DK174837B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af hirudin samt transformeret gær som kan anvendes ved fremgangsmåden - Google Patents

Description

i DK 174837 B1

Den foreliggende opfindelse angår gær transformeret med vektorer til ekspression af en DNA-sekvens, der koder for hirudin eller hirudinanaloge, samt en fremgangsmåde til fremstilling af hirudin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 16's kendetegnende del angivne.

5

Den antikoagulerende virkning, som findes i spytkirtlerne hos lægeigler, Hirudo medicinalis, stammer fra et lille polypeptid, som kaldes hirudin (l). Denne meget specifikke og meget effektive inhibitor af thrombin er i den senere tid blevet studeret indgående, da den potentielt udgør et meget interessant terapeutisk middel. De betragtelige vanskeligheder 10 og omkostninger, der er forbundet med at isolere og oprense inhibitoren, har imidlertid forhindret, at den er bfevet anvendt i større udstrækning, og at den kan undersøges på klinisk niveau.

Muligheden for at producere hirudin ved kloning af gener og ekspression af generne ved 15 rekombinant DNA-teknik er blevet påvist ved kloning af et naturligt igle-gen, der koder for hirudin, og ved ekspression af genet i mikroorganismen E. coli {fransk patentansøgning nr.

84 04755 i navnet Transgéne S.A., indleveret den 27. marts 1984). Skønt det har været muligt at fremstille et peptid med biologisk aktivitet i E. coli, er det meget vigtigt at fremstille hirudin i andre typer mikroorganismer. Klinisk anvendelse af hirudin kræver nemlig 20 en meget stor grad af produktets renhed, og eliminering af pyrogene kontaminanter kunne volde problemer ved oprensning af hirudin ud fra ekstrakter af colibakterien.

Desuden forbliver hirudin, der er syntetiseret af E. coli, intracellulært og skal således oprenses fra et meget stort antal peptider fra E. coli. Det er derfor interessant at lade 25 hirudin-genet udtrykkes i gær, som ikke danner stoffer, som er pyrogene eller toxiske for mennesker, og som er i stand til at secernere proteiner i dyrkningsmediet.

Hirudins virkningsmekanisme som antikoagulans er først for nylig blevet erkendt. Substratet for fiksering af hirudin er thrombin, som er et proteolytisk enzym, der ved aktive-30 ring (med den aktiverede faktor X) ud fra sin zymogenform, prothrombin, spalter fibrino* genet i kredsløbet og omdanner det til fibrin, som er nødvendigt til dannelse af koagel.

Dissocieringskonstanten for complexet thrombin/hirudin 1:1 (0,8 x 10-10) tyder på en meget stærk binding mellem disse molekyler (2). I praksis kan det ikke-covalente complex mellem disse to molekyler betragtes som ikke-dissocierbart in vivo.

35

Hirudin er en meget specifik inhibitor af thrombin med en meget større affinitet end det naturlige substrat, fibrinogen. Desuden er det ikke nødvendigt at have andre koagulationsfaktorer eller andre plasmabestanddele. Hirudins specifikke og meget store antithrom-bin-aktivitet forklarer dets kliniske anvendelighed som antikoagulans.

40

Hirudin er blevet undersøgt meget grundigt i dyr for sine antikoagulationsegenskaber. Den mest detaljerede undersøgelse (3) beskriver hirudins aktivitet ved forebyggelse af ve-nethromboser, vasculære okklusioner og disseminerede intravasculære koagulationer (DIC) hos rotter. Hirudin tåles godt af rotter, hunde, kaniner og mus, når det foreligger i 2 DK 174837 B1 meget oprenset form og injiceres intravenøst. LD50 i mus er over 500.000 U/kg legemsvægt (dvs. 60 mg/kg). En anden undersøgelse (4) viser, at mus tåler doser op til 1 g/kg, og at kaniner tåler op til 10 mg/kg både intravenøst og subkutant. Hos mus fører gentagne injektioner i løbet af et tidsrum på 2 uger ikke til sensibiliseringsreaktioner.

5

Desuden elimineres hirudin hurtigt i forsøgsdyr (halveringstid i størrelsesordenen 1 time) også i biologisk aktiv form via nyrerne (3).

To andre uafhængige undersøgelser, én, der anvender hunde (5), og en anden (6), der 10 påviser hirudins virkning ved forebyggelse af DIC hos rotter, stemmer godt overens med Markwardt et al.'s positive resultater. Disse forskere har for nylig udgivet den første in vivo-analyse af naturligt hirudins virkninger pi menneskers hæmostatiske system (7).

Materialet viser de opnåede biologiske virkninger og indikerer ikke toxiske bivirkninger.

15 Det har også kunnet påvises, at hirudin forebygger DIC induceret af endotoxiner i svin (8) og således udgør en mulig løsning på de meget alvorlige problemer, der skyldes endotoxi-næmier, hvilket fører til en meget høj dødelighed hos svin.

En nylig udkommet publikation (9) beskriver intravenøs og subkutan administration af 20 hirudin til mennesker. Seks frivillige forsøgspersoner blev anvendt til at vurdere farmako-kinetikken og virkningerne på det hæmostatiske system af en enhedsdosis (1000 antithrombin-enheder/kg) hirudin. Hirudin administreret intravenøst har en halveringstid på 50 minutter, og 50% af hirudinet findes i aktiv form i urinen i 24 timer efter injektionen. Der ses en forlængelse af koagulationstiden (målt in vitro for thrombin, thrombo-25 plastin og prothrombin) som en funktion af hirudinkoncentrationen i plasmaet, hvilket viser, at molekylet bevarer sin biologiske aktivitet i personens kredsløb. Der ses ingen ændring i antallet af blodplader, i mængden af fibrinogen eller i det fibrinolytiske system. Subkutane og intravenøse injektioner af hirudin tåles godt og giver ingen bivirkninger. Til undersøgelse af eventuel forekomst af allergiske reaktioner blev 2 intrakutane injektioner 30 administreret til de samme personer med 4 ugers interval; der sås ingen tegn på sensibilisering. Desuden detekteres ingen anti-hirudin-antistoffer i serummet.

Disse undersøgelser tyder på, at hirudin kan være et interessant klinisk middel som anti-koagulans. Præfasen af blodkoagulationen påvirkes ikke under hensyntagen til hirudins 35 høje virkningsspecificitet. Anti-thrombin-aktiviteten er afhængig af dosen, og hirudinets virkning er hurtigt reversibel som følge af dets hurtige eliminering i nyrerne. Det har kunnet påvises, at hirudin er meget bedre end heparin til behandling af DIC (3, 6), hvilket kunne forventes under hensyntagen til, at DIC ledsages af et fald i antithrombin III (en cofaktor, der er nødvendig for heparins virkning) og en forøgelse af blodpladefaktor 4, der 40 er et meget effektivt antiheparinmiddel.

En undersøgelse har påvist den mulighed, at hirudin kan absorberes af menneskehud (10), selv om de opnåede resultater er noget vanskelige at fortolke.

3 DK 174837 B1

Præparater af acellulære riekstrakter fra igler findes i handelen som salver (Hirucréme,

Société Nicholas, Frankrig; Exhirud-Blutgel, Plantorgan Werke, Vesttyskland), men der kræves yderligere tests med større doser af et højoprenset materiale for at fastslå, om dette er en interessant administrationsvej. De foretrukne administrationsveje er generelt 5 intravenøst, intramuskulaert og perkutant. Andre administrationsveje er beskrevet for hirudin, især den orale vej (BSM nr. 3792 M).

