PL155074B1

PL155074B1 - Method of obtaining hirudin

Info

Publication number: PL155074B1
Application number: PL1986259298A
Authority: PL
Priority date: 1985-05-02
Filing date: 1986-05-02
Publication date: 1991-10-31
Also published as: FI865303A; BG49717A3; FI104635B; HK1006183A1; FR2593518B1; CZ282928B6; DK174837B1; WO1986006406A1; AU5778786A; ES8703930A1; CA1341501C; DK634386D0; IE861183L; PT82490A; JPH09103295A; KR870700234A; PT82490B; ATE121778T1; HUT42131A; JPS62502661A

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 155 074

POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 86 05 02 (P. 259298)

Pierwszeństwo 85 05 02 Francja

Int. Cl.⁵ C12N 15/15

Zgłoszenie ogłoszono: 86 12 30

Opis patentowy opublikowano: 1992 04 30

Twórcy wynalazku: Gerard Loison, Paul Tolstoshev, Yves Lemoine, Jean P. Lecocq

Uprawniony z patentu: TRANSGENE S. A.,

Courbevoie (Francja)

Sposób wytwarzania hirudyny

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hirudyny przy użyciu wektorów ekspresji sekwencji DNA kodujących hirudynę lub jej analogi na drodze wydzielania hiduryny w środowisku hodowlanym drożdży transformowanych przez te wektory.

Aktywność przeciwkrzepliwa znajdująca się w gruczołach ślinowych pijawek lekarskich, Hirudo medicinalis, pochodzi z niewielkiego polipeptydu nazywanego hirudyną. Ten bardzo specyficzny i bardzo skuteczny inhibitor trombiny był w ostatnim okresie szeroko badany, gdyż stanowi on potencjalnie bardzo interesujący środek terapeutyczny. Jednakże bardzo powożną trudność stanowi koszt jego wydzielania i oczyszczania, przeszkadzający w szerokim stosowaniu a nawet w używaniu go do badań klinicznych.

Możliwość produkcji hirudyny przez klonowanie genów i ich ekspresja dzięki technice rekombinantów DNA były już wykazane dla klonowania genu naturalnego pijawki kodującego dla hirudyny oraz ekspresji w mikroorganizmie E. coli. Podobnie jak peptyd posiadający aktywność biologiczną mógł być produkowany w E. coli, bardzo ważne jest wyprodukowanie hirudyny w innych typach mikroorganizmów. W praktyce, stosowanie hirudyny w klinice wymaga bardzo wysokiej czystości produktu, zaś usuwanie zanieczyszczeń pirogennych wiązałoby się z problemami oczyszczania hirudyny pochodzącej z ekstraktów pałeczek okrężnicy.

Ponadto, hirudyną syntetyzowana przez E. coli pozostaje wewnątrzkomórkowa i musi być w związku z tym oczyszczona przy użyciu bardzo dużej liczby peptydów E. coli. Z tych względów, interesujące było wyrażenie genu hirudyny w drożdżach nie produkujących substancji pirogennych lub toksycznych dla człowieka, zdolnych do wydzielania protein w środowisku hodowlanym.

Mechanizm działania hirudyny jako środka przeciwkrzepliwego dopiero zaczyna być wyjaśniany. Substratem do umiejscowiania hirudyny jest trąbina będąca enzymem proteolitycznym, który, przez aktywację (aktywnym czynnikiem X) formy zymogennej, protrombiny, przecina fibrynogen w przepływie kołowym przekształcając go w fibrynę potrzebną do tworzenia zakrzepów krwi. Stała dysocjacja kompleksu trombina-hirudyny 1:1 (0,8 X 1O^_1°) wskazuje na wyjątkowo silne połączenie pomiędzy tymi cząsteczkami. W praktyce, ten niekowalentny kompleks można uważać za nie dysocjujący in vivo.

155 074

Hirudyna jest bardzo specyficznym inhibitorem trombiny, o dużo wyższym powinowactwie niż naturalny substrat, fibrynogen. Ponadto, nie zachodzi potrzeba posiadania innych czynników koagulujących lub innych składników plazmy. Specyficzna i bardzo istotna aktywność antytrombinowa hirudyny wykazuje oczywistość jej stosowania klinicznego jako środka przeciwkrzepliwego.

Hirudynę przebadano bardzo szeroko na zwierzętach pod względem jej własności przeciwkrzepliwych. W najbardziej szczegółowym badaniu opisano aktywność hirudyny w zapobieganiu zakrzepicom naczyniowym, okluzjom naczyniowym i rozsianemu krzepnieniu śródnaczyniowemu (DIC) u szczura. Hirudyna jest dobrze tolerowana przez szczury, psy, króliki i myszyjeśli występuje w formie bardzo czystej i jest podana drogą dożylną. LD50 dla myszy jest wyższe od 500000 V/kg ciężaru ciała (tzn. 60 mg/kg). Inne badanie wykazało, że myszy tolerują dawki do 1 g/kg oraz że króliki tolerują zarówno drogą dożylną jak i podskórną dawki do 10 mg/kg. Iniekcje powtarzane u myszy w okresie dwóch tygodni nie doprowadziły do reakcji uczulenia.

Ponadto, hirudyna jest u zwierząt eksperymentalnych szybko usuwana (czas półtrwania rzędu 1 godziny) jeszcze w formie biologicznie czynnej poprzez nerki.

Inne niezależne badania, jedno z zastosowaniem psów i drugie wykazujące aktywność hirudyny w zapobieganiu DIC u szczurów, były zgodne z pozytywnymi rezultatami Markwardta i współpracowników. Badacze ci opublikowali ostatnio pierwszą analizę in vivo wpływu naturalnej hirudyny na ludzki układ hemostatyczny. Materiał wykazał oczekiwane działanie biologiczne bez ubocznych efektów toksycznych.

Wykazano również, że hirudyna zapobiega DIC wywołanemu przez endotoksyny u świń i stanowi w ten sposób potencjalne rozwiązanie bardzo poważnych problemów spowodowanych endotoksynemiami prowadzącymi do wysokiej śmiertelności świń.

Jedyna publikacja bardzo aktualna opisuje podanie dożylne i podskórne hirudyny człowiekowi. Sześciu ochotników użyto do oceny farmakokinetyki i wpływu na system hemostatyczny jednostkowej dawki (1000 AT-V/kg) hirudyny. Hirudyna podana drogą dożylną wykazuje okres półtrwania 50 minut a 50% hirudyny w formie aktywnej odnajduje się w moczu, po 24 godzinach po iniekcji. Obserwuje się wydłużenie czasu krzepnięcia (mierzonego in vitro, dla trombiny, tromboplastyny i protrombiny) w zależności od stężenia hirudyny w plaźmie, co świadczy o tym, że cząsteczka zachowuje swą aktywność biologiczną w krążeniu u pacjenta. Nie obserwuje się zmian w liczbie płytek, w zawartości fibrynogenu ani w układzie fibrynolitycznym. Zarówno podskórne jak i dożylne iniekcje hirudyny są dobrze tolerowane i nie powodują efektów ubocznych. Dla zbadania ewentualnego pojawienia się odczynów alergicznych, tym samym pacjentom podano 2 iniekcje śródskórne, z przerwą 4-tygodniową; nie zaobserwowano żadnych objawów uczulenia. Ponadto nie oznaczono przeciwciał anty-hirudyny w surowicy.

