CZ282928B6

CZ282928B6 - Kvasinky transformované funkčním fragmentem DNA, způsob přípravy hirudinu fermentací těchto kvasinek, vnitřní potahová vrstva, antikoagulační směs, směs pro zjišťování krevní sraženiny

Info

Publication number: CZ282928B6
Application number: CS863217A
Authority: CZ
Inventors: Paul Tolstoshev; Yves Lemoine; Jean-Pierre Lecocq; Gérard Loison
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1985-05-02
Filing date: 1986-05-04
Publication date: 1997-11-12
Also published as: FR2601383A2; FR2601383B2; CZ321786A3; DK634386A; AU5778786A; EP0200655B1; FI104635B; HU202919B; DK174837B1; FI865303A0; FR2593518A1; CA1341501C; NO302375B1; DK634386D0; ES555121A0; FR2593518B1; IE861183L; JPH09103295A; PL155074B1; BG49717A3

Abstract

Kvasinky transformované funkčním fragmentem DNA zapojeným do plasmidu obsahujícího počátek replikace v kvasinkách nebo zapojeným do chromosomů kvasinek, přičemž kvasinky jsou rodu Saccharomyces, kmene Saccharomyces cerevisiae a funkční fragment obsahuje alespoň - jednu sekvenci DNA - str - Lex - Scl - genH - ter kodující hidrudin, jednu z jeho variant nebo jeho prekursor (genH), - vedoucí sekvenci (Lex) obsahující prvky nezbytné pro vylučování produktu genu a - sekvenci DNA (Str) obsahující signály zajišťující transkripci genu H kvasinkami. Způsob přípravy hidrudinu fermentací těchto kvasinek, přičemž hidrudin vznikající v kultivačním prostředí se izoluje z něho ve zralé formě nebo ve formě jeho prekursoru uzrávajícího in vitro. Vnitřní potahová vrstva pro mimotělní krevní oběh obsahující hidrudin. Antikoagulační směs obsahující výše uvedené kvasinky jakožto činidlo uvolňující hidrudin. Směs pro zajišťování vzniku krevní sraženiny obsahující značkový hidrudin.ŕ

Description

Vynález se týká způsobu přípravy hirudinu v maturované formě nebo ve formě prekurzoru kultivací mikroorganismů.

V popise se rovněž pojednává o vektorech exprese sekvence DNA, kódující hirudin nebo jeho analogu, a o sekreci hirudinu v kultivačním médiu kvasinek, transformovaných těmito vektory.

Dosavadní stav techniky

Antikoagulační aktivita, nacházející se v slinných žlázách lékařských pijavic, Hirudo medicinalis, je způsobována malým polypeptidem, nazývaným hirudin. Tento velmi specifický a účinný inhibitor thrombinu byl v poslední době důkladně studován, protože potenciálně 20 představuje velmi zajímavý terapeutický prostředek. Nicméně jeho výjimečně obtížná izolace a čištění, jakož i cena těchto operací, bránily, aby byl používán ve větší míře, nebo dokonce, aby mohl být studován klinicky.

Možnost produkce hirudinu klonováním genů ajejich exprese pomocí techniky rekombinace 25 DNA byla již ukázána pomocí klonování jednoho přírodního genu pijavice, který kóduje hirudin a jeho exprese v mikroorganismu E. coli (přihláška franc. patentu č. 84 04755, podána 27. března 1984). I když bylo možno vyprodukovat v E. coli peptid s biologickou aktivitou, je velmi důležité vyprodukovat hirudin i v jiných typech mikroorganismů. Skutečně, klinické použití hirudinu vyžaduje vysoko čistotu produktu a eliminace pyrogenních nečistot by mohla vyvolat 30 problémy při čištění hirudinu z extraktů kolibacilu.

Kromě toho zůstává hirudin, syntetizovaný v E.coli, uvnitř jeho buněk a musí proto být čištěn ze směsi velkého počtu peptidů E. coli. Z toho důvodu bylo zajímavé docílit expresi genu hirudinu v kvasinkách, které neprodukují pyrogenní citoxické látky pro člověka a které jsou schopny 35 vylučovat proteiny do kultivačního prostředí.

Podstata vynálezu

Mechanismus účinku hirudinu jako antikoagulantu teprve začíná být chápán. Substrátem pro fixaci hirudinu je thrombin, který je proteolytickým enzymem a který aktivací (pomocí aktivovaného faktoru X) své zymogenní formy, prothrombinu, štěpí fibrinogen v krevním oběhu a mění ho na fibrin, který je potřebný pro tvorbu krevní sraženiny. Konstanta disociace komplexu thrombin - hirudin 1 : 1 (0,8 x 10'¹⁰) ukazuje mimořádně silnou asociaci mezi těmito molekulami. Prakticky můžeme považovat nekovalentní komplex mezi těmito dvěma molekulami za nedisociovatelný in vivo.

Hirudin je velmi specifickým inhibitorem thrombinu s afinitou mnohem vyšší než u přírodního substrátu - fibrinogenu. Kromě toho není nutná přítomnost dalších faktorů koagulace nebo 50 dalších složek plazmy. Velmi specifická a důležitá antithrombická aktivita hirudinu se sama nabízí pro klinickou aplikaci jako antikoagulantu.

Hirudin byl studován důkladně na zvířatech s ohledem na své antikoagulační vlastnosti. Nejpodrobnější studie popisuje aktivitu hirudinu v prevenci trombózy žil, vaskulámích okluzí a roztroušených vnitrocévních koagulací (DIC) u krys. Hirudin je dobře snášen krysami, psy, králíky a myšmi, když je ve velmi čisté formě a injikován nitrožilně. LD50 u myší je vyšší než 5 500 000 jednotek na kg tělesné hmotnosti (tj. 60 mg/kg). Jiná studie ukazuje, že myši tolerují dávky až do 1 g/kg a že králíci tolerují jak nitrožilní, tak podkožní dávky až do 10 mg/kg. U myší nevedou opakované injekce po dobu dvou týdnů k senzibilizačním reakcím.

Kromě toho hirudin je rychle eliminován z experimentálních zvířat (poločas setrvání je kolem 10 1 h), a to ještě v biologicky aktivní formě, pomocí ledvin.

Dvě další nezávislé studie, z nichž jedna použila psy a druhá ukázala aktivitu hirudinu v prevenci DIC u krys, jsou v souladu s pozitivními výsledky Markwardta a spolupracovníků. Tito výzkumníci nedávno publikovali první in vivo analýzu účinků přírodního hirudinu na humánní 15 hemostatický systém. Výsledky ukázaly očekávané účinky, beze známek sekundárních toxických účinků.

Též bylo možno ukázat, že hirudin zamezuje DIC, indukovaný endotoxiny u vepřů a představuje tak možné řešení velmi vážných problémů, které vyvolává endotoxinemie a které vedou k vysoké 20 úmrtnosti u vepřů.

Nedávno bylo popsáno intravenózní a podkožní podání hirudinu člověku. Šest dobrovolníků bylo použito k farmakokinetickému hodnocení a ke zjištění účinků na hemostatický systém při jediné dávce hirudinu (1 000 AT-U/kg). Hirudin, podaný intravenózně, má poločas života 50 minut 25 a 50 % hirudinu lze najít v moči v aktivní formě 24 h po injekci. Lze pozorovat prodloužení koagulační doby (měřené in vitro, pro thrombin, thromboplastin a prothrombin) v závislosti na koncentraci hirudinu v plazmě, což ukazuje, že molekula zachovává svou biologickou aktivitu v krevním oběhu jedince. Nebyla pozorována změna v počtu destiček, ani v hladině fibrinogenu nebo ve fibrinolytickém systému. Jak podkožní, tak intravenózní injekce hirudinu jsou dobře 30 snášeny a nevyvolávají vedlejší účinky. Za účelem testování eventuálních alergických reakcí byly podány 2 intrakutánní injekce stejným jedincům ve 4-týdenních intervalech; nebyla zjištěna žádná známka senzibilizace. Co víc, nebyly zjištěny ani anti-hirudinové antilátky v séru.