Dette produkt kan ligeledes i kombination med andre bestanddele anvendes til behandling af psoriasis og andre hudsygdomme af samme type, hvilket er beskrevet i DE-OS 2 101 10 393.

Hirudin kan desuden anvendes som antikoagulans i kliniske forsøg i laboratorier og som forskningsværktøj. I dette tilfælde kan den høje specificitet over for et unikt trin i blodkoagulationen frembyde en betydelig fordel i forhold til de mest almindeligt anvendte antikoa-15 gulanser, hvis virkning er meget mindre specifik.

Desuden kan hirudin være meget nyttigt som antikoagulerende middel i kredsløb uden for kroppen og i dialysesystemer, hvor det kan have betydelige fordele i forhold til andre anti-koagulanser, især hvis det kan immobtliseres i aktiv form på overfladen af disse kunstige 20 kredsløbssystemer.

Hirudins fikseringsaktivitet på thrombin kan også muliggøre indirekte beskyttelse af koagulationsfaktorer såsom faktor VIII under oprensningen deraf.

25 Endelig kan anvendelsen af mærket hirudin udgøre en enkel og effektiv metode til måling af mængderne af thrombin og prothrombin. Mærket hirudin kan specielt anvendes til at visualisere blodpropper under dannelse, da koagulationsfænomenet medfører omdannelse af cirkulerende prothrombin til thrombin ved dannelsesstedet, og det mærkede hirudin fik-seres til thrombinet og kan visualiseres.

30

Det er endvidere muligt at forestille sig direkte anvendelse af transformeret gær som lægemiddel, der afgiver hirudin, fx ved på huden at smøre en creme indeholdende denne gær, der secernerer hirudin.

35 Kort fortalt har hirudin en lang række mulige anvendelsesområder: 1) som antikoagulans ved kritiske thrombotiske lidelser til profylakse og forebyggelse af udbredelse af allerede eksisterende thromboser, 2) som antikoagulans til reduktion af blodansamlinger og hævelser efter mikrokirurgi, idet 40 der i vid udstrækning anvendes levende igler, 3) som antikoagulans i kredsløbssystemer uden for kroppen og som antikoagulationsmid-del til at dække syntetiske biomaterialer, 4) som antikoagulans i kliniske tests af blodprøver ved laboratorieforsøg, 5) som antikoagulans ved klinisk forskning angående koagulation og som forsøgsværktøj, 4 DK 174837 B1 6) som et muligt topisk middel til kutan påføring ved behandling af hæmorrhoider, åreknuder og ødemer, 7) som bestanddel ved behandling af psoriasis og andre beslægtede lidelser, og 8) endelig kan hirudin anvendes til at fiksere thrombin ved opbevaring af blod og fremstil-5 ling af blodderivater (blodplader, faktor VIII og IX).

Som et eksempel kan hirudin anvendes i terapeutiske præparater i koncentrationer svarende til 100-50.000 antithrombin-enheder/kg/dag.

10 Da hirudin er vandopløseligt, er det let at opnå farmaceutiske præparater, der er injicer-bare eller kan påføres ad andre veje under anvendelse af farmaceutisk acceptable grundlag og bærere.

Det er endelig muligt at anvende mærket hirudin enten ved en radioaktiv mærkning eller 15 ved en helt anden type enzymatisk eller fluorescerende mærkning, der er udført ved kendte teknikker, for at foretage dosering in vitro eller visualisering in vivo, især til visualisering af dannelsen af blodpropper.

Et hirudinpræparat på basis af hele dyret blev anvendt til bestemmelse af proteinets ami-20 nosyresekvens (11, 12). I følgende forsøg blev der klonet et gen, der udtrykkes som mes-senger-RNA i hoveder på fastende igler. Dette gen bærer information for et protein (hirudin variant 2 eller HV-2), hvis sekvens på afgørende måde er forskellig fra den sekvens, der findes i hele dyrets krop (proteinvariant med betegnelsen HV-1). Der er 9 forskelle i aminosyrerester mellem HV-1 og HV-2, og forskellene mellem de to NH2-terminale 25 rester (val-val eller ile-thr) kan forklare de åbenlyse modsætninger i litteraturen med hensyn til hirudins NH2-terminal (13).

Fig. 1 viser de DNA-sekvenser i det rekombinante plasmid pTG717, som indeholderen kopi af cDNA svarende til mRNA fra HV-2 samt en aminosyresekvens afledt af DNA-sekvensen 30 ved b) og forskellene mellem denne sekvens og HV-l's aminosyresekvens ved c).

Det skal bemærkes, at sekvensen af cDNA sandsynligvis ikke er komplet, og at der kan forekomme en signalsekvens oven for begyndelsen af det modne protein.

35 Ekspressionen af cDNA fra HV-2 i mikroorganismer viser, at det tilsvarende protein har antithrombin-aktivitet.

Skønt følgende forsøg blev udført med varianten HV-2, betegnes i det følgende begge varianter, dvs. HV-i eller HV-2, og eventuelt andre varianter samt tilsvarende sekvenser 40 "hirudin" og "gen, der koder for hirudin", medmindre andet er angivet.

Et af formålene med den foreliggende opfindelse er produktion af hirudin ved hjælp af gær.

5 DK 174837 B1 Gær er éncellede eukaryote organismer. Gærslægten Saccharomyces omfatter stammer, hvis biokemi og genetik er blevet studeret indgående i laboratorier; den omfatter desuden stammer, der anvendes i levnedsmiddelindustrien (brød, alkoholiske drikke, etc.), og som således produceres i meget store mængder.

5

Den lethed, hvormed man kan manipulere med genetikken i celler fra Saccharomyces ce-revisiae, enten ved klassiske teknikker eller ved teknikker afledt af de genetiske metoder og endnu bedre ved en kombination af disse to typer teknik, og denne arts lange industrielle historie gør den til en foretrukken vært ved produktion af fremmede polypeptider.

10 EP-A-123 294 beskriver vektorer til transformation af gær, som sikrer sekretion af hybride precursor peptider og tillader oprensning af det ønskede polypeptid.

EP-A-116 201 beskriver gærvektorer som indeholder ledersekvensen fra faktor alpha.

15 EP-A-129 073 beskriver udtrykkeisen af GRF i gær især under anvendelse af elementer fra genet for faktor alpha.

EP-A-123 544 beskriver sekretion af proteiner under anvendelse af elementer som 20 stammer fra genet for faktor alpha.

Den foreliggende opfindelse angår derfor mere specifikt en gær transformeret med en funktionel DNA-blok integreret i et plasmid indeholdende et gær replikationsinitieringssted ("origin of replication"), eller integreret i et kromosom i gæren, hvilken blok i det mindste 25 indeholder: en DNA-sekvens som koder for hirudin (H-gen), mindst et spaltningssted (SC|j som ligger umiddelbart opstrøms fra H-genet, en leder-sekvens (Lex) indeholdende nødvendige elementer for at opnå sekretion 30 af genproduktet, en DNA-sekvens (Str) indeholdende signaler, der sikrer transkription af H-genet ved hjælp af gær.

35

Denne funktionelle blok, der er integreret i et plasmid eller i kromosomerne pi en gær, fortrinsvis af slægten Saccharomyces, kan efter transformation af gæren gøre det muligt at udtrykke hirudin, enten i aktiv form eller i form af en inaktiv precursor, der ved aktivering kan regenerere hirudin.

