenfixierungsstelle des Proteins CII von λ, dann das ATG und eine für das Fragment lacZ der β-Galactosidase codierende Sequenz. An dem ATG dieser codierenden Sequenz findet man eine Stelle NdeI. Dieser Vektor wird einer Digestion mit NdeI und PvuII unterworfen und das Vektorfragment wird gereinigt. Es wird verwendet zusammen mit einer anderen Kombination aus einem Oligonucleotid-Adapter und dem Fragment HinfI/AhaIII von Hirudin, um den zweiten Expressionsvektor von Hirudin zu konstruieren, der in der Fig. 6 auftritt. Die beiden Expressionsvektoren sind dazu bestimmt, das native Hirudinmolekül zu exprimieren (mit einer Sequenz val-val am N- terminalen Ende unmittelbar nach dem Initiator ATG).
In dem Adapter-Oligonucleotid wird der Codon der dritten Base so ausgewählt, daß ein hoher Translationsgrad begünstigt wird und daß die Bildung von Sekundärstrukturen in der mRNA in diesem Bereich vermieden wird.
Die beiden Vektoren werden wie folgt miteinander vereinigt: die Oligonucleotide werden am 5'-Ende durch die Polynucleotid-Kinase phosphoryliert, dann in einer äquimolaren Mischung behandelt (nach 10-minütigem Erwärmen auf 65ºC für 15 Stunden bei 15ºC). Der Vektor und das Hirudin- Fragment werden in der vorbestimmten Menge zugegeben, um Molverhältnisse Vektor/Hirudinfragmente/Adapter-Fragment von 1:20:50 zu ergeben und die Mischung wird mit der Ligase ADNT4 ligiert. Das Ligations-Gemisch wird verwendet zur Transformation des Stammes E. coli TG900 und die Transformanden, welche die Plasmide tragen, werden auf der Agar-Platte, die Ampicillin (100 µg/ml) enthält, selektioniert und diejenigen, welche die für das Hirudin codierende Sequenz aufweisen, werden durch Hybridisierung der Kolonien identifiziert unter Verwendung eines markierten Inserts von pTG717 als Sonde. Aus einer großen Anzahl von positiven Klonen werden jeweils 6 davon gleichzeitig mit einem negativen (Elternstamm) selektioniert und in einem Bouillon-L-Flüssigkeitsmilieu bei 30ºC bis zu einer optischen Dichte von 0,3 bei 650 nm kultiviert (wachsen gelassen). Die Expression aus dem Promotor PL wird anschließend durch eine Erhöhung der Temperatur auf 37ºC und eine Inkubation, die 6 Stunden lang aufrechterhalten wird, induziert. Die Zellen werden dann durch Zentrifugieren geerntet, in 1/5 des Volumens von TGE suspendiert (25 mM Tris HCl, pH 8,50 mM Glucose, 10 mM EDTA), dann durch Ultraschall zerkleinert (gemahlen). Nach der Klärung der Extrakte durch Zentrifugieren wird ein Aliquot der überstehenden Flüssigkeit auf seine Antithrombin-Aktivität getestet. Signifikante Werte der Antithrombin-Aktivität treten auf bei 5 von 6 Konstruktionen mit pTG927 und bei 4 von 6 Konstruktionen mit pTG951, die ebenfalls eine Aktivität anzeigen, obgleich sie etwas geringer ist.
Die Kontrollen zeigen keine signifikante Aktivität an. Die DNA-Sequenzanalyse der Klone, die positive Ergebnisse durch direkte Sequenzierung der Plasmide ergibt, zeigt an, daß die erwartete Sequenz sich bei allen Konstruktionen findet, die eine Aktivität aufweisen.
Zwei Klone, die eine positive Expression aufweisen, der von pTG951 abgeleitete Klon pTG719 und der von pTG917 abgeleitete Klon pTG718 werden wähend einer 6-stündigen Induktion analysiert. Nach dem Kultivieren der Kultur bei 30ºC bis zu einer optischen Dichte von 0,3 wird die Expression durch eine Erhöhung der Temperatur auf 37ºC induziert und ein Aliquot wird alle Stunde 6 Stunden lang aus den Extrakten entnommen, wie sie vorher hergestellt worden sind, und die Hirudin-Aktivität wird gemessen (29). Die Ergebnisse (Fig. 7) zeigen, daß der Klon pTG719 eine anfängliche Zunahme (Wachstum) aufweist, gefolgt von einem Plateau der Aktivität nach 3 bis 4 Stunden, das sich bei einer optischen Dichte von 650 auf dem Wert 770 U/l befindet.
Dagegen weist der Klon pTG718 eine höhere Aktivität auf, die während dieser gesamten Induktionsperiode noch weiterhin zunimmt.
Der nach 6 Stunden erhaltene Aktivitätswert ist etwa 5 mal höher als derjenige des Klons pTG719 und repräsentiert eine Gesamtaktivität von 7300 µ/l Kultur. Wenn dieses Hirudin-Rekombinat eine spezifische Aktivität ähnlich derjenigen des natürlichen Produkts val-val aufweist, entspricht das in den Extrakten erhaltene aktivste Produkt etwa 1 mg/l Kultur.