Omówione badania sugerują, że hirudyna może stanowić interesujący kliniczny środek przeciwkrzepliwy. Pre-faza krzępnięcia krwi nie zostaje naruszona z uwagi na wysoką specyficzność działania hirudyny. Działanie anty-trombinowe zależy od dawki a wpływ hirudyny jest szybko odwracalny z uwagi na szybką eliminację nerkową. Można było wykazać, że hirudyna jest dużo lepsza od heparyny w leczeniu DIC (3,6), czego można było się spodziewać wobec faktu, że DIC-owi towarzyszy obniżenie się antytrombiny III (ko-czynnik niezbędny dla działania heparyny) oraz zwolnienie czynnika płytkowego 4, który jest bardzo skutecznym środkiem przeciwheparynowym.

Jedno z badań miało na celu wykazanie możliwości absorpcji hirudyny przez skórę ludzką; jednakże otrzymane rezultaty były trudne do interpretacji.

Handlowe preparaty surowych ekstraktów bezkomórkowych pijawek dostępne są w postaci pomad (Hirucreme, Societe Nicholas, Francja; Exhirud-Blutgel, Plantorgan Werke, RFN), lecz badania uzupełniające z większymi dawkami materiału o wysokiej czystości są konieczne dla ustalenia interesującej drogi podawania. Ogólnie biorąc, korzystnymi drogami podawania są drogi dożylna, śródmięśniowa i skórna. Wymieniane są również inne drogi podawania hirudyny a zwłaszcza droga doustna (BSM nr 3792 M). Produkt ten może również, w połączeniu z innymi składnikami, być stosowany w leczeniu Psoriasis i innych zaburzeń skórnych tego samego typu, jak to opisano w opisie patentowym RFN DOS 2 101 393.

155 074

Hirudyna może być ponadto stosowana jako środek przeciwkrzepliwy w testach klinicznych w laboratoriach i jako narzędzie badawcze. W tym przypadku wysoka specyficzność dla pojedynczego etapu w krzepnięciu krwi może stanowić znaczną korzyść w stosunku do środków przeciwkrzepliwych powszechnie stosowanych, których działanie jest dużo mniej specyficzne.

Ponadto, hirudyna może być bardzo użyteczna jako środek przeciwkrzepliwy w krążeniu pozaustrojowym i w układach dializy, gdzie może przynosić znaczne korzyści w porównaniu z innymi środkami przeciwkrzepliwymi, zwłaszcza gdy może być unieruchomiona w postaci aktywnej na powierzchni tych sztucznych układów krążenia.

Aktywność umiejscawiania hirudyny na trombinie może ponadto pozwalać na niebezpośrednią ochronę czynników krzepnięcia, takich jak czynnik VIII, w czasie jej oczyszczania.

Na koniec, stosowanie znaczonej hirudyny może stanowić prostą i skuteczną metodę pomiaru zawartości trąbiny i protrombiny. Znaczona hirudyna może być zwłaszcza stosowana do wizualnej obserwacji powstawania zakrzepów, ponieważ zjawisko krzepnięcia wywołuje przekształcanie krążącej pretrombiny w trombinę w miejscu powstawania, zaś znaczona hirudyna mająca się umiejscowić na trombinie staje się widzialna.

Ponadto możliwe jest przewidzenie bazpośredniego zastosowania przekształconych drożdży jako leku uwalniającego hirudynę, na przykład przez wytworzenie kremu zawierającego wymienione wyżej drożdże wydzielające hirudynę na skórę.

Reasumując, hirudyna według wynalazku posiada cały szereg możliwych zastosowań:

1°/jako środek przeciwkrzepliwy w krytycznych warunkach trombotycznych dla profilaktyki i zapobiegania rozwojowi tromboz już istniejących;

2⁰/jako środek przeciwkrzepliwy dla ograniczenia krwiaków i obrzmień po mikro-chirurgii, w sytuacjach w których stosowano żywe pijawki;

3°/ jako środek przeciwkrzepliwy w układach krążenia pozaustrojowego i jako środek przeciwkrzepliwy dla pokrywania biomateriałów syntetycznych;

4°/ jako środek przeciwkrzepliwy w testach klinicznych próbek krwi w badaniach laboratoryjnych;

5°°/ jako środek przeciwkrzepliwy w badaniu klinicznym krzepnięcia i jako narzędzie badawcze;

6⁰/ jako środek domiejscowy do stosowania skórnego w leczeniu hemoroidów, żylaków i obrzęków;

7°/jako składnik w leczeniu Psoriasis i innych widocznych zaburzeń;

8°°/ i wreszcie, hirudyna może być stosowana do wiązania trombiny podczas konserwacji krwi i przygotowywania pochodnych krwi (płytki, czynniki VIII i IX).

Na przykład, hirudyna może być stosowana w kompozycjach leczniczych w stężeniach odpowiadających 100—50000 V anty-trombinowych/kg na dobę.

Ponieważ hirudyna jest rozpuszczalna w wodzie, łatwo jest otrzymać kompozycje farmaceutyczne do iniekcji lub do podawania innymi drogami, przy stosowaniu farmaceutycznie dopuszczalnych nośników i napełniaczy.

I wreszcie, możliwe jest stosowanie hirudyny znaczonej bądź przez znakowanie radioaktywne lub każdego innego rodzaju znakowanie enzymatyczne lub fluoroscencyjne, wykonane znanymi sposobami, w celu przeprowadzenia oznaczeń in vitro lub obrazu in vivo, zwłaszcza dla wizualizacji powstawania zakrzepów.

Do oznaczenia sekwencji aminokwasów proteiny użyto preparat hirudyny otrzymany z całego zwierzęcia. W doświadczeniach poniżej klonowano gen, który wyraża się w RNA informacyjnym w głowach pijawek na czczo. Gen ten niesie informację dla proteiny (hirudyna wariant 2 lub HV-2), której sekwencja jest znacząco różna od tej, jaka znajduje się w całym ciele zwierzęcia (proteina wariant zwany HV-1). Istnieje 9 różnic w resztach aminoacylowych pomiędzy HV-1 i HV-2 a różnice pomiędzy dwiema resztami NH₂-termm;ilnymi (val-val lub ile-thr) mogą wyjaśnić pojawiające się w literaturze sprzeczności dotyczące NH2-terminalnego końca hirudyny.

Rysunek 1 ukazuje sekwencje DNA plazmidu rekombinanta pTG717 zawierającego kopię cDNA odpowiadającą mRNA u HV-2, oraz sekwencję aminokwasów wyprowadzoną z sekwencji DNA, w b/, a także różnice pomiędzy sekwencją i sekwencją aminikwasów w HV-1, w c/.

155 074

Należy zaznaczyć, że sekwencja cDNA nie jest prawdopodobnie całkowita oraz, że może istnieć sekwencja sygnalna powyżej początku dojrzałej proteiny.

Ekspresja cDNA z HV-2 w mikroorganizmach wskazuje, że odpowiednia proteina ma aktywność anty-trombinową.

Wprawdzie doświadczenia opisane poniżej były prowadzone z wariantem HV-2, w opisie poniżej oznaczono przez „hirudynę i „gen kodujący hirudynę zarówno jeden jak i drugi wariant, tzn. HV-1 lub HV-2 a nawet ewentualnie inne warianty i odpowiednie sekwencje, o ile nie zazna czono inaczej.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hirudyny przy użyciu drożdży.

