DE3650306T2

DE3650306T2 - Expressions- und Ausscheidungsvektoren für Hirudin mittels transformierter Hefe.

Info

Publication number: DE3650306T2
Application number: DE3650306T
Authority: DE
Inventors: Jean-Pierre Lecocq; Yves Lemoine; Gerard Loison; Paul Biotechnology Tolstoshev
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1985-05-02
Filing date: 1986-05-02
Publication date: 1995-10-12
Anticipated expiration: 2006-05-03
Also published as: FR2601383A2; FR2601383B2; CZ321786A3; DK634386A; AU5778786A; EP0200655B1; FI104635B; HU202919B; DK174837B1; FI865303A0; FR2593518A1; CA1341501C; NO302375B1; DK634386D0; ES555121A0; FR2593518B1; IE861183L; JPH09103295A; PL155074B1; BG49717A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren zur Expression der DNA-Sequenz, die für ein Hirudin oder Analoga des Hirudins codiert, die Sekretion des Hirudins in das Kulturmedium der durch diese Vektoren transformierten Hefen und Verfahren, welche die Herstellung eines aktiven Hirudins durch Fermentation erlauben, sowie das dabei erhaltene Hirudin.
Die antikoagulierende Aktivität, die in den Speicheldrüsen der medizinischen Blutegel Hirudo medicinalis zu finden ist, stammt von einem kleinen Polypeptid, das man als Hirudin bezeichnet (1). Dieser sehr spezifische und sehr wirksame Thrombin-Inhibitor wurde in letzter Zeit sehr ausführlich untersucht, da er ein potentiell sehr interessantes therapeutisches Agens darstellt. Die extremen Schwierigkeiten und Kosten seiner Isolierung und seiner Reinigung haben bisher jedoch verhindert, daß er in größerem Umfange verwendet wird oder auch nur in klinischem Maßstab untersucht werden kann.
Die Möglichkeit der Herstellung von Hirudin durch Klonierung von Genen und ihre Expression unter Anwendung des rekombinanten DNA-Verfahrens wurde bereits gezeigt durch die Klonierung eines natürlichen Blutegel-Gens, das für Hirudin codiert, und die Expression in dem Mikroorganismus E. coli (französische Patentanineldung Nr. 84 04755 der Anmelderin, hinterlegt am 27. März 1984.). Auch wenn ein Peptid mit einer biologischen Aktivität in E. coli produziert (hergestellt) werden konnte, ist es sehr wichtig, das Hirudin in anderen Mikroorganismen-Typen herzustellen. Die klinische Verwendung des Hirudins erfordert nämlich eine sehr große Reinheit des Produkts und die Eliminierung von pyrogenen Kontaminanten könnte Probleme mit sich bringen bei der Reinigung des Hirudins aus Colibacillus-Extrakten.
Darüber hinaus bleibt das durch E. coli synthetisierte Hirudin intrazellulär und muß somit aus einer sehr großen Anzahl von Peptiden von E. coli gereinigt werden. Aus diesen Gründen war es vorteilhaft, das Gen des Hirudins in Hefe exprimieren zu lassen, die keine für den Menschen pyrogenen oder toxischen Substanzen bildet und in der Lage ist, Proteine in das Kulturmedium zu sekretieren.
Der Mechanismus der Wirkung des Hirudins als Antikoagulationsmittel beginnt erst verstanden zu werden. Das Substrat für die Fixierung des Hirudins ist das Thrombin, das ein proteolytisches Enzym darstellt, das durch Aktivierung (durch den aktivierten Faktor X), seiner zymogenen Form, des Prothrombins, das Fibrinogen in dem Blut-Kreislauf schneidet, um es zu Fibrin zu transformieren, das für die Bildung eines Blutgerinnsels erforderlich ist. Die Dissoziationskonstante des Thrombin/Hirudin (1/1)-Komplexes (0,8 x 10&supmin;¹&sup0;) zeigt eine extrem starke Assoziation zwischen diesen Molekülen an (2). In der Praxis kann man den nicht-kovalenten Komplex zwischen diesen beiden Molekülen als in vivo nicht dissoziierbar ansehen.
Das Hirudin ist ein sehr spezifischer Inhibitor des Thrombins mit einer viel höheren Affinität als das natürliche Substrat, das Fibrinogen. Außerdem ist es nicht erforderlich, daß andere (weitere) Koagulations-Faktoren oder andere (weitere) Plasma-Bestandteile vorhanden sind. Die spezifische und sehr starke Antithrombin-Aktivität des Hirudins macht seine klinische Verwendung als Antikoagulationsmittel naheliegend.
Das Hirudin wurde beim Tier auf seine antikoagulierenden Eigenschaften hin bereits sehr gründlich untersucht. Die detaillierteste Untersuchung (3) beschreibt die Aktivität von Hirudin bei der Prävention von Venenthrombosen, Gefäßverschlüssen und disseminierten intravaskulären Koagulationen (disseminierten Intravasal-Koagulopathien) (DIC) bei der Ratte. Das Hirudin wird von Ratten, Hunden, Kaninchen und Mäusen sehr gut vertragen, wenn es in einer sehr reinen Form vorliegt und intravenös injiziert wird. Die DL&sub5;&sub0; bei Mäusen liegt bei über 500 000 U/kg Körpergewicht (d.h. bei 60 mg/kg). In einer anderen Untersuchung (4) ist angegeben, daß Mäuse Dosen vertragen, die bis zu 1 g/kg gehen können und daß Kaninchen sowohl auf intravenösem als auch auf subkutanem Wege bis zu 10 mg/kg vertragen. Bei Mäusen führen wiederholte Injektionen während einer Zeitdauer von zwei Wochen nicht zu Sensibilisierungsreaktionen.
Außerdem wird das Hirudin von dem Versuchstier schnell eliminiert (ausgeschieden) (mit einer Halbwertszeit in der Größenordnung von 1 h) durch die Nieren in einer noch biologisch aktiven Form (3).
Zwei weitere unabhängige Untersuchungen, wobei in der einen Hunde verwendet werden (5) und in der anderen die Aktivität des Hirudins bei der Prävention der DIC bei Ratten gezeigt wird, stehen mit den positiven Ergebnissen von Markwardt und seinen Mitarbeitern in Übereinstimmung. Diese Forscher haben vor kurzem die erste in vivo-Analyse der Effekte von natürlichem Hirudin auf das hämostatische Human-System veröffentlicht (7). Das Versuchsmaterial hat die erwarteten biologischen Effekte ergeben ohne Anzeichen von toxischen Nebenwirkungen.
Es konnte auch gezeigt werden, daß das Hirudin die durch die Endotoxine bei Schweinen induzierten DIC verhindert (8) und somit eine potentielle Lösung für die sehr schwerwiegenden Probleme darstellt, die durch die Endotoxinämien entstehen, die zu einer erhöhten Mortalität bei den Schweinen führen.
Eine einzige sehr neue Publikation (9) beschreibt die intravenöse und subkutane Verabreichung von Hirudin an den Menschen. Für die Beurteilung der Pharmakokinetik und der Effekte auf das hämostatische System einer einzigen Dosis von Hirudin (1000 AT-U/kg) wurden sechs Freiwillige verwendet. Das auf intravenösem Wege verabreichte Hirudin weist eine Halbwertszeit von 50 min auf und innerhalb von 24 h nach der Injektion findet man 50 % des Hirudins in aktiver Form in dem Urin wieder. Man stellt eine Verlängerung der Koagulationszeit (gemessen in vitro für das Thrombin, das Thromboplastin und das Prothrombin) als Funktion der Konzentration an Hirudin in dem Plasma fest, was zeigt, daß das Molekül seine biologische Aktivität in dem Kreislauf des Patienten beibehält. Man beobachtet keine Veränderung bezüglich der Anzahl der Blutplättchen, des Fibrinogen-Gehalts und des fibrinolytischen Systems. Die subkutanen Hirudin-Injektionen werden ebenso wie die intravenösen Injektionen gut vertragen und rufen keine Nebenwirkung hervor. Um das eventuelle Auftreten von allergischen Reaktionen zu testen, wurden zwei intrakutane Injektionen dem gleichen Patienten in einem Zeitabstand von 4 Wochen verabreicht; es wurde kein Anzeichen für eine Sensibilisierung festgestellt. Darüber hinaus wurden keine Antihirudin-Antikörper in dem Serum nachgewiesen.
Diese Untersuchungen lassen vermuten, daß das Hirudin ein interessantes (vorteilhaftes) klinisches Agens als Antikoagulum darstellen kann. Die Vorphase der Koagulation des Blutes wird nicht beeinflußt wegen der hohen Spezifität der Wirkung des Hirudins. Die Antithrombin-Aktivität ist abhängig von der Dosis und der Effekt des Hirudins ist schnell reversibel wegen seiner schnellen Nieren-Ausscheidung. Es konnte gezeigt werden, daß das Hirudin dem Heparin in bezug auf die Behandlung der DIC weit überlegen ist (3,6), wie dies erwartet werden konnte aufgrund der Tatsache, daß die DIC von einer Abnahme des Antithrombins III (einem für die Wirkung des Heparins erforderlichen Cofaktor) und einer Aussalzung (Ausscheidung) des Blutplättchen-Faktors 4, der ein sehr wirksames Antiheparin-Agens ist, begleitet ist. Eine Untersuchung hat die Möglichkeit aufgezeigt, daß das Hirudin durch die Haut von Menschen absorbiert werden kann (10), obgleich die erhaltenen Ergebnisse etwas schwierig zu interpretieren sind.
Handelsübliche Präparate von azellulären Rohextrakten von Blutegeln sind in Form einer Salbe erhältlich (Hirucrème, Société Nicholas, Frankreich; Exhirud-Blutgel, Plantorgan Werke, RFA), es sind jedoch ergänzende Tests mit höheren Dosen eines stark gereinigten Materials erforderlich, um nachzuweisen, daß es sich dabei um einen interessanten Verabreichungsweg handelt. Allgemein sind die bevorzugten Verabreichungswege die intravenösen, intramuskulären Wege und der perkutane Weg. Es wurde auch bereits über andere Verabreichungswege für das Hirudin berichtet, insbesondere den oralen Weg (BSM Nr. 3 792 M).
Dieses Produkt kann auch in Kombination mit anderen Komponenten für die Behandlung der Psoriasis und anderer Hautstörungen des gleichen Typs, wie in der DE-OS 2 101 393 beschrieben, verwendet werden.
Das Hirudin kann außerdem als Antikoagulans in klinischen Labor-Tests und als Forschungs-Werkzeug verwendet werden. In diesem Fall kann die hohe Spezifität für eine einzige Stufe bei der Koagulation des Blutes einen beträchtlichen Vorteil bieten gegenüber den am häufigsten verwendeten Antikoagulantien, deren Wirkung viel weniger spezifisch ist.