Det interessante ved Saccharomyces cerevisiae er, at denne gær er i stand til at secernere nogle proteiner i dyrkningsmediet; undersøgelsen af de mekanismer, der er ansvarlige for denne sekretion, er i fuld gang, og det er påvist, at det efter relevante manipulationer var 40 6 DK 174837 B1 muligt at få gær til at secernere humane hormoner, der var korrekt dannede og på alle punkter lignede de hormoner, som findes i humant serum (14, 15).

Inden for den foreliggende opfindelses rammer udnyttes denne egenskab til at opnå se-5 kretion af hirudin, idet dette giver mange fordele.

Først og fremmest secernerer gær få proteiner, hvilket har den fordel, hvis det lykkes at styre sekretionen af et givet fremmed protein i højt niveau, at der i dyrkningsmediet kan opnås et produkt, der kan udgøre en stor procentdel af det samlede antal secernerede 10 proteiner, hvilket således letter arbejdet med oprensning af det ønskede protein.

Der findes flere proteiner eller polypeptider, der secerneres af gær. I alle de kendte tilfælde syntetiseres disse proteiner i form af en længere precursor, hvis IMF^-terminaie sekvens er afgørende for dens indtræden i den metaboliske vej, der fører til sekretion.

15

Syntese i gær af hybride proteiner, der indeholder den NF^-terminale sekvens for én af disse precursorer efterfulgt af sekvensen for det fremmede protein, kan i visse tilfælde føre til sekretion af dette fremmede protein. Det forhold, at dette protein syntetiseres i form af en precursor, som almindeligvis er inaktiv, gør det muligt at beskytte cellen mod det øn-20 skede molekyles eventuelle toxiske virkninger, idet den spaltning, der frigør det aktive protein, kun forekommer i de vesikler, der stammer fra Golgi-legemet, og som isolerer proteinet fra cytoplasmaet.

Anvendelse af de metaboliske veje, der fører til sekretion, til at få gæren til at producere 25 et fremmed protein har således en række fordele: 1) det er muligt at isolere et rimeligt rent produkt i supernatanten fra kulturen, 2) det er muligt at beskytte cellen mod det modne proteins mulige toxiske virkninger, 3) på den anden side kan de secernerede proteiner i visse tilfælde undergå modifikationer 30 (glycosylering, sulfatering, etc.).

Ekspressionsblokkene som er indeholdt i gæren ifølge opfindelsen har således mere specifikt følgende struktur: 35 - S(r - LgX - Sc) - H-gen hvor LgX koder for en leder-sekvens, der er nødvendig for sekretionen af et protein svarende til H-genet; SC| er en DNA-sekvens, der koder for et spaltningssted; segmentet Sc| - H-gen kan desuden være gentaget flere gange.

Som eksempel på sekretionssystemet er valgt α-pheromonet, dvs. at i ovenstående sekvens stammer sekvensen Lex fra genet for α-kønspheromonet fra gær, men andre systemer vil kunne anvendes (fx systemet fra Killer-proteinet) (14).

40 7 DK 174837 B1 α-Kønspheromonet fra gær er et peptid på 13 aminosyrer (indrammet i fig. 2), som secerneres i dyrkningsmediet af gæren S. ærevisiae med kønstypen Mata. a-Faktoren standser cellerne med den modsatte kønstype (Mata) i fase GI og inducerer biokemiske og 5 morfologiske ændringer, der er nødvendige for parringen af de to typer celler. Kurjan og Herskowitz (17) har klonet strukturgenet for α-faktoren og har ud fra sekvensen af dette gen sluttet, at α-faktoren på 13 aminosyrer blev syntetiseret i form af et præ-pro-precursorprotein på 165 aminosyrer (fig. 2). Precursoren indeholder en aminoterminal hydrofob sekvens på 22 rester (understreget med stiplet linje) fulgt af en sekvens på 61 10 aminosyrer indeholdende 3 glycosylenngssteder og endelig fulgt af 4 kopier af a-faktoren.

De 4 kopier er adskilt af "spacer"-sekvenser, og det modne protein frigøres fra precursoren ved følgende enzymatiske aktiviteter: 1) en endopeptidase af typen cathepsin B, som spalter dipeptiderne Lys-Arg til COOH 15 (spaltningssted vist med en fed pil), 2) en exopeptidase af typen carboxypeptidase B, som spalter baseresterne tii COOH i de udskårne peptider, 3) en dipeptidyl-aminopeptidase (betegnet A), som fjerner resterne Glu-Ala og Asp-Ala.

20 Denne precursors nukleotidsekvens omfatter desuden 4 Hindlll-restriktionssteder vist med en pil H.

Der er udført flere fusioner mellem genet for α-pheromonet og den modne hirudin-se-kvens. Gærceller af typen Mata kan udtrykke disse fusionerede gener. De tilsvarende 25 hybride proteiner kan derpå oparbejdes ved hjælp af de signaler, som de indeholder, og som stammer fra præ-pro-sekvenserne fra precursoren for α-pheromonet. Man kan derfor forvente, at man i supernatanten fra kulturen kan isolere polypeptider med sekvensen for hirudin.

30 1 én af konstruktionerne omfatter sekvensen Sc| ved 3'-enden en ATG-kodon før H-genet; det fusionerede protein indeholder således methionin umiddelbart oven for den første aminosyre af den modne hirudin-sekvens. Efter spaltning med cyanogenbromid frembringer dette polypeptid et hirudinmolekyie, som kan gøres aktivt efter et renatureringstrin.

35 I andre konstruktioner tjener de spaltningssignaler, der normait anvendes til at producere α-pheromonet, til i supernatanten fra kulturen at producere polypeptider med antithrombin-aktivitet. Dette er tilfældet, når sekvensen Sc| ved sin 3'-ende omfatter to kodoner, som koder for Lys-Arg, dvs. AAA eller AAG med AGA eller AGG; polypeptidet spaltes af en endopeptidase, som spalter dipeptiderne Lys-Arg til COOH, hvilket således 40 frigiver hirudin.

Opfindelsen angår især konstruktioner, i hvilke sekvensen før hirudin-genet koder for én af følgende aminosyresekvenser: 8 DK 174837 B1 1) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gin Val Asp Gly Ser Met hirudin ..., 2) Lys Arg Glu Ala Glu Ala hirudin 3) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg hirudin ..., 4) Lys Arg Glu Ala Glu Ser Leu Asp Tyr Lys Arg hirudin ... eller 5 5) Lys Arg hirudin ....

Det er naturligvis muligt at anvende andre sekvenser, som på aminosyreniveau spaltes selektivt af et enzym, med det forbehold, at dette spaltningssted ikke også findes i selve hirudinet.

10

Ekspressionsblokkene kan endelig efter H-genet have en terminatorsekvens fra gær, fx fra PGK-genet.

Ekspressionsblokkene ifølge opfindelsen kan generelt indsættes i en gær, især Saccha-15 romyces, enten i et plasmid med autonom replikation eller i gærens kromosom.

Når plasmidet er autonomt, omfatter det segmenter, der sørger for dets replikation, dvs. et replikationsinitieringssted såsom initieringsstedet fra plasmidet 2μ. Desuden kan plasmidet omfatte selektionssegmenter såsom genet URA3 eller LEU2, som sørger for kom- 20 plementering af gærstammerne ura3‘ eller Ieu2\ Disse plasmider kan desuden omfatte segmenter, der sørger for deres replikation i bakterier, når plasmidet skal være et shuttle-plasmid, fx et replikationsinitieringssted såsom stedet fra pBR322, et markørgen såsom Ampr og/eller andre segmenter, der er kendte for fagfolk.

