HU202919B - Process for producing vectors for expressing and secreting hirudin in transformed yeasts - Google Patents

Process for producing vectors for expressing and secreting hirudin in transformed yeasts Download PDF

Info

Publication number
HU202919B
HU202919B HU863185A HU318586A HU202919B HU 202919 B HU202919 B HU 202919B HU 863185 A HU863185 A HU 863185A HU 318586 A HU318586 A HU 318586A HU 202919 B HU202919 B HU 202919B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hirudin
sequence
gene
yeast
plasmid
Prior art date
Application number
HU863185A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT42131A (en
Inventor
Jean-Pierre Lecocq
Yves Lemoine
Gerard Loison
Paul Tolstoshev
Original Assignee
Transgene Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transgene Sa filed Critical Transgene Sa
Publication of HUT42131A publication Critical patent/HUT42131A/hu
Publication of HU202919B publication Critical patent/HU202919B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Instructional Devices (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • Developing Agents For Electrophotography (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás olyan DNS szekvenciák kifejezésére szolgáló vektorok előállítására, amelyek valamely hirudint vagy hirudin-analógot kódolnak, továbbá eljárás a hirudin kiválasztására, az ezekkel a vektorokkal transzformált élesztők segítségével.
Az orvosi pióca (Hirudo medicinaüs) nyálmirigyeiben jelen levő antikoaguláns aktivitás eredete a hirudinként ismert kis polipeptidre vezethető vissza (1). Ezt a fajlagos és nagyon hatásos trombin-inhibitort széles körben tanulmányozták az utóbbi időkben, mivel ez potenciálisan egy nagyon hatásos gyógyászati szer. Az izolálás és tisztítás különleges nehézségei és költségei azonban akadályt jelentenek abban, hogy ezt széles körben használják, és e miatt még az a lehetőség is kizárt, hogy klinikai szempontból tanulmányozzák.
A hirudin előállításának lehetőségét a gének klónozásával és ezek kifejezésével rekombináns DNS-technikát alkalmazva már bemutatták olyan természetes piócagén klónozásával, amely hirudint kódol, és ennek kifejezésével E. coli mikroorganizmusban (84/04 755 számú francia szabadalmi bejelentés, a bejelentő cég nevében benyújtva 1984. március 27-én). Bár már lehetséges E. coliban előállítani hirudin biológiai aktivitásával rendelkező peptidet, nagyon fontos hirudint előállítani más típusú mikroorganizmusokban is. A hirudin klinikai alkalmazása megköveteli, hogy a termék nagy tisztaságú legyen. A pirogén szennyeződések eltávolítása problémákat okozhat a hirudin tisztításánál a coli-bacillus kivonatokból.
Ezenkívül az E. coli-ban szintetizált hirudin intracelluláris marad, és e miatt nagy számú egyéb E. coli eredetű pepiidtől kell megtisztítani. Ezért előnyös a hirudin gént olyan élesztőkben kifejezni, amely nem termel emberekre nézve pirogén vagy toxikus anyagokat, és amely képes a fehérjéket a tenyészkőzegbe kiválasztani.
A hirudin, mint antikoaguláns hatásmechanizmusát csak most kezdik tudni megmagyarázni. A hirudin kötődéséhez szolgáló szubsztrátum a trombin nevű proteolitikus enzim, amely a protrombin nevű zimogén formájából való aktiválás után (X faktorral aktiválva) a fibrinogént elhasítja a vérkeringésben és fibrinné alakítja, amely a vérrögök képződéséhez szükséges. Az 1:1 arányú trombin-hirudin komplex disszociációs állandója (0,8 · 10‘10) rendkívül erős asszociációt jelez ezek között a molekulák között (2). Gyakorlatilag az e két molekula által alkotott nem kovalens komplexet in vivő nem disszociálhatónak lehet tekinteni.
A hirudin a trombinnak nagyon fajlagos inhibitora, sokkal nagyobb aktivitással, mint a természetes szubsztrátum, a fibrinogén. Ezenkívül szükséges, hogy más koagulációs faktorok vagy más plazmaalkotórészek is jelen legyenek. A hirudin fajlagos és nagyon jelentős antitrombin aktivitása nyilvánvalóvá teszi, hogy klinikailag is lehet alkalmazni antikoagulánsként.
A hirudint nagyon jelentős mértékben tanulmányozták állatokban antikoaguláns tulajdonságaik vonatkozásában. A legrészletesebb tanulmány (3) leírja a hirudin aktivitását a vénás trombózisok, a veredény-elzáródások és a kiterjedt véredényen belüli koagulációk (DIC) megelőzésében patkányokban. A hirudint a patkányok, kutyák, nyulak és egerek nagyon tiszta formában és intravénás injekcióban beadva jól tűrik. Az LD50 érték egerekben több, mint 500 000 egység /testsúlykilogramm (azaz mintegy 60 mg/kg). Egy másik tanulmány (4) azt mutatja, hogy az egerek 1 g/kg-ig terjedő, a nyulak 10 mg/kg-ig terjedő adagokat tűrnek, akár intravénásán, akár szubkután. Egerekben az ismételt injekciók kéthetes időtartamon át nem vezetnek érzékennyé tételt mutatű reakciókat.
Ezenkívül a kísérleti állatokban a hirudin gyorsan eltűnik a veséken át (a felezési idő 1 órás nagyságrendben van), még biológiailag aktív formában (3).
Két további független tanulmány, amelyek közül az egyikben (5) kutyákat alkalmaztak, másik (6) pedig a hirudin aktivitását mutatja be a DIC megelőzésére patkányokban, megerősíti van Markwardt és munkatársai pozitív eredményeit. Ezek a kutatók nemrégiben hozták nyilvánosságra a természetes hirudin humán vérzéscsillapító rendszerre gyakorolt hatásainak in vivő elemzését (7). A kezelt beteg a várt biológiai hatást mutatta toxikus mellékhatások bármiféle jele nélkül.
Ki tudták azt is mutatni, hogy a hirudin megakadályozza az endotoxinok által indukált DIC kialakulását sertésekben (8), és így az endotoxémiák által okozott nagyon súlyos problémák, amelyek a sertésekben jelentős elhulláshoz vezetnek, egy lehetséges megoldását jelentheti.
Egy újabb közlemény (7) leírja a hirudin intravénás és szubkután beadását emberekbe. Hat önkéntest alkalmaztak 1000 AT-egység/kg egyedi hirudin-adag farmakokinetikájának és vérzéscsillapító rendszerre való hatásának kiértékelésére. Intravénásán adagolva, a hirudin felezési ideje 50 perc, és a hirudin 50 %-a aktív formában jelenik meg a vizeletben az injekciót követő 24 óra során. A koagulációs idő (in vitro mérve trombinra, tromboplasztinra és protrombinra) elnyújtása figyelhető meg a plazmában levő hirudin koncentrációjától függően, ami azt mutatja, hogy a molekula megtartja biológiai aktivitását a beteg vérkeringésében. Nem figyelhető meg változás a vérlemezkék számában, a fibrinogén-szintben vagy a fibrinolitikus rendszerijén. Az intravénás injekciókhoz hasonlóan a hirudin szubkután injekcióit is jól tűrik, a kísérleti személyen mellékhatás nem jelentkezik. Allergiás reakciók esetleges megjelenésének vizsgálatára két intrakután injekciót adtak be ugyanabba a kezelt személybe 4 hetes időközökben; az érzékennyététel semmiféle jelét nem észlelték. Sőt antihirudin antitesteket sem mutatnak ki a szérumban.
Ezek a tanulmányok azt sejtetik, hogy a hirudin olyan klinikai szer lehet, amely antikoagulánsként használható. Mivel a hirudin nagyon fajlagos a vér koagulációjának az előfázisára nem hat. Az antitrombinaktivitás dózisfüggő, és a hirudin hatása gyorsan reverzibilis, mivel a vesén keresztül gyorsan eltűnik. Ki lehetett azt is mutatni, hogy a hirudin sokkal hatásosabb a heparinnál a DIC kezelésében (3, 6), amint ez várható is volt annak a ténynek az ismeretében, hogy a DIC az antitrombin Hl (a heparin tevékenységéhez
HU 202 919 Β szükséges kofaktor) csökkenésével és egy 4. vérlemezke-faktor, (amely nagyon hatásos heparinellenes szer) kibocsátásával jár.
Egy tanulmány azt a lehetőséget mutatja be, hogy a hirudint az emberek bőre abszorbeálhatja (9), bár az eredmények ugyancsak nehezen magyarázhatók.
Piócák sejtmentes nyers extraktumai kereskedelmi készítményként rendelkezésre állnak mint kenőcsök (Hirucreme, Societé Nicholas, Franciaország, Exhirud-Blutgel, Plantorgan Werke, Német Szövetségi Köztársaság), de további vizsgálatok szükségesek nagymértékben tisztított anyag nagyobb adagjaival, annak megállapítására, hogy vajon ez-e az előnyös adagolási mód. Általában az előnyös adagolási mód az intravénás és intramuszkuláris és a perkután út. Más hirudinadagolási módról is beszámoltak már, főleg az orális útról (BSM N° 3,792 M).
Más komponensekkel kombinálva ez a tennék alkalmazható a pikkelysömör és más, hasonló típusú bőrrendellenességek kezelésére is, amint ezt a 2 101 393 számú NSZK-beli szabadalmi közzétételi irat leírja.
A hirudint ezenkívül lehet alkalmazni antikoaguláns szerként klinikai laboratóriumi vizsgálatokban és kutatási segédeszközként. Ebben az esetben a vér koagulációjának bizonyos fázisára való nagyfokú fajlagossága jelentős előnnyel jár a leggyakrabban alkalmazott antikoagulánsokkal szemben, amelyek hatása sokkal kevésbé fajlagos.