Drożdże są eukariontami jednokomórkowymi. Rodzaj drożdży Saccharomyces zawiera szczepy, których biochemia i genetyka są intensywnie badane laboratoiyjnie. Zawiera on również szczepy stosowane w przemyśle spożywczym (chleb, napoje, alkohole, itp.) i w związku z tym produkowane w bardzo dużej ilości.

Łatwość z jaką można manipulować genetyką komórek Saccharomyces cerevisiae, bądź za pomocą technik klasycznych bądź za pomocą technik wywodzących się z technik wywodzących się z inżynierii genetycznej a jeszcze lepiej przez połączenie ich obu, oraz długa historia przemysłowa tego gatunku czynią z niego żywiciela dla produkcji obcych polipeptydów.

Sposób według wynalazku polega na tym, że w pożywce hodowlanej prowadzi się fermentycję drożdży transformowanych blokiem funkcyjnym DNA zawierającym co najmniej gen kodujący hirudynę lub jeden z jego wariantów (gen H) i sekwencję DNA (Str) zawierającą sygnały transkrypcji genu H przez drożdże, zintegrowanym bądź w plazmidzie, bądź w chromosomach drożdży, po czym odzyskuje się hirudynę otrzymaną w środowisku hodowlanym w postaci dojrzałej, albo w postaci prekursora hirudyny, który doprowadza się do dojrzałości in vitro. Korzystnie stosuje się drodże Saccharomyces.

Korzyść ze stosowania Saccharomyces cerevisiae polega na tym, że drożdże te są zdolne wydzielać niektóre proteiny w środowisku hodowlanym. Badania mechanizmów odpowiedzialnych za to wydzielanie są w pełnym toku; wykazano, że możliwe jest spowodowanie wydzielania przez drożdże, po manipulacjach adhoc. hormonów ludzkich poprawnie oprocesowanych i we wszystkich punktach podobnych do hormonów znajdujących się w surowicy ludzkiej.

W ramach niniejszego wynalazku właściwość tę wykorzystano dla uzyskania wydzielania hirudyny, gdyż przynosi ona liczne korzyści.

Przede wszystkim, drożdże wydzielają mało protein, co pozwala - jeśli uzyska się kierowanie wydzielania danej proteiny obcej na wysokim poziomie - na otrzymanie w środowisku hodowlanym produktu mogącego zawierać wysoki procent protein wydzielanych łącznie, a więc ułatwiać zabieg oczyszczania proteiny żądanej.

Istnieje szereg protein lub polipeptydów wydzielanych przez drożdże. We wszystkich znanych przypadkach proteiny te są syntetyzowane w formie dłuższego prekursora, którego sekwencja NH2-terminalna jest decydująca dla wejścia na drogę metaboliczną prowadzącą do wydzielania.

Synteza w drożdżach protein mieszańcowych zawierających sekwencję NH2 terminalną jednego z jej prekursorów z następną sekwencją proteiny obcej może, w pewnych przypadkach, dopro wadzić do wydzielania tej proteiny obcej. Fakt, że ta ostatnia jest syntetyzowana w formie prekursora, zazwyczaj nieaktywnego, pozwala na zabezpieczenie komórki przed ewentualnym działaniem toksycznym badanej cząsteczki, przy czym cięcie, które uwalnia proteinę aktywną zachodzi tylko w wyjściowych pęcherzykach aparatu Golgi, które izolują proteinę z cytoplazmy.

Stosowanie dróg metabolicznych prowadzących do wydzielania umożliwiającego produkowanie przez drożdże proteiny obcej przynosi szereg korzyści:

1°/ pozwala na odzyskanie w nadsączu hodowli produktu faktycznie czystego;

2⁰/ pozwala na zabezpieczenie komórki przed możliwym wpływem toksycznym proteiny dojrzałej;

3°/ Z drugiej strony, wydzielone proteiny mogą, w pewnych przypadkach, ulegać modyfikacjom (glikozylacja, sulfatacja, itp.).

Dlatego też bloki funkcyjne stosowane w sposobie według wynalazku posiadają, ściślej biorąc, następującą strukturę:

-Str - Lex - Sci - gen H 155 074 gdzie Lex koduje sekwencję lidera potrzebną do wydzielania proteiny odpowiadającej genowi H, Sci jest sekwencją DNA kodującą punkt cięcia, przy czym ponadto element Sci-gen H może być powtarzany szereg razy.

Jako przykład systemu wydzielania wybrano system feromonu alfa, tzn. że w sekwencji powyżej sekwencja Lex pochodzi z genu feromonu seksualnego alfa drożdży, lecz mogą być tu stosowane także inne systemy (na przykład system proteiny Killer).

Feromon seksualny a drożdży jest peptydem 13 aminokwasów (przedstawionych na rys. 2), wydzielanym w środowisku hodowlanym przez drożdże S. cerevisiae seksualnego Mat.a. Czynnik a zatrzymuje komórki przeciwnego typu płciowego (Mata) w fazie G1 i wywołuje zmiany biochemiczne i morfologiczne niezbędne dla kopulacji obu typów komórek. Kurjan i Herskowitz klonowali gen strukturalny czynnika a i wywnioskowali z sekwencji tego genu, że czynnik a 13 aminokwasów został zsyntetyzowany w formie pre-pro-proteiny prekursora 165 aminokwasów (rys. 2). Prekursor zawiera sekwencję hydrofobową amino-terminalną z 22 reszt (podkreśloną linią kropkowaną), po której następuje sekwencja 61 aminokwasów zawierająca 3 punkty glikozylacji, a po niej 4 kopie czynnika a. Cztery kopie są rozdzielone sekwencjami „spacer a dojrzała proteina uwalniana jest z prekursora dzięki następującym aktywnościom enzymatycznym:

1°/ endopeptydaza typu cathepsin B, która przecina w COOH dipeptydy Lys-Arg (punkt cięcia wskazany tłustą strzałką);

2°/ exopeptydaza typu karboksypeptydazy B, która odcina reszty zasadowe w COOH peptydów odciętych;

3°/ dipeptydylo-aminopaptydaza (zawana A), która usuwa reszty Glu-Ala i Asp-Ala.

Sekwencja nukleotydowa prekursora zawiera ponadto 4 punkty restrykcji Hind III, wskazane strzałką H.

Dokonano szeregu fuzji pomiędzy genem feromonu a i sekwencją dojrzałą hirudyny. Komórki drożdży typu Matff mogą wyrażać takie złączone geny. Odpowiednie hydrydy protein mogą być więc wytworzone dzięki sygnałom, które zawierają, i które pochodzą z sekwencji pre-pro prekursora feromonu a. W związku z tym doprowadza się do odzyskania w nadsączu hodowli polipeptydów mających sekwencję hirudyny.

W jednej z konstrukcji, sekwencja Sci zawiera na końcu 3' kodon ATG poprzedzający gen H; proteina złączona zawiera więc metioninę bezpośrednio powyżej pierwszego aminokwasu dojrzałej sekwencji hirudyny. Ten polipeptyd, po odcięciu przez bromocyjan, generuje cząsteczkę hirudyny, którą można uaktywnić po etapie renaturacji.