25 Den foreliggende opfindelse angår ligeledes gærstammer transformeret med en ekspressionsblok ifølge opfindelsen, enten båret på et plasmid eller integreret i dets kromosomer.

Blandt disse gærer kan der især nævnes gær af slægten Saccharomyces, specielt S. cere-visiae.

30 Nar promotoren er promotoren fra genet for α-pheromonet, har gæren fortrinsvis kønstypen Mata. Der kan fx anvendes en stamme med genotypen ura3* eller Ieu2" eller en anden, komplementeret af plasmidet for at sikre bevaring af plasmidet i gæren ved et passende selektionstryk.

35 Selv om det er muligt at fremstille hirudin ved fermentation af ovennævnte transformerede stammer i et tilpasset dyrkningsmedium ved akkumulation af hirudin i cellerne, foretrækkes det ikke desto mindre, hvilket fremgår af ovenstående beskrivelse, at lade hirudin secernere i mediet, enten i moden form eller i form af en precursor, som skal oparbejdes in vitro.

Denne modning kan ske i flere trin. Først kan det være nødvendigt at afspalte visse segmenter, der stammer fra translationen af sekvensen Lex; denne spaltning foretages på niveau med den sekvens, der svarer til SC|. Som anført ovenfor kan der før det modne 40 9 DK 174837 B1 hirudin være en methioninrest, som spaltes selektivt med cyanogenbromid. Denne proces kan anvendes, fordi den sekvens, der koder for hirudin, ikke omfatter methionin.

Det er også muligt ved N-enden at tilvejebringe dipeptidet Lys-Arg, som spaltes til COOH 5 af en specifik endopeptidase; da dette enzym er aktivt i sekretionsprocessen, kan det modne protein således opnås direkte i mediet. I visse tilfælde kan det dog være nødvendigt at foretage en enzymatisk spaltning efter sekretionen ved at tilsætte et specifikt enzym.

10 I visse tilfælde, specielt efter en behandling med cyanogenbromid, kan det være nødvendigt at renaturere proteinet ved at genskabe disulfid-broerne. Til dette formål denatureres peptidet, fx med guanidinium-chlorhydrat, og renatureres derefter i nærværelse af reduceret og oxideret glutathion.

15 Andre karakteristika og fordele ved den foreliggende opfindelse fremgår af nedenstående eksempler og af tegningen, hvor fig. 1 viser nukleotidsekvensen af hirudin-cDNA-fragmentet klonet i pTG717, fig. 2 viser nukleotidsekvensen af precursoren for a-kønspheromonet, 20 fig. 3 viser konstruktionen af pTG834, fig. 4 viser konstruktionen af pTG880, fig. 5 viser konstruktionen af pTG882, fig. 6 viser konstruktionen af M13TG882, fig. 7 viser konstruktionen af pTG874, 25 fig. 8 viser konstruktionen af pTG876, fig. 9 viser konstruktionen af pGT881, fig. 10 viser konstruktionen af pTG886, fig. 11 viser konstruktionen af pTG897, fig. 12 viser elektroforese på acrylamidgel af proteiner med en molekylvægt på > 1000 30 vundet i mediet efter dyrkning af gær transformeret med pTG886 og pTG897, fig. 13 viser elektroforese på acrylamidgel af proteiner med en molekylvægt på > 1000 vundet i mediet efter dyrkning af gær transformeret med pTG886 og pTG897, fig. 14 viser konstruktionen af pTGl805, fig. 15 viser elektroforese på acrylamidgel af proteiner med en molekylvægt på > 1000 35 vundet i mediet efter dyrkning af gær transformeret med pTG847 og pTG1805, og fig. 16 viser et skema, der sammenligner aminosyresekvenserne neden for det første spaltningssted (Lys-Arg) i forskellige konstruktioner.

Aminosyre- og nukleotidsekvenserne er ikke vist i den foreliggende beskrivelse for ikke at 40 gøre den for tung.

10 DK 174837 B1 EKSEMPEL 1

Konstruktion af pTG882 5

Et cDNA-fragment fra hirudin HV-2 blev ekstraheret fra en gel efter spaltning af plasmidet pTG7l7 med PstI og blev derefter spaltet med enzymerne Hinfl og Ahalll. Enzymet Hinfl spalter neden for den første kodon af den modne sekvens for hirudin HV-2. Enzymet Ahalll spalter ca. 30 basepar efter (3’) stopkodonen af hirudin-sekvensen. Det således 10 vundne HinfI*AhallI-fragment blev isoleret på agarosegel og blev derefter elueret fra denne gel.

Den sekvens, der koder for det modne protein, blev indsat i vektoren pTG880. Vektoren pTG880 er et derivat af vektoren pTG838 (fig. 3). Plasmidet pTG838 er identisk med 15 pTG833 bortset fra Bglll-stedet, der findes nær ved transkriptionsterminatoren fra PGK.

Dette sted blev fjernet ved udfyldning med Klenow-polymerase, hvilket gav pTG838.

Plasmidet pTG833 er et gær/E. coli shuttle-plasmid. Dette plasmid blev fremstillet for at udtrykke fremmede gener i gær. De grundlæggende segmenter i denne vektor (fig. 3) er 20 følgende: genet URA3 som selektionsmarkør i gær, replikationsinitieringsstedet fra gær-plasmidet 2μ, genet for ampicillinresistens og replikationsinitieringsstedet fra plasmidet pBR322 fra E. coli (disse to sidstnævnte segmenter muliggør replikation og selektion af dette plasmid i colibakterien), det flankerende område ved 5’ i PGK-gærgenet med den sekvens, der koder for dette gen, op til Sall-stedet, Sall-PvuII-fragmentet fra pBR322 og 25 terminatoren fra PGK-genet (20). Dette plasmid er beskrevet i fransk patentansøgning nr.

84 07125 i navnet Transgéne S.A., indleveret den 9. maj 1984.

Plasmidet pTG880 blev konstrueret ud fra pTG838 (fig. 4) ved indsætning af et kort poly-linker-område (stammende fra bakteriofagen M13) i pTG838 spaltet med EcoRI og Bglll, 30 hvilket gør det muligt at anbringe en række kloningssteder i rækkefølge: Bglll, PstI, Hin-dlll, BamHI, Smal og EcoRI, umiddelbart efter 5'-området, der flankerer PGK-gærgenet.

DNA fra plasmidet pTG880 blev spaltet med Bglll og Smal, og det store fragment, der blev vundet ved denne spaltning, blev isoleret og udvalgt fra en gel. Hinfl/AhaNI-fragmentet fra pTG717, som indeholder størstedelen af den sekvens, der koder for hirudin HV-2, blev 35 blandet med pTG880, der blev spaltet på samme tid som 3 syntetiske oligonukleotider (fig.

5), der var beregnet til at rekonstituere det NH2*terminale område fra hirudin-sekvensen, og som forbinder Bglll-stedet i vektoren med Hinfl-stedet i det fragment, der indeholder hirudinet. Denne blanding blev underkastet ligationsbehandling og tjente derefter til transformation af E. coli-celler. Plasmidet pTG882 blev isoleret fra transformanterne.

40

Dette plasmid blev anvendt til at transformere gærceller for at producere hirudin under kontrol af PGK-promotoren. Der kunne imidlertid ikke påvises nogen hirudin-aktivitet i råekstrakterne fra celler transformeret med denne vektor. Grunden til fraværelsen af produktion af aktivt hirudin er endnu ikke klarlagt. Konstruktionen pTG882 tjente imidlertid 11 DK 174837 B1 som kilde til en sekvens, der koder for hirudin, for de nedenfor beskrevne vektorer til sekretion af gær.