Außerdem kann das Hirudin als Antikoagulations-Mittel in extrakorporalen Kreisläufen und in Dialysesystemen verwendet werden, in denen es beträchtliche Vorteile bieten kann gegenüber anderen Antikoagulantien, insbesondere wenn es in seiner aktiven Form an der Oberfläche dieser künstlichen Kreislaufsysteme immobilisiert werden kann.
Die Aktivität der Fixierung des Hirudins an dem Thrombin kann außerdem den indirekten Schutz von Koagulationsfaktoren, wie des Faktors VIII bei seiner Reinigung, ermöglichen.
Schließlich kann die Verwendung von markiertem Hirudin eine einfache und wirksame Methode zur Bestimmung der Gehalte an Thrombin und Prothrombin darstellen. Insbesondere kann das markierte Hirudin zur Sichtbarmachung der Blutgerinnsel bei ihrer Bildung verwendet werden, da das Koagulations-Phänomen die Umwandlung des zirkulierenden Prothrombins in Thrombin an der Stelle der Bildung impliziert, wobei das markierte Hirudin an dem Thrombin fixiert wird und sichtbar gemacht werden kann.
Es ist außerdem möglich, die direkte Verwendung der transformierten Hefen als Hirudin freisetzendes Arzneimittel vorzusehen, beispielsweise durch Auftragen einer Creme auf die Haut, welche die genannten Hefen enthält, die das Hirudin sekretieren.
Zusammengefaßt weist das erfindungsgemäße Hirudin eine große Anzahl von möglichen Anwendungen auf:
1) als Antikoagulans bei kritischen thrombotischen Zuständen für die Prophylaxe und die Prävention der Ausbreitung bereits vorhandener Thrombosen;
2) als Antikoagulans zur Verkleinerung der Hämatome und der Anschwellungen nach inikrochirurgischen Eingriffen, Situationen, in denen man häufig von lebenden Blutegeln Gebrauch macht;
3) als Antikoagulans in extrakorporalen Kreislaufsystemen und als Antikoagulans zum Beschichten von synthetischen Biomaterialien;
4) als Antikoagulans in klinischen Tests von Blutproben in Laborversuchen;
5) als Antikoagulans in der klinischen Erforschung der Koagulation und als experimentelles Werkzeug;
6) als mögliches topisches Agens für den Auftrag auf die Haut bei der Behandlung von Hämorrhoiden, Krampfadern und Ödemen;
7) als Bestandteil bei der Behandlung von Psoriasis und anderen verwandten Störungen;
8) schließlich kann das Hirudin zum Fixieren von Thrombin bei der Blutkonservierung und bei der Herstellung von Blutderivaten (Blutplättchen, Faktoren VIII und IX) verwendet werden.
Das Hirudin kann beispielsweise in therapeutischen Zusammensetzungen in Konzentrationen verwendet werden, die 100 bis 50 000 Antithrombin-Einheiten/kg pro Tag entsprechen.
Das in Wasser lösliche Hirudin ist leicht handhabbar zur Herstellung von injizierbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen oder auf anderem Wege verabreichbaren Zusammensetzungen unter Verwendung von Trägern und Vehikula, die pharmazeutisch akzeptabel sind.
Schließlich ist es möglich, Hirudin, das durch radioaktive Markierung oder durch irgendeinen anderen Typ der enzymatischen oder fluoreszierenden Markierung markiert worden ist, hergestellt nach bekannten Verfahren, zu verwerden, um Bestimmungen (Analysen) in vitro durchzuführen oder für die bildliche Darstellung in vivo, insbesondere, um die Bildung von Blutgerinnseln sichtbar zu machen.
Ein Hirudinpräparat, hergestellt aus einem intakten (unversehrten) Tier, wurde verwendet zur Bestimmung der Aminosäuresequenz des Proteins (11, 12). In den folgenden Versuchen wurde ein Gen kloniert, das sich in den Köpfen von jungen Blutegeln in Form der Messenger-RNA exprimiert. Dieses Gen trägt eine Information für ein Protein (Hirudin-Variante 2 oder HV-2), dessen Sequenz signifikant verschieden ist von derjenigen, die man in dem gesamten Körper des Tieres findet (Protein-Variante, die als HV-1 bezeichnet wird). Es gibt neun Unterschiede an Aminoacyl- Resten zwischen HV-1 und HV-2 und die Unterschiede zwischen den beiden NH&sub2;-terminalen Resten (val-val oder ilethr) können die scheinbaren Widersprüche in der Literatur, betreffend das NH&sub2;-terminale Ende von Hirudin, erklären (13).
Die Fig. 1 zeigt die DNA-Sequenzen des rekombinanten Plasmids pTG717, das eine Kopie der cDNA enthält, die der mRNA von HV-2 entspricht, sowie die von der Sequenz der DNA abgeleitete Sequenz an Aminosäuren in b) und die Unterschiede zwischen dieser Sequenz und der Aminosäuresequenz von HV-1 in c).
Eine Variante von Hirudin HV-1 ist in FEBS LETTERS, 1984, Band 105(2), S. 180-184, beschrieben.
Es sei darauf hingewiesen, daß die Sequenz der cDNA wahrscheinlich nicht vollständig ist und daß eine Signal- Sequenz stromaufwärts vom Beginn des reifen Proteins vorliegen kann.
Die Expression der cDNA von HV-2 in den Mikroorganisen zeigt, daß das entsprechende Protein eine Antithrombin-Aktivität hat.
Obgleich die folgenden Versuche mit der Varianten HV- 2 durchgeführt wurden, ist nachstehend unter "Hirudin" und "Gen, das für Hirudin codiert" sowohl die eine als auch die andere der Varianten, d.h. HV-1 oder HV-2 und gegebenenfalls sogar weitere (andere) Varianten und die entsprechenden Sequenzen zu verstehen, außer wenn etwas anderes angegeben ist.
Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Hirudin durch Hefen.
Die Hefen sind einzellige Eukaryonten-Organismen. Der Hefe-Genus Saccharomyces umfaßt Stämme, deren Biochemie und Genetik im Labor gründlich untersucht worden sind; er umfaßt auch Stämme, die in der Lebensmittelindustrie (Brot, alkoholische Getränke und dgl.) verwendet werden und demzufolge in sehr großer Menge hergestellt werden.
Die Leichtigkeit, mit der man die Genetik der Zellen von Saccharomyces cerevisiae manipulieren kann, entweder durch Anwendung klassischer Verfahren oder durch Verfahren, die von der Gentechnik abgeleitet sind, und noch besser durch Kombination dieser beiden Verfahrens-Typen, und die lange industrielle Geschichte dieser Species machen aus ihr einen Wirt der Wahl für die Herstellung (Produktion) von Fremd-Polypeptiden.
In EP-A-123 294 sind Hefetransformations-Vektoren beschrieben, welche die Sekretion von Hybrid-Vorläufer-Polypeptiden gewährleisten, welche die Gewinnung (Rückgewinnung) des gewünschten Polypeptids erlauben.
In EP-A-116 201 sind Vektoren zur Sekretion in Hefen beschrieben, in denen die Leader-Sequenz des α-Faktors verwendet wird.
In EP-A-129 073 ist die Expression von GRF durch Hefen beschrieben, wobei insbesondere Elemente verwendet werden, die aus dem Gen des α-Faktors stammen.
In EP-A-123 544 ist die Sekretion von Proteinen beschrieben, bei der Elemente verwendet werden, die aus Genen des α-Faktors stammen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher insbesondere einen funktionellen DNA-Block, der die Herstellung von Hirudin aus Hefe erlaubt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er mindestens umfaßt:
. das Gen von Hirudin oder einer seiner Varianten (nachstehend als Gen H bezeichnet)
. eine DNA-Sequenz (Str), welche die Signale umfaßt, welche die Transkription des Gens H durch die Hefe gewährleisten.
Dieser funktionelle Block, der in ein Plasmid oder in die Chromosomen einer Hefe, vorzugsweise des Genus Saccharomyces, integriert ist, kann nach der Transformation der genannten Hefe die Expression von Hirudin entweder in der aktiven Form oder in Form eines inaktiven Vorläufers, der das Hirudin durch Aktivierung regenerieren kann, erlauben.
Der Vorteil von Saccharomyces cerevisiae besteht darin, daß diese Hefe in der Lage ist, einige Proteine in das Kulturmedium zu sekretieren, wobei die Untersuchung der für diese Sekretion verantwortlichen Mechanismen noch in vollem Gange ist und gezeigt wurde, daß es möglich ist, nach ad hoc-Manipulationen Human-Hormone, die in korrekter Weise prozessiert worden sind, und in allen Punkten denjenigen ähneln, die man in dem Human-Serum findet, in die Hefe sekretieren zu lassen (14, 15).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird diese Eigenschaft ausgenutzt zur Erzielung der Sekretion von Hirudin, da diese zahlreiche Vorteile bietet.
Zunächst sekretiert die Hefe wenige Proteine, was den Vorteil hat, daß man dann, wenn man die Sekretion eines gegebenen Fremd-Proteins auf einen hohen Wert einstellt, in dem Kulturmedium ein Produkt erhalten werden kann, das einen erhöhten Prozentsatz an sekretierten Gesamtproteinen darstellt und somit die Reinigung des gesuchten Proteins erleichtert.
Es gibt mehrere Proteine oder Polypeptide, die von der hefe sekretiert werden. In allen bekannten Fällen werden diese Proteine in Form eines längeren Vorläufers synthetisiert, dessen NH&sub2;-terminale Sequenz entscheidend ist für den Eintritt in den Stoffwechsel-Weg, der zu der Sekretion führt.
Die Synthese von Hybrid-Proteinen, welche die NH&sub2;- terminale Sequenz eines dieser Vorläufer, gefolgt von der Sequenz des Fremd-Proteins enthalten, in der hefe kann in bestimmten Fällen zur Sekretion dieses Fremd-Proteins führen. Die Tatsache, daß dieses Fremd-Protein in Form eines Vorläufers und damit in einer im allgemeinen inaktiven Form synthetisiert wird, erlaubt es, die Zelle gegen die eventuellen toxischen Wirkungen des gesuchten Moleküls zu schützen, wobei die Abspaltung (Freisetzung) des aktiven Proteins nur in Gefäßen, die aus der Golgi-Apparatur stammen, erfolgt, die das Protein des Cytoplasmas isolieren.
Die Anwendung von Stoffwechselwegen, die zur Sekretion führen, zur Herstellung eines Fremd-Proteins in der Hefe bietet somit mehrere Vorteile:
1) sie erlaubt die Gewinnung (Rückgewinnung) eines Produkts mit vernünftiger Reinheit aus dem Kulturüberstand;
2) sie erlaubt den Schutz der Zelle gegen die möglichen toxischen Effekte des reifen Proteins;
3) andererseits können die sekretierten Proteine in bestimmten Fällen Modifikationen (eine Glycosylierung, eine Sulfatierung und dgl.) erleiden.
Deshalb haben die erfindungsgemäßen Expressionsblöcke insbesondere die folgende Struktur:
worin:
Lex für eine Leader-Sequenz codiert, die erforderlich ist für die Exkretion des dem Gen H entsprechenden Proteins;
Scl steht für eine DNA-Sequenz, die für eine Schittstelle (Spaltungsstelle) codiert, wobei außerdem
das Element Scl-Gen H mehrfach wiederkehren kann.
Als Beispiel für das Sekretions-System wurde dasjenige des α-Pheromons gewählt, d.h., daß in der vorhergehenden Sequenz die Sequenz Lex aus dem Gen des α-Sexual- Pheromons von Hefe stammt, es können aber auch andere Systeme angewendet werden (beispielsweise das System des Killer-Proteins) (14).
Das α-Sexual-Pheromon von Hefe ist ein Peptid mit 13 Aminosäuren (die in der Fig. 2 eingerahmt sind), das in das Kulturmedium durch die hefen S. cerevisiae vom Sexual- Typ Matα sekretiert wird. Der α-Faktor stoppt die Zellen vom entgegengesetzten Sexual-Typ (Mata) in der G1-Phase ab und induziert biochemische und morphologische Veränderungen, die für die Kopulation der beiden Zellen-Typen erforderlich sind. Kurjan und Herskowitz (17) haben das Struktur-Gen des Faktors α kloniert und aus der Sequenz dieses Gens abgeleitet, daß dieser α-Faktor mit 13 Aminosäuren in Form eines Vorläufer-Proteins pre-pro mit 165 Aminosäuren synthetisiert wurde (Fig. 2). Der Vorläufer enthält eine hydrophobe Amino-terminale Sequenz von 22 Resten (die durch eine punktierte Linie unterstrichen sind), gefolgt von einer Sequenz von 61 Aminosäuren, die 3 Glycosylierungsstellen enthält, und gefolgt schließlich von 4 Kopien des α-Faktors. Die 4 Kopien sind durch "Spacer"-Sequenzen voneinander getrennt und das reife Protein wird aus dem Vorläufer freigesetzt durch die folgenden enzymatischen Aktivitäten:
1) eine Endopeptidase vom Cathepsin B-Typ, die in COOH der Dipeptide Lys-Arg einschneidet (Schnittstelle, die durch einen dicken Pfeil angezeigt ist);
2) eine Exopeptidase vom Carboxypeptidase B-Typ, welche die basischen Reste in COOH der ausgeschnittenen Peptide schneidet;
3) eine Dipeptidyl-Aminopeptidase (als A bezeichnet), welche die Rest Glu-Ala und Asp-Ala entfernt.
Die Nucleotid-Sequenz dieses Vorläufers weist außerdem vier Restriktionsstellen HindIII auf, die durch einen Pfeil H angezeigt sind.
Es wurden mehrere Fusionen zwischen dem Gen des α- Pheromons und der reifen Sequenz des Hirudins durchgefuhrt. Die Hefe-Zellen vom Typ Matα können diese fusionierten Gene exprimieren. Die entsprechenden Hybrid-Proteine können dan prozessiert werden mit Signalen, die sie enthalten und die aus pre-pro-Sequenzen des Vorläufers des α-Pheromons stammen. Infolgedessen ist zu erwarten, daß Polypeptide, welche die Sequenz von Hirudin aufweisen, aus dem Kulturüberstand gewonnen werden.
Bei einer der Konstruktionen weist die Sequenz Scl an dem 3'-Ende einen Codon ATG auf, der dem Gen H vorausgeht; das fusionierte Protein enthält somit unmittelbar stromaufwärts von der ersten Aminosäure der reifen Sequenz des Hirudins ein Methionin. Dieses Polypeptid ergibt nach dem Schneiden mit Cyanbromid ein Hirudin-Molekül, das man nach einer Renaturierungsstufe aktivieren kann.
In anderen Konstruktionen dienen die Schneide-Signale, die normalerweise zur Herstellung des α-Pheromons verwendet werden, dazu, in dem Kulturüberstand Polypeptide zu bilden, die eine Antithrombin-Aktivität aufweisen. Dies ist der Fall, wenn die Sequenz Scl an ihrem 3'-Ende zwei Codons aufweist, die für Lys-Arg codieren, d.h. AAA oder AAG mit AGA oder AGG; das Polypeptid wurd durch eine Endopeptidase geschnitten, die bei COOh die Dipeptide Lys-Arg schneidet unter Freisetzung von Hirudin.
Die Erfindung betrifft insbesondere Konstruktionen, in denen die dem Gen des Hirudins vorhergehende Sequenz für eine der folgenden Aminosäuresequenzen codiert:
1) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gln Val Asp Gly Ser Met Hirudin ...,
2) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Hirudin ...,
3) Lys Arg Gly Ala Glu Ala Lys Arg Hirudin ...
4) Lys Arg Glu Ala Glu Ser Leu Asp Tyr Lys Arg Hirudin ... oder
5) Lys Arg Hirudin ...
Es ist selbstverständlich möglich, auch andere Sequenzen zu verwenden, die im Bereich der Aminosäuren durch ein Enzym selektiv geschnitten werden, mit der Ausnahme, daß diese Schnittstelle nicht auch in dem Hirudin selbst vorhanden ist.
Schließlich können die Expressions-Blöcke nach dem Gen H eine Terminator-Sequenz von Hefe, beispielsweise diejenige des Gens PGK, aufweisen.
Allgemein können die erfindungsgemäßen Expressions- Blöcke in eine Hefe, insbesondere in Saccharomyces, integriert sein, entweder in ein autonomes Replikations-Plasmid oder in das Chromosom der Hefe.
Wenn das Plasmid autonom ist, enthält es Elemente, die seine Replikation gewährleisten, d.h. einen Replikationsursprung, wie denjenigen des Plasmids 2 u. Außerdem kann das Plasmid Selektions-Elemente enthalten, z.B. das Gen URA3 oder LEU2, welche die Komplementierung der Hefen ura3&supmin; oder leu2&supmin; gewährleisten. Diese Plasmide können auch Elemente enthalten, die ihre Replikation in den Bakterien gewährleisten, wenn das Plasmid ein "Schuttle"-Plasmid sein muß, beisielsweise ein Replikations-Ürsprung wie derjenige von pBR322, ein Marker-Gen wie Ampr und/oder andere Elemente, die dem Fachmann bekannt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Hefestämme, die durch einen erfindungsgemäßen Expressionsblock transformiert worden sind, die entweder von einem Plasmid getragen werden oder in ihre Chromosomen integriert sind. Unter diesen Hefen können insbesondere die hefen des Genus Saccharomyces, insbesondere S. cerevisiae, genannt werden.
Wenn der Promotor derjenige des Gens von α-Pheromon ist, ist die Hefe vorzugsweise eine solche vom Sexual-Typ Matα. Man verwendet beispielsweise einen Stamm vom Genotyp ura3&supmin; oder leu2&supmin; oder einen anderen, komplementiert durch das Plasmid, um die Aufrechterhaltung des Plasmids in der Hefe durch einen geeigneten Selektions-Druck zu gewährleisten.
Obgleich es möglich ist, das Hirudin durch Fermentation der obengenannten transformierten Stämme in einem geeigneten Kulturmedium durch Akkumulation von Hirudin in den Zellen herzustellen, ist es dennoch bevorzugt, wie aus der vorstehenden Beschreibung hervorgeht, das Hirudin in das Medium sekretieren zu lassen, entweder in der reifen Form oder in Form eines Vorläufers, der in vitro prozessiert werden muß.
Diese Reifung kann in mehreren Stufen erfolgen. Zunächst müssen bestimmte Elemente, die aus der Translation der Sequenz Lex stammen, gespalten (geschnitten) werden, wobei diese Spaltung Schnitt) im Vereich der dem Scl entsprechenden Sequenz durchgeführt wird. Wie weiter oben angegeben, kann dem reifen Hirudin ein Methionin vorhergehen, das durch Bromcyan selektiv geschnitten wird. Dieses Verfahren ist anwendbar, weil die codierende Sequenz von Hirudin kein Methionin enthält.
Es ist auch möglich, an dem N-Ende das Dipeptid Lys- Arg vorzusehen, das in COOH durch eine spezifische Endopeptidase geschnitten wird; da dieses Enzym in dem Sekretions-Prozeß aktiv ist, kann man somit direkt das reife Protein in dem Medium erhalten. In bestimmten Fällen kann es jedoch erforderlich sein, nach der Sekretion eine enzymatische Spaltung (Schnitt) vorzusehen durch Zugabe eines spezifischen Enzyms.
In bestimmten Fällen kann es insbesondere nach einer Behandlung mit Bromcyan erforderlich sein, das Protein zu renaturieren durch Wiederherstellung der Disulfid-Brücken. Um dies zu erreichen, wird das Peptid beispielsweise mit Guanidiumhydrochlorid denaturiert, dann in Gegenwart von reduziertem und oxidiertem Glutathion renaturiert.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung das in den erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Hirudin.
Weitere Charakteristika und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus den nachstehenden Beispielen hervor. In den beigefügten Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 die Nucleotid-Sequenz des Fragments der cDNA von Hirudin, das in pTG 717 kloniert ist;
Fig. 2 die Nucleotidsequenz des Vorläufers des α-Sexual-Pheromons;
Fig. 3 eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTG834;
Fig. 4 eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTG880;
Fig. 5 eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTG882;
Fig. 6 eine schematische Darstellung der Konstruktion von M13TG882;
Fig. 7 eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTG874;
Fig. 8 eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTG876;
Fig. 9 eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTG881;
Fig. 10 eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTG886;
Fig. 11 eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTG897;
Fig. 12 eine Elektrophorese der Proteine mit einem PM > 1000 auf einem Acrylamid-Gel, die in dem Medium nach der Kultivierung von durch pTG886 und pTG897 transformierten Hefen erhalten wurden;
Fig. 13 eine Elektrophorese der Proteine mit einem PM > 1000 auf Acrylamid-Gel, die in dem Medium nach der Kultivierung von mit pTG886 und pTG897 transformierten Hefen erhalten wurden;
Fig. 14 eine schematische Darstellung der Konstruktion von pTG1805;
Fig. 15 eine Elektrophorese der Proteine mit einem PM > 1000 auf Acrylamid-Gel, die in dem Medium nach der Kultivierung von mit pTG847 und pTG1805 transformierten Hefen erhalten wurden; und
Fig. 16 ein schema, in dem die Aminosäuresequenzen stromabwärts von der ersten Spaltungsstelle (Schnittstelle) (Lys-Arg) in unterschiedlichen Konstruktionen miteinander verglichen werden.
Die Aminosäuresequenzen und Nucleotidsequenzen sind in der vorliegenden Beschreibung nicht enthalten, um diese nicht zu belasten, werden hiermit jedoch ausdrücklich zu einem Teil derselben gemacht.