Tyto studie ukazují, že hirudin může představovat zajímavý klinický prostředek jako 35 antikoagulant. Předfáze krevní koagulace není ovlivněna vzhledem k vysoké specificitě působení hirudinu. Antithrombinová aktivita je závislá na dávce a účinek hirudinu je rychle reverzibilní vzhledem ke svému rychlému vylučování ledvinami. Bylo možno ukázat, že hirudin je značně lepší než heparin v léčbě DIC, jak bylo možno očekávat na základě skutečnosti, že DIC je doprovázen snížením hladiny antithrombinu III (kofaktor, potřebný pro účinek heparinu) 40 a rozšířením destičkového faktoru 4, který je velmi účinným anti-heparinovým agentem.

Jedna práce poukázala na možnost, že by hirudin mohl být absorbován kůží lidí, i když získané výsledky nelze zcela snadno interpretovat.

Komerční preparáty hrubých bezbuněčných extraktů pijavic lze získat jako pomády (Hirucréme, Société Nicholas, Francie; Exhirud-Blutgel, Plantorgan Werke, NSR), ale jsou potřebné dodatečné testy s vyššími dávkami vysoce vyčištěného materiálu, aby bylo možno zjistit, zda jde o dostatečně zajímavý· způsob podání (administrace). Obecné řečeno, intravenózní. intramuskulámí a perkutánní způsoby podávání jsou výhodné. Též jiné způsoby podávání 50 hirudinu byly popsány, zejména perorální (BSM No 3 792 M).

Tento produkt může být také použit v kombinaci s jinými složkami pro léčení psoriázy a jiných kožních poruch stejného typu, jak je to popsáno v NSR patentovém vykládacím spise č. 2 101 393.

-2CZ 282928 B6

Kromě toho může být hirudin použit jako antikoagulant v klinických nebo laboratorních testech jako prostředek pro výzkum. V tomto případě vysoká specifícita pro jedinou etapu krevní koagulace může představovat značnou přednost ve srovnání s nej častěji užívanými antikoagulanty, jejichž působení je mnohem méně specifické.

Hirudin může být navíc velice užitečný jako antikoagulační prostředek v mimotělních obvodech a v dialyzačních systémech, kde může znamenat značnou přednost ve srovnání s jinými antikoagulanty, zejména může-li být imobilizován v aktivní formě na povrchu těchto umělých oběhových systémů.

Aktivace fixace hirudinu na thrombin může kromě toho dovolit nepřímou ochranu koagulačních faktorů, jako např. faktoru VIII, během jeho čištění.

Konečně může použití značkovaného hirudinu představovat jednoduchou a účinnou metodu pro měření hladiny thrombinu a prothrombinu. Zejména může být značkovaný hirudin použit k tomu, aby byly lépe viditelné tvořící se krevní sraženiny, protože jev koagulace zahrnuje transformaci cirkulujícího prothrombinu na thrombin v místě tvoření, protože se značkovaný hirudin váže na thrombin a může tak být zviditelněn.

Kromě toho je možné předpovědět přímé použití transformovaných kvasinek jako léčiva, uvolňujícího hirudin, např. rozprostřením (rozmazáním) krému, obsahujícího řečené kvasinky vylučující hirudin na kůži.

Souhrnně lze říci, že hirudin, připravovaný způsobem podle vynálezu může být použit:

1. Jako antikoagulant v kritických thrombických podmínkách k profylaxi a prevenci rozšíření existujících trombóz;

2. jako antikoagulant ke snížení hematomů a otoků po mikrochirurgických zákrocích, tj. situacích, kde je důležitá aplikace živých pijavic;

3. jako antikoagulant v systémech mimotělní cirkulace ajako antikoagulační prostředek k potažení syntetických biomateriálů;

4. jako antikoagulant v klinických testech vzorků krve při laboratorních pokusech;

5. jako antikoagulant v klinických výzkumech antikoagulace ajako prostředek na pokusy;

6. jako možný topický prostředek pro kožní aplikaci při léčení hemeroidů, varixů či edémů;

7. jako složka při léčení psoriázy a jiných příbuzných onemocnění;

8. konečně, hirudin může být použit k fixování thrombinu při konzervaci krve a při přípravě krevních preparátů (destičky, faktory VIII a IX).

Například, hirudin může být použit v terapeutických přípravcích v koncentracích, odpovídajících 100 - 50 000 antithrombinových jednotek na kg hmotnosti na den.

Poněvadž je hirudin rozpustný ve vodě, je snadné získat injikovatelné farmaceutické přípravky nebo přípravky, aplikovatelné jinými způsoby, tím, že se použijí farmaceuticky přijatelná vehikula a nosiče.

Konečně lze použít značkovaný hirudin, ať už radioaktivní či jinak značkovaný enzymaticky či fluorescentně, získaný známými technikami, pro provádění in vitro stanovení nebo in vivo

-3CZ 282928 B6 pokusů, zejména pro zviditelnění tvorby krevních sraženin.

Preparát hirudinu z celého zvířete byl použit ke stanovení sekvence aminokyselin této bílkoviny. V následujících pokusech byl klonován gen, který se exprimoval do messenger RNA v hlavách hladovějících pijavic. Tento gen nese informaci pro bílkovinu (hirudin varianta 2 nebo HV-2), jejíž sekvence je signifikantně odlišná od té, která se nachází v celém těle zvířete (bílkovinná varianta nazvaná HV-1). Existuje 9 rozdílů ve zbytcích aminokyselin mezi HV-1 a HV-2 a rozdíly mezi dvěma NH^-terminálními zbytky (val-val nebo ile-thr) mohou vysvětlit zdánlivé kontradikce v literatuře, týkající se NH2-terminálního konce hirudinu.

Obrázek 1 ukazuje sekvence DNA rekombinantního plazmidu pTG717, který obsahuje kopii cDNA, odpovídající mRNA HV-A, jakož i sekvenci aminokyselin, odvozenou ze sekvence DNA (viz b), a rozdíly mezi touto sekvencí a sekvencí aminokyselin v HV-1 (viz c).

Je třeba poznamenat, ze sekvence cDNA není pravděpodobně úplná a že může existovat signální sekvence, předcházející začátku zralé bílkoviny.

Exprese cDNA HV-2 v mikroorganismech ukazuje, že odpovídající bílkovina má antithrombinovou aktivitu.

I když následující pokusy byly učiněny s variantou HV-2, budeme v dalším označovat jako hirudin a gen kódující hirudin jak jednu, tak druhou variantu, tj. H-l nebo HV-2, jakož i případné jiné varianty a odpovídající sekvence - není-li řečeno jinak.

Předmětem vynálezu je způsob syntézy hirudinu v maturované formě nebo ve formě prekurzoru kultivací mikroorganismů.

Podstata vynálezu je v tom, že se jako mikroorganismů používá při kultivaci kvasinek, transformovaných funkčním segmentem DNA, který obsahuje alespoň gen hirudinu nebo některé z jeho variant (gen H) a sekvenci DNA (Sh·), obsahující signály, které zajišťují transkripci genu H kvasinkami.

Při kultivaci se používá kvasinek, u nichž funkční segment obsahuje alespoň sekvenci

- Str “ Lex - Sci - gen H v níž

L_ex znamená vedoucí sekvenci, které je zapotřebí k dosažení vylučování produktu genu, a

S_C| znamená sekvenci DNA, která kóduje místo štěpení, při čemž prvek S_C| - gen H může se vícekrát opakovat.

S výhodou se při kultivaci používá kvasinek, u nichž sekvence L_ex znamená sekvenci pohlavního feromonu a kvasinek.

Lze používat kvasinek, u nichž sekvence S_ci znamená sekvenci, která obsahuje na konci 3' kodon ATG, který předchází gen H.

Sekvence S_d kvasinek může obsahovat na konci 3' dva kodony, kódující Lys-Arg před genem H.

Dále, sekvence S_d používaných kvasinek může obsahovat na konci 3' pět kodonů, kódujících Ser-Leu-Asp-Lys-Arg.