5 EKSEMPEL 2

Konstruktion af pTG886 og pTG897 Først blev Bglll-EcoRI-fragmentet (230 bp) fra pTG882 indeholdende hirudin-sekvensen 10 overført til bakteriofagen Ml3mp8 (fig. 6) mellem BamHI- og EcoRI-stederne. Dette gav fagen M13TG882, ud fra hvilken der kunne isoleres et EcoRi-Hindlll-fragment (ca. 245 bp). Dette fragment indeholder hele den sekvens, der koder for hirudin HV-2, fusionsstedet BamHI/Bglll og hæfteenderne (Hindlll-EcoRI), der muliggør kloning i gærsekretionsvektoren pTG881 (fig. 9).

15

Plasmidet pTG881 (10 kb) er et E. coli/gær shuttle-plasmid, der replikerer autonomt både i E. coli og i gærstammerne Saccharomyces cerevisiae, uvarum og carlsbergensis.

Indsætning af dette plasmid i E. coli gør det mufigt at opnå resistens over for ampicillin (og 20 andre antibiotika af beta-lactam-typen). Desuden bærer plasmidet gærgenerne LEU2 og URA3, der udtrykkes i stammer af E. coli og af Saccharomyces. Tilstedeværelsen af dette plasmid i E. coli eller i Saccharomyces gør det således muligt at opnå komplementering af stammer, der mangler beta-isopropylmalat-dehydrogenase eller OMP-decarboxylase.

25 Plasmidet pTG881 konstrueres på følgende måde:

Udgangsplasmidet er pTG848 (identisk med pTG849 beskrevet i fransk patent nr. 83 15716 med undtagelse af URA3-genet, hvis orientering er omvendt), og det udgøres af følgende DNA-fra g menter (fig. 7): 30 1) EcoRI-Hindlll-fragmentet på ca. 3,3 kb, der stammer fra plasmidet pJDB207 (18). Hin-dlll-stedet svarer til koordinaten 1505 i plasmidet 2p, B-form, og EcoRI-stedet til koordinat 2243. I dette fragment findes LEU2-genet indsat ved polydeoxyadenilat/poly-deoxy-thymidilat-forlængelse i Pstl-stedet pi fragmentet fra 2p, B-form (18).

35 2) Hindlll-fragmentet fra URA3-genet (19).

3) Det store EcoRI-(koordinat 0)-SalI-(koordinat 650)-fragment fra pBR322. I PvuII-stedet i dette fragment blev 510 bp EcoRI-Hindlll-fragmentet indsat (hvis ender i forvejen var 40 gjort stumpe ved hjælp af Klenow i nærværelse af de 4 nukleotider) svarende til enden af PGK-genet (20). EcoRl-enden, der er afskåret fra PGK-genet, regenererer et EcoRI-sted, når den forbindes til Pvull-enden af pBR322.

4) Hindlll-Sall-fragmentet (2,15 kb) fra PGK-genet (20).

12 DK 174837 B1

Plasmidet pTG848 blev spaltet med Hindlll, og enderne fra de to således frigjorte fragmenter gøres stumpe ved behandling med Klenow i nærværelse af de 4 deoxyribonukleoti-der. De to fragmenter ligeres, og før transformation underkastes denne ligationsblanding 5 behandling med Hindlll, hvilket gør det muligt at eliminere enhver form for plasmid, der har bevaret ét (eller to) HindHI-steder. Stammen E. coli BJ5183 (pyrF) transformeres, og transformanterne selekteres for ampicillinresistens og for pyr+-karakter. Herved fås plasmidet pTG874 (fig. 7), hvor de to Hindlll-steder er fjernet, og orienteringen af URA3-ge-net giver anledning til transkription i samme orientering som orienteringen af genet for 10 phosphoglycerat-kinase (PGK).

Plasmidet pTG874 spaltes med Smal og Sall, og et fragment på 8,6 kb isoleres derefter fra en agarosegel. Plasmidet pGT864, som omfatter EcoRI-Sall-fragmentet (ca. 1,4 kb) fra genet MFal klonet i samme pBR322-steder, spaltes med EcoRI. Enderne på det således 15 lineariserede plasmid gøres stumpe ved hjælp af Klenow i nærværelse af de 4 nukleotider.

Der udføres derefter spaltning med enzymet Sall, og EcoRI (stump ende)-SalI-fragmentet svarende til genet MFal isoleres. Dette fragment ligeres med Smal-Sall-fragmentet (8,6 kb) fra pTG874, hvilket giver plasmidet pTG876 (fig. 8).

20 Til fjernelse af Bglll-stedet tæt ved sekvensen af MFal-promotoren blev en delvis spaltning med Bglll af plasmidet pTG876 fulgt af behandling med Klenow i nærværelse af de 4 deoxyribonukleotider. Det vundne nye plasmid, pTG881 (fig. 9), gør det muligt at indsætte fremmede kodende sekvenser mellem det første Hindll-sted i MFal-genet og Bglll-stedet ved enden af PGK-genet.

25

Nar fusionen ved HindNI-stedet af det fremmede kodende DNA gør det muligt at opnå translation i samme læseramme, omfatter det vundne hybride protein præ-pro-delene af a-pheromonet.

30 Kloning i pTG881 af Hindlll-EcoRl-fragmentet, som bærer genet for hirudin, fører til plasmidet pTG886 (fig. 10). Efter at kloningen er udført, findes der et Bglll-sted neden for fragmentet, hvilket gør det muligt at udtage fragmentet i form af Hinfl-BgIII, idet Hinfl-stedet er det samme som det, der blev anvendt ovenfor. Da Bglll er unikt i pTG881, er det meget enkelt at rekonstituere 5'-enden af den sekvens, der koder for hirudin, under an-35 vendelse af 3 oligonukleotider, der rekonstituerer 5'-sekvensen af hirudin og gør det muligt i fase at læse præ-pro-sekvensen af α-pheromonet efterfulgt af den modne hirudin-sekvens.

Dette nye plasmid betegnes pTG897 (fig. 11).

40 EKSEMPEL 3

Ekspression af hirudin i gær 13 DK 174837 B1 DNA fra pTG897 blev anvendt til transformation af en gær TGYlsp4 {Mata, ura3 - 251 -373 - 328, his3 - 11-15) til ura+ ifølge en allerede beskrevet teknik (21).

5 En transformeret koloni blev udpladet og anvendt til podning af 10 mt minimalmedium plus casaminosyrer (0,5%). Efter 20 timers dyrkning blev cellerne centrifugeret, og superna-tanten blev dialyseret mod destilleret vand og koncentreret ved inddampning (centrifugering i vakuum).

10 En kultur af TGYlsp4 transformeret med PTG886 og en kultur af TGYlsp4 transformeret med et plasmid, der ikke bar en hirudin-sekvens (TGYlsp4 pTG856), blev parallelt behandlet på samme måde. Det tørre bundfald blev hældt i 50 pi vand, og 20 μΙ blev kogt i nærværelse af 2,8% SDS og 100 mM mercaptoethanol og blev derefter anbragt på en acrylamid-SDS-gel (15% acrylamid, 0,1% SDS) (22). Efter fiksering og farvning med 15 Coomassie-blåt kan der påvises polypeptider, som akkumuleres i supernatanterne fra kulturerne af TGYlsp4/pTG886 og TGYlsp4/pTG897, og som ikke er til stede i supernatanten fra kontrolkulturen (fig. 12). Desuden mærkes disse serier af supplerende peptider kraftigt med -^S-cystein, hvilket kunne forventes for hirudin-peptider, idet dette molekyle er meget rigt på cystein (fig. 10).