W innych budowach, sygnały cięcia normalnie stosowane do produkowania feromonu a służą do produkowania w nadsączu hodowli polipeptydów posiadających aktywność anty--trombinową. Przypadek ten ma miejsce wówczas, gdy sekwencja Sci zawiera na końcu 3' dwa kodony kodujące dla Lys-Arg, tzn. AAA lub A AG z AGA lub AGG; polipeptyd jest przecięty przez endopeptydazę, która odcina w COOH dipeptydy Lys-Arg, uwalniając w ten sposób hirudynę.

Wynalazek dotyczy zwłaszcza konstrukcji, w których sekwencja genu hirudyny koduje dla jednej z sekwencji następujących aminokwasów:

1/ Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gin Val Asp Gly Ser Met Hirudyna...,

2/ Lys Arg Glu Ala Glu Ala Hirudyna...,

3/ Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg Hirudyna...,

4/ Lys Arg Glu Ala Glu Ser Leu Asp Tyr Lys Arg Hirudyna...lub

5/ Lys Arg Hirudyna...

Oczywiście możliwe jest wzięcie pod uwagę innych sekwencji, które - na poziomie aminokwasów - są odcinane selektywnie przez enzym, pod warunkiem, że taki punkt cięcia nie będzie również obecny w samej hirudynie. I wreszcie, bloki funkcyjne stosowane w sposobie według wynalazku mogą zawierać, za genem H, sekwencję terminalną drożdży, na przykład sekwencję genu PGK.

Ogólnie biorąc, bloki funkcyjne stosowane w sposobie według wynalazku mogą być zintegrowane w drożdżach, zwłaszcza Saccharomyces, bądź w plazmidzie o replikacji autonomicznej bądź w chromozomie drożdży.

Jeśli plazmid jest autonomiczny, zawiera on elementy zapewniające jego replikację, tzn. oryginał replikacji taki jak oryginał plazmidu 2μ. Ponadto, plazmid może zawierać elementy sekwencji takie jak gen URA3 lub LEU2 zapewniające komplementację drożdży ura3” lub leu^2-.

155 074

Plazmidy te mogą również zawierać elementy zapewniające ich replikację w bakteriach, jeśli plazmid będzie plazmidem „navette“, na przykład oryginał replikacji taki jak pBR322, gen znakujący taki jak Ampr i/lub inne elementy znane specjalistom z tej dziedziny.

W sposobie według wynalazku stosuje się szczepy drożdży transformowane blokiem funkcyjnym, niesionym bądź przez plazmid bądź zintegrowanym w chromozomach. Spośród drożdży, stosuje się zwłaszcza drożdże rodzaju Saccharomyces, a szczególnie S. cerevisiae.

Jeśli promotor pochodzi z genu feromonu a, drożdże będą korzystnie typu seksualnego Mata. Stosuje się, na przykład, szczep genotypu ura3_ lub leu2_ lub inny, komplementowany plazmidem dla zapewnienia utrzymania plazmidu w drożdżach przez odpowiednie ciśnienie selekcji.

Wprawdzie możliwe jest wytwarzanie hirudyny przez fermentycję transformowanych szczepów w odpowiednim środowisku hodowlanym, przez akumulację hirudyny w komórkach, to jednak korzystniej jest, jak to wynika z powyższego opisu, prowadzić wydzielanie hirudyny w środowisku, bądź w formie dojrzałej, bądź w formie prekursora, który powinien być wytworzony in vitro.

Dojrzewanie można prowadzić w kilku etapach. Najpierw może okazać się konieczne odcięcie pewnych elementów pochodzących z tłumaczenia sekwencji Lex, przy czym odcięcie to prowadzi się na poziomie sekwencji odpowiadającej Sci. Jak to już zaznaczono wcześniej, dojrzała hirudyna może być poprzedzona metioniną, która będzie selektywnie odcięta bromocyjanem. Proces ten stosuje się dlatego, że sekwencja kodująca hirudyny nie zawiera metioniny.

Można również przewidzić na końcu N dipeptyd Lys-Arg, który jest odcięty w COOH przez endopeptydazę specyficzną; ponieważ enzym ten jest aktywny w procesie wydzielania, można otrzymać bezpośrednio dojrzałą proteinę w środowisku. Jednak w niektórych przypadkach może okazać się niezbędne przewidzenie cięcia enzymatycznego po wydzieleniu, przez dodanie specyficznego enzymu.

W niektórych przypadkach, zwłaszcza po traktowaniu bromocyjanem, może okazać się konieczna renaturacja proteiny przez tworzenie mostków disiarczkowych. Aby to przeprowadzić denaturuje się peptyd, na przykład za pomocą chlorowodorku guanidyny, po czym renaturuje się w obecności zredukowanego i utlenionego glutationu.

Inne charakterystyki i korzyści wynalazku zostaną ukazane w przykładach poniżej:

Na załączonych rysunkach: rys.l przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu cDNA hirudyny klonowanej w pTG 717; rys.2 przedstawia sekwencję nukleotydową prekursora feromonu seksualnego a; rys.3 przedstawia schematycznie budowę pTG 834; rys.4 przedstawia schematycznie budowę pTG 880; rys.5 przedstawia schematycznie budowę pTG 882; rys.6 przedstawia schematycznie budowę M13TG 882; rys.7 przedstawia schematycznie budowę pTG 874; rys.8 przedstawia schematycznie budowę pTG 876; rys.9 przedstawia schematycznie budowę pTG 881; rys. 10 przedstawia schematycznie budowę pTG 886; rys. 11 przedstawia schematycznie budowę pTG 897; rys. 12 przedstawia elektroforezę na żelu z akryloamidu protein o c. cz. >1000 otrzymanych w środowisku po hodowli drożdży transformowanych przez pTG 886 i pTG 897; rys. 13 przedstawia elektroforezę na żelu z akryloamidu protein o c. cz.>1000 otrzymanych w środowisku po hodowli drożdży transformowanych przez pTG 886 i pTG 897; rys. 14 przedstawia schematycznie budowę pTG 1805; rys. 15 przedstawia elektroforezę na żelu z akryloamidu protein o c. cz.>1000 otrzymanych w środowisku po hodowli drożdży transformowanych przez pTG 847 i pTG 1805; rys. 16 jest schematem porównującym sekwencje aminokwasów poniżej pierwszego punktu cięcia (Lys-Arg) w różnych budowach.

Sekwencje aminokwasów i nukleotydów nie są umieszczone w niniejszym opisie by go nie obciążać, lecz stanowią wyraźnie jego część.

Przykład I - Konstrukcja pTG 822.

Fragment cDNA hirudyny HV-2 wyekstrahowano z żelu po trawieniu plazmidu pTG717 za pomocą Pstl, po czym trawiono równocześnie enzymami Hinfl i Ahalll. Enzym Hinf I odcina odcinek poniżej pierwszego kodonu sekwencji dojrzałej hirudyny HV-2. Enzym Aha III odcina około 30 par zasad poniżej (3') kodonu stop sekwencji hirudyny. Tak otrzymany fragment HinflAha III wyizolowano na żelu aga ozowym, po czym eluowano z tego żelu. Sekwencję kodującą dojrzałą proteinę wprowadzono do wektora p'TG880. Wektor pTG880 pochodzi od wektora pTG 838 (fig. 3). Plazmid pTG 838 jest identyczny z plazmidem pTG 833 z wyjątkiem miejsca usytuowa155 074 7 nia Bgl II blisko terminatora transkrypcji PGK. Miejsce to usunięto przeprowadzając wypełnianie polimerazą Klenowa w celu otrzymania pTG 838.