Beispiel 1 - Konstruktion von pTG822

Ein Fragment er cDNA von Hirudin HV-2 wurde nach der Digestion des Plasmids pTG717 mit PstI aus einem Gel extrahiert, dann gleichzeitig mit den Enzymen HinfI und AhaIII digeriert. Das Enzym HinfI schneidet stromabwärts von dem ersten Codon der reifen Sequenz des Hirudins HV-2. Das Enzym AhaII schneidet etwa 30 Basenpaare hinter dem Stopp-Codon (3') der Hirudin-Sequenz ab. Das so erhaltene Fragment HinfI-AhaIII wurde auf Agarosegel isoliert und dann aus diesem Gel eluiert.
Die fur das reife Protein codierende Sequenz wurde in den Vektor pTG880 eingeführt. Der Vektor pTG880 ist ein Derivat des Vektors pTG838 (Fig. 3). Das Plasmid pTG838 ist identisch mit pTG833, ausgenommen der Teil, der die Stelle BglII betrifft, die nahe bei dem Transkriptions- Terminator von PGK ageordnet ist. Diese Stelle wurde durch die Ausfüllungswirkung der Klenow-Polymerase unterdrückt unter Bildung von pTG838.
Das Plasmid pTG833 ist ein Hefe-E. coli-Shuttle-Plasmid. Dieses Plasmid wurde entworfen, um die Fremd-Gene in der Hefe zu exprimieren. Die Basis-Elemente dieses Vektors (Fig. 3) sind die folgenden: das Gen URA3 als Selektions- Marker in der Hefe, der Replikationsursprung des Plasmids 2 u von Hefe, das Resistenz-Gen gegen Ampicillin und der Replikationsursprung des Plasmids pBR322 von E. coli (diese beiden zuletzt genannten Elemente erlauben die Vermehrung und Selektion dieses Plasmids in dem Colibacillus), die flankierende Region in 5'-Stellung des Gens PGK von Hefe mit der codierenden Sequenz dieses Gens bis zur Stelle SalI, das Fragment SalI-PvuII von pBR322 und der Terminator des Gens PGK (20). Dieses Plasmid wurde bereits in der französischen Patentanmeldung Nr. 84 07125 der Anmelderin, hinterlegt am 9. Mai 1984, beschrieben.
Das Plasmid pTG880 wurde konstruiert aus pTG838 (Fig. 4) durch Insertion einer kurzen Polylinker-Region (die aus einem Bakteriophagen M13 stammt) in das durch EcoRI und BglII geschnittene pTG838, was die Anordnung einer Reihe von Klonierungsstellen in der Reihenfolge BglII, PstI, HindIII, BamHI, SmaI und EcoRI unmittelbar nach der 5'-Region, die das Gen PGK von Hefe flankiert, erlaubt. Die DNA des Plasmids pTG880 wurde mit BglII und SmaI digeriert und das bei dieser Digestion erhaltene große Fragment wurde isoliert und aus einem Gel eluiert. Das Fragment HinfI/AhaIII von pTG717, das den Hauptteil des codierenden Sequenz von Hirudin HV-2 enthält, wurde mit dem digerierten pTG880 gemischt zur gleichen Zeit wie drei synthetische Oligonucleotide (Fig. 5), die zur Wiederherstellung der NH&sub2;-terminalen Region der Hirudin-Sequenz bestimmt sind und die Stelle BglII des Vektors mit der Stelle HinfI des Hirudin enthaltenden Fragments wieder verbinden. Diese Mischung wurde einer Ligationsbehandlung unterworfen, dann zur Transformation der Zellen von E. coli verwendet. Das Plasmid pTG882 wurde aus Transformanden gewonnen (abgetrennt).
Dieses Plasmid diente der Umwandlung der Hefezellen mit dem Ziel, Hirudin unter der Kontrolle des Promotors PGK zu bilden. Es wurde jedoch keine Hirudin-Aktivität in den Rohextraktion der mit diesem Vektor transformierten Zellen festgestellt. Der Grund für das Fehlen der Bildung von aktivem Hirudin ist noch nicht geklärt. Die Konstruktion pTG882 dient jedoch als Quelle für die Hirudin- Sequenz, die für die nachstehend beschriebenen Hefe-Sekretions-Vektoren codiert.