20

De i fig. 12 og 13 viste elektroforeser blev udført som følger:

Ti! fig. 12 blev ekstrakterne fremstillet på følgende måde: 10 ml minimalmedium (Yeast Nitrogen Base Difco uden aminosyre (6,7 g/l), 10 g/l glucose beriget med 0,5% casamino-25 syrer blev podet med forskellige stammer og dyrket i 20 timer (stationær fase). Cellerne blev centrifugeret, og supernatanten blev dialyseret mod vand (minimal retention: molekylvægt 1000) og derefter tørret ved centrifugering i vakuum. Prøverne blev derefter forsynet med 50 μ I påføringspuffer, hvoraf 20 μΙ var behandlet som beskrevet ovenfor, og blev anbragt på acrylamid-SDS-gel (15% acrylamid, 0,1% SDS) (22).

30

De anvendte stammer er: brønd 2: TGYlsp4 transformeret med et plasmid, der ikke indeholder hirudin-sekvensen (kontrol), 35 brønd 3: TGYlsp4 transformeret med pTG886, brønd 4: TGYlsp4 transformeret med pTG897, brønd 1: i brønd 1 anbragtes reference-markører (LMW-kit fra Pharmacia; fra neden og opefter: 94.000, 67.000, 43.000, 30.000, 20.100, 14.000).

40 Bandene blev fremkaldt ved farvning med Coomasie-blåt R-250.

Til fig. 13 blev ekstrakterne fremstillet som følger: 100 ml minimalmedium + 40 pg/ml histidin blev podet med forskellige stammer til kulturer natten over. Nar celletætheden når ca. 5xl06 (eksponentiel vækstfase), sættes 40 μΙ 35S-cystein (9,8 mCi/ml, 1015 Ci/mmol) DK 174837 B1 14 til hver kultur. Efter 10 minutter centrifugeres cellerne, anbringes i 10 ml komplet miljø (30°C) og inkuberes ved 30°C under agitation. Efter 3 timer dialyseres 10 ml af supernatanten mod vand og koncentreres til et volumen på 0,5 ml som beskrevet for fig.

12. Ca. 35.000 cpm (40 pi) anbringes på acrylamid-SDS-gel (15% acrylamid, 0,1% SDS).

5 Proteinbåndene visualiseres efter fluorografi.

De anvendte stammer er: brønd 2: TGYlsp4 transformeret med et plasmid, der ikke indeholder hirudin-sekvensen, 10 brønd 3: TGYlsp4 transformeret med pTG886, brønd 4: TGYlsp4 transformeret med pTG897, brønd 1: i brønd 1 anbragtes markører, hvis molekylvægt er anført (xlO3).

Nar supernatanterne indeholdende disse polypeptider blev testet for deres antithrombin-15 aktivitet, kunne der imidlertid ikke detekteres nogen aktivitet.

I tilfælde af det polypeptid, der udskilles af TGYlsp4/pTG886 forventes det, at det gennemgår de normale spaltningstrin for precursoren for α-pheromonet, hvilket giver et hirudin-molekyle, der er forlænget med 8 aminosyrer ved sin Nl-^-ende. Det er derfor ikke 20 overraskende, at det polypeptid, der secerneres af TGYlsp4/pTG886-celIeme, ikke er aktivt.

1 tilfælde af det polypeptid, der udskilles af TGYlsp4/pTG897, forventes det derimod, at polypeptidet er identisk med det naturlige protein og således er aktivt. Flere hypoteser kan 25 forklare fraværelsen af aktivitet: 1) Proteinets modning er ikke fuldstændig; der kan være Glu-Ala-rester tilbage ved NH2, hvilket er beskrevet for EGF (16).

30 2) Proteinet er ikke aktivt, for det har ikke den rigtige konformation, eller også findes der i supernatanten fra kulturen proteiner eller molekyler med en molekylvægt på 1000, som inhiberer aktiviteten.

3) Proteinet er ikke komplet, fordi det har undergået en intracellulær og/eller ekstracellu-35 lær proteolyse.

EKSEMPEL 4 40 Aktivering ved spaltning med cyanogenbromid

Hvis årsagen til fraværelsen af aktivitet er forbundet med tilstedeværelsen af yderligere aminosyrer ved NH2*terminalen, burde det være muligt at genoprette aktiviteten ved at underkaste det peptid, der er secerneret fra TGYlsp4/pTG886, spaltning med cyanogen- 15 DK 174837 B1 bromid. Dette reagens er nemlig specifikt for methioninrester, og det fusionerede protein, der indkodes af pTG886, indeholder kun én methioninrest. Denne reaktion blev udført pi følgende måde: gær indeholdende enten plasmidet pTG886 eller et kontrolplasmid, der ikke indeholder hirudin-indsætning, dyrkes i 10 ml medium i 24 timer. På dette tidspunkt 5 når kulturen en tæthed på 7-10xl07 celler/ml. Supernatanten adskilles fra cellerne, dialyseres grundigt mod destilleret vand og lyofiliseres. Det tørre pulver opløses i 1 ml 70% myresyre, og en alikvot anvendes til bestemmelse af indholdet af totale proteiner (ved metoden med farvning med Coomassie-blåt med de af Biorad forhandlede reagenser); resten af præparationen behandles med 1 ml frisk cyanogenbromid-opløsning (30 mg/ml) i 10 70% myresyre.

Efter eliminering af oxygen med en nitrogenstrøm inkuberes reagensglassene i mørke i 4 timer ved omgivelsestemperatur. Alle manipulationerne med cyanogenbromid udføres med passende forholdsregler og i et ventileret stinkskab. Spaltningsreaktionen med cyanogen-15 bromid standses ved tilsætning af 10 volumen destilleret vand, hvorefter opløsningen lyo-filiseres.

De spaltede peptider genopløses i 10 ml destilleret vand og genlyofiliseres to gange. Til slut opløses peptiderne i et lille volumen destilleret vand, og en alikvot anvendes til måling 20 af antithrombin-aktiviteten. Resten af prøven lyofiliseres og underkastes renatureringstrin som beskrevet nedenfor.

Eftersom hirudin-aktiviteten afhænger af tilstedeværelsen af disulfid-broer i molekylet (1), syntes det at være sandsynligt, at det med cyanogenbromid spaltede peptid skulle rena-25 tureres korrekt for at have en biologisk aktivitet. De spaltede peptider blev derfor underkastet denaturering med 5M GuHCI efterfulgt af renaturering ved en fremgangsmåde, som er kendt for fagfolk.

Kort fortalt opløses de lyofiliserede peptider i 400 μΙ 5M guanidinium-hydrochlorid (GuHCI) 30 i 250 mM Tris-HCI, pH 9,0; derefter gøres opløsningen 2 mM med hensyn til reduceret glutathion og 0,2 mM med hensyn til oxideret glutathion i et slutvolumen på 2,0 ml (stofkoncentrationen er 1,0 M GuHCI og 50 mM Tris).

Efter 16 timers inkubation ved 23°C i mørke dialyseres prøverne i 24 timer mod 3 x 2 I 50 35 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI ved 23°C, og slutdialysatet klares ved centrifugering.