-4CZ 282928 B6

Při jednom z řešení lze při kultivaci používat kvasinek, u nichž gen H je následován sekvencí terminátoru kvasinky.

Při jiném postupu podle vynálezu se při kultivaci používá kvasinek, u nichž sekvence terminátoru kvasinky je stejná jako u genu PGK.

Výhodný postup je ten, že se při kultivaci používá kvasinek, u nichž funkční segment obsahuje alespoň jednu sekvenci, která kóduje aminokyseliny (1) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gin Val Asp Gly Ser Met Hirudin ..., (2) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Hirudin ..., (3) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg Hirudin ..., (4) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Leu Asp Lys Arg Hirudin ..., nebo (5) Lys Arg Hirudin ....

Dalším význačným znakem postupu podle vynálezu je to, že se při kultivaci používá kvasinek, u nichž funkční segment je části plazmidu, který obsahuje alespoň jeden zdroj (počátek)/replikace v kvasinkách.

Lze používat s výhodou kvasinek, u nichž zdroj replikace uvedeného plazmidu je tentýž, jako 25 u plazmidu 2 μ.

S výhodou se používá kvasinek, u nichž uvedený plazmid obsahuje navíc selekční markér.

Je výhodné, je-li selekční markér dán genem URA 3.

Kvasinkami, jichž se při kultivaci používá, jsou kvasinky rodu Saccharomyces, s výhodou, které představují sexuální typ Mat a, především kvasinky kmenu Saccharomyces S. cerevisiae.

Získaný hirudin se izoluje z kultivačního prostředí.

Maturovaný hirudin se při postupu podle vynálezu získává z prekurzoru pomocí chemického nebo enzymatického štěpení na úrovni sekvence, odpovídající S_C[.

Maturovaný hirudin lze při postupu podle vynálezu získávat štěpením na úrovni methioninu.

Dále lze maturovaný hirudin získávat enzymatickým štěpením po sekvenci Lys-Arg nebo SerLeu-Asp-Lys-Arg prekurzoru.

Jiným znakem postupu podle vynálezu je, že se hirudin, získaný štěpením prekurzoru, podrobí 45 renaturaci.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je příprava hirudinu pomocí kvasinek. Kvasinky jsou eukaryotickými jednobuněčnými organismy. Druh Saccharomyces zahrnuje kmeny, jejichž biochemie a genetika jsou intenzivně studovány v laboratoři; zahrnuje rovněž kmeny, používané 50 v potravinářském průmyslu (chléb, alkoholické nápoje atd.) a jsou tedy produkovány ve velkých množstvích.

Lehkost, se kterou lze manipulovat genetiku buněk Saccharomyces cerevisiae, ať už klasickými technikami nebo technikami, rozvinutými moderní genetikou, a ještě lépe kombinací těchto dvou typů technik, a dlouhá průmyslová historie tohoto druhu z něj činí nejvhodnější organismus pro produkci cizích polypeptidů.

Proto tento vynález se zejména týká funkčního segmentu DNA, umožňujícího přípravu hirudinu z kvasinek, charakterizovaného tím, že obsahuje alespoň:

. gen hirudinu a nebo některý z jeho variant (dále gen H);

to . sekvenci DNA (Str), obsahující signály, zajišťující transkripci genu H kvasinkou.

Tento funkční segment, integrovaný v plazmidu nebo v chromozomech některé kvasinky , přednostně druhu Saccharomyces, umožní po transformaci zmíněné kvasinky expresi hirudinu, 15 ať už v aktivní formě, nebo ve formě neaktivního prekurzoru, který umožní regeneraci hirudinu pomocí aktivace.

Důležitost Saccharomyces cerevisiae spočívá v tom, že tato kvasinka je schopna vylučovat některé bílkoviny do kultivačního média, studium mechanismů, odpovědných za toto vylučování, 20 je v plném rozmachu, a bylo ukázáno, že je možné přimět kvasinku vylučovat po ad hoc manipulacích lidské hormony, správně zpracované a podobné ve všech ohledech těm, které se nacházejí v lidském séru.

V rámci tohoto vynálezu byla tato vlastnost využita k získání sekrece hirudinu, protože to má 25 četné výhody.

Především kvasinky secemují jen málo bílkovin, což má za výhodu, že to dovoluje - když se podaří seřídit sekreci dané cizí bílkoviny na vysoké hladiny - získat v kultivačním médiu produkt, který může představovat vysoké procento z celkových vylučovaných bílkovin a proto 30 ulehčit operace při čištění žádané bílkoviny.

Existuje více bílkovin nebo polypeptidů, vylučovaných kvasinkami. Ve všech známých případech jsou tyto bílkoviny syntetizovány ve formě delšího prekurzoru, jehož NFL-terminální sekvence je rozhodující pro zapojení do metabolické cesty, vedoucí k sekreci.

Syntéza v kvasince hybridních bílkovin, obsahujících NEL-terminální sekvenci jednoho z těchto prekurzorů, následovaná sekvencí cizí bílkoviny, může v určitých případech vést k sekreci této cizí bílkoviny. Skutečnost, že tato cizí bílkovina je syntetizována ve formě prekurzoru, obecně neaktivního, umožňuje chránit buňku proti možným toxickým vlivům hledané molekuly, protože 40 ke štěpení, které uvolňuje aktivní bílkovinu, dochází jen ve váčcích, pocházejících z Golgiho aparátu, které izolují bílkovinu z cytoplazmy.

Využití metabolických cest, vedoucích k sekreci ktomu, aby kvasinka produkovala cizí bílkovinu, má tedy několik předností:

1. Dovoluje získat ze supematantu kultury dostatečně čistý produkt;

2. dovoluje chránit buňku proti možným toxickým vlivům zralé bílkoviny;

3. na druhé straně mohou vylučované bílkoviny v určitých případech podlehnout modifikacím (glykosylace, sulfatace atd.).

Proto bloky exprese podle vynálezu budou mít zejména následující strukturu:

-6CZ 282928 B6

Str ~ L_ex - S_ci - gen H kde

L„ kóduje leader sekvenci, potřebnou k extrakci bílkoviny, odpovídající genu H;

S_C| znamená sekvenci DNA, kódující místo štěpení; kromě toho prvek S_C|-gen H se může opakovat vícekrát.

Jako příklad sekretujícího systému byl zvolen feromon a, to jest, že v předcházející sekvenci pochází sekvence L„ z genu sexuálního feromonu a kvasinky, ale mohly by být užity i jiné systémy (např. systém bílkoviny Killer).

Sexuální feromon a kvasinky je peptid o 13 aminokyselinách (v rámečku na obrázku 2), který’je 15 sekretován do kultivačního média kvasinkou S. cerevisiae sexuálního typu Mata. Faktor a zastavuje buňky opačného sexuálního typu (Mata) ve fázi G1 a indukuje biochemické a morfologické změny, potřebné ke kopulaci těchto dvou typů buněk. Kutjan a Herskowitz klonovali strukturální gen faktoru a a bylo dedukováno ze sekvence tohoto genu, že faktor a o 13 aminokyselinách je syntetizován ve formě pre-pro-proteinu, prekurzoru o délce 165 20 aminokyselin (obr. 2). Prekurzor obsahuje hydrofobní amino-terminální sekvenci o 22 zbytcích (podtržené tečkováním), následované sekvencí o 61 aminokyselinách a obsahující 3 místa pro glykosylaci, následující konečně 4 kopiemi faktoru a. Tyto 4 kopie jsou odděleny spacer sekvencemi a zralá bílkovina je uvolněna z prekurzoru díky těmto enzymatickým aktivitám:

l. endopeptidázy typu kathepsinu B, štěpící na karbonylovém konci dipeptidy Lys-Arg (místo štěpení je označeno silnou šipkou);

2. endopeptidázy typu karboxypeptidázy B, která štěpí bázické zbytky na karboxylovém konci vyštěpených peptidů;

3. dipeptidyl-aminopeptidázy (zvané A), která odstraňuje zbytky Glu-Ala a Asp-Ala.