Ezenkívül a hirudin nagyon hasznos lehet antikoaguláns szerként a testen kívüli vérkeringésben és a dializáló rendszerekben, ahol jelentős előnyökkel bírhat a többi antikoagulánsokkal szemben, különösen, ha aktív formában immobilizálni lehet a mesterséges vérkeringési rendszereknek a felületén.
A hirudinnak a trombinhoz való kötődést aktivitása ezenkívül még lehetővé teszi a koagulációs faktorok, pl. a VHI. faktor, közvetett védelmét a tisztítás során.
Végül a jelzett hirudin alkalmazása egyszerű és hatásos módszert biztosíthat a trombin- és protrombinszint mérésére. A jelzett hirudint főleg arra lehet használni, hogy észlelhetővé tegyük a rögöket a képződés folyamán, mivel a koaguláció jelensége magában foglalja a keringő protrombin átalakulását trombinná a képződés helyén; a jelzett hirudin a trombinhoz kötődik és így a rögöket észlelhetővé teszi.
Lehetőség van arra is, hogy olyan gyógyszerkészítményt állítsunk elő, amely a transzformált élesztőket tartalmazza és így hirudint bocsát ki, ilyen gyógyszerkészítmény pl. az említett élesztőt tartalmazó kenőcs, amely hirudint választ ki a bőrre.
Összefoglalva a fentieket, a jelen találmány szerinti hirudinnek nagyszámú lehetséges alkalmazási területe van:
1. antikoagulánsként kritikus trombózisos állapotban a megelőzésre és a meglevő trombózisok kiterjedésének megakadályozására;
2. antikoagulánsként hematómák és duzzanatok csökkentésére mikroműtétek után, amely helyzetekben gyakran élő piócákat szoktak használni;
3. antikoagulánsként testen kívüli vérkeringési rendszerekben, és antikoaguláns szerként szintetikus biológiai anyagok bevonására;
4. antikoagulánsként vérmintákon végzett klinikai vizsgálatokban, laboratóriumi kísérletekben;
5. antikoagulánsként koagulánsokra vonatkozó klinikai kutatásokban, és kísérleti eszközként;
6. lehetséges helyi alkalmazású szerként bőrön való alkalmazásban aranyér, visszerek és ödéma kezelésében;
7. komponensként pikkelysömör és más rokon rendellenességek kezelésében;
8. végül a hirudin alkalmazható trombin lekötésére a vér tárolása során és a vérszármazékok (vérlemezkék Vili. és IX. faktor) készítése során. Irányelvként elmondható, hogy a hirudint gyógyászati kompozíciókban 100-50 000 antitrombin egység/kg/nap dózisban alkalmazhatjuk.
Mivel a hirudin vízben oldható, injektálható gyógyászati kompozíciók vagy más úton alkalmazható gyógyászati kompozíciók egyszerűen készíthetők, gyógyászatilag elfogadható kötő- és hordozóanyagokat alkalmazva.
Végül lehetséges jelzett hirudint alkalmazni abból a célból, hogy in vitro méréseket vagy in vivő megjelenítést végezzünk, különösen a vérrögképződés észlelhetővé tételére, a jelzés lehet radioaktív jelzés vagy bármilyen enzim- vagy fluoreszcens jelzés, ahol a jelzést ismert technikákkal végezhetjük el.
A hirudin előállítását a teljes állatból arra használták, hogy meghatározzák a fehérje aminosavszekvenciáját (10,11). Az ez után következő kísérletekben egy olyan gént klónoztak, amely hírvivő (messenger) RNS-ként fejeződött ki koplaltatott piócák fejében. Ez a gén egy olyan fehérjére (2. hirudinvariáns, vagy HV-2) vonatkozó információt hordoz, amelynek szekvenciája jelentősen különbözik attól, amelyet az állat teljes testében találtak (HV-l-ként ismert fehérjevariáns). Kilenc különbség van az aminosavgyökökben a HV-1 és HV-2 között, és a két NH2-terminális gyök közötti különbségek (Val-Val vagy Ile-Thr) megmagyarázhatják a nyilvánvaló ellentmondást az irodalomban a hirudin NH2-terminális végét illetően (12).
Az 1. ábra a pTG 717 rekombináns plazmid DNS szekvenciáját mutatja be, amely tartalmazza: a) HV-2 mRNS-nek megfelelő cDNS- nek egy kópiáját, valamint b) a DNS szekvenciából kikövetkeztetett aminosavszekvenciát, és a c)-nél a különbséget e között és a HV-1 aminosav-szekvenciája között.
Megjegyzendő, hogy a cDNS szekvencia valószínűleg nem teljes, és lehet, hogy van egy szignál szekvencia az érett fehérje kezdetétől „felfelé”.
A HV-2 cDNS kifejeződése mikroorganizmusokban azt mutatja, hogy a megfelelő fehérjének van trombinellenes aktivitása.
Bár az alábbi kísérleteket a HV-2 variánssal hajtottuk végre, a következőkben, hacsak másképpen nem jelezzük, a „hirudin” és a „hirudint kódoló gén” kifejezéseket úgy használjuk, hogy ezek felölelik mindkét variánst, azaz a HV-1 vagy HV-2 variánsokat, és ha3
HU 202 919 Β sonlóképpen más lehetséges variánsokat és az ezeknek megfelelő szekvenciákat is.
A találmány tárgya hirudin előállítása élesztőkben.
Az élesztők egysejtű eukarióta organizmusok. Az élesztők Saccharomyces nemzetsége olyan törzseket tartalmaz, amelyek biokémiáját és genetikáját intenzíven tanulmányozták a laboratóriumokban, ez magában foglal olyan törzseket is, amelyeket az élelmiszeriparban alkalmaznak (kenyér, alkoholos italok, stb.), és amelyeket következésképpen nagyon nagy mennyiségben állítanak elő.
Idegen polipeptidek kifejezéséhez alkalmas gazdaszervezet a Saccharomyces cerevisiae, mivel a sejtek genetikailag könnyen manipulálhatók, akár klasszikus, akár géntechnológiai módszerekkel, vagy még inkább ennek a két technikának a kombinációjával, valamint ez a faj hosszú ipari múltra tekint vissza.
A találmány tehát elsősorban egy olyan funkcionális DNS szakasz előállítására vonatkozik, amely lehetővé teszi, hogy hirudint állítsunk elő élesztőben; az említett DNS szakaszra az jellemző, hogy tartalmaz legalább
- egy, a hirudinhoz vagy variánsainak egyikéhez tartozó gént (ezt a továbbiakban H génnek nevezzük); és
- egy olyan DNS szekvenciát (Str), amely azokat a szignálokat tartalmazza, amelyek a H gén élesztők általi átírásáról gondoskodnak.
Amikor egy élesztő, előnyösen Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztő egy plazmidjában vagy kromoszómáiban integrálódik, ez a funkcionális szakasz az említett élesztő transzformálása után lehetővé teszi, hogy a hirudin kifejeződjék vagy aktív formában, vagy olyan inaktív prekurzor formájában, amelyből a hirudin aktiválás hatására felszabadul.
A Saccharomyces cerevisiae előnye az, hogy ez az élesztő képes bizonyos fehérjéket kiválasztani a tenyészközegbe. A kiválasztásért felelős mechanizmust széles körben tanulmányozták már, és kimutatták, hogy megfelelő manipulációkkal az élesztők olyan korrektül előállított humán hormonok kiválasztására késztethetők, amelyek minden tekintetben hasonlók a humán szérumban találhatókhoz (13, 14).
A jelen találmánnyal összefüggésben ez a tulajdonság nagyon hasznos a hirudin kiválasztásának elérésében, mivel ez a lehetőség számos előnyt nyújt.
Először is az élesztő kevés fehérjét választ ki, aminek az az előnye, hogy ha az adott idegen fehérje kiválasztásának irányítását magas szinten tudjuk elvégezni, a tenyészközegben termelendő terméket az összes kiválasztott fehérjére vonatkoztatva olyan nagy százalékos arányban kapjuk, ami jelentősen megkönnyíti a keresett fehérje tisztítását.
Az élesztő számos fehérjét vagy polipeptidet választ ki. Az összes ismert esetben ezek a fehérjék hosszabb prekurzor formájában szintetizál ódnak, amelyeknek NH2-terminális szekvenciája kritikus a kiválasztáshoz vezető metabolikus útba való belépés szempontjából.
Az ezen prekurzorok egyikének NH2-terminálisát és az ezt követő idegen fehérje szekvenciáját tartalmazó hibrid fehérjék szintézise élesztőben bizonyos esetekben ennek az idegen fehérjének a kiválasztásához ve4 zethet. Az a tény, hogy ez az idegen fehérje prekurzor formájában szintetizálódik, amely ezért általában inaktív, lehetővé teszi, hogy a sejt védve legyen a keresett molekulák esetleges toxikus hatásai ellen; ezeknek a hasítása, amely az aktív fehérjét felszabadítja, csak a Golgi-apparátusból származó vesiculumokban megy végbe, amelyek a fehérjét a citoplazmától elválasztják.
A kiválasztáshoz vezető ilyen metabolikus út alkalmazása, ami az élesztőt az idegen fehérje termelésére készteti, számos előnnyel jár:
1. lehetővé válik egy meglehetősen tiszta tennék kinyerése a tenyészet felülúszójából;
2. lehetővé válik a sejt védelme az érett fehérje esetleges toxikus hatásai ellen;
3. ezentúl a kiválasztott fehérjéket adott esetekben alá lehet vetni bizonyos módosításoknak (glikozilezés, szulfatálás, és hasonlók).