Eigenschaften des erhaltenen Hirudins

Um das aus E. coli erhaltene Hirudin zu charakterisieren, analysiert man direkt Kulturproben nach der Indukton, die 15 min lang auf 70ºC erwärmt worden sind oder nach der Herabsetzung des pH-Wertes 2,8 mit HCl auf 70ºC erwärmt worden sind. Im letztgenannten Falle wird der pH- Wert des Extrakts vor der Dosierung wieder auf den Neutralpunkt gebracht. Das auf die gleiche Weise behandelte native Hirudin weist keine Aktivitätsverluste auf, wie das zu erwarten gewesen wäre aufgrund der publizierten Eigenschaften des Moleküls (20). Im Falle des Extrakts treten nach dieser Behandlung keine Aktivitätsverluste auf, man beobachtet vielmehr nach der Behandlung eine Zunahme der Aktivität auf etwa das 2-fache. Dies kann entweder einen Abbau oder eine Inaktivierung der Bestandteile des Extrakts wiederspiegeln, der die Wirkung des Hirudins inhibierte, oder der pH-Wert kann ausreichend niedrig sein und die Stufe der Erwärmung kann in bestimmten Fällen eine vollständigere Rückbildung der Disulfidbrücken gewährleisten, die erforderlich sind, damit das Hirudin eine maximale Aktivität aufweist. Die Kontroll-Extrakte weisen keine Aktivität vor oder nach der Behandlung auf.
Wenn die Bakterienextrakte mit dem an einem Sepharose-Harz fixierten Thrombin vorinkubiert werden und die Thrombin-Sepharose durch Zentrifugieren eliminiert wird, wird praktisch die gesamte anfängliche Hirudin-Aktivität aus dem Extrakt eliminiert. Das erfindungsgemäß erhaltene Hirudin scheint sich auf sehr wirksame Weise mit dem Thrombin-Sepharose-Harz zu verbinden, was es erlaubt, eine Möglichkeit für die Reinigung dieses bakteriellen Hirudins in Betracht zu ziehen.
Bakterielle Zellkulturen, die den Expressionsvektor pTG718 enthalten, werden bis zu einer optischen Dichte von 0,3 bei 30ºC kultiviert, dann bei 37ºC induziert und jede Stunde werden Aliquote entnommen und markiert in einem Minimal-Milieu mit Methionin 35S 100 µCi/ml. Die Bakterien werden durch Zentrifugieren gesammelt und die Gesamtheit der markierten Bakterienproteine wird durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-SDS-Gel und nachfolgende Fluorographie analysiert.
Mindestens zwei Polypeptide, die durch die Konstruktion des Vektors in signifikanter Menge induziert worden sind, können bei etwa 6 bis 8000 Dalton beobachtet werden (Fig. 8-Reihen 5 bis 10).
Wenn die markierten Materialien aus Kulturen, die nicht mit pTG718 induziert worden sind, und aus Kulturen von 3 und 5 Stunden nach der Induktion bei 70ºC und pH 2,8 15 min lang behandelt werden, zentrifugiert werden, um die denaturierten Proteine zu eliminieren, und analysiert werden auf einem Polyacrylamid SDS-Gel, ist es klar, daß die wesentlichen Teile der markierten Proteine von E. coli aus der Probe eliminiert worden sind (Fig. 9-Reihen 1 und 2). Dieses Verfahren ergibt eine sehr zufriedenstellende Reinigung der beiden Banden mit geringem Molekulargewicht, die in den Expressionsvektoren von Hirudin induziert worden sind.
Die Gesamtheit der Hirudin-Aktivität findet sich in der überstehenden Flüssigkeit.

Herstellung der Vektor-Plasmide pTG951 und pTG927

Diese Vektorplasmide wurden verwendet, um das Interferon γ zu klonen oder Derivate von Plasmiden, die bei der Herstellung solcher Vektoren auftreten. An diese Synthese wird nachstehend kurz erinnert unter Hinweis auf die beiliegenden Zeichnungen, wobei zeigen:
- Fig. 10 die Herstellung von pTG907,
- Fig. 11 die Herstellung von M13 TG910
- Fig. 12 die Herstellung von pTG908
- Fig. 13 die Herstellung von pTG909
- Fig. 14 die Herstellung von pTG941
- Fig. 15 die Herstellung von pTG951.
Die Herstellung dieser Vektorplasmide umfaßt im wesentlichen:
a) die Herstellung des Vektors pTG908, der PL, N und CII rbs umfaßt
b) die Herstellung des Vektors pTG951, der eine Stelle zur Fixierung von synthetischen Ribosomen umfaßt.

Herstellung von pTG907 (Fig. 10)

Das verwendete Grund-Plasmid ist das Plasmid pBR322; dieses hat jedoch den Nachteil, daß es im Innern des Gens ampR eine Restriktionsstelle PstI aufweist, weil eine Stelle der gleichen Art anschließend verwendet wird in der Klonierungszone als einzige (neuartige) Restriktionsstelle. Es ist daher zweckmäßig, diese Restruktionsstelle PstI verschwinden zu lassen unter Verwendung einer Mutante des Plasmids pBR32, des Plasmids pUC8, in dem das gegenüber Ampicillin resistente Gen keine Restriktionsstelle PstI aufweist (diese Stelle wurde durch Mutation in vitro eliminiert). pBR322 ist im Handel erhältlich insbesondere von der Firma Bethesda Research Laboratories und pUC8 ist in der Literaturstelle 30 beschrieben.
Um dies durchzuführen, tauscht man das Fragment PvuI/PvuII mit 1669 bp von pBR322 gegen das analoge Fragment PvuI/PvuII des Plasmids pUC8 aus. Um diesen Austausch durchzuführen, werden die Plasmide pBR322 und pUC8 nacheinander mit PvuI, PvuIIa behandelt, dann unter der Einwirkung einer Ligase zirkularisiert.
Man erhält so das Plasmid pTG902, das keine Restriktionsstelle PstIa mehr enthält und das auch die Restriktionsstelle NdeI verloren hat, die ursprünglich bei pBR322 vorhanden war (in der Figur nicht dargestellt). Außerdem trägt das Plasmid pTG902 ein Fragment von 50 kb entsprechend der Sequenz laci', in der sich die Stelle PvuII befindet.
Der Promotor PL und das Gen λN, das aus dem Phasen stammt, (das Gen λN codiert für eine Transkriptions-Antiterminierungsfunktion) werden aus dem Plasmid pKC30 isoliert, um in pTG902 inseriert zu werden, wie dies in der beiliegenden Fig. 10 angezeigt ist, durch Behandlung von EcoRI, S1, BamHI für pTG902 und durch Behandlung von PvuI, S1, BamHI für pKC30 mit Ligation.
Eines der nach der Transformation des Stammes TGE900 erhaltenen Plasmide, das pTG906, wird so behandelt, daß das Segment PvuII-SalI eliminiert wird. Um dies zu erzielen, wird pTG906 nacheinander mit SalI, der Nuclease S1, PvuII und der Ligase behandelt. Man erhält so pTG907.

Herstellung von M13 TG910 (Fig. 11)

Man inseriert anschließend den "Ribosomenfixierungsbereich" λcIIrbs (der ebenfalls aus dem Phagen λ stammt) in Form eines Fragments AvaI/TaqI in den Beginn des Gens LacZ' (Fragment α der β-Galactosidase), der in dem Phagen M13 kloniert worden war, als M13tg110 bezeichnet. Diese Strategie erlaubt einen einfachen Funktionstest für rbs, d.h. die Herstellung des Proteins lacZ' und infolgedessen die Gewinnung von blauen Platten in Gegenwart von IPTG und Xgal; dies erlaubt ebenfalls eine schnelle Sequenzierung der Konstruktion unter Anwendung der genannten Dideoxy-Methode.
Man erhält so nach der Selektion in den kompetenten Bakterien einen resultierenden Klon M13tg910, dessen Gesamtaufbau im unteren Teil der Figur dargestellt ist.