Nukleotidová sekvence tohoto prekurzoru obsahuje též 4 místa pro štěpení restrikční endonukleázou Hind III, označená šipkou H.

Bylo uskutečněno více fúzí mezi genem feromonu a a zralou sekvencí hirudinu. Kvasinkové buňky typu Mat a mohou exprimovat tyto fúzované geny. Odpovídající hybridní bílkoviny mohou být tedy zpracovány díky signálům, které obsahují a které pocházejí ze sekvencí pre-proprekurzoru feromonu a. Lze tedy očekávat, že bude možno získat z kultivačního média 40 polypeptidy, mající sekvenci hirudinu.

V jedné z konstrukcí obsahuje sekvence S_C| na konci 3' kodon ATG, předcházející gen H; v této fúzované bílkovině tedy methioninový zbytek předchází první aminokyseliny zralé sekvence hirudinu. Tento polypeptid po štěpení bromkyanem dává vznik molekule hirudinu, kterou lze aktivovat po etapě renaturace.

V ostatních konstrukcích signály štěpení, které jsou normálně užívány pro tvorbu feromonu a, slouží k produkci polypeptidů v supematantu kultury, které obsahují antithrombinovou aktivitu. Tento případ nastává, když sekvence S_c| obsahuje na svém 3' konci dva kodony, kódující Lys-

Arg, tj. AAA nebo AAG s AGA nebo AGG; polypeptid je štěpen endopeptidázou, která štěpí u karboxylového konce dipeptidy Lys-Arg a uvolňuje tak hirudin.

-7 CZ 282918 B6

Zejména se vynález týká konstrukcí, ve kterých sekvence, předcházející gen hirudinu, kóduje jednu ze sekvencí těchto aminokyselin:

1. Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gin Val Asp Gly Ser Met Hirudin ...,

2. Lys Arg Glu Ala Glu Ala Hirudin ...,

3. Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg Hirudin ...,

4. Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Leu Asp Tyr Lys Arg Hirudin nebo

5. Lys Arg Hirudin ....

Je ovšem možné předpovědět i použití jiných sekvencí, které jsou na úrovni aminokyselin štěpeny selektivně enzymem, s tím, že toto místo štěpení není současně přítomno v samotném hirudinu.

Konečně mohou bloky exprese představovat - po genu H - sekvenci kvasinkového terminátoru, např. genu PGK.

Obecně mohou být segmenty exprese podle vynálezu integrovány do kvasinky, zejména Saccharomyces, buď do plazmidů o autonomní replikaci, nebo do chromozomu kvasinky.

Je-li plazmid autonomní, bude obsahovat prvky, zajišťující jeho replikaci, tj. počátek replikace, jako je u plazmidů 2 u. Kromě toho, plazmid bude moci obsahovat prvky selekce, jako jsou gen URA3 nebo LEU2, které zajišťují komplementaci kvasinek ura3' nebo leu2‘. Tyto plazmidy mohou rovněž obsahovat prvky, zajišťující jejich replikaci v bakteriích, vzhledem ktomu, že se jedná o plazmid pro více hostitelů, např. počátek replikace, jako je v pBR322, značkující gen, jako je Amp^r, a/nebo jiné prvky, známé odborníku.

Předložený vynález se také týká kmenů kvasinek, transformovaných blokem exprese, podle vynálezu, obsazeným buď v plazmidů nebo integrovaným v chromozomech. Mezi těmito kvasinkami je třeba zejména jmenovat kvasinky rodu Saccharomyces, zejména S. cerevisiae.

Jestliže je promotorem gen feromonu a, pak má přednost kvasinka sexuálního typu Mat a. Bude např. použit kmen genotypu ura3‘ nebo leu2' nebo jiný, komplementovaný plazmidem za účelem zajištění udržení plazmidů v kvasince pomocí vhodného selekčního tlaku.

I když je možné připravit hirudin fermentací předchozích transformovaných kmenů na přizpůsobených kultivačních půdách pomocí akumulace hirudinu v buňkách, je nicméně výhodnější, jak to vyplývá z předchozího popisu, když se nechá hirudin sekretovat do prostředí, ať už ve zralé formě nebo ve formě prekurzoru, který musí být dále zpracován in vitro.

Tato maturace se může provést v několika etapách. Především může být potřebné štěpení některých prvků, pocházejících z překladu sekvence L_ex, a toto štěpení bude provedeno na úrovni sekvence odpovídající S_c). Jak to bylo naznačeno již dříve, zralý hirudin může být předcházen methioninem, který- bude selektivně štěpen bromkyanem. Tento postup je použitelný, protože kódující sekvence hirudinu neobsahuje methionin.

-8CZ 282928 B6

Je rovněž možné předpovědět na N-konci dipeptid Lys-Arg, který je štěpen na karboxylovém konci specifickou endopeptidázou; protože je tento enzym aktivní v procesu sekrece, můžeme tak získat přímo zralý protein v prostředí. Avšak, v některých případech může být potřebné předpovědět enzymatické štěpení po sekreci přidáním specifického enzymu.

V určitých případech, zejména po působení bromkyanu, může být potřebné, aby se bílkovina renaturovala tím, že se znovuvytvoří disulfidické mosty. Tak za tímto účelem je peptid denaturován, např. guanidin-hydrochloridem, pak je renaturován v přítomnosti redukovaného glutathionu a oxidován.

Příklady provedení wnálezu

Jiné charakteristiky a výhody tohoto vynálezu se ukáží při čtení následujících příkladů.

Na přiložených obrázcích:

Obr. 1 představuje nukleotidovou sekvenci fragmentu cDNA hirudinu, klonovaného v pTG 717;

Obr. 2 představuje nukleotidovou sekvenci prekurzoru sexuálního feromonu a;

Obr. 3 schematizuje konstrukci pTG834;

Obr. 4 schematizuje konstrukci pTG880;

Obr. 5 schematizuje konstrukci pTG882;

Obr. 6 schematizuje konstrukci M13TG882;

Obr. 7 schematizuje konstrukci pTG874;

Obr. 8 schematizuje konstrukci pTG876;

Obr. 9. schematizuje konstrukci pTG881;

Obr. 10 schematizuje konstrukci pTG886;

Obr. 11 schematizuje konstrukci pTG897;

Obr. 12 představuje elektroforézu v polyakrylamidovém gelu bílkoviny o molekulové hmotnosti vyšší než 1 000, získané z prostředí po kultivaci kvasinek, transformovaných pomocí pTG886 a pTG897;

Obr. 13 představuje elektroforézu bílkovin o mol. hmotnosti vyšší než 1 000 v akrylamidovém gelu, získaných z média po kultivaci kvasinek, transformovaných pomocí pTG886 apTG897;

Obr. 14 je schématem konstrukce pTG897;

Obr. 15 představuje elektroforézu bílkovin o molekulové hmotnosti vyšší než 1 000 v akry [amidovém gelu, získaných z média po kultivaci kvasinek, transformovaných pomocí pTG847 a pTG805;

-9CZ 282928 B6

Obr. 16 je schématem, srovnávajícím sekvence aminokyselin směrem dolů od prvního místa štěpení (Lys-Arg) v různých konstrukcích.

Sekvence aminokyselin a nukleotidů nejsou v tomto popisu uvedeny, aby nebyl příliš zatížen, jsou však jeho zřejmou součástí.

Příklad 1

Konstrukce pTG822

Fragment DNA hirudinu HV-2 byl extrahován z gelu po štěpení plazmidu pTG717 působením Pstl, pak byl štěpen současně pomocí enzymů Hinfl a AhalII. Enzym Hinfl štěpí po proudu od prvního kodonu maturované sekvence hirudinu HV-2. Enzym AhalII štěpí přibližně 30 párů nukleotidů za (3’) stop kodonem sekvence hirudinu. Fragment Hinfl-AhalII takto získaný byl izolován na agarosovém gelu a pak z něj eluován.