Beispiel 2 - Konstruktion von pTG886 und pTG897

Zunächst wurde das Fragment BglII-EcoRI (230 bp) von pTG882, das die Hirudin-Sequenz enthielt, in den Bacteriophagen M13mp8 (Fig. 6) zwichen die Stellen BamHI und EcoRI transferiert. Dies ergab den Phagen M13TG882, aus dem ein Fragment EcoRI-HindIII (etwa 245 bp) isoliert werden konnte. Dieses Fragment enthält die Gesamtheit der codierenden Sequenz des Hirudins HV-2, die Fusions-Stelle BamHI/BglII und kohäsive Enden (HindIII-EcoRI), welche die Klonierung in den Hefe-Sekretions-Vektor pTG881 erlauben (Fig. 9).
Das Plasmid pTG881 (10 kb) ist ein E. coli/Hefe- Schuttle-Plasmid, das sich autonom repliziert gleichzeitig in E. coli und in den Stämmen Saccharomyces cerevisiae uvarum und carlbergensis.
Die Einführung dieses Plasmids in E. coli erlaubt die Erzielung einer Resistenz gegen Ampicillin (und andere Antibiotika vom β-Lactam-Typ). Darüber hinaus trägt dieses Plasmid die Gene LEU2 und URA3 von Hefe, die in den Stämmen von E. coli und Saccharomyces exprimiert worden sind. Die Anwesenheit dieses Plasmids in E. coli oder in Saccharomyces erlaubt somit die Komplementierung von Stämmen, die defizitär an β-Isopropylmalat-Dehydrogenase oder an OMP-Decarboxyase sind.
Das Plasmid pTG881 wird auf die folgende Weise konstruiert:
Das Ausgangs-Plasmid ist das pTG848 (das mit dem in dem französischen Patent Nr. 83 15716 beschriebenen pTG849 identisch ist mit Ausnahme des Gens ura3, dessen Orientierung umgekehrt ist), es besteht aus den folgenden DNA- Fragmenten (Fig. 7):
1) Dem Fragment EcoRI-HindIII von etwa 3,3 kb, das aus dem Plasmid pJDB207 stammt (18). Die Stelle HindIII entspricht der Koordinate 105 des Plasmid 2 u in der Form B, die Stelle EcoRI entspricht der Koordinate 2243. In diesem Fragment findet sich das Gen LEU2, das durch Polydesoxyadenylat/Polydesoxythymidylat-Extension in die Stelle PstI des Fragments von 2 u in der Form B inseriert worden ist (18).
2) Dem Fragment HindIII des Gens URA3 (19).
3) Dem großen Fragment EcoRI (Koordinate 0)-SalI (Koordinate 650) von pBR322. In die Stelle PvuII dieses Fragments wurde das Fragment EcoRI-HindIII (dessen Enden vorher durch Klenow-Behandlung in Gegenwart von 4 Nucleotiden freigelegt worden sind) von 510 Basenpaaren, das dem Ende des Gens PGK entspricht, inseriert (20). Das Ende EcoRI, das aus dem Gen PGK gelöscht worden ist, regeneriert eine Stelle EcoRI, wenn es mit dem Ende PvuII von pBR322 verbunden wird.
4) Dem Fragment HindIII-SalI (2,15 kb) des Gens PGK (20).
Das Plasmid pTG848 wurde mit HindIII geschnitten, die Enden der auf diese Weise fregesetzten beden Fragmente wurden durch Klenow-Behandlung in Gegenwart von 4 Desoxyribonucleotiden freigelegt. Die beiden Fragmente wurden ligiert und vor der Transformation wurde diese Ligationsmischung der Wirkung von HindIII unterworfen, wodurch jede Form von Plasmid, die ein (oder zwei) stellen HindIII konserviert hatte, eliminiert werden konnte. Man transformiert den Stamm E. coli BJ5183 (pyrF) und selektioniert die Transformanden im Hinblick auf die Resistenz gegenüber Ampicillin und im Hinblick auf den Charakter pyr&spplus;. Man erhält so das Plasmid pTG874 (Fig. 7), in dem die beiden Stellen HindIII unterdrückt sind, wobei die Orientierung des Gens URA3 zu einer Transkription in der gleichen Orientierung wie diejenige des Gens der Phosphoglycerat-Konase (PGK) fürht.
Dieses Plasmid pTG874 wird mit SmaI und SalI geschnitten, das Fragment von 8,6 kg wird anschließend aus einem Agarosegel isoliert. Das Plasmid pTG864, welches das Fragment EcoRI-SalI (etwa 1,4 kg) des in die gleichen Stellen von pBR322 klonierten Gens MFα1 enthält, wird mit EcoRI geschnitten. Die Enden des auf diese Weise linearisierten Plasmids werden durch Klenow-Behandlung in Gegenwart von 4 Nucleotiden freigelegt. Anschließend wird eine Digestion mit dem Enzym SalI durchgeführt und das dem Gen MFα1 entsprechende Fragment EcoRI (freies Ende)-SalI wird isoliert. Das zuletzt genannte Fragment wird mit dem Stück SmaI-SalI (8,6 kb) von pTG874 ligiert, wobei man auf diese Weise das Plasmid pTG876 erhält (Fig. 8).
Um die Stelle BglII in der Nähe der Sequenz des Promotors MFα1 zu unterdrücken, wurde eine partielle Digestion des Plasmids pTG876 mit BglII mit anschließender Klenow-Behandlung in Gegenwart von 4 Desoxyribonucleotiden durchgeführt. Das erhaltene neue Plasmid pTG881 (Fig. 9) erlaubt die Insertion von codierenden Fremd-Sequenzen zwischen die erste Stelle HindIII des Gens MFα1 und die Stelle BglII des Endes des Gens PGK.
Wenn die Fusion mit der Stelle HindIII der codierenden Fremd-DNA die Herstellung einer Transformation in der gleichen Lesephase erlaubt, enthält das erhaltene Hybrid- Protein die Abschnitte pre-pro des α-Pheromons.
Die Klonierung des Fragments HindIII-EcoRI in pTG881, welches das Hirudin-Gen trägt, führt zu dem Plasmid pTG886 (Fig. 10). Wenn einmal die Klonierung durchgeführt worden ist, ist sie mit einer Stelle BglII stromabwärts von dem Fragment zu finden, was die Wiederherstellung des Fragments in der Form HinfI-BglII erlaubt, wobei die Stelle HinfI die gleiche ist wie diejenige, wie sie weiter oben verwendet wurde. Da BglII in pTG881 alleinstehend ist, ist es sehr leicht, das 5'-Ende der für das Hirudin codierenden Sequenz wieder herzustellen durch Verwendung von 3 Oligonucleotiden, welche die 5'-Sequenz des Hirudins wieder herstellen, und das lesen der Sequenz pre-pro des α- Pheromons in Phase, gefolgt von der reifen Sequenz des Hirudins, erlaubt.
Dieses neue Plasmid wird als pTG897 bezeichnet (Fig. 11).