Herstellung von pTG908 (Fig. 12)

Das Fragment cIIrbs/lacZ' des Phagen M13tg910 wird auf das vorher hergestellte Vektorplasmid pTG907 übertragen.
Um dies zu erreichen, eliminiert man die Stellen EcoRI, BamHI und AvaI stromaufwärts von cIIrbs, dann inseriert man eine Stelle BglII. Unter diesen Bedingungen kann cIIrbs in Form eines Fragments BglII-BglII entnommen und in die Stelle BamHI stromabwärts von dem Promotor PL und dem Gen λN von pTG907 eingeführt werden.
Der Phage M13tg910 wird mit EcoRI digeriert, dann mit Bal31 und schließlich mit der Polymerase von Klenow behandelt. Die erhaltenen Fragmente werden danach in Gegenwart eines nicht-phosphorylierten Adapters BglII der Einwirkung der Ligase ausgesetzt. Die erhaltene Ligationsmischung wird zur Transformation der kompetnenten Zellen JM103 verwendet.
Dann selektioniert man die blauen Bereiche. Diese Klone werden anschließend analysiert um zu verifizieren, daß sie die Stelle BglII enthalten und daß sie keine Stelle EcoRI oder BamHI stromaufwärts mehr enthalten. Man erhält so Klone, wie M13tg912 deren Struktur dagestellt ist.
Die Behandlung durch Bal31 führt zu einer Deletion von 101 bp, wodurch die Stellen EcoRI, BamHI und AvaI eliminiert werden ebenso wie die Sequenzen von lac ATG und lac Shine/Dalgarno. Die eingeführte Stelle BglII ist etwa 100 bp stromaufwärts von ATG von cII und 10 bp stromabwärts von Plac plaziert.
Das Fragment BamHI/SphI von pTG907, das Fragment BglII/HpaI, das cIIrbs und lacZ' trägt, und der phosphorylierte Adapter wurden in einem Molverhältnis 1:2:1 vorhybridisiert und dann mit der Ligase T&sub4; behandelt. Zur Transformation der kompetenten Zellen des Stammes 6150 bei 3ºC werden Aliquote verwendet.
Die interessanten Zellen werden identifiziert durch Selektionieren der Transformanden mit einem Fragment cIIrbs/lacZ', das mit P³² markiert ist, und die dabei erhaltene Konsturktion wird durch eine Prüfung der enzymatischen Restriktion bestätigt.
Um ein erstes Anzeichen zu haben, das zeigt, daß die verschiedenen Elemente des Expressionssystems sich wie gewünscht verhalten, wird das erhaltene Plasmid pTG908 in einen Wirtsstamm N6437 transferiert, der gleichzeitig c1857 und das Fragment ω der β-Galactosidase, welches das Fragment α ergänzt, aufweist, der für das Plasmid codiert ist.
Die erhaltenen Transformanden, die auf eine IPTG + Xgal enthaltende Schale aufgebracht werden, sind bei 28ºC weiß, dann werden sie innerhalb von 30 min blau, wenn man sie auf 42ºC bringt.
Dieser Vektor wurde vor seiner Verwendung zum Klonieren von Hirudin angepaßt zum Klonieren des Human-γ-Interferons: IFN-γ, für die Klonierung des Hirudins hat die Natur des klonierten Zwischenproteins nämlich keine Bedeutung, die Vektoren wurden jedoch nach dem nachfolgenden Schema hergestellt.
Die Analyse der Sequenz der Nucleotide von IFN-γ für die Restriktionsstellen zeigt eine Stelle EcoRII bei 8bp stromabwärts vom Beginn des reifen Proteins und eine Stelle Sau3A bei 285 bp stromabwärts von dem Stopp-Codon, was praktisch die Isolierung der gesamten für das reife Protein codierenden Sequenz auf einem Fragment Eco- RII/Sau3A erlaubt. Der aus einer Bank erhaltene Klon von IFN-γ wird als pTG11 bezeichnet.

Konstruktion von pTG909 (Fig. 13)

Man verwendet zunächst ein synthetisches Adaptermolekül, das erlaubt:
a) die Durchführung der Vereinigung zwischen den Enden EcoRII und NdeI,
b) die Einführung der fehlenden 8 bp in bezug auf die Sequenz, die für reifes IFN-γ codiert, und
c) die Wiederherstellung des Ausgangs-Codons ATG von cIIrbs in der Weise, daß die für das reife Protein IFN- codierende Sequenz übertragen wird ohne fusionierte Aminosäuren mit Ausnahme des Initiators F-met.
Dieser Adapter wird chemisch synthetisiert und seine Konstitution ist in der Figur dargestellt.
pTG11 wird einer Digestion unterzogen mit EcoRII und Sau3A und pTG908 mit NdeI und BamHI.
Die geeigneten Fragmente werden an einem Gel gereinigt, mit einer äquimolaren Menge des Adapters gemischt, vorhybridisiert und ligiert. Die Mischung wird zur Transformation der kompetenten Zellen TGE900 verwendet und die Transformanden werden selektioniert durch Hybridisieren eines Inserts PstI und pTG11, "nick-übertragen" und markiert mit P³² mit den Transformanden.
Es werden 13 Klone selektioniert und kontrolliert durch Kartographie und einer von ihnen pTG909 wird durch Sequenzierung verifiziert.

Konstruktion des Vektors pTG941 (Fig. 14)

pTG909 enthält zwei Stellen NdeI, die eine am Ausgangscodon von IFN-γ und die andere 22 bp eb stromabwärts von der Sequenz IFN-γ.
Der Bereich zwischen diesen Stellen, welcher der Bereich ist, der für die 7 ersten Aminosäuren von IFN-γ codiert, wurde durch Behandlung mit NdeI eliminiert und durch ein synthetisches Oligonucleotid, das in der Figur dargestellt ist, ersetzt.
Diese Reaktion zerstört die Stelle NdeI stromabwärts und stellt die Stelle NdeI stromaufwärts wieder her unter Einführung einer Stelle BamHI, die neuartig ist. Man erhält so den Vektor pTG941.