Sekvence, kódující zralý protein, byla zavedena ve vektoru pTG880. Vektor pTG880 je derivátem vektoru pTG838 (obr. 3). Plazmid pTG838 je identický s pTG833 až na místo BglII, umístěné vedle terminátoru transkripce PGK. Toto místo bylo zrušeno zarovnáním konců pomocí Klenowovy polymerázy, za účelem obdržení pTG838.

Plazmid pTG833 je vektorem pro pár hostitelů kvasinka-E-coli. Tento plazmid byl vymyšlen pro expresi cizích genů v kvasince. Základní prvky tohoto vektoru (obr. 3) jsou tyto: gen URA3 jako značkující selekci v kvasince, počátek replikace plazmidu 2 μ kvasinky, gen odolnosti vůči ampicilinu a počátek replikace plazmidu pBR322 E. coli (tyto dva poslední prvky dovolují propagaci a selekci tohoto plazmidu v kolibacilu), oblast končící u 5' genu PGK kvasinky kódující sekvenci tohoto genu až do místa Sáli, fragment SalI-PvuII pBR322 a terminátor genu PGK. Tento plazmid již byl popsán ve francouzské patentové přihlášce č. 84 07125 ze dne

9. května 1984.

Plazmid pTG880 byl konstruován zpTG838 (obr. 4) vsunutím krátké polylinkerové oblasti (pocházející z bakteriofágu M13) do pTG838, štěpené EcoRI a BglII, což umožňuje umístit celou řadu míst pro klonování v tomto pořadí: BglII, Pstl, HindlII, BamHI, Smál a EcoRI, ihned za oblast 5', končící kvasinkový PGK gen. DNA plazmidu pTG880 byla digerována BglII a Smál a velký fragment, vzniklý touto digescí, byl izolován a eluován z gelu. Fragment Hinfl/AhalII pTG717, který obsahuje větší část sekvence, kódující hirudin HV-2, byl smíchán spTG880, který byl štěpen současně s třemi oligonukleotidy (obr. 5), určenými k rekonstituci NH₂terminální oblasti sekvence hirudinu, a které spojují místo BglII vektoru s místem Hinfl fragmentu, obsahujícího hirudin. Tato směs byla podrobena postupu ligace a pak sloužila k transformaci buněk E.coli. Plazmid pTG882 byl rekuperován z těchto transformovaných buněk.

Tento plazmid sloužil k transformaci buněk kvasinek za účelem produkce hirudinu pod kontrolou promotoru PGK. Nicméně nebyla zjištěna žádná aktivita hirudinu v hrubých extraktech buněk, transformovaných tímto vektorem. Důvod netvoření aktivního hirudinu je zatím nejasný. Přesto konstrukce pTG882 sloužila jako zdroj kódující sekvence hirudinu pro vektory sekrece kvasinek, popsaných výše.

- 10CZ 282928 B6

Příklad 2

Konstrukce pTG886 a pTG897

Především byl fragment BglII-EcoRI (230 bp, tj. párů bází) pTG882, obsahující sekvenci hirudinu, přenesen do bakteriofágu M13mp8 (obr. 6) mezi místa BamHl a EcoRI. Tak byl získán fág M13TG882. z něhož bylo možno izolovat fragment EcoRI-HindlII (kolem 245 bp). Tento fragment obsahuje celou kódující sekvenci hirudinu HV-2, přičemž místo splynutí BamHI/BglII a kohezivní konce (HindlII-EcoRI) dovolují klonování do kvasinkového sekrečního vektoru io pTG881 (obr. 9).

Plazmid pTG881 (10 kb, tj. tisíců bází) je vektorem pro hostitele E. coli - kvasinka, který se replikuje autonomním způsobem jak v E. coli, tak v kmenech Saccharomyces cerevisiae uvarum a carlbergensis.

Zavedení tohoto plazmidu do E. coli dovoluje získat odolnost vůči ampicilinu (a jiným antibiotikům typu β-laktamu). Kromě toho tento plazmid nosí geny LEU2 aURA3 kvasinky, které vedou k expresi v kmenech E. coli i Saccharomyces. Dovoluje tedy přítomnost tohoto plazmidu v E. coli nebo v Saccharomyces docílení komplementace kmenů, deficitních na β20 isopropylmalát dehydrogenázy nebo OMP dekarboxylázy.

Plazmid pTG881 je konstruován následovně:

Výchozím plazmidem je pTG848 (identický s pTG849, popsaným ve franc. patentu č. 83 15716, 25 kromě genu ura3, jeho orientace je opačná), aje sestaven z následujících fragmentů DNA (obr. 7):

1. Fragment EcoRI-HindlII o přibližně 3,3 kb, pocházející z plazmidu pJDB207. Poloha HindlII odpovídá koordinátě 105 plazmidu 2 μ formy B, poloha EcoRI koordinátě 2243. V tomto fragmentu se nachází gen LEU2, vsunutý prodloužením polydesoxyadenilát/polydesoxythymidilát do místa Pstl fragmentu 2 μ formy B.

2. Fragment HindlII genu URA3.

3. Veliký fragment EcoRI (koordináta 0)-SaII (koordináta 650) pBR322. V místě PvuII tohoto fragmentu byl vsunut fragment EcoRI-HindlII (jehož konce předtím byly zarovnány působením Klenowova enzymu v přítomnosti 4 nukleotidů) o 510 párech nukleotidů a odpovídající konci genu pGK. Zarovnaný konec EcoRI genu PGK, když je navázán na konec PvuII pBR322, regeneruje jedno místo EcoRI.

4. Fragment HindlII-SalI (2,15 kb) genu pGK.

Plazmid pTG848 byl štěpen HindlII, a konce takto uvolněných dvou fragmentů jsou zarovnány postupem podle Klenowa v přítomnosti 4 desoxyribonukleotidů. Oba fragmenty jsou podrobeny 45 ligaci a před transformací je tato ligační směs podrobena působení HindlII, což dovoluje eliminovat jakoukoliv formu plazmidu, která by měla zachováno jedno (nebo dvě) místo HindlII. Kmen E. coli BJ5183 (pyrF) se transformuje a vyberou se buňky, transformované pro rezistenci vůči ampicilinu a pro znak pyr⁺. Získá se tak plazmid pTG874 (obr. 7), kde obě místa HindlII jsou potlačena a orientace genu URA3 vede k transkripci ve stejném směru jako u genu 50 fosfoglycerát kinázy (PGK).

- 11 CZ 282928 B6

Plazmid pTG874 je štěpen Smál a Sáli, fragment o 8,6 kb je pak izolován z agarosového gelu. Plazmid pTG864, obsahující fragment EcoRI-SalI (kolem 1,4 kb) genu MFal, klonovaného ve stejných místech jako pBR322, je štěpen EcoRI. Takto linearizované konce plazmidů jsou zarovnány působením Klenowova enzymu v přítomnosti 4 nukleotidů. Štěpení enzymem Sáli je 5 pak uskutečněno a fragment EcoRI (volný konec)-SalI, odpovídající genu MFal, se izoluje.

Tento poslední fragment je navázán s kusem Smal-Sall (8,6 kb) pTG874 za účelem získání plazmidů pTG876 (obr. 8).

Za účelem potlačení místa BglI vedle sekvence promotoru MFal parciální štěpení s BglII io plazmidů pTG876 byla následována působením Klenowova enzymu v přítomnosti 4 desoxyribonukleotidů. Nově získaný plazmid, pTG881 (obr. 9), dovoluje vřazení cizích kódujících sekvencí mezi prvním místem HindlII genu MFal a místem BglII konce genu PGK.

Když fúze cizího kódujícího DNA k místu HindlII dovoluje získat překlad ve stejné fázi čtení, 15 získaná hybridní bílkovina obsahuje části pre-pro feromonu a.