Beispiel 3 - Expression von Hirudin durch Hefen

Die DNA von pTG897 diente der Transformation einer Hefe TGY1sp4 (Matα, ura3 - 251 - 373 - 328, his3- 11-15) in ura&spplus; nach einem bereits beschriebenen Verfahren (21).
Eine transformierte Kolonie wurde überimpft und diente der Impfung von 10 ml Minimal-Medium + Casaminosäuren (0,5 %). Nach 20 stündiger Kultivierung wurden die Zellen zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Eindampfen (Zentrifugieren unter Vakuum) konzentriert.
Parallel dazu wurden eine Kultur von TGY1sp4, die mit pTG886 transformiert worden war, und eine Kultur von TGY1sp4, die durch ein Plasmid transformeirt worden war, das keine Sequenz für Hirudin trug (TGY1sp4/pTG856) behandelt. Die trockenen Blutgerinnsel wurden in 50 ul Wasser wieder aufgenommen und 20 ul wurden in Gegenwart von 2,8 % SDS und 100 mM Mercaptoethanol zum Sieden erhitzt, dann auf Acrylamid-SDS-Gel (15 % Acrylamid, 0,1 % SDS) abgeschieden (22). Nach dem Fixieren and Anfärben mit Coosmassie-Blau konnten Polypeptide nachgewiesen werden, die sich in den Kulturüberständen von TGY1sp4/pTG886 und TGY1sp4/pTG897 anreicherten und in dem überstand der Kontroll-Kultur fehlten (Fig. 12). Darüber hinaus wurden diese Reihen von ergänzenden Peptiden mit ³&sup5;S-Cystein stark markiert, wie für Hirudin-Peptide zu erwarten war, da dieses Molekül sehr reich an Cystein ist (Fig. 10).
Die in den Fig. 12 und 13 dargestellten Elektrophoresen wurden wie folgt durchgeführt:
Für die Fig. 12 wurden die Extrakte auf die folgende Weise hergestellt: 10 ml Minimal-Medium (Hefe-Stickstoff- Basis-Difco ohne Aminosäure (6,7 g/l) Glucose 910 g/l), ergänzt mit 0,5 % Casaminosäuren, wurden mit verschiedenen Stämmen geimpft und 20 h lang kultiviert (stationäre Phase). Die Zellen wurde zentrifugiert, der Überstand wurde gegen Wasser dialysiert (Retention-Minimum: PM 1000), dann durch Zentrifugieren unter Vakuum getrocknet. Die Proben wurden anschließend mit 50 ul Beschickungs-Puffer aufgenommen, von denen 20 ul wie vorstehend beschrieben behandelt wurden, und auf Acrylamid-SDS-Gel (15 % Acrylamid, 0,1 % SDS) abgeschieden (22).
Die verwendeten Stämme waren folgende:
. Vertiefung 2: TGY1sp4, transformiert durch ein Plasmid, das keine Hirudin-Sequenz enthielt (Kontrolle);
. Vertiefung 3: TGY1sp4, transformiert durch pTG886;
. Vertiefung 4: TGY1sp4, transformiert durch pTG897;
. Vertiefung 1: in der Vertiefung 1 wurden die Referenz-Marker (LMW Kit der Firma Pharmacia; von oben nach unten: 94 000, 67 000, 43 000, 30 000, 20 100, 14 000) abgeschieden.
Die Banden wurden durch Färbung mit Coomassie R-250- Blau sichtbar gemacht.
Für die Fig. 13 wurden die Extrakte wie folgt hergestellt: 100 ml Minimal-Medium + 40 ug/ml Histidin wurden mit unterschiedlichen Stämmen geimpft für die Herstellung von Übernacht-Kulturen. Wenn die Zelldichte etwa 5x10&sup6; (exponentielle Wachstumsphase) erreicht hat, werden 40 ul ³&sup5;S-Cystein (9,8 mCi/ml; 1015 Ci/mmol) zu jeder Kultur zugegeben. Nach 10 min werden die Zellen zentrifugiert, in 10 ml Komplett-Medium (30ºC) aufgenommen und unter Rühren bei 30ºC inkubiert. Nach 3 h werden die 10 ml Kulturüberstand gegen Wasser dialysiert und bis auf ein Volumen von 0,5 ml eingeengt, wie für die Fig. 12 beschrieben. Es werden etwa 35 000 cpm (40 ul) auf einem Acrylamid-SDS-Gel (15 % Acrylamid, 0,1 % SDS) abgeschieden. Die Protein-Banden werden nach der Fluorographie sichtbar gemacht.
Die verwendeten Stämme sind folgende:
. Vertiefung 2: TGY1sp4, transformiert durch ein Plasmid, das keine Hirudin-Sequenz enthält;
. Vertiefung 3: TGY1sp4, transformiert durch pTG886;
. Vertiefung 4: TGY1sp4, transformiert durch pTG897;
. Vertiefung 1: in der Vertiefung 1 wurden Marker, deren Molekulargewichte angegeben sind (x10³) abgeschieden.
Wenn die Kulturüberstände, die dieses Polypeptide enthielten, im Hinblick auf ihre Antithrombin-Aktivität getestet wurden, konnte jedoch keine Aktivität nachgewiesen werden.
Im Falle des durch TGY1sp4/pTG886 exkretierten Polypeptids wurde angenommen, daß es die normalen Spaltungsstufen des Vorläufers des α-Pheromons durchläuft unter Bildung eines Hirudinmoleküls, das an seinem NH&sub2;-Ende um 8 Aminosäuren verlängert ist. Es ist daher nicht überraschend, daß das durch die Zellen TGY1sp4/pTG886 sekretierte Polypeptid nicht aktiv ist.
Dagegen war im Fall des durch TGY1sp4/pTG897 sekretierten Polypeptids zu erwarten, daß das Polypeptid mit dem natürlichen Protein identisch und damit aktiv ist. Es gibt mehrere Hypothesen, welche das Fehlen der Aktivität erklärlich machen können:
1) Die Ausreifung des Proteins ist nicht vollständig, an NH&sub2; können Glu-Ala-Reste verbleiben, wie dies von EGF beschrieben wurde (16).
2) Das Protein ist nicht aktiv, weil es keine gute Konformation hat oder auch weil in dem Kulturüberstand Proteine oder Moleküle mit einem Molekulargewicht von 1000 vorhanden sind, welche die Aktivität hemmen.
3) Das Protein ist nicht vollständig, weil es eine intrazelluläre und/oder extrazelluläre Proteolyse erlitten hat.