Konstruktion von pTG951 (Fig. 15)

Die Fig. 15 stellt in schematischer Form die Konstruktion von pTG951 dar, der abgeleitet ist von pTG941, in dem das das cIIrbs enthaltende Fragment ersetzt wurde durch eine synthetische Sequenz auf der Basis der Sequenz des Initiierungsbereiches der Translation des Operons E. coli lac, als E. coli lac-Operon rbs bezeichnet. Dieses synthetische Oligonucleotid wurde in Höhe der Stelle HgaI zwischen der neuartigen Stelle NdeI des Ausgangs-Codons der für IFN-γ codierenden Sequenz und der Stelle ClaI, die in das Gen N inseriert worden war, inseriert.
Aufgrund dessen enthält das Plasmid pTG951 durch die Behandlung mit NdeI und ClaI nicht mehr als ein verkürztes (verstümmeltes) Gen N (ein Stopp-Codon in Phase mit der Translation des Gens N ist unmittelbar stromaufwärts von der neuen Stelle rbs plaziert) und es ist frei von den Transkriptions-Terminatoren tL1 und tR1, die in pTG909 und pTG941 vorhanden sind.
Die hauptsächlichen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt: Name Promotor Sequenz von RBS und Verbindung mit der Sequenz
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Herstellung der Varianten HV2, die an ihrem N-terminalen Ende modifiziert ist. In den beiliegenden Zeichnungen repräsentieren:
Fig. 16 eine Kurve der Hirudin-Aktivität, die in einer Kultur von E. coli TG900, enthaltend pTG720, induziert wurde;
Fig. 17 ein Analysenspektrum der mit ³&sup5;S markierten Proteine der Extrakte von E. coli TG900, enthaltend pTG720.

Herstellung des modifizierten HV2

Die Konstruktion des Plasmids pTG720, das erfindungsgemäßes Hirudin exprimiert, wird nach dem gleichen Verfahren wie das oben beschriebene Plasmid pTG718 erhalten, wobei man von pTG717 und pTG927 ausgeht.
Man vereinigt das Fragment NdeI/PvuII von pTG927 mit dem Fragment HinfI/AhaIII von pTG717 mittels Adapter-Oligonucleotiden, wie nachstehend beschrieben, um am N-terminalen Ende des Hirudins die Sequenz ile-thr wiederherzustellen.
Das Ligations-Gemisch wird verwendet, um E. coli TG900 zu transformieren, und die Plasmide enthaltenden Transformanden werden auf einer Platte von L-Agar, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, selektioniert. Die Konstruktionen, welche die Sequenz von Hirudin enthalten, werden durch Hybridisierung der Kolonien identifiziert unter Verwendung eines markierten Inserts von pTG717 als Sonde.
Die DNA-Sequenz des fertigen Plasmids wurde durch direkte Sequenzierung der DNA in dem Expressionsplasmid kontrolliert.

Expression der Hirudin-Aktivität durch pTG720

Zellen von E. coli TG900, die das Plasmid pTG720 enthalten, werden auf dem Milieu LB plus 50 µg/ml Ampicillin bei 30ºC kultiviert (wachsen gelassen) bis zu einer optischen Dichte 600 von 0,3.
Die Zellkulturen werden anschließend bei 37ºC transferiert, um die Transkription, ausgehend von dem Promotor PL, zu induzieren.
Pro Stunde entnimmt man 1 ml eines Aliquots und die Dichte bei 600 nm wird gemessen, dann werden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt.
Der Zentrifugierungsrückstand wird in 200 µl TGE (25 mM Tris HCl, pH 8,0, 50 mmM Glucose, 10 mM EDA) wieder suspendiert und die Zellen werden durch Ultraschallbehandlung lysiert.
Nach der Klärung wird die überstehende Flüssigkeit gesammelt und die Antithrombin-Aktivität wird bestimmt entweder nach dem Koagulations-Versuch oder durch kolorimetrische Dosierung der Inhibierung des Zerschneidens (Kupierens) des Substrats Tosyl-glycil-propyl-arginin-4- nitroanilidacetat (Chromozym TH, Boehringer Mannheim GmbH) durch eine Standard-Thrombin-Lösung.
Die Reaktion wird in einem Reaktionsvolumen von 1 ml durchgeführt unter Verwendung von 13 µm Substrat in einem Puffer, bestehend aus 100 mM Tris HCl, pH 8,0, 0,15 M KCl, 0,1 % Polyethylenglycol 6000.
Die Reaktion mit 0,25 U Thrombin wird 2 Stunden lang mit einem Spektrophotometer bei 405 nm verfolgt und die Reaktionsgeschwindigkeit wird gemessen, ausgehend von dem Steigungswert der optischen Dichte.
Zu dieser Reaktionsmischung von Thrombin werden Standard-Hirudin oder unbekannte Extrakte zugegeben, um die Inhibierungsmenge oder die Antithrombin-Aktivität zu bestimmen.
Die beiliegende Fig. 16 zeigt den Effekt der Induktion der Antithrombin-Aktivität einer Zellenkultur, enthaltend pTG720, ausgedrückt in Antithrombin-Einheiten für eine optische Dichte von 600 pro Liter Kultur, und das über eine Zeitdauer von 6 Stunden.
Die punktierte Linie gibt die Wachstumskurve der Zellen von E. coli an, gemessen bei einer optischen Dichte von 600 während der gleichen Zeitdauer.
Man beobachtet eine Aktivität vom Hirudin-Typ, die aufgrund der Induktion eine beträchtliche Höhe aufweist.
Kontrollysate der das Plasmid ohne die Hirudin-Sequenz enthaltenden Kulturen weisen keine Aktivität auf.
Wenn diese Bakterien-Lysate nach der Ansäuerung auf pH 2,8 mit HCl 15 min lang auf 70ºC erwärmt werden, wird eine beträchtliche Menge an Proteinen denaturiert und ausgefällt. Wenn diese durch Zentrifugieren des abgekühlten Extrakts eliminiert wird und wenn die über stehende Flüssigkeit durch Zugabe eines Puffers Tris HCl (Endkonzentration 100 mM, pH 8,0) neutralisiert wird, finden sich mindestens 100 % und meistens mehr der Ausgangsaktivität in der überstehenden Flüssigkeit.
In einem typischen Versuch finden sich 130 % der Ausgangsaktivität in der überstehenden Flüssigkeit.
In dem in dem Rückstand ausgefällten Material findet sich keine restliche Aktivität.
Wenn ein Bakterienextrakt, das erwärmt und angesäuert worden ist nach dem Abkühlen, Zentrifugieren und Neutralisieren (200 µl, enthaltend 5 ATU Hirudin) 15 min lang bei 37ºC mit 100 µl eines Breis (einer Brühe) mit 50 % Thrombin, das kovalent an ein Cepharose-Harz gebunden ist (hergestellt nach Standardverfahren), inkubiert wird, und wenn das Sepharose-Thrombin durch Zentrifugieren eliminiert wird, findet sich keine Aktivität vom Hirudin-Typ in der überstehenden Flüssigkeit.
Auf diese Weise hat das durch pTG720 gebildete Hirudin die gleichen allgemeinen Eigenschaften wie das native Molekül und wie dasjenige, das durch pTG7717 und pTG718 erhalten wurde.
Die Polypeptide, die in der Kultur pTG720 spezifisch induziert worden sind, nach der Markierung mit dem Methionin S³&sup5;, der Auflösung durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel und Sichtbarmachung durch Fluorographie sind in der Fig. 2 dargestellt. Insbesondere wurde eine Reihe von Polypeptiden mit einem kleinen Molekulargewicht (5 bis 10 000 Dalton) induziert. In der Fig. 17 stellen dar:
- die Reihe 1 die nicht-induzierten Zellen,
- die Reihe 2 die Induktion bei der Stunde 0,
- die Reihe 3 die Induktion nach 1 Stunde,
- die Reihe 4 die Induktion nach 2 Stunden,
- die Reihe 5: Molekulargewichtsmarker,
- die Reihe 6 die Induktion nach 3 Stunden
- die Reihe 7 die Induktion nach 4 Stunden
- die Reihe 8 die Induktion nach 5 Stunden
- die Reihe 9 die Induktion nach Stunden
- die Reihe 10 die Induktion nach 7 Stunden
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Herstellung des Hirudins HV1.