Ebből az okból a jelen találmány szerinti kifejeződő szakasz részletesebben a következő szerkezettel bír:
— Str — Lex — ScL — H gén
Az Lex kódolja a H génnek megfelelő fehérje kiválasztásához szükséges vezető szekvenciát; az ScL az a DNS-szekvencia, amely a hasítási helyet kódolja; ezenkívül az ScL - H rész többször is ismétlődhet.
A kiválasztórendszer példájaként az alfa feromon rendszert választottuk, azaz a fenti szekvenciában az Lex szekvencia az élesztő alfa szex feromonjához tartozó génből származik, de más rendszereket is lehet alkalmazni (pl. a gyilkos fehérje rendszert). (13).
Az élesztő alfa szex feromonja olyan peptid, amely 13 aminosavból áll (a 2. ábrában bekeretezve), és amelyet a MATa szex típusú S. cerevisiae élesztők a tenyészközegbe választanak ki. Az alfa faktor megragadja az ellenkező szextípus (MATa) sejteket a Gl fázisban, és a sejtek két típusának éréséhez szükséges biokémiai és morfológiai változásokat indukál. Kurjan és Herskowitz (16) klónozták az α-faktorhoz tartozó struktúrgént és arra a következtetésre jutottak ennek a génnek a szekvenciájából, hogy ez a 13 aminosavból álló α-faktor egy 165 aminosavból álló prekurzor elófehérje formájában szintetizálódik (2. ábra). A prekurzor egy 22 gyökből álló aminoterminális hidrofób szekvenciát tartalmaz (szaggatott vonallal aláhúzva), ezt követi egy 61 aminosavból álló szekvencia, amely 3 glikozilező helyet tartalmaz, végül ezt követi az afaktor négy másolata. A négy másolat térközt tartó („spacer”) szekvenciákkal van elválasztva és az érett fehérje a prekurzorból a következő enzimaktivitások eredményeképpen szabadul fel:
1. katepszin B típusú endopeptidáz, amely a Lys-Arg dipeptidek COOH oldalán hasít (a hasítási helyet széles nyilak jelölik);
2. karbopeptidáz B típusú exopeptidáz, amely az elmetszett peptid COOH végénél jelen levő bázisos gyököket hasítja le;
3. dipeptidil-aminopeptidáz („A”-ként ismert), amely eltávolítja a Glu-Ala és Asp-Ala gyököket.
Ennek a prekurzomak a nukleotid-szekvenciája ezenkívül tartalmaz még 4 Hindlll restrikciós helyet, amelyeket H nyíllal jelölünk.
HU 202 919 Β
Számos fúziót hajtottunk végre az α-feromon gén és az érett hirudinszekvencia között. Az MATa. típusú élesztősejtek ki tudják fejezni ezeket a fúziós géneket. A megfelelő hibridfehérjét azután el lehet készíteni azoknak a szignáloknak az eredményeképpen, amelyeket ezek tartalmaznak, és amelyek a feromon prekurzor prepro-szekvenciáiból erednek. Következésképpen az várható, hogy hirudinszekvenciával rendelkező polipeptidek nyerhetők ki a tenyészközeg felülúszóból.
Ezeknek a konstrukcióknak egyike, az Scl szekvencia egy ATG kodont tartalmaz a H gént megelőző 3’ végnél; a fúziós fehérje ezért tartalmaz egy metionint közvetlenül az érett hirudinszekvencia első aminosavától „fölfelé”. Cianogén-bromiddal végzett hasítás után a polipeptidből olyan hirudinmolekulát kapunk, amelyet egy renaturáló lépés után aktívvá lehet tenni.
Egy másik konstrukcióban az α-feromon előállításához normálisan használt hasítási szignálok szolgálnak trombinellenes aktivitással bíró polipeptidek a tenyészet felülúszójában történő előállítására. Ez az az eset, amikor az ScL szekvencia két kodont tartalmaz 3’ végénél, amelyek Lys-Arg-ot kódolnak, azaz AAA-t vagy AAG-t AGA-val vagy AGG-vel; a polipeptidet valamely olyan endopeptidázzal hasítjuk, amely a LysArg dipeptidet a COOH oldalon elhasítja, ezáltal szabadítva fel a hirudint.
A találmány főleg olyan konstrukciókra vonatkozik, amelyekben a hirudin gént megelőző szekvencia a következő aminosav-szekvenciák egyikét kódolja.
1. Lys Arg Glu Alá Glu Alá Trp Leu Gin Val Asp Gly
Ser Met hirudin
2. Lys Arg Glu Alá Glu Alá hirudin ...,
3. Lys Arg Glu Alá Glu Alá Lys Arg hirudin ...,
4. Lys Arg Glu Alá Glu Ser Leu Asp Tyr Lys Arg hirudin ....
vagy
5. Lys Arg hirudin ...
Lehetséges természetesen előirányozni más szekvenciák alkalmazását is, amelyek aminosavszinten szelektíven hasadnak valamilyen enzimmel, azzal a feltétellel, hogy ennek a hasítási helynek nem szabad jelen lenni a hirudinen magán.
Végül a kifejező szakasznak a H gén után rendelkeznie kell egy élesztő terminátor szekvenciával, pl. a PGK (foszfogliceráz-kináz) génszekvenciával.
Általában a találmány szerinti kifejeződő szakaszokat vagy egy autonóm módon replikálódó plazmidban, vagy az élesztő kromoszómában lehet integrálni valamely élesztőben, főleg Saccharomycesben.
Amikor a plazmid autonóm, az tartalamazzon a replikációját biztosító elemeket, azaz egy replikációs origót, pl. a 2 μ plazmid replikációs origót. Ezenkívül a plazmid tartalmazhat szelekciós elemeket, pl. URA3 vagy LEU2 gént, amelyek az ura3' vagy leu2' élesztők komplementációját szolgáltatják. Ezek a plazmidok tartalmazhatnak olyan elemeket is, amelyek a replikációjukat szolgáltatják baktériumokban, amikor a plazmidnak „ingázó” („shuttle”) plazmidnak kell lennie, pl. egy replikációs origót, mint pl. a pBR322 origója, egy marker gént, mint pl. Ampr és/vagy más elemeket, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak.
A jelen találmány olyan élesztőtörzsekre is vonatkozik, amelyek egy jelen találmány szerinti kifejeződő szakasszal vannak transzformálva, amelyet vagy valamely plazmid hordoz, vagy a kromoszómájába van integrálódva. Ezek közül az élesztők közül leginkább a Saccharomyces nemzetség élesztőit, elsősorban a S. cerevisiae-t kell megemlítenünk.
Amikor a promotor az α-feromon gén promotorja, az élesztő előnyösen MATa. szex típusú. így pl. valamely ura3' vagy leu2' genotípusú törzset alkalmazunk, amely komplementálva van olyan plazmiddal, amely a plazmid fenntartását szolgáltatja az élesztőben megfelelő szelekciós kényszer alkalmazásával.
Bár hirudint a fenti transzformált törzs fermentálásával, a hirudinnak a sejtben való felgyülemlésével elő lehet állítani, mégis előnyösebb, ami a fentebbi leírásból is világossá vált, ha a hirudin kiválasztását a tenyészkőzegbe vagy érett formában, vagy prekurzor formájában érjük el, amelyet azután in vitro kell feldolgozni.
Ezt az érést számos lépésben lehet kivitelezni. Először is szükséges lehet néhány, az Lex szekvencia transzlációjából eredő elemet lehasítani, és ezt a hasítást az ScL-nek megfelelő szekvencián kell végbevinni. Amint fentebb megállapítottuk, az érett hirudint megelőzheti egy metionin, amelyet szelektíven hasítunk le cianogén-bromiddal. Ezt a módszert azért lehet alkalmazni, mert a hirudint kódoló szekvencia nem foglal magában metionin kodont.
Eljárhatunk úgy is, hogy az N-terminális végnél a Lys-Arg dipeptidet alakítunk ki, amely a COOH oldalon egy specifikus endopeptidáz hatására elhasad; mivel ez az enzim aktív a kiválasztási folyamatban, ezért lehetséges ilyen módon az érett fehérjét közvetlenül megkapni a tápközegben. Bizonyos esetekben azonban szükséges lehet az enzimes hasítást a kiválasztás után fajlagos enzim hozzáadásával végezni.
Bizonyos esetekben, főleg cianogén-bromiddal végzett kezelés után, szükséges lehet a fehérje renaturálása a diszulfidhidak újraképzéséhez. Ebből a célból a peptidet denaturáljuk pl. guanidinium-hidrokloriddal, majd renaturáljuk redukált és oxidált glutation jelenlétében.
Végül a találmány a jelen találmány szerinti eljárással nyert hirudinra is vonatkozik.
A jelen találmány szerinti eljárást az alábbi példák és ábrák segítségével mutatjuk be közelebbről.
Az 1. ábra a pTG 717-ben klónozott hirudin cDNS fragmens nukleotid szekvenciáját mutatja be.
A 2. ábra az alfa szex feromon prekurzor nukleotid szekvenciáját mutatja be.
A 3. ábra vázlatosan bemutatja a pTG834 megalkotását.
A 4. ábra vázlatosan bemutatja a pTG880 megalkotását.
Az 5. ábra vázlatosan bemutatja a pTG882 megalkotását.
A 6. ábra vázlatosan bemutatja az M13TG882 megalkotását.
HU 202919 Β
A 7. ábra vázlatosan bemutatja a pTG874 megalkotását.
A 8. ábra vázlatosan bemutatja a pTG876 megalkotását.