Plazmid pTG 833 jest plazmidem drożdży rzepiku (navette)-E. coli. Plazmid ten został wydedukowany dla wyrażenia obcych genów w drożdżach. Elementy zasady tego wektora (fig. 3) są następujące: gen URA3 jako marker selekcji w drożdżach, źródło replikacji plazmidu 2 μ drożdży, gen odporności na ampicylinę i źródło replikacji plazmidu pBR322 z E. coli (te dwa ostatnie elementy pozwalają na propagację i selekcję tego plazmidu w pałeczkach okrężnicy), region w otoczeniu 5' genu PGK drożdży z sekwencją kodującą tego genu aż do miejsca Sal I, fragment Sal I - Pvu II plazmidu p BR 322 i terminator genu PGK. Plazmid ten jest znany.

Plazmid pTG 880 zbudowano z plazmidu pTG 838 (fig. 4) przez włączenie krótkiego regionu poliłącznika (pochodzącego z bakteriofagu M13) do plazmidu p TH 838 pociętego Eco RI i Bgl II, co pozwala umiejscowić szerg miejsc klonowania w porządku: Bgl II, Pst I, Hind III, Bam HI, Sma I i Eco RI tuż za regionem 5' flankującym gen PGK drożdży. DNA plazmidu pTG 880 trawiono za pomocą Bgl II i Sam I i duży fragment wydzielony z tego trawienia wyodrębniono i wyeluowano z żelu. Fragment Hinf I/Aha III z pTG 717, który zawiera większą część sekwencji kodującej hirudynę HV-2 zmieszano z pTG 880 trawionym w tym samym czasie co 3 oligonukleotydy syntetyczne (fig. 5) przeznaczonym do rekonstrukcji regionu terminalnej grupy NH2 sekwencji hirudyny, i który łączy miejsce Bgl I wektora z miejscem Hinf I fragmentu zawierającego hirudynę. Mieszanina ta poddana traktowaniu łączącemu, następnie służyła przekształceniu komórek E. coli. Odbierano plazmid pTG 882 w transformantach . Plazmid ten służył do trnasformacji komórek drożdży w celu wytwarzania hirudyny pod kontrolą promotora PGK. Jednakże, nie odkryto żadnej aktywności hirudyny w surowych ekstraktach komórek przekształconych z tym wektorem. Przyczyna braku wytwarzania hirudyny aktywnej nie jest jeszcze wyjśniona. Dotychczas, konstrukcja pTG 882 służyła jako źródło sekwencji kodującej hirudynę dla wektorów wydzielania powyższych drożdży.

Przykład II. Konstrukcja pTG 886 i pTG 897.

Od razu fragment Bgl II - Eco RI (230 bp) plazmidu pTG 882 zawierający sekwencję hirudyny przeniesiono w bakteriofagu M 13 mp 8 (fig. 6) między miejscami Bam HI i Eco RI. Dało to fag M13TG 882, z którego może być wyodrębniony fragment EcoRI-Hind III (około 245 bp). Fragment ten zawiera całą sekwencję kodującą hirudyny HV-2, miejsce zlania Bam HI (Bgl II i lepkie końce /Hind III - Eco RI) pozwalające na klonowanie w wektorze wydzielania drożdży pTG 881 (fig· 9).

Plazmid pTG 881 (10 kb) jest plazmidem (navette) E. coli, replikującym się w sposób niezależny jednocześnie w E. coli i w szczepie Saccharomyces cerevisial, uvarum i carlbergensis.

Wprowadzenie tego plazmidu do E. coli pozwala otrzymać odporność na ampicylinę (i inne antybiotyki typu -laktamowego). Co więcej, plazmid ten niesie geny LEU2 i URA3 drożdży, które są wyrażone w szczepach E. coli i Saccharomyces. Zatem obecność tego plazmidu w E. coli lub w Saccharomyces pozwala otrzymać kompensację szczepów z brakami deshydrogenazy -izopropylomalanianowej lub dekarboksylazy OMP.

Plazmid pTG 881 zbudowany jest w sposób następujący: Plazmid wyjściowy jest plazmidem pTG 848 (identycznym z pTG 849 opisanym we francuskim opisie patentowym nr 8 315716 z wyjątkiem genu URA3, który jest odwrotnie zorientowany) i składa się z następujących fragmentów DNA (fig. 7):

1°/ Fragmentu EcoRI-Hind III o około 3,3 kb, pochodzącego od plazmidu pIDB207 (18). Miejsce Hind III odpowiada współrzędnej 105 plazmidu 2μ forma B, miejsce EcoRI współrzędnej 2243. We fragmencie tym znajduje się gen LEU2 wprowadzony przez rozszerzenie polidezoksyadenilan/polidezoksytymidylanu w miejscu Pst I z fragmentu 2μ formy B (18).

2°°/ Fragmentu Hind III genu URA3 (19).

3°°/ Dużego fragmentu EcoRI (współrzędna 0) - Sal I (współrzędna 650) pBR322. Do miejsca Pvu II tego fragmentu wprowadzono fragment EcoRI - Hind III (którego końce zostały uprzednio uczynione otwartymi za pomocą operacji Klenowa w obecności 4 nukleotydów) o 510 parach zasad i odpowiadający na końcu genowi PGK. Koniec EcoRI jest zrównany z genem PGK, gdy przyłączony jest do końca Pvu II plazmidu pBK 322 zregenerowanego w miejscu EcoRI.

155 074

4°/ Fragmentu Hind III - Sal I (2,15 kb) genu PGK. Plazmid pTG 848 został pocięty przez Hind III, końce dwóch fragmentów tak uwolnionych czyni się otwartymi przez traktowanie według Klenowa w obecności 4 dezoksyrybonukleotydów. Dwa fragmenty poddaje się wiązaniu i, przed transformacją, mieszaninę przeznczoną do wiązania poddaje się działaniu Hind III, co pozwala wyeliminować całą formę plazmidu mającego zachowane jedno (lub dwa) miejsca Hind III. Transformuje się szczep E. coli BJ 5183 (pyrF) i sekcjonuje się transformowane według odporności na ampicylinę i według charakteru pyr +. W ten sposób otrzymano plazmid pTG 874 (fig. 7), w którym dwa miejsca Hind III są skasowane, orientacja genu URA3 daje miejsce transkrypcji o tej samej orientacji co gen fosfogliceranu kinazy (PGK).

Plazmid pTG 874 pocięto za pomocą Smal i Sali, fragment o 8,6 kb następnie wyodrębniono z żelu agarozy. Plazmid pTG 864, który zawiera fragment Eco - Sal I (około 1,4 kb) genu MFcrl klonowany w tym samym miejscu plazmidu pBR322, pocięto za pomocą Eco RI. Końce plazmidu w ten sposób linearyzowanego uczyniono otwartymi na traktowanie według Klenowa w obecności 4 nukleotydów. Następnie przeprowadzono trawienie enzymem Sal I i wyodrębniono następnie fragment Eco RI (koniec wolny) -Sal I odpowiadający genowi MFffl. Ten ostatni fragment poddano wiązaniu kawałkiem Smal - Sal I (8,6 kb) plazmidu pTG 874 w celu otrzymania w ten sposób plazmidu pTG 876 (fig. 8).