Untersuchung des Gens HV1 und Synthese-Strategie

Die Synthese-Strategie zur Herstellung des Gens von Hirudin HV1 umfaßt verschiedene Stufen.
Zunächst kann, da es keinen Unterschied in bezug auf die Aminosäuren zwischen HV1 und HV2 nach der Aminosäure 53 gibt, wie dies aus der Fig. 18 hervorgeht, und da es eine neuartige Stelle TaqI in dem cDNA von kloniertem HV2 in pTG717 gibt, die an der Aminosäure 56 zentriert ist (Fig. 19) die DNA-Sequenz der Variante HV1 nach der Aminosäure 56 durch das Fragment TaqI-PstI von pTG717 geliefert werden.
Deshalb muß nur die DNA, die für die 56 ersten Aminosäuren von HV1 codiert, chemisch synthetisiert werden.
Diese DNA wurde in zwei getrennten Blöcken synthetisiert. Der erste, dargestellt in der Fig. 20, beginnt mit einer Kohäsions-Stelle EcoRIa, die im wesentlichen für die Klonierung bestimmt ist, unmittel gefolgt von einer Stelle NdeI, die den Initiierungs-Codon ATG vor der für HV1 codierenden Sequenz enthält. Das vollständige Gen kann entnommen werden unter Verwendung der Stelle NdeI am 5'-Ende zur Insertion in einen Expressionsvektor in E. coli. Auf diesen Teil folgt eine Verlängerung der DNA, die für die Aminosäuren 1 bis 32 von HV1 codiert und kann abgeschlossen werden durch ein kohäsives Ende BamHI, da die Aminosäuren 31 und 32 gly und ser sind und durch eine Stelle BamHI codiert sein können, wie dies nachstehend dargestellt ist:
Dieser Teil der synthetischen DNA, der 109 bp darstellt, wird durch Kondensation mit seinen Oligonucleotid- Bestandteilen vereinigt, die dann durch Ligation in den Phagen M13mp8 plaziert werden, der durch EcoRI/BamHI so geschnitten wird, daß dies zur Konstruktion von M13TG724 führt. Da die synthetische DNA in dem Polylinker-Bereich des Phagen M13 enthalten ist, kann sie sofort sequenziert werden zur Verifizierung der richtigen Vereinigung dieses ersten synthetischen Blocks.
Der zweite synthetische Block entspricht den Aminosäuren 33 bis 56 und ist begrenzt an einem Ende durch eine kohäsive Stelle BamHI und an dem anderen Ende durch eine Stelle TaqI (Fig. 21). Dieser synthetische Block von 49 bp wird wieder vereinigt, ausgehend von seinen Oligonucleotid-Bestandteilen, in die dann das Fragment TaqI/PstI eingearbeitet wird, das von pTG717 in M13TG724 stammt, das durch BamHI/PstI geschnitten wurde, wie in der Fig. 21 angezeigt. Dies führt zu einem Phagen M13TG725, der die für HV1 insgesamt codierende Sequenz enthält. Wie vorstehend angegeben, kann die genaue Zusammenführung dieser Konstruktion sofort durch Sequenzierung verifiziert werden.
Die folgende Stufe umfaßt den Transfer des Fragments NdeI/AhaIII, das mit dem ATG der Hirudinsequenz beginnt und in einem nicht übertragenen Bereich am 3'-Ende endet, in das Plasmid pTG927, das durch NdeI/PvuII geschnitten wird. Dieser Expressionsvektor ist identisch mit demjenigen, der zur Konstruktion des Hirudin HV2-Expressionsvektors pTG720 verwendet worden ist, und seine Struktur und seine Konstruktion sind bereits beschrieben worden. Der fertige Expressionsvektor, der für die Variante HV1 codiert, wird als pTG726 bezeichnet und ist in der Fig. 22 dargestellt.
Die genaue Sequenz der für die Konstruktion dieser beiden Blöcke verwendeten Oligonucleotide ist in der Fig. 23 angegeben. Der Block 1 erstreckt sich von der Stelle EcoRI bis zu der Stelle BamHI und er besteht aus 8 Oligonucleotiden mit Größen von 22 bis 32 Basen. Der Block 2 erstreckt sich zwischen der Stelle BamHI und der Stelle TaqI und besteht aus 6 Oligonucleotiden mit Größen, die sich zwischen 19 und 30 Basen staffeln.
Die Oligonucleotide werden durch ein manuelles Phosphotriester-Verfahren auf einem Siliciumdioxid-Träger (Literaturstelle 31) synthetisiert und sie werden gereinigt unter Anwendung der HPLC-Methoden oder durch Elution unter Verwendung eines Polyacrylamidgels.
Die genaue Sequenz der für den synthetischen Teil des Gens verwendeten Oligonucleotide wird ausgewählt unter Berücksichtigung der folgenden Parameter:
a) die Auswahl der Codons, wenn dies möglich ist, ist diejenige der Gene, die in sehr hohen Mengen in E. coli exprimiert werden; diese Auswahl wird durchgeführt unter Verwendung der publizierten Angaben (Literaturstelle 32, 33);
b) die Analyse durch den Ordinator jedes der einzelnen Oligonucleotide und anschließend in der vollständigen Sequenz in der Weise, daß Strukturen, die "Haarspangen" bilden können, eliminiert werden;
c) die Auswahl des N-terminalen Endes des Hirudinmoleküls entspricht der bevorzugten Verwendung bestimmter Codons zur Herstellung von Basen in bestimmten Positionen dieses Bereiches, von denen gezeigt wurde, daß sie wichtig sind für eine erhöhte Expression von Fremdproteinen in E. coli.