A 9. ábra vázlatosan bemutatja a pTG881 megalkotását.
A 10. ábra vázlatosan bemutatja a pTG886 megalkotását.
All. ábra vázlatosan bemutatja a pTG897 megalkotását.
A 12. ábra a pTG886-tal és pTG897-tel transzformált élesztő tenyésztése után a tápközegben kapott, >1000 molekulatömegő fehérje egy akrilamidgél elektroforézisét mutatja.
A 13. ábra a pTG886-tal és pTG897-tel transzformált élesztő tenyésztése után a tápközegben kapott, >1000 molekulatömegű fehérje egy akrilamidgél elektroforézisét mutatja.
A 14. ábra vázlatosan bemutatja a pTG1805 megalkotását.
A 15. ábra a pTG847-tel és pTG1805-tel transzformáit élesztő tenyésztése után a tápközegben kapott, >1000 molekulatömegű fehérje akrilamidgél elektroforézisét mutatja.
A 16. ábra olyan diagram, amely összehasonlítja a különböző aminosavszekvenciákat az első hasítási helytől (Lys-Aig) „lefelé” különböző konstrukciókban.
Az aminosav és nukleotid-szekvenciákat nem ismételjük meg a jelen leírásban, hogy ne terheljük túl a leírást, de ezek természetesen határozottan részeit képezik a leírásnak.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük.
A példákban alkalmazott eljárásokat a szakterületen jártas szakemberek számára ismert módon, például a Moiecular CIoning című kézikönyvben (Sambrook J., Fritsch E.F. és Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.) ismertetett módon végeztük.
Az enzimeket a gyártó előírásai szerinti körülmények között alkalmaztuk.
7. példa. A pTG822 megalkotása
A hirudin HV-2 cDNS fragmensét a pTG717 plazmidnak Pstl-gyel végzett emésztése után képzett gélből kivontuk, majd egyidejűleg emésztett Hinfl és Ahaffl enzimekkel. A Hinfl enzim az érett hirudin HV-2 szekvencia első kodonjától „lefelé” hasít. Az Ahaffl enzim a hirudin szekvencia stop kodonja (3’) mögött mintegy 30 bázispárral hasít. Az így kapott Hinfl - Ahaffl fragmenst agaróz gélen izoláltuk, majd ebből a gélből eluáltuk.
Az érett fehérjét kódóló szekvenciát a pTG880 vektorba vezettük be. A pTG880 vektor a pTG838 vektor egyik származéka (3. ábra). ApTG838 plazmid azonos a pTG833-mal a PGK átírási terminátorhoz közel elhelyezkedő BglII hely kivételével. Ezt a helyet Klenow polimerázzal végzett feltöltéssel eltüntettük, és így alakult ki a pTG838.
A pTG833 egy élesztő/E. coli „ingázó” plazmid. Ezt a plazmidot arra tervezték, hogy idegen fehérjéket fejezzen ki élesztőben. Ennek a vektornak (3. ábra) az alapelemei a következők: az URA3 gén, mint szelekciós marker élesztőben; a 2 μ plazmid élesztő replikációs origó; az ampicillin rezisztenciához szolgáló gén; a pBR322 E. coli plazmid replikációs origója (ez a két utóbbi elem lehetővé teszi, hogy a plazmid szaporodjék és szelektálódjék E. coli bacilusban); az élesztő PGK gén 5’ szegélyező területe azzal a szekvenciával, amely ezt a gént kódolja a SalII helyig, a pBR322 Sáli - PvuII fragmense, és a PGK gén terminátor (19). Ezt a plazmidot már leírták a 84/07,125 számú francia szabadalmi bejelentésben.
A pTG880 plazmidot a pTG838-ból alkottuk meg (4. ábra) úgy , hogy egy rövid polilinker területet iktattunk be (amely az Ml3 bakteriofágból származik) EcoRI-gyel és BglII-vei hasított pTG838-ba, amely lehetővé teszi egy sor klónozó hely elhelyezkedését (sorrendben BglII, PstI, Hindin, BamHl, Smal és EcoRI) közvetlenül az élesztő PGK gént szegélyező 5’ terület után. A pTG880 plazmid DNS-t BglII-vel és Smal-gyel emésztettük, és az emésztéssel képződött nagy fragmenst izoláltuk és gélről eluáltuk. A pTG717 Hinfl - Ahaffl fragmensét, amely tartalmazza a hirudin HV-2-t kódoló szekvencia nagyobb részét, összekevertük az emésztett pTG880-nal, valamint egyedejűleg a hirudin szekvencia NH2 terminális területének helyreállítására szánt három szintetikus oligonukleotiddal, amely nukleotidok újra összekötik a vektor BgUI helyét a hirudint tartalmazó fragmens Hinfl helyével. Ezt a keveréket ligációs kezelésnek vetettük alá, majd ez szolgált E. coli sejtek transzformálására. A pTG882 plazmidot transzfoimánsokból nyertük ki.
Ez a plazmid szolgált az élesztősejtek transzformálására, abból a célból, hogy hirudint termeljünk a PGK promotor szabályozása alatt. Az ezzel a vektorral transzformált sejtek nyers sejtextraktumaiban azonban hirudin aktivitást nem mutattunk ki. Az aktív hirudintermelés hiányának oka még nem világos. A pTG882 megalkotása azonban a hirudint kódoló szekvencia forrásaként szolgált az alábbiakban leírt élesztő kiválasztó vektorokhoz.
2. példa. A pTG886 és pTG897 megalkotása
Először a hirudinszekvenciát tartalmazó pTG882 EgUI-EcoRI fragmensét (230 bp) vittük át M13mp8 bakteriofágba (6. ábra) a BamHl és ExoRI helyek közé. így kaptuk az M13TG882 fágot, amelyből egy EcoRI-HindlII fragmenst (mintegy 245 bp) lehetett izolálni. Ez a fragmens tartalmazza a hirudin HV-2 teljes kódoló szekvenciáját, a BamHI/BglH fúziós helyet, és olyan kohezív végeket (Hindffl-EcoRI), amelyek lehetővé teszik, hogy ez klónozható legyen a pTG881 élesztő kiválasztó vektorba (9. ábra).
A pTG881 (10 kb) egy E. coli/élesztő „ingázó” plazmid, amely autonóm módon replikálódik mind E, coli-ban, mind Saccharomyces cerevisiae, S.uvarum és S.carlsbergiensis törzsekben.
HU 202 919 Β
Ennek a plazmidnak a bevezetése E. coli-ba a keletkezett törzs ampicillinre (és más β-laktám típusú antibiotikumokra) való rezisztenciáját eredményezi. Ezenkívül ez a plazmid hordozza a LEU2 és URA3 élesztógéneket, amelyek mind az E. coli, mind a Saccharomyces törzsekben kifejeződnek. Ennek a plazmidnak a jelenléte E. coli-ban vagy Saccharomycesben tehát lehetővé teszi, hogy a β-izopropil-malát dehidrogenáz vagy orotidin-monofoszfát-dekarboxilázhiányos törzsek komplementációját kapjuk.
A pTG881 plazmidot a következő módon alkottuk meg.
A kiindulási plazmid a pTG848 volt (ez azonos a 83/15 716 számon bejelentett francia szabadalmi bejelentésben leírt pTG849-cel azzal a különbséggel, hogy az ura3 gén iránya fordított); ez a következő DNS fragmenseket tartalmazza (7. ábra).
1. A pJDB207 plazmidból származó, mintegy 3,3 kb-s
EcoRI-HindlI fragmens (17). A Hindül hely megfelel a 2 μ plazmid B formája 105. koordinátájának, az EcoRI hely pedig a 2243. koordinátának. Ebben a fragmensben a LEU2 gént a 2 μ fragmens B formája Pstl helyére polidezoxi-adenilát/polidezoxi- timidilát meghosszabbítás révén iktattuk be (17).
2. Az URA3 gén Hindül fragmense (18).
3. A pBR322 nagy EcoRI (O. koordináta/-SalI (650. koordináta) fragmense. Ennek a fragmensnek a PvuII helyébe a PGK gén végének megfelelő 510 bázispáros EcoRI-Hindlü fragmenst (amelynek végeit előzőleg a 4 nukleotid jelenlétében Klenow-enzim segítségével tompává tettük) iktattuk be (19). Amikor ezt beiktatjuk a pBR322 PvuII végébe, a PGK gén kivágott EcoRI helye egy EcoRI helyet regenerál.
4. A PGK gén HindlII-Sall fragmense (2,15 kb).
A pTG848 plazmidot Hindlü-mal hasítottuk, és az ezáltal felszabadult két fragmens végeit tompává tettük Klenow enzimmel végzett kezeléssel a négy dezoxiribonukleotid jelenlétében. A két fragmens ligálását elvégeztük, és a transzformálás előtt ezt a ligációs keveréket Hindül tevékenységének vetettük alá, ami lehetővé teszi, hogy bármilyen plazmidból, amely HindlII helyet (vagy két ilyen helyet) tartalamaz, ezt eltávolítsuk. A BJ5183/pyrF/ E. coli törzset transzformáltuk ezzel és a transzformánsokat ampicillin-rezisztenciára és pyr+ jellemzőre szelektáltuk. A pTG874 plazmidot kaptuk ilyen módon (7. ábra), amelyben a Hindül helyek eltűntek, és az átírást előidéző URA3 gén orientációja azonos irányú, mint a foszfoglicerát kináz (PGK) gén iránya.