Beispiel 4 - Aktivierung durch Schneiden mit Bromcyan

Wenn die Ursache für das Fehlen von Aktivität an die Anwesenheit von zusätzlichen Aminosäuren in der NH&sub2;-terminalen Stellung gebunden ist, muß es möglich sein, die Aktivität wieder zu erlangen durch Schneiden des durch TGY1sp4/pTG886 sekretierten Peptids mit Bromcyan. Dieses Reagens ist nämlich spezifisch für Methionin-Reste und das durch pTG886 codierte fusionierte Protein enthält nur ein einziges Methionin. Dieses Reaktion wurde wie folgt durchgeführt: Hefen, die entweder das Plasmid pTG886 oder ein Kontroll-Plasmid, das kein Hirudin-Insert aufwies, enthelten, wurden in 10 ml Medium 24 h lang kultiviert. Zu diesem Zeitpunkt erreichte die Kultur eine Dichte von 7 bis 10.10&sup7; Zellen/ml. Der Kulturüberstand wird von den Zellen getrennt, gegen destilliertes Wasser intensiv dialysiert und dann lyophilisiert. Das trockene Pulver wird in 1 ml 70 %iger Ameisensäure gelöst und ein aliquoter Anteil wird verwendet zur Bestimmung des Gesamtgehaltes an Proteinen (mit der Färbemethode mit Coomassie-Blau mit den von der Firma Biorad vertriebenen Reagentien); der Rest des Präparats wird mit 1 ml frischer Bromcyanlösung mit einer Konzentration von 30 mg/ml in 70 %iger Ameisensäure behandelt.
Nach der Eliminierung von Sauerstoff durch einen Stickstoffstrom werden die Reagensröhrchen 4 h lang im Dunkeln bei Umgebungstemperatur inkubiert. Alle Manipulationen in Gegenwart von Bromcyan werden unter Anwendung geeigneter Vorsichtsmaßnahmen und in einem belüfteten Abzug durchgeführt. Die Spaltungsreaktion mit Bromcyan wird durch Zugabe von 10 Volumenteilen destilliertem Wasser abgestoppt, dann wird die Lösung lyophilisert.
Die gespaltenen Peptide werden in 10 ml destilliertem Wasser wieder aufgelöst und zweimal lyophilisiert. Zum Schluß werden die Peptide in einem geringen Volumen destilliertem Wasser gelöst und ein aliquoter Anteil wird verwendet zur Messung der Antithrombin-Aktivität. Der Rest der Probe wird lyophilisiert und den weiter unten beschriebenen beiden Renaturierungsstufen unterworfen.
Das die Aktivität des Hirudins von der Anwesenheit von Disulfid-Brücken in dem Molekül abhängt (1), ist es wahrscheinlich, daß das mit Bromcyan abgespaltene Peptid in korrtekter Weise renaturiert werden muß, um eine biologische Aktivität aufzuweisen. Die abgespaltenen Peptide wurden daher einer Denaturierung in 5 M GuHCl, gefolgt von einer Renaturierung, nach einem an sich bekannten Verfahren unterworfen.
Zusammenfassend werden die lyophilisierten Peptide in 400 ul 5 M Guanidiumhydrochlorid (GuHCl) in 250 mM Tris- HCl, pH 9,0, gelöst; anschließend macht man die Lösung 2 mM an reduziertem Glutathion und 0,2 mM an oxidiertem Glutathion in einem Endvolumen von 2,0 ml (die Endkonzentration beträgt 1,0 M GuHCl und 50 mM Tris).
Nach 16-stündiger Inkubation bei 23ºC im Dunkeln werden die Proben 24 h lang dreimal gegen 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, bei 23ºC dialysiert und das Schluß-Dialysat wird durch Zentrifugieren geklärt.
Alschließend bestimmt man die Antithrombin-Aktivität der Kulturüberstände. Das Ergebnis dieses Versuchs, dargestellt in der Tabelle I, zeigt eindeutig eine Rückgewinnung der Antithrombin-Aktivität in den Kulturüberständen der Zellen, die durch das Plasmid pTG886 infiziert worden sind, während keine Aktivität bei dem Kontroll-Plasmid auftritt. Tabelle I Antithrombin-Aktivität der Kulturüberstände von Hefezellen Plasmid Behandlung des Kulturüberstandes Aktivität (U/ml) spezifische Aktivität (U/mg) der ursprünglichen Proteine Kontrolle nach der Spaltung, vor der Renaturierung
Zusammenfassend können Hefezelen, die ein rekombinantes Plasmid tragen, nach der Spaltungs- und Renaturierungsreaktion ein Peptid sekretieren, das die biologische Aktivität von Hirudin aufweist. Dies zeigt, daß die Anwesenheit von zusätzlichen Aminosäuren in NH&sub2;-terminaler Stellung genügt, um das Fehlen der Aktivität der Polypeptide zu erklären, die in den Kulturen von TGY1sp4/pTG886 vorhanden sind und wahrscheinlich auch im Falle der Kulturen von TGY1sp4/pTG897 (Glu-Ala-Schwänze).

Beispiel 5 - Einführung einer neuen Schnittstelle unmittelbar vor der ersten Aminosäure der codierenden Sequenz von Hirudin HV-2 - Plasmid pTG1805

Bei der Konstruktion von pTG897 besteht die Gefahr, daß das sekretierte Peptid in NH&sub2;-Stellung Glu-Ala- Schwänze behält, was das Fehlen einer Antithrombin-Aktivität dieses Materials erklären würde. Wenn diese Hypothese der Wirklichkeit entspricht, muß es möglich sein, die Aktivität direkt wiederzugewinnen in dem Kulturüberstand durch Erzeugung einer Schnittstelle zwischen den Glu-Ala- Resten und der ersten Aminosäures des Hirudin HV-2 (Isoleucin). Dies wurde durchgeführt durch Anfügen einer Sequenz, die für das Dublett LysArg codiert, welche die Erkennungsstelle für die Endopeptidase darstellt, die an der Reifung des Vorläufers des Pheromons beteiligt ist (Fig. 2). Die Konstruktion wurde wie für das Plasmid pTG897 beschrieben erhalten, ausgenommen die Sequenz von zwei synthetischen Oligonucleotiden (Fig. 14). Das resultierende Plasmid wird als pTG1805 bezeichnet. Das Plasmid dient dazu, den Stamm TGY1sp4 in ura&spplus; zu transformieren. Das in den Kulturüberstand sekretierte Material wurde auf einem Elektrophoresegel analysiert, wei weiter oben beschrieben, und mit dem Material verglichen, das mit TGY1sp4/pTG897 erhalten wurde (Fig. 15).
Die verwendeten Stämme sind die folgenden:
. Vertiefung 1: Marker, identisch mit denjenigen der Fig. 12;
. Vertiefung 2: TGY1sp4, transformiert durch pTG897;
. Vertiefung 3: TGY1sp4, transformiert durch pTG1805;
. Vertiefung 4: Kontrolle, die kein Hirudin bildet.
Die für den Stamm TGY1sp4/pTG1805 spezifischen Polypeptide wandern langsamer als diejenigen, die für den Stamm TGY1sp4/pTG897 spezifisch sind. Dieses Ergebnis läßt vermuten, daß die neue Spaltungsstelle durch die entsprechende Endopeptidase nicht wirksam ausgenutzt wurde. Dennoch zeigt die Bestimmung des Hirudins in dem Kulturüberstand durch die biologische Aktivität, daß ein geringer Teil dieses Materials aktiv ist, gegenüber dem, was mit den Kulturen TGY1sp4/pTG897 erhalten wird, das eindeutig inaktiv ist (Tabelle II). Tabelle II Antithromibn-Aktivität der Kulturüberstände von Hefekulturen (10 ml) Plasmid spezifische Aktivität (U/mg) Gesamtaktivität (U) (10 ml) nicht nachweisbar

Beispiel 6 - neue Konstruktion einer neuen wirksameren Schnittstelle, welche die Freisetzung von reifem Hirudin erlaubt

Bei der obengenannten Konstruktion (pTG897) wurde nur eine geringe Hirudin-Aktivität in dem Kulturüberstand erhalten, wahrscheinlich weil die zweite Schnittstelle (Spaltungsstelle), die dazu bestimmt ist, reifes Hirudin freizusetzen, mit geringer Wirksamkeit erkannt wird. Es wurde daher eine neue Konstruktion durchgeführt, die dazu bestimmt war, diese zusätzliche Spaltungsstelle (Schnittstelle) für die Endopeptidase besser erkennbar zu machen durch Hinzufügung in der Stromaufwärts-Richtung einer Sequenz der drei Aminosäuren Ser leu Asp, die natürlicherweise stromaufwärts von dem ersten Dublett LysArg vorhanden ist (Fig. 2 und 16).
Die angewendete Technik ist die gleiche wie diejenige, wie sie weiter oben beschrieben wurde, ausgenommen die Oligonucleotide, deren Sequenzen nachstehend angegeben sind:
Die Aminosäuresequenz in der Spaltungsregion ist in der Fig. 13 angegeben. Das entsprechende Plasmid wird als pTG818 bezeichnet und unterscheidet sich von pTG1805 nur durch die Insertion der Nucleotide 5'-TTG GAT AAA, die den Codons Ser-Leu-Asp entsprechen.
Die in den Überständen der Kulturen von TGY1sp4/pTG1818 nach den bereits beschriebenen Standardbedingungen bestimmte Aktivität beträgt etwa 200 Einheiten auf 10 ml Kultur und ist etwa 100 mal höher als diejenige, die in dem obengenannten Beipsiel gefunden wurde. Es sei darauf hingewiesen, daß die Bestimmung mit 10 ml nichtkonzentriertem Kulturmedium durchgeführt werden kann.

Beispiel 7 - Konstruktion, die zur Synthese eines Vorläufers führt, der frei von den Sequenzen Glu-Ala-Glu-Ala ist

In den beiden vorhergehenden Beispielen wurde gezeigt, daß die hinzufügung einer neuen Stelle Lys Arg unmittelbar stromaufwärts des Beginns der reifen Hirudin-Sequenz die Freisetzung von aktivem Material in dem Kulturüberstand erlaubte. Wenn jedoch das Schneiden des Vorläufers an der ersten Stelle Lys Arg (im Abstand zum Beginn der reifen Sequenz) durchgeführt wird, kann man in diesen Beispielen in dem Kulturmedium eine schwerere inaktive Kontaminante erhalten, die Hirudin-Ketten entspricht, die an dem NH&sub2;-Ende verlängert sind. Dies gilt insbesondere im Fale der Kulturen von TGY1sp4/pTG1805, in denen die inaktive Kontaminante überwiegt. Dies bleibt auch erklärlich für den Fall der Kulturen von TGY1sp4/pTG1818, in denen die inaktive Kontaminante nicht überwiegt, jedoch vorhanden sein kann, wie für andere im Falle von EGF beschrieben (15). Um diesen Ausbeuteverlust zu vermeiden, den die Synthese an inaktivem Material darstellt, wurde entscheiden, eine neue Konstruktion durchzuführen, die zur Synthese eines Vorläufers führt, der sich von demjenigen, der durch die Zellen TGY1sp4/pTG897 synthetisiert wurde, nur durch das Fehlen der Sequenz Glu Ala Glu Ala zwischen der Schnittstelle Lys Arg und der ersten Aminosäure der reifen Hirudin-Sequenz unterscheidet.
Die folgenden Stämme wurden bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) des INSTITUT PASTEUER, 28 rue du Docteur-Roux, Paris, 15ème, am 30. April 1985 hinterlegt:
. TGY1sp4/pTG1818: Saccharomyces cerevisiae, Stamm TGY1sp4 (Matα ura3-251-373-328-his 3-11-15), transformiert durch ein Plasmid pTG1818 in ura&spplus;; Hinterlegungsnummer I 441;
. TGY1sp4/pT886: Saccharomyces cerevisiae, Stamm TGY1sp4 (Matα ura3-251-373-328-his 3-11-15), transformiert durch ein Plasmid pTG886 in ura&spplus;; Hinterlegungsnummer I 442;