W końcu promotora MF<al, po trawieniu częściowym Bgl II plazmidu pTG 876 przeprowadzono operację Klenowa w obecności 4 dyzoksyrybonukleotydów. Otrzymany nowy plazmid pTG 881 (fig.9) pozwolił na wprowadzenie obcej sekwencji kodującej między pierwszym miejscem Hind III genu MFffl i miejscem Bgl II końca genu PGK.

Gdy zlanie w miejscu Hind III DNA obcego kodanta pozwala otrzymać przekład w tej samej fazie zapisu, otrzymana proteina hybrydowa zawiera części pre-pro feromonu a.

Klonowanie w pTG 881 fragmentu Hind III - Eco RI, który niesie gen hirudyny prowadzi do plazmidu pTG 886 (fig. 10). Raz przeprowadzone klonowanie znajduje się w miejscu Bgl III poniżej tego fragmentu, który umożliwia ponowne wyjście fragmentu w postaci Hinfl - Bgl II, miejsca Hinf I, które są takie same jak stosowane powyżej. Bgl II, który jest jedyny w pTG 881 jest bardzo łatwo rekonstruować na końcu 5' sekwencji kodującej dla hirudyny wykorzystując 3 oligonukleotydy odnawiające sekwencję 5' hirudyny i pozwala na zapis w fazie sekwencji pre-proferomonu a a następnie sekwencji dojrzałej hirudyny. Ten nowy plazmid nazywa się pTG 897 (fig. 11).

Przykład III. Ekspresja hirudyny przez drożdżowy DNA z pTG 897 służyła do transformacji drożdży TGY 1 sp 4/Mata, ura 3 - 251 - 372 - 328, his 3 - 11 - 1^/ w ura⁺ techniką opisaną powyżej.

Kolonia przekształcona została przesadzoną i służyła do posiewu 10 ml środowiska minimum plus casaminokwasy (0,5%). Po 20 godzinnej hodowli komórki odwirowano, warstwę wierzchnią dializowano wobec wody destylowanej i zatężono przez odparowanie (odwirowanie pod próżnią).

Równolegle w ten sam sposób zadano hodowlą TGY lsp4 transformowanego przez pTG 886 i hodowlę TGY 1 sp4 transformowanego przez plazmid nie niosący sekwencji dla hirudyny (TGY 1 sp 4 pTG 856). Suchą pozostałość rozprowadzono w 50 μΐ wody i 20 μΐ gotowano w obecności 2,8% SDS i 100 mmoli merkaptoetanolu, po czym osadzono na żelu akryloamid - SDS (15% akryloamidu, 0,1% SDS) (22). Po utrwaleniu i zabarwieniu błękitem Coomassiego można wykrywać polipeptydy, które zbierają się w warstwie wierzchniej hodowli TGY 1sp 4 (pTG886 i TGY 1 sp 4) pTG 897, a które są nieobecne w warstwie wierzchniej hodowli porównawczej (fig. 12). Ponadto, szereg peptydów uzupełniających silnie zaznacza się 35s cysteiny, jak można oczekiwać dla peptydów hirudyny cząsteczka ta jest bardzo bogata w cysteinę (fig. 10).

Elektroforezę przedstawioną na fig. 12 i 13 prowadzono następująco: Dla fig. 12 ekstrakty przygotowano następująco: 10 ml środowiska minimum (Drożdżowa Zasada Aminowa Difco bez aminokwasu (6,7 g/1) glukoza (10 g/1) uzupełnione casaminokwasami 0,5% zasiano różnymi szczepami i hodowano przez 20 godzin (faza stacjonarna). Komórki odwirowano, warstę wierzchnią dializowano wobec wody (minimalna retencja: c. cz. 1000) po czym wysuszono przez odwirowanie pod próżnią. Próbki rozprowadzono następnie w 50μ1 wsadowego roztworu buforowego, z których 20μ1 traktowano tak jak opisano powyżej i nałożono na żel akryloamid - SDS (15% akryloamidu, 0.1% SDS) (22).

155 074

Stosowano następujące szczepy: zbiornik 2 - TGY1 sp 4 przekształcony przez plazmid nie zawierający sekwencji hirudyny (próba kontrolna); zbiornik 3 - TGY1 sp 4 przekształcony przez pTG 886; zbiornik 4 - TGY1 sp 4 przekształcony przez pTG 897; zbiornik 1- w zbiorniku 1 złożono markery porównawcze (LMW Kit de Pharmacia, od najwyższego do najniższego 94 000, 67 000, 43000, 30 000, 20 100, 14 000).

Pasma wywołane przez zabarwienie błękitem Coomassigo R-250.

Dla figury 13 ekstrakty sporządzono następująco: 100 ml środowiska minimum + histydyna 40pg/ml. zasiano różnymi szczepami w celu całonocnych hodowli. Gdy gęstość komórek osiągnęła około 5X10⁶ (faza funkcji wykładniczej narastania) do każdej hodowli dodano 35s - cysteinę (9,8mCi/ml, 1015 Ci/(mmol).

Po 10 minutach, komórki odwirowano, rozprowadzono w 10 ml pełnego środowiska (30°C) i inkubowano w temperaturze 30°C mieszając. Po 3 godzinach 10 ml warstwy wierzchniej dializowano wobec wody i zatężono do objętości 0,5 ml tak jak opisano dla fig. 12 około 35 000 cpm (40μ1) nałożono na żel akryloamid - SDS (15% akryloamidu, 0,1 % SDS). Pasma protein uwidoczniono po fluorografii.

Stosowano następujące szczepy: zbiornik 2 - TGY1 sp 4 przekształcony przez plazmid nie zawierający sekwencji hirudyny, zbiornik 3 - TGY1 sp 4 przekształcony przez pTG 886, zbiornik 4 -TGY 1 sp 4 przekształcony przez pTG 897, zbiornik 1 - w zbiorniku 1 osadzono markery, których c i cz. są identyczne (χ 10³).

Tymczasem, gdy warstwa wierzchnia zawierała polipeptydy, badano je na działanie antytrombinowe, nie wykryto żadnego działania.

W przypadku polipeptydu wydzielonego przez TGY 1sp 4 pTG 886, oczekuje się, że ulegnie on normalnym etapom odszczepiania prekursora feromonu a, które dadzą częsteczkę hirudyny wydłużoną o 8 aminokwasów na końcowym NH. Nic więc dziwnego, że polipeptyd wydzielony przez komórki TGY 1 sp 4 pTG 886 nie był aktywny.

W przeciwnieństwie do tego, w przypadku polipeptydu wydzielonego przez TGY1 sp 4 /pTG 897 oczekuje się polipeptydu identycznego z proteiną naturalną, a zatem aktywną. Wiele hipotez może być wziętych pod uwagę odnośnie do braku aktywności:

1°/ Dojrzewanie proteiny nie jest całkowite, może pozostać pozostałość Glu-Alo przy NH2, jak opisano przy EGF (16),

2°// Proteina nie jest aktywna, ponieważ nie ma dobrej konformacji lub w warstwie wierzchniej są hodowle protein lub cząsteczek o c. cz. 1000, które hamują aktywność.