A pTG874 plazmidot Smal-gyel és Sall-gyel hasítottuk, és azután a 8,6 kb-s fragmenst agaróz gélről izoláltuk. A pTG864 plazmidot, amely az MFal génnek a pBR322 azonos helyébe klónozott EcoRI-Saü fragmensét (mintegy 1,4 kb) tartalmazta, EcoRI-gyel hasítottuk. A plazmid végeit, amelyet ilyen módon linearizáltunk, tompa végűvé tettük Klenow-enzim segítségével a négy nukleotid jelenlétében. Emésztést végeztünk ezután Sáli enzimmel, és az EcoRI (tompa vég) - Saü fragmenst, amely az MFal génnek felel meg, izoláltuk. Ez utóbbi fragmenst a pTG874 SmalSall darabjával (8,6 kb) ligáljuk, ezáltal kaptuk a pTG876 plazmidot (8. ábra).
Abból a célból, hogy az MFal promotor szekvencia középponthoz közelebb eső (proximális) BgUI helyét eltüntessük, a pTG876 plazmidot a Bgül-vel végzett részleges emésztés után Klenow-enzim hatásának tettük ki a négy dezoxiribonukleotid jelenlétében. A nyert plazmid, a pTG881 (9. ábra) lehetővé teszi idegen kódoló szekvenciák beiktatását az MFal gén első Hindin helye és a PGK gén végének BglII helye között.
Amikor az idegen kódoló DNS Hindül helyénél a fúzió lehetővé válik olyan módon, hogy a kapott transzláció azonos leolvasó fázisban van, a kapott hibridfehérje tartalmazza a feromon prepro-részeit.
A HindIÜ-EcoRI fragmens, amely a hirudin gént hordozza, klónozása pTG881-be a pTG886 plazmidhoz vezet (10. ábra). Amikor a klónozást végrehajtottuk, a fragmenstől „lefelé” egy BglII hely van, és ez lehetővé teszi, hogy a fragmens ismét kivonható legyen. Hinfl-Bglü formában, ahol a Hinfl hely azonos, mint amelyet fentebb használtunk. Mivel csupán egyetlen Bglü hely van a pTG881-ben, nagyon könnyű a hirudint kódoló szekvencia 5’ végének helyreállítása 3 oligonukleotidot alkalmazva, amely helyreállítja a hirudin 5’ szekvenciáját, és lehetővé teszi, hogy az érett hirudinszekvencia által követett α feromon prepro-szekvenciája az adott fázisban olvasható legyen.
Ezt az új plazmidot pTG897-nek nevezzük (11. ábra).
3. példa. A hirudin kifejezése élesztőkkel
A pTG897 DNS-ét alkalmaztuk, hogy egy TGYlsp4/MATa, ura3-251-373-328, his3-ll-15/ élesztőt ura+-szá transzformáljuk már leírt technika alkalmazásával (20).
Egy transzformált telepet altenyésztésnek vetettünk alá és felhasználtuk 10 ml minimál táptalaj + 0,5 % kazaminosav (hidrolizált kazein) beoltására. A tenyésztés 20. órája után a sejteket centrifugáltuk és a felülúszót dializáltuk desztillált vízzel szemben, és bepárlással koncentráltuk (centrifugálás vákuumban).
Párhuzamos eljárásban egy pTG886-tal transzformáit TGYlsp4 tenyészetet és egy hirudin szekvenciát nem hordozó plazmiddal transzformált TGYsp4 telepet (TGYlsp4/pTG856) kezeltünk hasonló módon. A száraz üledéket 50 μ vízben felvettük és 20 μΐ-t felforraltunk 2,8 % SDS (nátrium-dodecil-szulfát) és 100 mmól/1 merkapto-etanol jelenlétében, majd akrilamidSDS gélre (15 % akrilamid; 0,1 % SDS) vittük (21). A rögzítés és Coomassie kékkel végzett festés után olyan polipeptideket tudtunk kimutatni, amelyek a TGYsp4/pTG886 és TGYlsp4/pTG897 tenyészet felülúszókban felgyülemlettek, de amelyek nincsenek jelen a kontroll tenyészet felülúszóiban (12. ábra). Ezenkívül ezeknek a többletpeptideknek a sorozata [35S] ciszteinnel erősen jelzett, ami el is várható a hirudinpeptidektől; ez a molekula ugyanis ciszteinben nagyon gazdag (10. ábra).
HU 202 919 Β
Az elektroforézis-mintákat, amelyeket a 12. és 13. ábrákon mutatunk be, a következőképpen készítjük el.
A 12. ábrához az extraktumokat a következő módon készítettük: 10 ml minimál tápközeget [Difco Yeast Nitrogén Base, aminosav nélkül (6,7 g/1) és glükóz (10 g/1), 0,5 % kazaminosavval (hidrolizált kazein) kiegészítve] beoltottunk különböző törzsekkel, és 20 órán át tenyésztettünk (stacioner fázis). A sejteket azután centrifugáltuk és a felülúszót vízzel szemben dializáltuk (retenciós minimum: 1000 molekulatömeg), majd centrifugálással szárítottuk vákuumban. A mintákat azután felvettük 50 μΐ ráterhelő pufferban, húsz mintát úgy kezeltünk, ahogyan ezt fentebb leírtuk, és akrilamid-SDS gélre (15 % akrilamid, 0,1 % SDS) vittük fel (21).
Az alkalmazott törzsek:
- 2. üreg: TGYlsp4 olyan plazmiddal transzformálva, amely nem tartalmazza a hirudinszekvenciát;
- 3. üreg: TGYlsp4, pTG886-tal transzformálva;
- 4. üreg: TGYlsp4, pTG897-tel transzformálva;
- 1. üreg: Az 1. üregben a referencia-markert helyeztük el (Pharmacia LMW készlet; felülről lefelé: 94 000, 67 000, 43 000, 30 000, 20 100, 14 000).
A csíkokat Coomassie kék R-250-nel végzett festéssel tettük láthatóvá.
A 13. ábrához az extraktumokat a következő módon készítettük: 100 ml minimál táptalajt (+40 μ/ml hisztidin) beoltottunk különböző törzsekkel egy éjszakán át végzett tenyésztéshez. Amikor a sejt sűrűsége elérte a mintegy 5· 106 értéket (exponenciális növekedési fázis), 40 μΐ S ciszteint (9,8 mCi/ml; 1,015 Ci/mmól) adtunk minden egyes tenyészethez. 10 perc múlva a sejteket centrifugáltuk, felvettük 10 ml teljes tápközegben (30°C) és 30°C hőmérsékleten inkubáltuk keverés mellett. 3 óra múlva a felülúszó 10 ml-ét dializáltuk vízzel szemben, és 0,5 ml térfogatra koncentráltuk, amint ezt a
12. ábránál leírtuk. Mintegy 35 000 cpm-et (40 μΐ) helyeztünk akrilamid-SDS gélre (15 % akrilamid, 0,1 % SDS). A fehérjecsíkok fluorográfia után láthatóvá váltak.
Az alkalmazott törzsek:
- 2. üreg: TGYlsp4 olyan plazmiddal transzformálva, amely nem tartalmazza a hirudinszekvenciát.
- 3. üreg: TGYlsp4, pTG886-tal transzformálva;
- 4. üreg: TGYlsp4, pTG897-tel transzformálva;
- 1. üreg: az 1. üregbe a 13. ábrán jelzett molekulatömegű (·103) markereket helyeztük.
Amikor az ezeket a polipeptideket tartalmazó felülúszőkat vizsgáltuk trombinellenes aktivitásra, aktivitást nem tudtunk kimutatni.
A TGYlsp4/pTG886 által kiválasztott polipeptid várhatóan az α-feromon prekurzor hasításának normális lépésein megy keresztül, amely olyan hirudinmolekulát ad, amely NH2 terminális végénél 8 aminosavval ki van bővítve. Ezért nem meglepő, hogy a TGYlsp4/pTG886 sejtek által kiválasztott polipeptidek nem aktívak. 8
Ezzel ellentétben a TGYlsp4/pTG897 által kiválasztott polipeptid esetében az lenne várható, hogy ez a polipeptid azonos legyen a természetes fehérjével, és ezáltal aktív legyen. Számos feltevés magyarázhatja az aktivitás hiányát:
1. A fehérje érése nem teljes, és valószínűleg maradnak Glu-Ala gyökök az NH2 végnél, amint azt EGF-nél felhám növekedési faktor (14).
2. A fehérje azért inaktív, mert nem rendelkezik a korrekt konformációval, vagy egy másik elképzelés szerint azért, mert a tenyészet felülúszóban olyan fehérjék vagy 1000 molekulatömegű molekulák vannak, amelyek gátolják az aktivitást.
3. A fehérje nem teljes, mivel intracelluláris és/vagy extracelluláris proteolizisen ment keresztül.
4. példa.
Aktiválás cianogén-bromiddal végzett hasítással Ha az aktivitás hiányát az NH2 terminális végnél levő többlet aminosavak jelenléte okozta az aktivitást helyreállíthatjuk olyan módon, hogy a TGYlsp4/pTG886 által kiválasztott peptidet cianogénbromiddal hasítjuk. Ez a reagens a metionin gyökökre fajlagos, és a pTG886 által kódolt fúziós fehérje csak egyetlen metionint tartalmaz. Ezt a reakciót a következő módon hajtottuk végre: vagy a pTG886 plazmidot, vagy egy hirudin beiktatást nem tartalmazó kontroll plazmidot tartalmazó élesztőt tenyésztettünk 10 ml tápközegben 24 órán át. Ebben az időpontban a tenyészet elérte a 7-10·107 sejt · ml’1 sűrűséget. A felülúszót elkülönítettük a sejttől, intenzíven dializáltuk desztillált vízzel szemben, majd liofileztük. A száraz port 1 ml 70 % erősségű hangyasavban feloldottuk és egy alikvotot használtunk fel a teljes fehérjetartalom meghatározására (a Coomassie kékkel, a Biorad által forgalmazott reagenssel végzett festés módszerével); a készítmény maradékát 1 ml friss cianogén-bromid oldattal kezeltük (30 mg/ml) 70 % erősségű hangyasavban.