Klonování vpTG881 (obr. 10) fragmentu HindlII-EcoRI, nesoucího gen hirudinu, vede k plazmidů pTG886. Když je klonování uskutečněno, nacházíme se u místa BglII po proudu fragmentu, což umožňuje získat ho ve formě Hinfl-BglII, přičemž je místo Hinfl stejné jako 20 místo použité výše. Protože je BglII jediné v pTG881, je snadné rekonstituovat konec 5', kódující sekvence hirudinu za použití 3 oligonukleotidů k rekonstituci sekvence 5' hirudinu za umožnění přečtení ve fázi sekvence pre-pro feromonu a, následovaného zralou sekvencí hirudinu.

Tento nový plazmid je nazýván pTG897 (obr. 11).

Příklad 3

Exprese hirudinu kvasinkami

DNA pTG897 sloužila k transformaci kvasinky TGYlsp4 (Mata, ura3 - 251 - 373 - 328, his3 11 - 15) na ura’ podle již popsané techniky.

Transformovaná kolonie byla přeočkována a sloužila k zaočkování 10 ml minimálního média 35 plus kasaminokyseliny (0,5%). Po 20 h kultivace byly buňky centrifugovány, supematant byl dialyzován proti destilované vodě a odpařen centrifugací ve vakuu.

Současně byla stejným způsobem zpracována kultura TGYlsp4, transformovaná pTG886, a kultura TGYlsp4, transformovaná plazmidem, neobsahujícím sekvenci pro hirudin (TGYlsp4 40 pTG856). Suché sedliny byly suspendovány v 50 μΐ vody a 20 μΐ této suspenze bylo vařeno v přítomnosti 2,8 % SDS a 100 mM merkaptoethanolu a naneseno na akrylamidový gel-SDS (15% akrylamidu; 0,1% SDS). Po fixaci a obarvení Coomassie-ovou modří je možno detegovat polypeptidy, které se akumulují v supematantu kultur TGYlsp4/pTG886 a TGYlsp4/pTG897 a které jsou nepřítomné v supematantu kontrolní kultury (obr. 12). Kromě toho se tyto série 45 dodatečných peptidů silně značí cysteinem ^3:>S, jak to lze očekávat pro peptidy hirudinu, protože tato molekula je velmi bohatá na cystein (obr. 10).

Elektroforézv, znázorněné na obr. 12 a 13, byly provedeny takto:

Pro obr. 12 extrakty byly připraveny následujícím způsobem: 10 ml minimálního média (Yeast Nitrogen Base Difco bez aminokyseliny (6,7 g/1), glukóza (10 g/1), doplněno kasaminokyselinami 0,5%), bylo naočkováno různými kmeny a kultivováno 20 h (stacionární fáze). Buňky byly odstředěny, supematant dialyzován proti vodě (minimální retence: mol. hmotnost 1 000), pak

- 12CZ 282928 B6 sušen centrifugací ve vakuu. Vzorky pak byly suspendovány v 50 μΐ pufru a z toho 20 μΐ bylo zpracováno jak výše popsáno a pak naneseno na akrylamidový gel-SDS (15% akrylamidu, 0,1% SDS).

Použité kmeny jsou tyto:

.jamka2: TGYlsp4, transformovaný plazmidem, neobsahujícím sekvenci hirudinu (kontrola);

. jamka 3: TGY1 sp4, transformovaný pTG886;

.jamka 4: TGYlsp4, transformovaný pTG897;

.jamka 1: do jamky 1 byly dány standardy molekulové hmotnosti (LMW Kát Pharmacia; shora dolů: 94 000, 67 000, 43 000, 30 000, 20 100, 14 000).

Zóny jsou odkryly barvením pomocí Coomassie-ové modři R-250.

Pokud jde o obrázek 13, extrakty byly připraveny takto: 100 ml minimálního média + histidin 40 pg/ml bylo naočkováno různými kmeny pro noční kultivaci. Když hustota buněk dosáhla přibližně 5.10⁶ (exponenciální fáze růstu), bylo přidáno 40 μΐ cysteinu ^3;iS (9,8 mCi/ml; 1015 Ci/mmol) ke každé kultuře. Po deseti minutách byly buňky odstředěny a suspendovány v 10 ml úplného média (30 °C) a inkubovány při 30 °C za třepání. Po 3 hodinách 10 ml supematantu bylo dialyzováno proti vodě a koncentrováno na objem 0,5 ml, jak popsáno na obr. 12. Kolem 35 000 cpm (40 μΐ) bylo naneseno na akrylamidový gel-SDS (15 % akrylamidu, 0,1 % SDS). Zóny bílkovin byly detegovány po fluorografii.

Použité kmeny jsou tyto:

. jamka 2: TGYlsp4, transformován plazmidem, neobsahujícím sekvenci hirudinu;

. jamka 3: TGY 1 sp4, transformován pomocí pTG886;

.jamka 4: TGYlsp4, transformován pomocí pTG897;

.jamka 1: v jamce 1 byly dány standardy molekulových hmotností, jejichž molekulová hmotnost je uvedena (x 10³).

Nicméně, když byly supematanty, obsahující tyto polypeptidy, testovány na svou antithrombinovou aktivitu, nebylo možno žádnou aktivitu prokázat.

V případě polypeptidu, vyloučeného TGYlsp4 pTG886, bylo očekáváno, že projde normálními etapami štěpení prekurzoru feromonu a, což by vedlo k molekule hirudinu, prodloužené o 8 aminokyselin na jeho NH₂-konci. Není tedy divu, že polypeptid, sekretovaný buňkami TGYlsp4 pTG886, není aktivní.

Naproti tomu v případě polypeptidu, sekretovaného TGYlsp4/pTG897, lze očekávat, že polypeptid bude identický s přírodní bílkovinou a bude tedy aktivní. Několik hypotéz může objasňovat nepřítomnost aktivity:

1. maturace bílkoviny není úplná, naNH₂ mohou zůstat zbytky Glu-Ala, jak to bylo popsáno pro EGF.

- 13 CZ 282928 B6

2. Bílkovina není aktivní, protože nemá dobrou konformaci, anebo jsou v supematantu přítomny bílkoviny či molekuly o molekulové hmotnosti 1 000, které inhibují aktivitu.

3. Bílkovina není úplná, protože prodělala vnitrobuněčnou nebo mimobuněčnou proteolýzu.

Příklad 4

Aktivace pomocí štěpení bromkyanem

Jestliže je příčina nepřítomnosti aktivity vázána na přítomnost dodatečných aminokyselin na koncové aminokyselině, mělo by být možné znovu najít aktivitu po podrobení peptidu, sekretovaného TGYlsp4/pTG886, štěpení bromkyanem. Skutečně, tento reagent je specifický pro zbytky methioninu a fúzovaná bílkovina, kódovaná pomocí pTG886, obsahuje jen jeden 15 methionin. Tato reakce byla uskutečněna následujícím způsobem: kvasinky, obsahující buď plazmid pTG 886, nebo kontrolní plazmid, neobsahující hirudinový inzert, jsou kultivovány v 10 ml prostředí během 24 h. V tento okamžik kultura dosahuje hustoty 7 až 10.10⁷ buněk v 1 ml. Supematant se oddělí od buněk, intenzivně se dialyzuje proti destilované vodě a pak se lyofilizuje. Suchý prášek se rozpustí v 1 ml 70 % kyseliny mravenčí a z toho se odebere alikvotní 20 množství pro stanovení obsahu celkových bílkovin (metodou barvení Coomassie-ovou modří, za použití reagentu, prodávaného Biorad-em); na zbytek preparátu se působí 1 ml roztoku bromkyanu (30 mg/ml v 70% kyselině mravenčí).

Po odstranění kyslíku proudem dusíku jsou zkumavky inkubovány ve tmě 4 h při teplotě okolí.

Všechny manipulace v přítomnosti bromkyanu jsou prováděny s potřebnou opatrností a v dobře táhnoucí digestoři. Reakce štěpení bromkyanem se zastaví přídavkem 10 objemů destilované vody a pak se roztok lyofilizuje.

Štěpené peptidy se znovu rozpustí v 10 ml destilované vody a jsou znovu dvakrát lyofilizovány.

Na ukončení se peptidy rozpustí v malém objemu destilované vody a alikvotní část se použije k měření antithrombinové aktivity. Zbytek vzorku se lyofilizuje a podrobí renaturačnímu postupu, popsanému níže.