Literaturstellen

1. D. Bagdy, E. Barabas, L. Fraf, T.E. Petersen und S. Nagnussen, "Methods in Enzymology", Teil B, Band 45, S. 669-678 (176).
2. F. Markwardt, "Methods in Enzymology", ed. G.E. Perlman und L. Lorand, "Academic Press", Band 19, S. 924- 932 (1970).
3. F. Markwardt, J. Hauptmann, G. Nowak, Ch. Klessen und P. Walsmann, "Thromb. Hemistasis" (Stuttgart) 47, 226-229 (1982).
4. P. Walsmann und F. Markwardt, "Die Pharmazie" 10, 653-660 (1981).
5. Th. Kloss und U. Mittmann, "Longenbecks Arch. Chirurg.", 358, 548 (1982).
6. A. Ishikawa, R. Hafter, U. Seemuller, J.M. Gokel und M. Graeff, "Thrombosis Research", 19, 351-358 (1980).
7. F. Markwardt, G. Nowak, J. Sturzebecker, U. Greisbadi, P. Walsmann und G. Vogel, "Thromb. Hemostatis" (Stuttgart), 52, 160-163 (1984).
8. C. Nowak und F. Markwardt, "Expt. Path.", 18, 438-443 (1980).
9. F. Markwardt, G. Nowak, J. Sturzenbecker, U. Greisback, P. Walsmann und G. Vogel, "Thromb. Hemostatis", 52, 160-163 (1984).
10. A.H. Sutor, S. Knop und D. Adler, "Kontrolle Antithrombotica", 23rd Symp. "Blutgerinnung", Hamburg, S. 117-123 (1981).
11. T.E. Petersen, H.R. Roberts, L. Sottrup-Jensen, S. Magnusson und D. Badgy, "Protides Biol. Fluids, Proc. Colloq." Band 23, S. 145-149 (1986).
12. J.-Y. Chang, "Febs Lett.", 164, 307-313 (1983).
13. I.P. Baskova, D.U. Cherkesova und V.V. Mosolov, "Thromb. Res.", 30, 459-467 (1983).
14. H. Bussey, D. Saville, D. Greene et al., "Mol Cell. Biol.", 3, 1362-1370 (1983).
15. A.J. Brake, J.P. Merryweather, D.G. Coit, U.A. Heberlein, F.R. Mariarz, G.T. Mullenbach, M.S. Urdea, P. Valenzuela und P.F. Barr, "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA, 81, 4642-4646 (1984).
16. G.A. Bitter, K.K. Chen, A.R. Banks und P.H. Lai, "Proc. Natl. Acad. Sci", USA, 81, 5330-5334 (1984).
17. J. Kurjan und I. Herskowitz, "Cell", 30, 933-943 (1982).
18. J. Beggs, "Genetic Engineering", 2, 175-203 (1981).
19. M.L. Bach, F. Lacroute und D. Botstein, "Proc. Natl. Acad. Sci.", (USA), 76, 386-390 (1979).
20. R.A. Hitzeman, E.F. Hagie, J.S. Hayfflick et al., "Nucleic Acids Res.", 10, 7791-7808 (1982).
21. H. Ito, Y. Fukuda, K. Murata und A. Kimura, "J. Bacteriol", 153, 163-168 (1983).
22. V.K.C. Laemmli, "Nature", 227, 680-685 (1970).

Claims

1. Hefe, die transformiert worden ist durch einen funktionellen DNA-Block, der integriert ist in ein Plasmid, das einen Replikationsursprung in der Hefe aufweist, oder integriert ist in ein Chromosom der genannten hefe, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Block umfaßt mndestens:

- eine DNA-Sequenz, die für Hirudin, eine seiner Varianten oder einen Vorläufer desselben (Gen H) codiert,

- eine Leader-Sequenz (Lex), welche die für die Erzielung der Exkretion des Produkts des Gens erforderlichen Elemente aufweist, und

- eine DNA-Sequenz (Str), welche die Signale aufweist, welche die Transkription des Gens H durch die Hefe gewährleisten.

2. Transformierte Hefe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte funktionelle Block ab dem 5'-Ende bis zu dem 3'-Ende mindestens die folgenden Sequenzen aufweist:

- eine Sequenz (Str), welche die Signale aufweist, welche die Transkription des Gens h durch die Hefe gewährleisten,

- eine Leader-Sequenz (Lex), welche die für die Erzielung der Exkretion des Produkts des Gens erfoderlichen Elemente aufweist,

- das Gen, das für Hirudin, eine seiner Varianten oder einen Vorläufer desselben codiert, und

- das Gen, das für Hirudin oder eine seiner Varianten oder Vorläufer desselben codiert, dem eine Schnittstelle Scl vorausgeht.

3. Hefe nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz Lex diejenige des α-Sexual- Pheromons von Hefe ist.

4. Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Leader-Sequenz das Fragment ("pre" des α-Sexual-Pheromons von Hefe umfaßt.

5. Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Block die Sequenz pre-pro des α-Sexual-Pheromons von Hefe an dem 5'-Ende des Gens H aufweist.

6. Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß auf das Gen H eine Terminator-Sequenz von Hefe folgt.

7. Hefe nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Terminator-Sequenz von Hefe diejenige des Gens PGK ist.

8. hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Schnittstelle (Spaltungsstelle) das Dipeptid Lys-Arg ist.

9. Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der funktionelle Block in ein Plasmid integriert ist, das mindestens einen Replikationsursprung in den Hefen aufweist.

10. Hefe nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Replikationsursprung derjenige des Plasmids 2 u ist.

11. Hefe nach einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid außerdem einen Selektionscharakter aufweist.

12. Hefe nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionscharakter durch das Gen URA3 gegeben ist.

13. Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um eine hefe des Genus Saccharomyces handelt.

14. Hefe nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Sexual-Typ Matalpha darstellt.

15. Hefe nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um einen Stamm von S. cerevisiae handelt.

16. Verfahren zur Herstellung von Hirudin durch Fermentation einer Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 15 auf einem Kulturmedium und Gewinnung (Abtrennung) des in dem Kulturmedium gebildeten Hirudins.

17. Verfahren zur Herstellung von Hirudin durch Fermentation einer Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß man:

a) einen Hefe-Stamm, der einen funktionellen DNA-Block aufweist, der von einem Plasmid getragen wird oder integriert ist in ein Chromosom der genannten Hefe, auf einem Kulturmedium kultiviert, wobei die Hefe dadurch charakterisiert ist, daß sie mindestens die Sequenz aufweist:

in der:

. Str steht für eine DNA-Sequenz, welche die Signale aufweist, welche die Transkription des Gens H durch die Hefe gewährleisten,

. Lex steht für eine Leader-Sequenz, welche die Erzielung der Exkretion von reifem Hirudin oder in Form eines in vitro reifungsfähigen Vorläufers des Hirudins erlaubt,

. Scl steht für ein DNA-Signal, das für eine Schnittstelle codiert, die ausgewählt wird aus ATG und den Sequenzen, die für Lys-Arg codieren; und

b) das in dem Kulturmedium gebildete Hirudin in reifer Form oder in Form eines in vitro reifungsfähigen Hirudinvorläufers gewinnt (abtrennt).

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz Scl-Gen H eine Sequenz aufweist, die für die Sequenz Lys-Arg-Ile-Thr codiert.

19. Extrakorporaler Blutkreislauf, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des Kreislaufes, der mit dem Blut in Kontakt steht, eine neutrale Hirudin-Oberfläche aufweist, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18 erhalten worden ist.

20. Antikoagulans-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie Hefen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Mittel enthält, das Hirudin freisetzt.

21. Zusammensetzung zur Sichtbarmachung der Bildung eines Blutgerinnsels, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus dem markierten Hirudin besteht, das nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18 erhalten worden ist.