Az oxigént nitrogénárammal eltávolítottuk, majd a csöveket sötétben inkubáltuk 4 órán át szobahőmérsékleten. Minden manipulációt, amelyet cianogén-bromid jelenlétében hajtottunk végre, megfelelő óvintézkedések mellett és füstkamrában végeztünk. A cianogén-bromiddal végzett hasítási reakciót 10 térfogat desztillált víz hozzáadásával állítottuk le, majd az oldatot liofileztük.
Az elhasított peptideket újra feloldottuk 10 ml desztillált vízben, majd még kétszer újra liofileztük. Végül a peptideket kis térfogat desztillált vízben újra feloldottuk, és egy alikvotot alkalmaztunk, hogy megmérjük a trombinellenes aktivitást. A minta maradékát liofileztük és az alább leírt helyreállítási (renaturáló) lépéseknek vetettük alá.
Mivel a hirudinaktivitás függ a diszulfidhidak jelenlététől a molekulában (1), valószínűnek tűnik, hogy a cianogén-bromiddal hasított peptidet korrekt módon helyre kell állítani abból a célból, hogy biológiai aktivitást mutasson. A hasított peptideket ezért denaturálásnak kell alávetni 5 mól/l-es guanidin«HCl-ben, ezt
HU 202 919 Β követi a helyreállítás (renaturálás) olyan ismert módszerrel, [M.E. Winkler, M. Blaber, G.L. Bennett, W. Holmes and C.A. Vehar: Perification characterication of recombinant motivate from E. Coli, Bio/Technology 3, 993-1000, (1985)].
Összefoglalva az eljárást, a liofilezett peptideket feloldjuk 400 μΐ 5 mól/l-es guanidium-kloridban (GuHCl), amely 250 mmól/1 trisz«HCl-ben volt oldva, pH 9,0; az oldatot azután redukált glutationra nézve 2 mmól/l-essé, oxidált glutationra nézve 0,2 mmól/1essé tettük 2,0 ml végső térfogatban (a végső koncentráció 1,0 mól/1 GuHCl és 50 mmól/1 trisz).
órás, 23 ’C hőmérsékleten, sötétben végzett inkubálás után a mintákat dializáltuk 24 órán át 3*2 liter 50 mmól/1 trisz*HCl-t (pH 7,5/ és 50 mmól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal szemben 23 ’C hőmérsékleten, és a végső dializátumot centrifugálással derítettük. Ekkor megmértük a felülúszók trombinellenes aktivitását. Ennek a kísérletnek az eredményei, amelyeket az I. táblázatban mutatunk be, világosan megmutatják, hogy a pTG886 plazmiddal fertőzött sejtek felülúszóiban a trombinellenes aktivitás helyreállítása megtörtént, ugyanakkor nincs aktivitás a kontroll plazmidnál.
I. TÁBLÁZAT
AZ ÉLESZTŐTENYÉSZETEK FELŰLÚSZÓINAK TROMBINELLENES AKTIVITÁSA
Plazmid A felülúszó kezelése Aktivitás, egység/ml Fajlagos aktivitás, egység/mg kiindulási fehérje
pTG86 a. hasítás után, helyreállítás előtt <0,3
b. hasítás és helyreállítás után 2,46 102,5
Kontroll a. hasítás után, helyreállítás előtt <0,3
b. hasítás és helyreállítás után <0,15 <5,6
Amint látható, a rekombináns plazmidot kódoló élesztősejtek ki tudnak választani olyan peptidet, amely a hasítási és helyreállítási reakció után a hinidin biológiai aktivitásával bír. Ez azt mutatja, hogy a többletaminosavak jelenléte az NH2-terminális végnél elegendő magyarázat a TGYlsp4/pTG886-ban jelen levő polipeptidek aktivitásának hiányára, és valószínűleg a TGYlsp4/pTG897 tenyészetek esetében is (Glu-Ala farok) ez a helyzet.
5. példa.
Új hasítási hely bevezetése közvetlenül a HV-2 hirudint kódoló szekvencia első aminosava előtt - a pTG1805 plazmid
A pTG897 konstrukcióban az a kockázati tényező, hogy a kiválasztott peptid megtartja Glu-Ala farkát az
NH2 végen, amely megmagyarázná a trombinellenes aktivitás hiányát. Ha ez a feltevés megfelel a valódi helyzetnek, lehetséges lenne az aktivitást közvetlenül a felülúszóból kinyerni úgy, hogy egy hasítási helyet hozzunk létre a Glu-Ala gyökök és a hirudin HV-2 első aminosava (izoluecin) között. Ezt úgy hajtottuk végre, hogy egy Lys-Aig dublettet kódoló szekvenciát adtunk hozzá, amely a feromon prekurzor érésében érdekelt endopeptidáz felismerő hely (2. ábra). A konstrukciót pontosan úgy kaptuk meg, ahogyan ezt a pTG897-nél leírtuk, azzal az eltéréssel, amely a két szintetikus oligonukleotidnál látható (14. ábra). Az így létrejött plazmidot pTG1805-nek neveztük. Ezt a plazmidot használtuk a TGYlsp4 törzs transzformálására, hogy ura+ típusú legyen. A felülúszóba kiválasztott anyagot gélelektroforézissel elemeztük, amint fentebb leírtuk, és összehasonlítottuk a TGYlsp4/pTG897-tel nyert anyaggal (15. ábra).
Az alkalmazott törzsek:
- I. üreg: markerek, amelyek a 12. ábránál alkalmazott markerekkel azonosak;
- 2. üreg: TGYlsp4, pTG897-tel transzformálva;
- 3. üreg: TGYlsp4, pTG1805-tel transzformálva;
- 4. üreg: kontroll, amely nem termel hirudint.
A TGYlsp4/pTG1805 törzsre fajlagos polipeptidek lassabban vándoroltak, mint azok a polipeptidek, amelyek a TGYlsp4/pTG897 törzsre fajlagosak. Ez az eredmény azt sugallja, hogy az új hasítási helyet a megfelelő endopeptidáz nem használja hatásosan. A hirudin biológiai aktivitására a felülúszóban végzett vizsgálat azonban azt mutatta, hogy ennek az anyagnak egy kis része aktív, ellentétben azzal az anyaggal, amelyet a TGYlsp4/TpTG897 tenyészeteiből kaptunk, ahol az anyag világosan inaktív.
H. TÁBLÁZAT
ÉLESZTŐTENYÉSZETEK (10 ml) FELŰLÚSZÓINAK TROMBINELLENES AKTIVITÁSA
Plazmid Fajlagos aktivitás egység/mg Teljes aktivitás egység (10 ml)
pTG856 nem mutatható ki —
pTG897 nem mutatható ki
pTG1805 21 - 2,0
6. példa.
Új konstrukció, amely új, hatásosabb hasítási helyet foglal magában, amely lehetővé teszi az érett hirudin felszabadítását
A fenti konstrukcióban (pTG897) a hirudin-aktivitásnak csak kis mennyiségét kaptuk meg a felülúszóban, valószínűleg azért, mert az érett hirudin felszabadítására tervezett második hasítási hely nem ismerődön fel hatásosan. Ezért új konstrukciót hoztunk létre, amelyet úgy terveztünk, hogy a hozzáadott hasítási helyet az endopeptidáz számára érzékenyebbé tegyük, „felfelé” a Ser Leu Asp három aminosav
HU 202 919 Β szekvenciáját adva hozzá, amely a természetben jelen van az első Lys-Arg dublettől „felfelé” (2. és 16. ábra).
Az alkalmazott technika azonos azzal, amelyet fen tebb leírtunk az alkalmazott oligonukleotidok kivéte lével, amelyek szekvenciája a következő:
26-mer 15-mer
5’-AGCTTCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGACTGCACAG
AGAAACCTATTTTCTTAATGCATATGTCTGACGTGTCTTA
40-mer
A hasítási területnél az aminosavszekvenciát a 16. ábra mutatja be. A megfelelő plazmidot pTG1818-nak neveztük, és ez csupán abban különbözik a pTG1805től, hogy a Ser-Leu-Asp kodonoknak megfelelő 5’- 15 TTG GAT AAA nukleotidok vannak beleiktatva.
ATGYlsp4/pTG1818 tenyészet felülúszóikban mért aktivitás, a mérésnél a már leírt standard körülményeket követve, mintegy 200 egység 10 ml tenyészetben, ez mintegy 100-szor nagyobb mennyiségnek felel 20 meg, mint amelyet az előző példában találtunk. Meg kell jegyeznünk, hogy a mérést 10 ml nem koncentrált tenyésztő tápkőzegben hajthattuk végre.