Poněvadž aktivita hirudinu závisí na přítomnosti disulfidických mostů v molekule, zdálo by se 35 pravděpodobným, že peptid, štěpený bromkyanem, by se měl renaturovat správně, aby měl biologickou aktivitu. Proto byly štěpené peptidy podrobeny denaturaci pomocí 5 M-GuHCl, následovanou renaturací podle postupu, známého odborníkům.

Konečně jsou lyofilizované peptidy rozpuštěny ve 400 μΐ 5M-guanidin hydrochloridu (GuHCl) 40 v Tris HC1 (250 mM, pH 9,0); pak se roztok upraví na 2 mM redukovaného glutathionu a 0,2 mM oxidovaného glutathionu v konečném objemu 2,0 ml (konečná koncentrace je 1,0 M GuHCl a 50 mM Tris).

Po 16 hodinách inkubace při 23 °C ve tmě jsou vzorky dialyzovány během 24 h proti 3 krát 2 1 45 Tris HC1 (50 mM, pH 7.5), NaCl (50 mM) při 23 °C a konečný dialyzát je centrifugován.

Pak se měří aktivita antithrombinu v supematantech. Výsledek tohoto pokusu je znázorněn v tabulce I a ukazuje jasně rekuperaci antithrombinové aktivity v supematantech buněk, infikovaných plazmidem pTG886, zatím co nebyla nalezena aktivita v kontrolním plazmidů.

- 14CZ 282928 B6

Tabulka I

Antithrombinová aktivita supematantu kvasinkových kultur

plazmid	zpracování supematantu	aktivita U/ml	specifická aktivita U/mg výchozích bílkovin
pTG886	a) po štěpení před renaturaci	<0,3	-
	b) po štěpení a renaturaci	2,46	102,5
kontrola	a) po štěpení před renaturaci	<0,3	-
	b) po štěpení a renaturaci	<0,15	< 5,6

Závěrem, buňky kvasinek, obsahující rekombinující plazmid, mohou sekretovat peptid s biologickou aktivitou hirudinu po štěpné reakci a renaturaci. Toto ukazuje, že přítomnost dodatečných aminokyselin na NH₂-konci by stačila k objasnění nepřítomnosti aktivity v polypeptidech, přítomných v kulturách TGYsp4/pTG886, a možná také v případě kultur 10 TGYlsp4/pTG897 (konce Glu-Ala).

Příklad 5

Zavedení nového místa rozštěpení bezprostředně před první aminokyselinou sekvence, kódující hirudin HV-2 - plasmid pTG1805

V konstrukci pTG897 je přítomno riziko, že sekretovaný peptid si zachová konce Glu-Ala na NH₂, což by vysvětlovalo nepřítomnost antithrombinové aktivity v tomto materiálu. Jestliže tato 20 hypotéza odpovídá realitě, pak by mělo být možné obnovit aktivitu přímo v supematantu tím, že se utvoří místo štěpení mezi zbytky Glu-Ala a první aminokyselinou hirudinu HV-2 (isoleucin). To bylo uskutečněno přidáním sekvence, kódující dublet LysArg, který je místem rozpoznání endopeptidázou, účastnící se maturace prekurzoru feromonu (obr. 2). Konstrukce byla obdržena přesně tak, jak je popsáno pro plazmid pTG897, až na sekvenci dvou oligonukleotidů (obr. 14). 25 Vzniklý plazmid je zván pTG1805. Plazmid sloužil k přeměně kmene TGYlsp4 na ura\ Materiál, vylučovaný do supematantu, byl analyzován na elektroforezovém gelu, jak bylo výše popsáno, a srovnán s materiálem, získaným s TGYlsp4/pTG897 (obrázek 15).

Použité kmeny jsou tyto:

. jamka 1: markéry, identické s těmi na obr. 12;

.jamka 2: TGYlsp4, transformován pomocí pTG897;

.jamka 3: TGYlsp4, transformován pomocí pTG 1805;

. jamka 4: kontrola, neprodukující hirudin.

Specifické polypeptidy kmene TGYlsp4/pTG1805 migrují pomaleji než specifické polypeptidy 40 kmene TGYlsp4/pTG897. Tento výsledek naznačuje, že nové místo štěpení není využito

- 15 CZ 282928 B6 efektivně odpovídající endopeptidázou. Nicméně, stanovení hirudinu v supematantu pomocí biologické aktivity odhaluje, že malá část tohoto materiálu je aktivní, v protikladu k tomu, co bylo získáno s kulturami TGYlsp4/pTG897, zřejmě inaktivními (tabulka Π).

Tabulka II

Antithrombinová aktivita supematantů kvasinkových kultur (10 ml)

plazmid	specifická aktivita U/mg	celková aktivita U (10 ml)
pTG856	nedetegovatelné
pTG897	nedetegovatelné	-
pTG1805	21	2,0

Příklad 6

Nová konstrukce, tvořící nové místo efektivnějšího štěpení, dovolující uvolnění zralého hirudinu

V předchozí konstrukci (pTG897) bylo získáno jen málo hirudinové aktivity v supematantu, pravděpodobně proto, že druhé místo štěpení, určené k uvolnění zralého hirudinu, je rozpoznáváno s malým účinkem. Proto byla sestavena nová konstrukce, která učinila toto dodatečné místo štěpení citlivější vůči endopeptidáze tím, že se k němu přidá proti proudu sekvence 3 aminokyselin, Ser Leu Asp, která je přirozeně přítomna proti proudu prvního dubletu LysArg (obr. 2 a 16).

Použitá technika je stejná jako ta, která byla popsána dříve, až na oligonukleotidy, jejichž sekvence jsou uvedeny níže:

26-mer 15-mer

5'-AGCTTCTTTGGATAAAAGAATTACGT ATACAGACTGCACAG AGAAACCTATTTTCTTAATGCATATGTCTGACGTGTCTTA 40-mer

Sekvence aminokyselin v oblasti štěpení je uvedena na obrázku 13. Odpovídající plazmid je zván pTG1818 a liší se od pTG1805 jen vsunutím nukleotidů 5-TTG GAT AAA, odpovídajících kodonům Ser-Leu-Asp.

Aktivita, stanovená v supematantech kultur TGYlsp4 pTG1818, je podle již popsaných standardních podmínek kolem 200 jednotek pro 10 ml kultury, tj. kolem 100 krát vyšší než aktivita, nalezená v předchozím příkladu. Je třeba poznamenat, že se dávkování může uskutečnit s 10 μΐ nekoncentrovaného kultivačního prostředí.

Příklad 7

Konstrukce, vedoucí k syntéze prekurzoru, zbaveného sekvence Glu-Ala-Glu-Ala

Ve dvou předchozích příkladech bylo ukázáno, že přidání nového místa Lys Arg právě proti směru od začátku maturované sekvence hirudinu umožňuje uvolnění aktivního materiálu v supematantu. Nicméně v těchto příkladech, jestliže se štěpení prekurzoru uskuteční u prvního

- 16CZ 282928 B6 místa Lys Arg (distální vzhledem k začátku maturované sekvence), je možno získat v kultivačním médiu těžší kontaminant, inaktivní a odpovídající řetězcům hirudinu, prodlouženého na konci NH₂. Toto je zejména jasné v případě kultur TGYlsp4 pTG1805, kde inaktivní kontaminant převládá. Toto zůstává stejně přijatelné v případě kultur TGYlsp4 5 pTG1818, kde inaktivní kontaminant nepřevládá, ale mohl by být přítomný, jak bylo popsáno jinými autory v případě EGF. Aby bylo zamezeno této ztrátě výtěžku, vyplývající ze syntézy neaktivního materiálu, bylo rozhodnuto přistoupit k nové konstrukci, která by vedla k syntéze prekurzoru, který· by se lišil od prekurzoru, syntetizovaného buňkami TGYlsp4 pTG897, pouze nepřítomností sekvence Glu Ala Glu Ala mezi místem štěpení Lys Arg a první aminokyselinou 10 maturované sekvence hirudinu.