Zusammenbau des synthetischen Gens

Erster synthetischer Block

Die diesen Block aufbauenden Oligonucleotide 1-8 (Fig. 23) werden unter Standardbedingungen an ihrem 5'- Ende mit der Polynucleotid-Kinase phosphoryliert außer den beiden End-Oligonucleotiden 1 und 8. Dies dient dazu, die Bildung eines Dimers oder eines Polymers des synthetischen Blockes in den folgenden Stufen der Ligation zu vermeiden. 500 Picomol jedes der Oligonucleotide werden unter Verwendung von zwei Einheiten Polynucleotid-Kinase in einem Endvolumen von 25 µl von 60 mM Tris HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 8 mM Dithiothreit, enthaltend auch 3,3 Picomol ³²P γ-ATP, dessen spezifische Aktivität 5000 Ci/mMol beträgt, kinatisiert. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37ºC werden die Oligonucleotide anschließend durch Zugabe von 5 mMol kaltem ATP vollständig phosphoryliert.
Nach 15-minütiger ergänzender Inkubation bei 37ºC werden die Oligonucleotide gereinigt durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel, das zu 20 % in den denaturierten Zustand überführt worden ist. Die markierten Oligonucleotide werden durch Audioradiographie nachgewiesen, die geeigneten Bereiches des Gels werden ausgeschnitten und die Oligonucleotide werden mittels H&sub2;O während einer Inkubation während einer Nacht bei 37ºC eluiert.
Die Oligonucleotide werden anschließend auf DEAE-Cellulose-Kolonnen aufgegeben, mit einem Triethylammoniumbicarbonat-Puffer, 1 M, pH 8, eluiert und lyophilisiert.
Für die nicht-kinatisierten und nicht-markierten Oligonucleotide 1 und 8 wird die Gel-Reinigung wie oben durchgeführt, wobei jedoch die Oligonucleotide durch UV- Absorption nachgewiesen werden.
Die komplementären Fragmente (1 + 5, 2 + 6 ...) werden miteinander gemischt unter Verwendung äquivalenter Mengen, 100 Picomol jedes der Oligonucleotide in einem Endvolumen von 50 µl von 66 mM Tris HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, 8 mM Dithiothreit. Diese Mischungen werden auf 100ºC erwärmt und innerhalb von 2 Stunden langsam auf 37ºC abgekühlt. Die Lösungen werden durchgemischt, um Hybride zu ergeben, mit 4 Oligonucleotiden in 100 ul. Die Mischungen werden schließlich gesammelt und die 8 Oligonucleotide werden eine Nacht lang bei 37ºC in einem Endvolumen von 200 µl miteinander gepaart. 0,005 Picomol der gepaarten Oligonucleotide werden mit 25 ng M13mp9, digeriert durch BamHI/EcoRI und gereinigt auf einem Gel, ligiert in einem Endvolumen von 20 µl einer Ligationsmischung, enthaltend 66 mM Tris pH 7,5, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit, 0,5 mM ATP.
Die Ligation wird 24 Stunden lang bei 15ºC fortgesetzt, danach 24 Stunden lang bei 4ºC weiterverfolgt. Die Ligationsmischung wird dann verwendet zur Transformation von E. coli JM103. Aus zahlreichen weißen Platten, die durch Transformation erhalten werden, selektioniert man 8 Kandidaten, stellt die DNA der einsträngigen Phagen her und unterwirft sie einer direkten DNA-Sequenzierung nach der Dideoxy-Kettenterminierungsmethode (Literaturstelle 34). Unter diesen Kandidaten enthalten zwei den korrekten Oligonucleotid-Zusammenbau, der dem Block 1 der Fig. 23 entspricht, und einer von ihnen wird als M13TG724 angesehen und in der folgenden Stufe verwendet.

Zweiter synthetischer Block und Zusammenbau des gesamten Gens

Um den zweiten synthetischen Block zusammenzubauen, wendet man im wesentlichen die gleiche Strategie an wie sie vorstehend beschrieben worden ist, mit Ausnahme der Tatsache, daß die Oligonucleotid-Bestandteile nicht vor der Paarungsstufe vorgereinigt werden, sondern vielmehr kinatisiert werden (mit Ausnahme der endständigen Oligonucleotide 9 und 14 - Fig. 23), und dann direkt gepaart werden. Die Paarungsbedingungen sind die gleichen wie diejenigen, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, mit 100 Picomol jedes der Oligonucleotide in einem Endvolumen von 150 µl.
Nach der Paarungsstufe wird die Mischung auf ein 2 %iges Agarosegel (Agarose mit tiefer Schmelztemperatur) aufgegeben, dann der Elektrophorese zugeführt. Die Oligonucleotide werden durch Färbung mit Ethydiumbromid nachgewiesen und die entsprechenden Banden im zusammengebauten Block (69 bp) werden aus dem Gel herausgeschnitten und nach Standardverfahren eluiert.
Der zweite synthetische Block (2 ng) wird anschließend gemischt mit 50 ng des Phagen M13TG724, geschnitten durch PstI/BamHI und gereinigt auf einem Gel, und 2 ng eines Fragments TaqI/PstI von pTG717, gereinigt auf einem Gel. Die Gesamtheit dieser Elemente wird in einem Volumen von 20 µl von 66 mM Tris HCl pH 7,5, 6,6 mM MgCl&sub2; zusammengebaut, 15 min lang auf 65ºC erwärmt und man gibt DTT bis zu 10 mM, ATP bis zu 0,5 mM und 5 Einheiten der Ligase T&sub4; zu. Die Ligation wird 16 Stunden lang bei 15ºC durchgeführt, dann wird die Ligationsmischung zur Transformation von E. coli JM103 verwendet.
Aus den weißen Platten unter den Transformanden wählt man 12 aus, die anschließend selektioniert werden zur Herstellung eines Einfachstrang-Phagen für die direkte Sequenzierung. Außerdem wird der Phage auch hergestellt in Form eines Doppelstranges (Literaturstelle 35), um die Existenz einer einzigen (neuartigen) Stelle BamHI zu untersuchen, die in den korrekt zusammengebauten Rekombinanten vorhanden sein muß. Die Mehrzahl dieser Klone enthält gleichzeitig die Stelle BamHI und die DNA-Sequenz, die dem korrekten Zusammenbau der Gesamtheit des für HV1 codierenden Gens entspricht. Man wählt einen von ihnen aus, der nachstehend als M13TG725 bezeichnet wird.