Derpå måles supernatanternes antithrombin-aktivitet. Resultatet af dette forsøg (vist i tabel I) viser klart en isolering af antithrombin-aktiviteten i supernatanterne fra celler inficeret med plasmidet pTG886, medens der ikke findes aktivitet i kontrolplasmideme.

40 TABEL 1

Antithrombin-aktivitet i supernatanter fra gærkulturer DK 174837 B1 16

Plasmid Behandling af super Aktivitet Specifik aktivitet natanten U/ml U/mg af initiale proteiner pTG886 a) efter spaltning < 0,3 før renaturering b) efter spaltning og 2,46 102,5 renaturering kontrol a) efter spaltning <0,3 før renaturering b) efter spaltning og <0,15 <5,6 renaturering

Det kan konkluderes, at gærceller, der bærer et rekombinant plasmid, kan secernere et peptid med hirudins biologiske aktivitet efter en spaltningsreaktion og renaturering. Dette antyder, at tilstedeværelsen af yderligere aminosyrer ved NH2"terminalen er tilstrækkeligt 5 til at forklare fraværelsen af aktivitet hos de polypeptider, der er til stede i kulturerne af TGYlsp4/pTG886, og måske også i tilfælde af kulturer af TGYlsp4/pTG897 (Glu-Ala-ha-ler).

10 EKSEMPELS

Indsætning af et nyt spaltningssted lige før den første aminosyre i den sekvens, der koder for hirurin HV-2 - plasmidet pTG1805 15 I konstruktionen pTG897 er der en risiko for, at det secernerede peptid beholder Glu-Ala-haler ved NH2, hvilket ville forklare fraværelsen af antithrombin-aktivitet i dette materiale.

Hvis denne hypotese stemmer overens med realiteterne, skulle det være muligt at genvinde aktiviteten direkte i supernatanten ved at danne et spaltningssted mellem resterne Glu-Ala og den første aminosyre i hirudin HV-2 (isoleucin). Dette blev udført ved at tilføje 20 en sekvens, som koder for dubletten LysArg, som er genkendelsesstedet for den endopep-tidase, der er impliceret i modningen af precursoren for pheromonet (fig. 2). Konstruktionen blev foretaget nøjagtigt som beskrevet for plasmidet pTG897 undtagen med hensyn til sekvensen af to syntetiske oligonukleotider (fig. 14). Det resulterende plasmid betegnes pTG1805. Plasmidet blev anvendt til transformation af stammen TGYlsp4 til ura+. Det 25 materiale, der blev secerneret i supernatanten, blev analyseret ved gelelektroforese som beskrevet ovenfor og blev sammenlignet med det materiale, der blev vundet med TGYlsp4/pTG897 (fig. 15).

De anvendte stammer er: brønd 1: Markører identiske med de i forbindelse med fig. 12 beskrevne, brønd 2: TGYlsp4 transformeret med pTG897, brønd 3: TGYlsp4 transformeret med pTG1805, 30 17 DK 174837 B1 brønd 4: kontrol, der ikke producerer hirudin.

De specifikke polypeptider for stammen TGYlsp4/pTG1805 vandrer langsommere end dem, der er specifikke for stammen TGYlsp4/pTG897. Dette resultat antyder, at det nye 5 spaltningssted ikke udnyttes effektivt af den tilsvarende endopeptidase. Dosen af hirudin i supernatanten med hensyn til biologisk aktivitet viser ikke desto mindre, at en lille del af dette materiale er aktiv i modsætning til det, der opnås med kulturer af TGYlsp4/pTG897, som klart er inaktive (tabel II).

10 TABEL II

Antithrombin-aktivitet i supernatanter af gærkulturer (10 ml)

Plasmid Specifik aktivitet Samlet aktivitet U/mg U (10 ml) pTG856 ikke detekterbar pGT897 ikke detekterbar PTG1805 21 2^0 ’ 15 EKSEMPEL 6

Ny konstruktion med et nyt, mere effektivt spaltningssted, der muliggør frigivelse af mo-20 dent hirudin I førnævnte konstruktion (pTG897) kunne der kun opnås en smule hirudin-aktivitet i supernatanten, sandsynligvis fordi det andet spaltningssted, der var beregnet på at frigive modent hirudin, kun genkendes med lille effektivitet. Der blev derfor foretaget en ny kon-25 struktion, der skulle gøre dette yderligere spaltningssted mere modtageligt for endopeptidase ved ovenfor at tilføje en sekvens på 3 aminosyrer, Ser Leu Asp, som naturligt er til stede oven for den første LysArg-dublet (fig. 2 og 16).

Den anvendte teknik er den samme som beskrevet ovenfor bortset fra oligonukleotiderne, 30 hvis sekvenser er vist nedenfor: 26-mer l5-mer 5 * - AGC T T C T T TGG AT AAAAG AAT T AC G τ\ΐ AC AG AC TGC ACAG* ,AGAAACCT ATTTTCTT AATGCAT AT GT CT GACGT GTCTT A, 40-mer 18 DK 174837 B1

Aminosyresekvensen i spaltningsomridet er vist i fig. 13. Det tilsvarende plasmid betegnes pTG1818 og er kun forskelligt fra pTG1805 ved indsætning af nukleotiderne 5‘-TTG GAT AAA svarende til kodonerne Ser-Leu-Asp.

5 Den aktivitet, der er doseret i supernatanterne fra kulturerne TGYlsp4/pTGl818 ifølge de allerede beskrevne standardbetingelser, er ca. 200 enheder pr. 10 ml kultur, dvs. ca. 100 gange stærkere end den aktivitet, der findes i det foregående eksempel. Det skal bemærkes, at dosen kan opnås med 10 pi ikke-koncentreret dyrkningsmedium.

10 EKSEMPEL 7

Konstruktion, der fører til syntese af en precursor, som mangler sekvenserne Glu-Ala-Glu-Ala 15 I de to ovenstående eksempler blev det påvist, at tilsætning af et nyt Lys Arg-sted lige oven for begyndelsen af den modne hirudin-sekvens gjorde det muligt at frigøre aktivt materiale i supernatanten. Hvis spaltningen af precursoren finder sted ved det første Lys Arg-sted (distalt i forhold til begyndelsen af den modne sekvens), kan der imidlertid i disse 20 eksempler i dyrkningsmediet opnås en tungere, inaktiv kontaminant, der svarer til hirudin-kæder, som er forlænget ved NH2-enden. Dette er særlig klart i tilfælde af TGYlsp4/pTG1805~kulturer, hvor den inaktive kontaminant er i overtal. Dette er ligeledes plausibelt i tilfælde af TGYlsp4/pTG18l8-kulturer, hvor den inaktive kontaminant ikke er i overtal, men kunne være til stede som beskrevet af andre forskere i tilfælde af EGF (15).

25 For at undgå dette udbyttetab, som syntesen af inaktivt materiale udgør, blev det besluttet at foretage en ny konstruktion, som fører til syntese af en precursor, som kun er forskellig fra den precursor, der er syntetiseret af TGYlsp4/pTG897-cel!erne, ved fraværelse af sekvensen Glu Ala Glu Ala mellem spaltningsstedet Lys Arg og den første aminosyre i den modne hirudin-sekvens.

30 Følgende stammer er den 30. april 1985 deponeret i Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l’Institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux, Paris 15:

- TGYlsp4 pTG1818: Saccharomyces cerevisiae, stamme TGYlsp4 (Mata ura3-251-373-35 328-his 3-11-15) transformeret til ura+ med et plasmid, pTG1818; deponeringsnummer I

441,

- TGYlsp4 pTG886: Saccharomyces cerevisiae, stamme TGYlsp4 (Mata ura3-25l-373-328-his 3-11-15) transformeret til ura+ med et plasmid, pTG886; deponeringsnummer I

442.