Az előző két példában azt mutattuk be, hogy az új Lys-Arg hely hozzáadása közvetlenül az érett hi- 25 rudin-szekvenciától „fölfelé” lehetővé teszi, hogy az aktív anyag kiszabaduljon a felülúszóba. Ezekben a példákban azonban, miközben a prekurzor hasítása végbemegy az első Lys-Arg helyen (a központtól távoleső helyen az érett szekvencia kezdetét tekintve), 30 egy nehezebb, inaktív szennyezést is kapunk a tény észközegben, amely az NH2-terminális végnél kiterjesztett hirudin-láncnak felel meg. Ez különösen világosan mutatkozik a TGYlsp4/pTG1805 tenyészetek esetében, ahol az inaktív szennyeződés van túlsúlyban. Ez megmarad valószínűleg a TGYlsp4/pTG1818 tenyészetek esetében is, ahol ugyan az inaktív komponens nincs túlsúlyban, de jelen lehet, amint ezt mások is leírták az EGF esetében (14). Hogy elkerüljük az inaktív anyag szintézise által képviselt kitermelési veszteséget, elhatároztuk, hogy olyan prekurzor szintéziséhez vezető új konstrukció megalkotásához fogunk hozzá, amely csupán abban különbözik a TGYlsp4/pTG897 sejtek által szintetizált konstrukciótól, hogy hiányzik belőle a Glu Alá Glu Alá szekvencia a Lys-Arg hasítási hely és az érett hirudinszekvencia első aminosava között.
A következő törzseket helyeztük el az Institut Pasteur (28 rue du Docteur-Roux, PARIS 15-eme) Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) törzsgyűjteményében 1985. április 30-án:
TGYlsp4/pTG1818: Saccharomyces cerevisiae, TGYlsp4(MATctKrű 3-251-373-328-Ats 3-11-15), ura+-szá transzformálva pTG1818 plazmiddal; ez az I
441 számot kapta.
TGYlsp4/pTG886: Saccharomyces cerevisiae, TGYlsp4 (MATawrö 3-25l-373-328-A« 3-11-15), ura+-szá transzformálva pTG886 plazmiddal; ez az I
442 számot kapta.
IRODALMI HIVATKOZÁSOK
1. BAGDY D., BARABÁS E., GRÁF L., PETERSEN T.E. és MAGNUSSON S.: Methods in Enzimology, B. rész, 45. kötet, 669-678 oldal (1976).
2. MARKWARDT F.: Methods in Enzimology (szerkesztette: Perlman G.E. és Lorand L„ Academic Press) 19. kötet, 924-932 oldal (1970).
3. MARKWARDT E, HAUPTMANN I, NOWAK G., KLESSEN Ch. és WALSMANN P.: Thromb. Hemostatis (Stuttgart) 47, 226-229 (1982).
4. WALSMANN P. és MARKWARDT E: Die Pharmazie 10, 653-660 (1981).
5. KLOSS Th. és ΜΓΓΤΜΑΝΝ U.: Longenbecks Arch. Chirurg. 359, 548 (1982).
6. ISHIKAWA A„ HAFTER R„ SEEMULLER U., GOKEL J.M. és GRAEFF M.: Thrombosis Research 19, 351-358 (1980).
7. MARKWARDT E, NOWAK G., STURZEBECKER J„ GREISBADI U., WALSMANN P. és VOGEL G.: Thromb. Hemostasis (Stuttgart) 52, 160— 163 (1984).
8. NOWAK C. és MARKWARDT E: Expt. Path. 18, 438-443 (1980).
9. SUTOR A.H., KNOP S. és ADLER D.: Kontrolle Antithrombocita; 23ste Symp. Blutgerinnung. Hamburg, 117-123. oldal (1981).
10. PETERSEN T.E., ROBERTS H.R., SOTTRUPJENSEN L., MAGNUSSON S. és BAGDY D.:
Protides Bioi. Fluids; Proc Colloq. 23. kötet, 145— 149. oldal (1976).
11. CHANG J.Y.: FEBS Lett. 164, 307-313 (1983).
12. BASKOVA I.P., CHERKESOVA D.U. és MOSOLOV V.V.: Thromb. Rés. 30. 459-476 (1983).
13. BUSSEY H., SAVILLE D„ GREENE D. és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 3, 1367-1370 (1983).
14. BRAKE A.J., MERRYWEATHER J.P., COIT D.G., HEBERLEIN U.A., MARIARZ F.R., MULLENBACH G.T., URDEA M.S., VALENZUELA
P. és BARR P.J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4641-4646 (1984).
15. BITTÉR G.A., CHEN K.K., BANKS A.R. és LAI P.H.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5330-5334 (1984).
16. KURJAN J. és HERSKOWITZ I.: Cell 30, 933943 (1982).
17. BEGGS J.: Genetic Engineering 2, 175-203 (1981).
18. BACH M.L., LACROUTE F. és BOTSTEIN D.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 386-390 (1979).
-101
HU 202 919 Β
19. ΗΓΓΖΕΜΑΝ R.A., HAGIE E.F., HAYFFLICK J.S. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 10, Π91-18Ο8 (1982).
20. ΓΓΟ H., FUKUDA Y., MURATA K. és KIMURA A.: J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983).
21. LAEMMLI V.K.C.: Nature 227, 680-685 (1970).
22. KRAMER W„ DRUTSA V., JANSEN H.W. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 12, 9441-9556 (1984).

Claims (5)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1 - Lys Arg Glu Alá Glu Alá Tip Leu Gin Val Asp
Gly Ser Met hirudin
1. Eljárás —Str - Lex - ScL - H gén szekvenciával rendelkező funkcionális DNS-szakaszelőállítására, ahol
H gén jelentése a hirudin génje vagy annak egy variánsa,
ScL jelentése egy hasítási helyet kódoló DNS-szekvencia,
Lex jelentése a gén-termék kiválasztás eléréséhez szükséges vezető szekvencia,
Str jelentése egy olyan DNS-szekvencia, amely a H gén élesztőkben történő átírásához szükséges jeleket tartalmazza, és az -ScL-Η gén- szakasz többször ismétlődhet, azzal jellemezve, hogy a H gént vagy valamely variánsát élesztő/E. coli ingázó vektorba iktatjuk be.
2 - Lys Arg Glu Alá Glu Alá hirudin ...
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Lex szekvenciaként élesztő a szex feromon szekvenciát használunk.
3 - Lys Arg Glu Alá Glu Alá Lys Aig hirudin ...
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ScL szekvenciaként a H gént a 3’ végnél megelőző ATG kódont tartalmazó szekvenciát használunk.
4 - Lys Aig Glu Alá Glu Alá Ser Leu Asp Lys Arg hirudin ...
5 - Lys Arg hirudin ..., azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-szakaszokat kapcsoljuk.
9. Eljárás a hirudinélesztők általi kiválasztásához szükséges elemeket tartalmazó plazmid előállítására, amely az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti funkcionális szakaszt és legalább egy, élesztőben működő replikációs origót és adott esetben egy szelekciós jellemzőt tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-szakaszokat kapcsoljuk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy replikációs origóként a 2 μ plazmid replikációs origóját alkalmazzuk.
11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti eljárás a szelekciós jellemzőt is tartalmazó plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-szakaszokat kapcsoljuk.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szelekciós jellemzőként URA3 gént alkalmazunk.
13. Eljárás hirudin struktúrgént tartalmazó élesztőtranszformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas élesztőt egy, a 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított plazmiddal transzformálunk.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztőtranszformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő Saccharomyces élesztőket transzformálunk.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Mata szex típusú Saccharomyces élesztőt transzformálunk.
16. A 13-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Saccharomyces cerevisiae törzset transzformálunk.
17. Eljárás hirudin előállítására, azzal jellemezve, hogy a 13-16. igénypontok bármelyike szerinti élesztőtranszformánst megfelelő tápközegben fermentáljuk, és a tápközegben termelt hirudint érett formában, vagy hirudin-prekurzor formájában kinyerjük, majd az utóbbit in vitro éretté alakítjuk.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hirudint a tápközegből nyerjük ki.
19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett hirudint valamely prekurzorból az ScL-nek megfelelő szekvencia kémiai vagy enzimes hasításával nyerjük ki.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett hirudint a prekurzor metionin helyénél végzett kémiai hasítással nyerjük ki.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett hirudint a prekurzor Lys-Aig vagy Ser-Leu-Asp-Lys-Arg szekvenciája után végzett enzimes hasítással nyerjük ki.
22. A 17-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor hasítása után kapott hirudint helyreállításnak (renaturálásnak) vetjük alá.
23. Eljárás gyógyszerkészítmények és diagnosztikumok előállítására, azzal jellemezve, hogy a 17. igénypont szerinti eljárással előállított hirudint vagy egy, a
13. igénypont szerinti eljárással előállított élesztőt a gyógyszeikészítésben szokásos hordozóanyagokkal
-111
HU 202 919 Β és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé, illetve diagnosztikummá alakítunk.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás emberben vagy állatokban vérrögképződés kimutatására alkalmas szer előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő segédanyagokat alkalmazzuk.
25. A 23. igénypont szerinti eljárás antikoaguláns előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő segédanyagokat alkalmazzuk.
26. A 23. igénypont szerinti eljárás in vivő leképzéshez alkalmas készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a hirudint jelzett formában alkalmazzuk a megfelelő segédanyaggal együtt.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ScL szekvenciaként két olyan kódont tartalmazó szekvenciát alkalmazunk, amelyek Lys-Arg-ot kódolnak a H gén előtt a 3’ végnél.
5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Scl szekvenciaként öt olyan kódont tartalmazó szekvenciát alkalmazunk, amelyek Ser-Leu-Asp-Lys-Arg-ot kódolnak a 3’ végnél.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a H gént követően egy élesztő terminátor szekvenciát iktatunk be.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztő terminátor szekvenciaként a PGK gén szekvenciáját alkalmazzuk.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás legalább az alábbi aminosavakat kódoló szekvenciát tartalmazó funkcionális szakasz előállítására
5 27. Eljárás vér testen kívüli kezeléséhez, azzal jellemezve, hogy a vért a 17. igénypont szerinti eljárással előállított hirudinnal legalább részben bevont, önmagában ismert, külső vérkeringető berendezésen bocsájtjuk keresztül.