Transfer des Gens HV1 in den Expressionsvektor

Die Endstufe zur Erzeugung des Plasmidvektors, der das Protein HV1 exprimieren kann, besteht darin, das Segment von 248 bp NdeI/AhaIII von M13TG725 in pTG927, geschnitten durch durch NdeI/PvuII (Fig. 22), zu transferieren. Da jedoch die replikative Form des Phagen mit diesem Digestions-Typ zu einem zweiten Fragment von M13 mit praktisch der gleichen Größe führt, das sich jedoch in dem Expressionsvektor wirksamer kloniert als das gewünschte Fragment, war es zunächst erforderlich, ein Fragment AvaII/BglII (1,71 kb) herzustellen, das die Gesamtheit der Hirudinsequenz HV1 enthält, und dann dieses mit NdeI/AhaIII zu digerieren. Dieses Produkt der Digestion ohne weitere Reinigung wurde in dem Expressionsvektor pTG927 nach dem Schneiden mit NdeI/PvuII ligiert. Unter den Transformanden von E. coli TGE900 wurde die korrekte Konstruktion pTG726 identifiziert durch die Anwesenheit einer einzigen (neuartigen) Stelle BamHI, die aus der Sequenz des Gens HV1 stammt, und anschließend durch eine direkte DNA-Sequenzanalyse.

Expression der biologischen Aktivität des Hirudins HV1 mit pTG726

Der Expressionsvektor pTG726 umfaßt einen wärmeinduzierbaren Promotor, den Promotor PL, einen Haupt-Links- Promotor des Bacteriophagen λ. Da dieser Promotor durch einen wärmeempfindlichen Repressor, der durch den Wirt codiert ist, blockiert ist, wird das Gen von Hirudin HV1 während des Wachstums bei 30ºC nicht transkribiert. Wenn jedoch die Temperatur auf einen Wert über 37ºC erhöht wird, wird die Transkription dieses Gens induziert.
Die Fig. 24 zeigt die Wachstumskurven und die Induktion der Antithrombin-Aktivität in einer Kultur von E. coli pTG726, die bei 30ºC bis zu einer optischen Dichte von 0,3 bei 600 nm wachsen gelassen wurde und dann bei 37ºC induziert wurde.
Die Hirudinaktivität wird gemessen durch die Fähigkeit der ultraschallbehandelten Extrakte von Bakterienzellen, die Rinder-Thrombin-Aktivität in bezug auf seine Fähigkeit, chromogene Substrate zu Spalten, zu inhibieren.
Es ist klar, daß signifikante Mengen an Hirudin in den Kulturen von pTG726 induziert werden. Etwa 3 bis 4 000 Einheiten Antithrombin/DO/Liter Kultur, diese Aktivität nimmt jedoch mit der Zeit schnell ab. Dieser Effekt ist gut reproduzierbar mit einem Aktivitätsspitzenwert 3 Stunden nach der Induktion, woran sich eine Stufe der Abnahme anschließt.
Die Art dieser Induktionskurve ist sehr charakteristisch und reproduzierbar und unterscheidet sich signifikant von denjenigen, die weiter oben mit dem Expressionsvektor pTG720 festgestellt wurden, der durch Induktion die Hirudinvariante HV2 exprimiert. Diese Variante wird viel langsamer induziert (Fig. 25A) mit einer Latenzzeit von etwa 2 Stunden, die Aktivität steigt an, wobei sie praktisch den gleichen Wert wie diejenige von pTG726 erreicht (Fig. 25B), dann jedoch ohne jedes Anzeichen der Abnahme konstant bleibt. Da die beiden Hirudin-Varianten unter Verwendung genau des gleichen Expressionsvektors in genau der gleichen Wirtszelle E. coli TGE900 produziert wurden, muß diese Differenz in bezug auf die Induktion und die Stabilität mit Sicherheit in Zusammenhang stehen mit den Differenzen in bezug auf die Primärstrukturen zwischen HV1 und HV2. Dies kann außerdem eine Differenz in bezug auf die Beständigkeiten gegen die proteolytische Digestion zwischen den beiden Varianten reflektieren und es kann ein Hinweis auf die unterschiedliche biologische Aktivität oder eine unterschiedliche biologische Rolle für die beiden Varianten sein. Derartige Unterschiede in bezug auf die Stabilität und in bezug auf andere biologische Eigenschaften können gegebenenfalls bei der Verwendung dieser Hirudine ausgenutzt werden.
Die Differenz in bezug auf die Expression von HV1 und HV2 in E. coli kann auch durch "Impuls-Markierungs"-Analyse von Zellen von E. coli TGE900 festgestellt werden, die durch zwei unterschiedliche Expressionsvektoren transformiert worden sind. Da die beiden Hirudin-Varianten sehr reich an Cystein sind (etwa 10 % des Moleküls) und da diese Aminosäure ziemlich selten ist in den Proteinen von E. coli, ist das Cystein 35S sehr nützlich als radioaktiver Marker der Expression von Hirudin. Die Zellen von E. coli, die durch pTG726 transformiert worden sind, werden wachsen gelassen bis zu einer optischen Dichte von 0,3, bestimmt in LB + Ampicillin (100 µg/ml), dann induziert zum Exprimieren der Variante HV1 durch Erhöhung der Temperatur auf 37ºC.
In einem regelmäßigen Abstand von einer Stunde entnimmt man ein Aliquot von 200 ul aus der Kultur und man gibt 70 µCi Cystein 35S (spezifische Aktivität 1000 Ci/mMol) während einer Markierungszeitspanne von 2 min zu. Dann gibt man einen großen Überschuß, etwa 2 ml, eines kalten Kaliumphosphatpuffers zu, die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und die markierten Proteine der gesamten Zellen werden analysiert, indem man den Rückstand 5 min lang in 40 µl eines Puffers, dem ein SDS-Gel zugesetzt worden ist (50 mM Tris HCl, pH 6,8, 1,3 % SDS, 5 % Glycerin, 2,5 % β-Mercaptoethanol, 0,004 % Bromphenolblau) sieden läßt und man gibt 5 µl auf ein Gel aus 15 % SDS- Polyacrylamid (Laemli-Protokoll gemäß Literaturstelle 36). Nach der Elektrophorese wird das Gel einer Fluorographie unterworfen, woran sich eine Audioradiographie anschließt.
Die Ergebnisse zeigen die Induktion einer Reihe von Banden in dem Bereich von 6000 bis 12 000 Dalton entsprechend dem Hirudin. Diese Banden sind nur schwach markiert mit den Extrakten von E. coli/pTG726 (Variante HV1), während sie sehr stark markiert sind mit den Extrakten von E. coli/pTG720.
Dieser sehr deutliche Unterschied in der Physionomie der Markierung tritt auf trotz der Tatsache, daß die beiden Kulturen nahezu das gleiche Niveau der Antithrombin- Aktivität aufweisen.