Následující kmeny byly uloženy v Národní sbírce kultur mikroorganismů (CNCM) Pasteurova ústavu, v ul. Doktora Rouxe 28, Paříž, dne 30. dubna 1985:

. TGYlsp4 pTG1818: Saccharomyces cerevisiae, kmen TGYlsp4 (Mata ura 3-251-373328-his 3-11-15), transformován na ura⁺ plazmidem pTG1818; položka č. 1441.

. TGYlsp4 pTG886: Saccharomyces cerevisiae, kmen TGYlsp4 (Mata ura 3-251-373328-his 3-11-15) transformován na ura⁺ plazmidem pTG886; položka č. I 442.

Literatura:

1. Bagdy D., Barabas E., Graf L., Petersen T.E. a Magnusson S.: Methods in Enzymology, část B, 45, 669 až 678 (1976).

2. Markwardt F.: Methods in Enzymology, ed. Perlman G.E. a Lorand L., Academie Press, 19. 924 až 932 (1970).

3. Markwardt F., Hauptmann J., Nowak G., Klessen Ch. a Walsmann P.: Thromb. Hemostasis (Stuttgart), 47, 226 až 229 (1982).

4. Walsmann P. a Markwardt F.: Die Pharmazie 10, 653 až 660 (1981).

5. Kloss Th. a Mittmann U.: Longenbecks Arch. Chirurg. 358. 548 (1982).

6. Ishikawa A„ Hafter R., Seemuller U., Gokel J.M. a Graeff M.: Thrombosis Research 19, 351 až 358 (1980).

7. Markwardt F., Nowak G., Sturzebecker J., Greisbadi U., Walsmann P. a Vogel G.: Thromb.

Hemostasis (Stuttgart) 52, 160 až 163 (1984).

8. Nowak C. a Markwardt F.: Expt. Path. 18, 438 až 443 (1980).

9. Markwardt F., Nowak G., Sturzenbecker J., Greissback U., Walsmann P. a Vogel G.:

Thromb. Hemostasis 52, 160 až 163 (1984).

10. Sutor A.H.. Knop S. a Adler D.: Kontrolle Antithrombotica, 23rd Symp. Blutgerinnung, Hamburg, str. 117 až 123 (1981).

11. Petersen T.E., Roberts H.R., Sottrup-Jensen L., Magnusson S. a Bagdy D.: Protides Biol.

Fluids, Proč. Colloq., 23, 145 až 149 (1976).

12. Chang J-Y.: Febs Letí. 164, 307 až 313 (1983).

- 17CZ 282928 B6

13. Baskova I.P., Cherkesova D.U. a Mosolov V.V.: Thromb. Res. 30, 459 až 467 (1983).

14. Bussey H„ Saville D., Greene D. a spol.: Mol. Cell. Biol. 3, 1362 až 1370 (1983).

15. Brake A.J., Merryweather J.P., Coit D.G., Heberlein U.A., Mariarz F.R., Mullenbach G.T., Urdea M.S., Valenzuela P., a Barr P.J.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 4642 až 4646 (1984).

16. Bitter G.A., Chen. K.K., Banks A.R. aLai P.H.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 5330 až 5334(1984).

17. Kurjan J. a Herskowitz I.: Cell 30, 933 až 943 (1982).

18. Beggs J.: Genetic Engineering 2, 175 až 203 (1981).

19. Bach M.L., Lacroute F. a Botstein D.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76, 386 až 390 (1979).

20. Hitzeman R.A., Hagie E.F., Hayfflick J.S. a spol.: Nucleic Acids Res. 10, 7791 až 7808 (1982).

21. Ito H., Fukuda Y., Murata K. a Kimura A.: J. Bacteriol. 153, 163 až 168 (1983).

22. Laemmli V.K.C.: Nátuře 227, 680 až 685 (1970).

Claims

1. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, zapojeným do plazmidu, obsahujícího počátek replikace v kvasinkách, nebo zapojeným do chromozomů kvasinek, přičemž kvasinky jsou rodu Saccharomyces, kmene Saccharomyces cerevisiae, a funkční fragment obsahuje alespoň

- jednu sekvenci DNA - Su- - L„ - S_ci - gen H - ter, kódující hirudin, jednu z jeho variant nebo jeho prekurzor (gen H),

- vedoucí sekvenci (L_ex), obsahující prvky, nezbytné pro vylučování produktu genu, a

- sekvenci DNA (S_ff), obsahující signály, zajišťující transkripci genu H kvasinkami.

2. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle nároku 1, kde funkční fragment obsahuje alespoň následující sekvence od konce 5' až po konec 3'

- sekvenci (S_tr), obsahující signály, zajišťující transkripci genu H kvasinkami,

- vedoucí sekvenci (L_ex), nesoucí prvky, nezbytné pro vylučování produktu genu,

- gen, kódující hirudin, jednu z jeho variant nebo jeho prekurzor, a

- 18CZ 282928 Β6

- gen kódující hirudin nebo jednu zjeho variant nebo jeho prekurzor, předcházející místo štěpení S_C|.

3. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle nároků 1 a 2, kde sekvencí L_ex je sekvence alfa pohlavního feromonu kvasinek.

4. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle některého z nároků 1 až 3, kde vedoucí sekvence obsahuje fragment před alfa pohlavním feromonem kvasinek.

5. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle některého z nároků 1 až 4, kde funkční fragment obsahuje sekvenci před alfa pohlavním feromonem kvasinek na konci 5’ genu H.

6. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle některého z nároků 1 až 5, kde po genu H následuje sekvence terminátoru kvasinek.

7. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle nároku 6, kde sekvenci terminátoru kvasinek je sekvence genu PGK.

8. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle některého z nároků 1 až 7, kde místem štěpení je dipeptid Lys-Arg.

9. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle některého z nároků 1 až 7, kde funkční segment je zapojen do plazmidu, obsahujícího alespoň jeden počátek replikace v kvasinkách.

10 18. Směs pro zjišťování vzniku krevní sraženiny, vyznačující se tím, že obsahuje značkovaný hirudin, získávaný způsobem podle některého z nároků 14 a 15.

10. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle nároku 9, kde počátkem replikace je místo v plazmidu 2 μ.

11. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle některého z nároků 9 a 10, kde plazmid má mimo jiné schopnost selekce.

12. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle nároku 11, kde schopnost selekce je dána genem URA3.

13. Kvasinky, transformované funkčním fragmentem DNA, podle nároků 1 až 12, kde kvasinky jsou kvasinky pohlavního typu Matalfa.

14. Způsob přípravy hirudinu fermentaci kvasinek, vyznačující se tím, že se

a) kultivuje na kultivačním prostředí kmen kvasinek Saccharomyces cerevisiae, obsahujících funkční segment DNA, nesený plazmidem nebo zapojený do chromozomů kvasinek, obsahující alespoň sekvenci

- S_tr - L_ex - S_ci - gen H - ter v níž Str je sekvence DNA, obsahující signály, zajišťující transkripci genu H kvasinkami, L_ex je vedoucí sekvence, umožňující vylučování zralého hirudinu nebo ve formě jeho prekurzoru, uzrávajícího in vitro a S_cl je signál DNA, kódující místo štěpení a

b) hirudin, vznikající v kultivačním prostředí, se izoluje z něho ve zralé formě nebo ve formě jeho prekurzoru, uzrávajícího in vitro.

- 19CZ 282928 B6

15. Způsob přípravy hirudinu podle nároku 14, vyznačující se t í m , že se použije sekvence S_cl- gen H obsahující sekvenci, kódující sekvenci Lys-Arg-Ile-Thr.

16. Vnitřní potahová vrstva pro mimotělní krevní oběh, vyznačující se tím, že 5 obsahuje hirudin, získaný způsobem podle nároků 14 a 15.

17. Antikoagulační směs, vyznačující se tím, že obsahuje kvasinky podle některého z nároků 1 až 13, jakožto činidlo, uvolňující hirudin.

15 výkresů