3°// cząsteczka nie jest kompletna ponieważ poddana jest proteolizie wewnątrzkomórkowej i/lub zewnątrzkomórkowej.

Przykład IV. Aktywacja przez cięcie bromkiem cyjanu.

Jeśli przyczyna braku aktywności związana jest z obecnością dodatkowych aminokwasów przy końcu NH2 możliwe będzie odnalezienie aktywności przez poddanie peptydu wydzielonego przez TGY 1 sp 4/ pTG 886 rozszczepianiu bromkiem cyjanu. W rezultacie reagent ten jest specyficzny dla pozostałości metioniny i proteina zlana zakodowana przez pTG 886 zawiera tylko metioninę. Reakcję tę przeprowadza się w sposób następujący: drożdże zawierające bądź plazmid pTG 886, bądź plazmid kontrolny, nie zawierające insertu hirudynowego, hodowano w 10 ml środowiska przez 24 godziny. W tym czasie hodowla osiągnęła gęstość 7 -10 · 10⁷ komórek na ml. Warstwę wierzchnią oddzielono od komórek, intensywnie dializowano wobec wody destylowanej, po czym liofilizowano. Suchy proszek rozpuszczono 1 ml 70% kwasu mrówkowego i krotność użyto do oznaczenia całej zawartości protein (metodą barwienia błękitem Coomassiego z reagentem sprzedawanym przez Biorad), resztę preparatu traktowano 1 ml świeżego roztworu bromku cyjanu o stężeniu 30mg/ml w 70% kwasie mrówkowym. Po usunięciu tlenu przez przemycie azotem probówki inkubowano w ciemności przez 4 godziny w temperaturze otoczenia. Wszystkie operacje w obecności bromku cyjanu przeprowadzono z odpowiednią ostrożnością i przy intensywnym wietrzeniu. Reakcję odszczepiania za pomocą bromku cyjanu zatrzymano przez dodanie 10 objętości wody destylowanej, po czym roztwór liofilizowano.

Odszczepione peptydy, ponownie rozpuszczono w 10 ml wody destylowanej i ponownie liofilizowano dwukrotnie. Na zakończenie peptydy rozpuszczono w małej objętości wody

155 074 destylowanej i krotność wykorzystano do pomiaru aktywności antytrombinowej. Resztę próbki liofilizowano i poddano etapom renaturacji opisanym powyżej.

Ponieważ aktywność hirudyny zależy od obecności mostków dwusiarczkowych w cząsteczce wydaje się prawdopodobne, że peptyd rozszczepiony bromkiem cyjanu może być prawidłowo ronaturowany w celu wy kazania działania biologicznego. Przeto odszczepione peptydy poddaje się denaturacji w 5 m GuHCl a następnie renaturacji znanym sposobem.

Krótko mówiąc, liofilizowane peptydy rozpuszcza się w 400μ1 5 m chlorowodorku guamidyny (GuHCl) w Tris HC1 250mmoli, pH 90, następnie uzyskuje się roztwór 2mmoli o obniżonym glutationie i 0,2mmoli utlenianego glutationu w końcowej objętości 2,0 ml (stężenie końcowe wynosi 1,0 molowego Gu HC1 i 40 mmoli Tris).

Po 16 godzinach inkubowania w ciemności próbki dializowano przez 24 godziny wobec 3 krotnie 21 Tris HC1 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, w temperaturze 23°C i końcowy dializat klarowano przez odwirowanie.

Następnie zmierzono aktywność antytrombinową warstwy wierzchniej. Wyniki z tej próby podane w tabeli 1 wykazują jasno odzyskanie aktywności antytrombinowej w warstwie wierzchniej komórek zainfekowanych plazmidem pTG 886, podczas gdy plazmid kontrolny nie wykazał aktywności.

Tabela 1

Działanie antytrombinowe warstwy wierzchniej w hodowli drożdży

Plazmid	Traktowanie warstwy wierzchniej	Aktywność Jedn./ml	Aktywność właściwa protein początkowych Jedn/mg
pTG 886	a/ po odszczepieniu przed renaturacją	3	-
	b/ po odszczepieniu i renaturacji	2,46	1)2,5
próba	a/ po odszczepieniu przed renaturacją	0,3	-
	b/ po odszczepieniu i renaturacji	0,15	5,6

Reasumując, komórki drożdży niosące plazmid rekombinant mogą wydzielać peptyd mający aktywność biologiczną hirudyny, po reakcji odszczepiania i renaturacji. Wskazuje to, że obecność aminokwasów uzupełniających na końcu - NH2 wystarczyła do wyjaśnienia braku aktywności polipeptydów obecnych w hodowli TGY1 sp4/pTG 886 i być może także w przypadku hodowli TGY1 sp 4/pTG 897 (kolejność Glu-Ala).

Przykład V. Wprowadzanie nowego miejsca cięcia tuż przed pierwszym aminokwasem sekwencji kodującej hirudynę HV-2-plazmid pTG 1805.

Przy budowie pTG 897 istnieje ryzyko, że wydzielony peptyd chroni kolejność Glu - Ala przy NH2, co tłumaczyłoby brak aktywności antytrombinowej tego materiału. Jeżeli hipoteza ta odpowiada rzeczywistości, mogłoby być możliwe odzyskanie aktywności bezpośrednio w supernatancie tworząc miejsca cięcia między resztą Glu - Ala a pierwszym aminokwasem hirudyny HV-2 (izoleucyna). Przeprowadza się to dając jedną sekwencję kodującą do dubletu Lys Arg, który jest miejscem rozpoznawczym endopeptydazy przy dojrzewaniu prekursora feromonu (fig. 2). Otrzymano konstrukcję taką samą jak opisana przy plazmidzie pTG 897 z wyjątkiem tego co dotyczy sekwencji 2 oligonukleotydów z syntezy (fig. 14). Otrzymany plazmid nazwano pTG 1805. Plazmid ten służy do transformowania szczepu TGY1 sp 4 w ura + . Materiał wydzielony w supernatancie analizowano na żelu z elektroforezy jak opisano powyżej i porównano z materiałem otrzymanym z TGY1 sp 4/pTG 897 (fig. 15).

Stosowano następujące szczepy: zbiornik 1 - markery takie same jak na fig. 12; zbiornik 2 -TGY 1 sp 4 transformowane przez pTG 897; zbiornik 3 - TGY 1 sp 4 transformowane przez pTG 1805; zbiornik 4 - próba kontrolna nie wytwarzająca hirudyny.

Polipeptydy właściwe szczepu TGY 1 sp 4/ pTG 1805 migrują wolniej od polipeptydów właściwych szczepów TGY 1 sp 4/pTG 897. Wynik ten sugeruje, że nowe miejsce odszczepiania nie jest skutecznie wykorzystane przez odpowiadającą endopeptydazę. Jednakże dawka hirudyny w supernatancie w odniesieniu do aktywności biologicznej wykazuje jedynie, że mała część tego materiału jest aktywna, w przeciwieństwie do materiału otrzymanego z hodowli TGY 1 sp 4/ pTG 897, wyraźnie nieaktywnego (tabela 2).