Weitere Eigenschaften der HV1-Rekombinanten von Hirudin

Eine der Eigenschaften von natürlichem Hirudin und auch der mit E. coli hergestellten Variante HV2 ist ihre Beständigkeit gegenüber Wärmebehandlung unter ausreichend tiefen pH-Wertbedingungen. Dies gilt auch für die aus E. coli hergestellte Variante HV1. Eine 3 Stunden lang induzierte Kultur von Zellen von E. coli, die durch pTG726 transformiert worden waren, wird durch Zentrifugieren gesammelt, in 1/5 des Volumens der Kultur von TGE (50 mM Tris HCl, pH 8,0, 50 mM Glucose, 10 mM EDTA) wieder suspendiert und die Zellen werden durch Ultraschallbehandlung zerkleinert. Die Zellbruchstücke werden durch Zentrifugieren eliminiert und ein Teil der überstehenden Flüssigkeit wird direkt für die Bestimmung der Antithrombin- Aktivität verwendet.
Ein anderer Teil wird mit verdünnter HCl auf pH 2,8 eingestellt und dann 15 min lang auf 70ºC erwärmt. Das Ganze wird dann auf Eis 30 min lang abgekühlt und die denaturierten unlöslichen Proteine werden durch Zentrifugieren eliminiert. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Zugabe von verdünnter NaOH neutralisiert, dann wird die Antithrombin-Aktivität gemessen. Unter Berücksichtigung der kleinen Volumenänderungen durch das Ansäuern und das Neutralisieren kann man errechnen, daß 100 % der ursprünglichen Aktivität diese Säure/Wärme-Behandlung überlebt haben. Deshalb ist die Variante HV1 identisch mit natürlichem Hirudin und mit der Variante HV2.
Die Hirudin HV2-Aktivität kann auch vollständig aus einem Bakterienextrakt entnommen werden unter Verwendung von Thrombin, das covalent an Sepharose-Kugeln gebunden ist. Ein Extrakt von E. coli/pTG726, der mit Säure und Wärme behandelt und dann neutralisiert worden ist und 7,7 Einheiten Antithrombin-Aktivität in 200 µl enthält, wird mit 50 µl einer Sepharose-Suspension mit 50 % Thrombin 15 min lang bei 37ºC inkubiert. Die Thrombin-Sepharose-Kugeln werden durch Zentrifugieren entnommen und die überstehende Flüssigkeit wird auf ihre Antithrombin-Aktivität getestet. Mehr als 95 % der ursprünglichen Antithrombin-Aktivität werden durch diese Sepharose-Thrombin-Behandlung eliminiert. Infolgedessen ist die durch die Zellen von E. coli gebildete Variante HV1 in der Lage, sich mit dem Thrombin, das an Sepharosekugeln fixiert ist, zu ligieren.
Die folgenden Stämme wurden am 26. März 1985 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur-Roux - 75724 Paris Cedex 15, hinterlegt:
E. coli TGE900 transformiert durch pTG718 Nr. I-427
E. coli TGE900 transformiert durch pTG720 Nr. I-428
E. coli TGE900 transformiert durch pTG726 Nr. I-429.

LITERATURSTELLEN

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Claims

1. Hirudin, umfassend das gesamte oder einen Teil des Peptids:

sowie seine Variante:

1. IleTVal

2. ThrTVal.

2. Hirudin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es keine Glykolisierung oder Sulfatierung aufweist.

3. Clonierungs- und Expressions-Vektor in einer Wirtszelle, für Hirudin oder ein Analoges von Hirudin, dadurch gekennzeichnet, daß er das für Hirudin oder ein Analoges von Hirudin kodierende Gen umfaßt, wobei dieses kodierende Gen mit einer Sequenz beginnt, die nach der Ausgangssequenz für Ile und Thr kodiert.

4. Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er folgende Sequenz am Anfang des Gens für Hirudin umfaßt:

5. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er folgende Sequenz am Anfang des Gens für Hirudin umfaßt:

6. Vektor pTG720, hinterlegt im Stamm E. coli TGE900 bei CNCM unter der Nummer I-428.

7. Zelle, transformiert durch einen Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 6.

8. Zelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Bakterie handelt.

9. Zelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Stamm von E. coli handelt.

10. Verfahren zur Herstellung von Hirudin oder einem Analogen von Hirudin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 7 bis 9 kultiviert und daß man das gebildete Hirudin oder das Analoge von Hirudin gewinnt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Hirudin aus dem Kulturprodukt gewonnen wird durch Erwärmen bei saurem pH, gefolgt von einem Dekantieren, wobei das Hirudin oder sein Analoges aus der überstehenden Flüssigkeit gewonnen werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Hirudin durch Fixieren auf einem Thrombin tragenden Harz und anschließendes Eluieren des Harzes nach dem Fixieren mit einem mit Hirudin konkurrierenden Material gewonnen wird.

13. Hirudin oder Analoges von Hirudin, erhältlich durch Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 12.

14. Verwendung von Hirudin nach einem der Ansprüche 1 und 2 und 13, markiert, zur Herstellung eines diagnostischen Mittels für die Bildung von Blutklümpchen bei Mensch und Tier.

15. Extracorporaler Blutkreislauf, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil des mit dem Blut in Kontakt befindlichen Kreislaufs mit Hirudin gemäß einem der Ansprüche 1 und 2 und 13 ausgekleidet ist.

16. Verfahren zur Abtrennung eines Koagulationsfaktors von Blut oder einer Blutfraktion, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung in Anwesenheit von Hirudin gemäß einem der Ansprüche 1 und 2 und 13 durchgeführt wird.