40

REFERENCER

1. Bagdy D., Barabas E., Graf L., Petersen T.E. og Magnusson S. (1976) Methods in Enzy-mology del B, vol. 45, s. 669-678.

19 DK 174837 B1 2. Markwardt F. (1970) Methods in Enzymology, red. Perlman G.E. og Lorand L, Academic Press, vol. 19, s. 924-932.

3. Markwardt F., Hauptmann J., Nowak G., Klessen Ch. og Walsmann P. (1982) Thromb. Hemostasis (Stuttgart) 47, s. 226-229.

5 4. Walsmann P. og Markwardt F. (1981) Die Pharmazie 10, s. 653-660.

5. Kloss Th. og Mittmann U. (1982) Longenbecks Arch. Chirurg. 358, s. 548.

6. Ishikawa A., Hafter R., Seemuller U., Gokel J.M. og Graeff M. (1980) Thrombosis Research 19, s. 351-358.

7. Markwardt F.( Nowak G., Sturzebecker J., Greisbadi U., Walsmann P. og Vogel G.

10 (1984) Thromb. Hemostasis (Stuttgart) 52, s. 160- 163.

8. Nowak C. og Markwardt F. (1980) Expt. Path. 18, s. 438-443.

9. Markwardt F., Nowak G., Sturzenbecker J., Greissback U., Walsmann P. og Vogel G.

(1984) Thromb. Hemostasis 52, s. 160-163.

10. Sutor, A.H., Knop S. og Adler D. (1981) Kontrolle Antithrombotica, 23. Symp. Blutge-15 rinnung, Hamburg, s. 117-123.

11. Petersen T.E., Roberts H.R., Sottrup-Jensen L, Magnusson S. og Badgy D. (1976) Pro-tides Biol. Fluids, Proc. Colloq. vol. 23, s. 145-149.

12. Chang J-Y. (1983) Febs Lett. 164, s. 307-313.

13. Baskova I.P., Cherkesova D.U. og Mosolov V.V. (1983) Thromb. Res. 30, s. 459-467.

20 14. Bussey H., Saville D., Greene D. et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3, s. 1362-1370.

15. Brake A.J. Merryweather J.P., Coit D.G., Heberlein U.A., Mariarz F.R., Mullenbach G.T.,

Urdea M.S., Valenzuela P. og Barr P.J. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, s. 4642-4646.

16. Bitter G.A., Chen K.K., Banks A.R. og Lai P.H. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, s. 5330-5334.

25 17. Kurjan J. og Herskowitz I. (1982) Cell 30, s. 933-943.

18. Beggs J. (1981) Genetic Engineering 2, s. 175-203.

19. Bach M.L., Lacroute F. og Botstein D. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, s. 386-390.

20. Hitzeman R.A., Hagie E.F., Hayfflick J.S. et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10, s. 7791-30 7808.

21. Ito, H., Fukuda Y., Murata K. og Kimura A. (1983) J. Bacteriol. 153, s. 163-168.

22. Laemmli V.K.C. (1970) Nature 227, s. 680-685.

Claims (16)

1. 20 DK 174837 B1
2. 1. Gær transformeret med en funktionel DNA-blok integreret i et piasmid indeholdende et gær replikationsinitieringssted, eller integreret i et kromosom i gæren, hvilken blok i det 5 mindste indeholder: en DNA-sekvens som koder for hirudin (H-gen), mindst et spaltningssted (Sc|j som ligger umiddelbart opstrøms fra H-genet, en leder-sekvens (Lex^ indeholdende nødvendige elementer for at opnå sekretion 10 af genproduktet, en DNA-sekvens (Sj-r) indeholdende signaler, der sikrer transkription af H-genet ved hjælp af gær.
3. 2. Transformeret gær ifølge krav 1, kendetegnet ved at nævnte funktionelle blok 15 indeholder i det mindste følgende sekvenser, regnet fra 5’-enden til 3'-enden: en DNA-sekvens (S(r) indeholdende signaler, der sørger for transkription af H-genet i gær, er en leder-sekvens (Lex) indeholdende nødvendige elementer for at opnå 20 sekretion af genproduktet, en DNA-sekvens som koder for HV,- eller HV2-hirudin, hvilken sekvens der indkodes heraf fremgår af linierne (c) henholdsvis (b) i figur 1, og hvilken har spaltningsstedet Sc| placeret foran. 25 3. Gær ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved at sekvensen Lex er sekvensen fra a-kønspheromonet fra gær, som er vist indrammet på figur 2.
4. 4. Gær ifølge krav 1-3, kendetegnet ved at ledersekvensen indeholderet prefragment af gærens α-kønspheromon, som er vist understreget med stiplet linje på figur 2. 30
5. 5. Gær ifølge hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved at blokken indeholder en pre-pro-sekvens af α-kønspheromon i H-genets 5'-ende, hvilken sekvens er vist i figur 2 og koder aminosyrerne 1-83. 35 6. Gær ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved at H-genet efterfølges af en terminatorsekvens fra gær.
6. 7. Gær ifølge krav 6, kendetegnet ved at terminatorsekvensen fra gær er sekvensen fra PGK-genet. 40
7. 8. Gær ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved at spaltningsstedet er dipeptidet Lys-Arg H-genet, hvis DNA-sekvens er AAA eller AAG sammen med AGA eller AGG. 21 DK 174837 B1
8. 9. Gær ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved at den funktionelle blok er integreret i et plasmid, hvilket indeholder i det mindste et repiikationsinitieringssted for gær. 5
9. 10. Gær ifølge krav 9, kendetegnet ved at replikationsinitienngsstedet er initieringsstedet for replikation fra plasmidet 2μ.
10. 11. Gær ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved at plasmidet desuden omfatter et 10 selektionstræk.
11. 12. Gær ifølge krav 11, kendetegnet ved, at selektionstrækket tilvejebringes af URA3-genet. 15 13. Gær ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12, kendetegnet ved, at det drejer sig om en gær af slægten Saccharomyces.
12. 14. Gær ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den har kønstypen Mata . 20
13. 15. Gær ifølge et hvilket som helst af kravene 12-14, kendetegnet ved, at det drejer sig om en stamme af S. cerevisiae.
14. 16. Fremgangsmåde til fremstilling af hirudin, 25 kendetegnet ved, at en gær ifølge et hvilket som helst af kravene 1-15 fermenteres i et dyrkningsmedium, og det hirudin, der produceres i dyrkningsmediet, isoleres.
15. 17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved at 30 a) i dyrkningsmediet fermenteres en gærstamme, som indeholder en funktionel DNA-blok i et plasmid eller integreret i et kromosom af nævnte gær, hvilken blok indeholder mindst en sekvens: - S{-r - Lex - SC| - H-gen - ter 35 hvori: Str er en DNA-sekvens omfattende signaler, der sørger for transkription af H-genet i gær; LgX er en leder-sekvens, der muliggør sekretion af hirudin i moden form eller sekretion af hirudin i form af en precursor for hirudin, der kan modnes in vitro;
16. 40 Sc| er en DNA-signal, der koder for et spaltningssted valgt blandt ATG og sekvenser som koder for Lys-Arg; b) det producerede hirudin isoleres fra dyrkningsmediet i moden form efler i form af en precursor for hirudin, der kan modnes in vitro.