HU863185A 1985-05-02 1986-05-02 Process for producing vectors for expressing and secreting hirudin in transformed yeasts HU202919B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8506672A FR2593518B1 (fr) 1985-05-02 1985-05-02 Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees
PCT/FR1986/000153 WO1986006406A1 (fr) 1985-05-02 1986-05-02 Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT42131A HUT42131A (en) 1987-06-29
HU202919B true HU202919B (en) 1991-04-29

Family

ID=9318888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU863185A HU202919B (en) 1985-05-02 1986-05-02 Process for producing vectors for expressing and secreting hirudin in transformed yeasts

Country Status (23)

Country Link
EP (1) EP0200655B1 (hu)
JP (2) JP2580141B2 (hu)
KR (1) KR870700234A (hu)
AT (1) ATE121778T1 (hu)
AU (1) AU600667B2 (hu)
BG (1) BG49717A3 (hu)
CA (1) CA1341501C (hu)
CZ (1) CZ282928B6 (hu)
DE (1) DE3650306T2 (hu)
DK (1) DK174837B1 (hu)
ES (1) ES8703930A1 (hu)
FI (1) FI104635B (hu)
FR (2) FR2593518B1 (hu)
HK (1) HK1006183A1 (hu)
HU (1) HU202919B (hu)
IE (1) IE67136B1 (hu)
MC (1) MC1785A1 (hu)
NO (1) NO302375B1 (hu)
PL (1) PL155074B1 (hu)
PT (1) PT82490B (hu)
RU (1) RU1774950C (hu)
WO (1) WO1986006406A1 (hu)
ZA (1) ZA863261B (hu)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3738541A1 (de) * 1987-11-13 1989-05-24 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin
FR2593518B1 (fr) * 1985-05-02 1989-09-08 Transgene Sa Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees
GB8530631D0 (en) 1985-12-12 1986-01-22 Ciba Geigy Ag Thrombin inhibitors
MY101203A (en) * 1985-12-12 1991-08-17 Ucp Gen Pharma Ag Production of thrombin iinhibitors.
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation
FR2607516B2 (fr) * 1986-12-01 1989-12-22 Transgene Sa Vecteurs perfectionnes d'expression d'un variant de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu
FR2607517B2 (fr) * 1986-12-01 1989-12-22 Transgene Sa Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu
FR2611723B1 (fr) * 1987-02-27 1989-09-08 Transgene Sa Vecteur d'expression d'adn recombinant codant pour l'hirudine, cultures de cellules de mammiferes infectees ou transformees, procede de preparation de l'hirudine et proteine obtenue
EP0371041A1 (en) * 1987-06-24 1990-06-06 Novo Nordisk A/S A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation
US5256559A (en) * 1988-03-04 1993-10-26 Biogen, Inc. Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation
DE3819079A1 (de) * 1988-06-04 1989-12-07 Hoechst Ag Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung
AU633020B2 (en) * 1988-07-23 1993-01-21 Novozymes Delta Limited New secretory leader sequences
DE3835815A1 (de) * 1988-10-21 1990-04-26 Hoechst Ag Neue isohirudine
CA2000887A1 (en) * 1988-11-01 1990-05-01 Cecilia S.L. Ku Thromboresistant materials and methods for making same
US5053453A (en) * 1988-11-01 1991-10-01 Baxter International Inc. Thromboresistant materials and methods for making same
FR2646437B1 (fr) * 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
US6514730B1 (en) 1991-03-21 2003-02-04 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Secretion of hirudin derivatives
US5837808A (en) * 1991-08-20 1998-11-17 Baxter International Inc. Analogs of hirudin
DE4140381A1 (de) * 1991-12-07 1993-06-09 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet
SG49859A1 (en) * 1992-09-04 2002-03-19 Ucp Gen Pharma Ag Process for the production of protease inhibitors
US6500645B1 (en) 1994-06-17 2002-12-31 Novo Nordisk A/S N-terminally extended proteins expressed in yeast
ZA954983B (en) * 1994-06-17 1996-02-14 Novo Nordisk As N-terminally extended proteins expressed in yeast
DE19529997C1 (de) 1995-08-16 1997-04-10 Hoechst Ag Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen
DE19543737A1 (de) * 1995-11-24 1997-05-28 Hoechst Ag Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices
DE19544233A1 (de) * 1995-11-28 1997-06-05 Hoechst Ag Verfahren zur Nutzung des Hefe-ADH II-Promotorsystems zur biotechnologischen Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten
ZA9610456B (en) * 1995-12-20 1997-06-20 Novo Nordisk As N-terminally extended proteins expressed in yeast
EP0787569B1 (en) 1996-01-31 2002-10-02 Sumitomo Bakelite Company Limited Method of producing epoxy resin-encapsulated semiconductor device
US6265204B1 (en) * 1997-01-17 2001-07-24 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides for secretion of polypeptides in filamentous fungi
US7638618B2 (en) 2001-02-20 2009-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
US7202059B2 (en) 2001-02-20 2007-04-10 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium
DE10149678A1 (de) 2001-10-09 2009-03-12 Novel Science International Gmbh Organische Verbindungen mit biologischer Wirkung als Thrombinhemmer und ihre Verwendung
DE10301255A1 (de) 2003-01-15 2004-07-29 Cpi Creative Pharma International Gmbh Organische Verbindungen mit biologischer Wirkung als Thrombinhemmer und ihre Verwendung
US7795205B2 (en) 2004-04-12 2010-09-14 Canyon Pharmaceuticals, Inc. Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3382547D1 (de) * 1983-01-12 1992-05-27 Chiron Corp Sekretorische expression in eukaryoten.
AU572125B2 (en) * 1983-03-17 1988-05-05 Mabco Limited Monoclonal antibodies with specificity for crosslinked fibrin and their diagnotic uses
JPS60501140A (ja) * 1983-04-22 1985-07-25 アムジエン 酵母による外因性ポリペプチドの分泌
JPS6041487A (ja) * 1983-04-25 1985-03-05 ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用
NZ207926A (en) * 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
JPS59227899A (ja) * 1983-05-25 1984-12-21 チロン・コ−ポレイシヨン 成長ホルモン放出因子の製造方法
CA1341417C (fr) * 1984-03-27 2003-01-21 Paul Tolstoshev Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine
ATE64956T1 (de) * 1984-06-14 1991-07-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren.
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
DE3445517C2 (de) * 1984-12-13 1993-11-18 Ciba Geigy Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins
FR2593518B1 (fr) * 1985-05-02 1989-09-08 Transgene Sa Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees

Also Published As

Publication number Publication date
FI865303A (fi) 1986-12-23
BG49717A3 (en) 1992-01-15
FI104635B (fi) 2000-03-15
HK1006183A1 (en) 1999-02-12
FR2593518B1 (fr) 1989-09-08
CZ282928B6 (cs) 1997-11-12
DK174837B1 (da) 2003-12-15
WO1986006406A1 (fr) 1986-11-06
AU5778786A (en) 1986-11-18
ES8703930A1 (es) 1987-03-16
CA1341501C (fr) 2006-03-14
DK634386D0 (da) 1986-12-30
IE861183L (en) 1986-11-02
PT82490A (fr) 1986-05-01
JPH09103295A (ja) 1997-04-22
KR870700234A (ko) 1987-05-30
PT82490B (pt) 1988-03-03
ATE121778T1 (de) 1995-05-15
HUT42131A (en) 1987-06-29
JPS62502661A (ja) 1987-10-15
IE67136B1 (en) 1996-03-06
JP2580141B2 (ja) 1997-02-12
FI865303A0 (fi) 1986-12-23
EP0200655B1 (fr) 1995-04-26
FR2601383B2 (fr) 1989-12-22
DE3650306T2 (de) 1995-10-12
ZA863261B (en) 1986-12-30
PL155074B1 (en) 1991-10-31
DE3650306D1 (de) 1995-06-01
ES555121A0 (es) 1987-03-16
RU1774950C (ru) 1992-11-07
FR2593518A1 (fr) 1987-07-31
JP2779930B2 (ja) 1998-07-23
NO302375B1 (no) 1998-02-23
FR2601383A2 (fr) 1988-01-15
AU600667B2 (en) 1990-08-23
CZ321786A3 (en) 1997-07-16
NO865336L (no) 1987-03-02
EP0200655A1 (fr) 1986-11-05
MC1785A1 (fr) 1987-09-02
DK634386A (da) 1986-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU202919B (en) Process for producing vectors for expressing and secreting hirudin in transformed yeasts
EP0745092B1 (en) Peptide inhibitors of urokinase receptor activity
EP0402068B1 (en) Polypeptides and polypeptide analogues with inhibitory activity against human elastase
FI100250B (fi) Hirudiinijohdannaisten eritys
AU625375B2 (en) Novel polypeptides with an anticoagulant activity
EP0511393B1 (en) Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism
EP0802983B1 (en) Expression of urokinase plasminogen activator inhibitors
US5164482A (en) Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof
JP2006516113A5 (hu)
IL88925A (en) A consequence of heroin and a drug containing it
US5180668A (en) Hirudin derivative
Courtney et al. Production and evaluation of recombinant hirudin
US5268296A (en) DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18
US5821079A (en) Vectors for the expression and secretion of hirudin by transformed yeasts
EP0662514A1 (en) Hirustasin, an antistasin type serine proteinase inhibitor from Hiruda
US5861377A (en) Antistasin type serine protease inhibitors
JP2696316B2 (ja) ヒルジンの発現のためのベクター、形質転換細胞及びヒルジンの製造方法
GB2257974A (en) Hirudin analogues and process for their preparation

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: BEHRINGWERKE A.G., DD

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT, DE