155 074

Tabela 2

Aktywność anty-trombmowa supernatantów

z hodowli drożdży (10 ml)
Plazmid	Aktywność właściwa Jedn/mg	Aktywność całkowita Jedn (10 ml)
pTG 856	nie wykrywalna	-
pTG 897	nie wykrywalna	-
pTG 1805	21	2,0

Przykład VI. Nowa budowa implikująca nowe bardziej skuteczne miejsce cięcia pozwalające na uwalnianie dojrzałej hirudyny.

W poprzedniej konstrukcji (pTG 897) otrzymano jedynie niewielką aktywność hirudyny w supernatancie, prawdopodobnie dlatego, że drugą część odszczepienia przeznaczonego do uwolnienia dojrzałej hirudyny uznano za mało skuteczną. Zrealizowano zatem nową konstrukcję przeznaczoną do uzyskania dodatkowego miejsca odszczepienia bardziej wrażliwego na endopeptydazę po dodaniu jej przed sekwencją 3 aminokwasów Ser Leu Asp, która jest naturalnie obecna przed pierwszym dubletem Lys Arg (fig. 2 i 16).

Stosuje się taką samą technikę jak opisana powyżej z wyjątkiem tego co dotyczy nukleotydów o następującej sekwencji:

26-m4r

15-mer _Av_

-AGCTTC TTTGGATAAAAGAATTAC GTATAC AGAC TGC AC AG , AGAAACC TATTTTC TTAATGC ATATGTC TGAC GTGTC TTA y

- - ' y~ '

40-mer

Sekwencja aminokwasów w regionie odszczepiania jest przedstawiona na fig. 13. Odpowiadający plazmid nazywa się pTG 818 i różni się od pTG 1805 tylko przez wprowadzenie nukleotydów 5' -TTG-GAT AAA odpowiadając kodonom Ser-Leu-Asp.

Dawka aktywna w supernatancie z hodowli TGY lsp 4 pTGl 818 prowadzonej w warunkach standardowych już opisana wynosi 200jednostek na 10 ml hodowli, bądź około 100 krotnie więcej niż podano w poprzednim przykładzie. Należy zwrócić uwagę, że dawka ta może być wytworzona przez 10 μΐ środowiska hodowlanego niestężonego.

Przykład VII. Konstrukcja prekursora otrzymanego z syntezy, pozbawionego sekwencji Glu-Ala-Glu-Ala.

W dwóch poprzednich przykładach wskazano, że dodanie nowego miejsca Lys Arg tuż przed początkiem sekwencji dojrzałej hirudyny pozwoli na uwolnienie w supernatancie materiału aktywnego. Tymczasem w tych przykładach, jeśli cięcie prekursora wykonuje się w pierwszym miejscu Lys Arg (distal w stosunku do początku sekwencji dojrzałej) można otrzymać w środowisku hodowlanym zanieczyszczenia cięższe, nieaktywne odpowiadające łańcuchom hirudyny wydłużonym na końcowym NH2. Jest to szczególnie jasne w przypadku hodowli TGY 1 sp 4 pTG 1805, gdzie zanieczyszczenia nieaktywne stanowią większość. Pozostaje to również na pozór słuszne w przypadku hodowli TGY 1 sp 4 pTG 1818, gdzie zanieczyszczenie nieaktywne nie stanowi większości, ale może być obecne jak opisano w przypadku EGF. Aby uniknąć tej straty wadajności, którą przedstawia synteza materiału nieaktywnego, postanowiono opracować nową strukturę stanowiącą wynik syntezy prekursora, który różni się od otrzymanego z syntezy przez komórki TGY 1 sp 4 pTG 897 nieobecnością sekwncji Glu Ala Glu Ala między miejscem cięcia Lys Arg i pierwszym aminokwasem sekwencji dojrzałej hirudyny.

Następujące szczepy zdeponowano 1985-04-30 w Collection National de Cultures de Microorganismes (CNCM) Instytutu Pasteura, 28 rue du Docteur-Roux, Paris 15 eme.

- TGY 1 sp 4 pTG 1818: Saccharomyces cerevisiae, szczep TGY 1 sp 4 (Mata ura 3-251-373328-his 3-11-15) transformowany w ura + przez plazmid pTG 1818, nr depozytu I 441.

-TGY 1 sp4pTG886: Saccharomyces cerevisiae, szczep TGY 1 sp 4 (Malta ura 3-251-373-328his 3-11-15) transformowany w ura⁺ przez plazmid pTG 886, nr depozytu 1 442.

155 074

Claims

Zastrzeżenia patentf^we

1. Sposób wytwarzania hirudyny, znamienny tym, że w pożywce hodowlanej prowadzi się fermentację drożdży transformowanych blokiem funkcyjnym DNA zawierającym co najmniej gen kodujący hirudynę lub jeden z jego wariantów (gen H) i sekwencję DNA (Str) zawierającą sygnały transkrypcji genu H przez drożdże, zintegrowanym bądź w plazmidzie, bądź w chromosomach drożdży, po czym odzyskuje się hirudynę otrzymaną w środowisku hodowlanym w postaci dojrzałej, albo w postaci prekursora hirudyny, który doprowadza się do dojrzałości in vitro.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny, który przedstawia co najmniej sekwencję -StrLex-Sci-gen H-, w której Lex oznacza sekwencję prowadzącą, niezbędną do uzyskania produktu genu, Sci oznacza sekwencję DNA kodującą miejsce rozszczepienia, przy czym fragment Sci-gen H może być powtórzony wielokrotnie.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny zawierający jako sekwencję Lex feromon płciowy a drożdży.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny zawierający jako Sci sekwencję końcową 3' kodonu ATG poprzedzającą gen H.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny, w którym Sci oznacza sekwencję zawierającą końcówkę 3' dwóch kodonów kodujących Lys-Arg przed genem H.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że stosuje się blok, w którym Sci oznacza sekwencję z końcem 3' pięciu kodonów kodujących Ser-Leu-Asp-Lys-Arg.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się blok, w którym gen H następuje po sekwencji terminatora drożdży.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się blok, w którym sekwencję terminatora drożdży stanowi gen PGK.
9. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się blok funkcyjny, który zawiera co najmniej jedną sekwencję kodującą aminokwasy 1 -Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gin Val Asp Gly Ser Met Hirudyna 2-Lys Arg Glu Ala Glu Ala Hirudyna...3-Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg Hirudyna; 4-Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Leu Asp Lys Arg Hirudyna...lub 5-Lys Arg Hirudyna...
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako plazmid stosuje się plazmid 2μ.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się plazmid, który niesie ponadto cechę selekcyjną.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się plazmid, którego cecha selekcyjna dana jest przez gen URA3.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się drożdże rodzaju Saccharomyces.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się drożdże typu płciowego Mata.
15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, ż.e stosuje się drożdże ze szczepu S. cerevisiae.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dojrzałą hirudynę otrzymuje się z prekursora przez odszczepienie chemiczne lub enzymatyczne na poziomie sekwencji odpowiadającej Sci.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że dojrzałą hirudynę otrzymuje się przez odszczepienie chemiczne na poziomie metioniny.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że dojrzałą hirudynę otrzymuje się przez odszczepienie enzymatyczne po sekwencji prekursora Lys-Arg lub Ser-Leu-Asp-Lys-Arg.
19. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 18, znamienny tym, że hirudynę otrzymaną po odszczepieniu od prekursora poddaje się renaturacji.