FI104635B - Hirudiinia tuottava transformoitu hiiva ja menetelmä hirudiinin valmistamiseksi sillä - Google Patents
Hirudiinia tuottava transformoitu hiiva ja menetelmä hirudiinin valmistamiseksi sillä Download PDFInfo
- Publication number
- FI104635B FI104635B FI865303A FI865303A FI104635B FI 104635 B FI104635 B FI 104635B FI 865303 A FI865303 A FI 865303A FI 865303 A FI865303 A FI 865303A FI 104635 B FI104635 B FI 104635B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- yeast
- hirudin
- sequence
- gene
- plasmid
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 83
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 title claims description 115
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 title claims description 109
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 title claims description 105
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 title claims description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 81
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 34
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 23
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 21
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 18
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 claims description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 12
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 claims description 11
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 claims description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 8
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 6
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000877 Sex Attractant Substances 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 108010010968 hirudin HV2 Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 13
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 13
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 8
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 7
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 6
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 5
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- JGAMUXDWYSXYLM-SRVKXCTJSA-N Lys-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JGAMUXDWYSXYLM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 4
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 2
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- PUBLUECXJRHTBK-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PUBLUECXJRHTBK-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282821 Hippopotamus Species 0.000 description 1
- 101710154919 Hirudin variant-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N Leu-Asp-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QLQHWWCSCLZUMA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000724220 Phage M13mp8 Species 0.000 description 1
- 101001045444 Proteus vulgaris Endoribonuclease HigB Proteins 0.000 description 1
- 101001100822 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Pyocin-S2 Proteins 0.000 description 1
- 101001100831 Pseudomonas aeruginosa Pyocin-S1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N Val-Asp-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002668 anti-heparin effect Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 238000001152 differential interference contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000003234 fluorescent labeling method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000014617 hemorrhoid Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 101150116440 pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 108010021889 valylvaline Proteins 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Instructional Devices (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
, 104635
Hirudiinia tuottava transformoitu hiiva ja menetelmä hirudiinin valmistamiseksi sillä.
Esillä oleva keksintö koskee hiivaa, joka on transformoitu toimivalla 5 DNA-fragmentilla integroituna plasmidiin, joka sisältää replikaation aloituskohdan hiivassa, tai integroituna mainitun hiivan kromosomiin. Lisäksi kuvataan hirudiinia koodatavien DNA-sekvenssien ilmentämisvektoreita, näiden vektoreiden avulla tuotetun hirudiinin erittymistä transformoidun hiivan viljely-ympäristöön sekä menetelmää aktiivisen hirudiinin valmistamiseksi 10 fermentoinnin avulla, kuten myös saatua hirudiinia.
Lääkeiilimatojen, Hirudo medicinalis, sylkirauhasissa esiintyvä antikoagulanttiaktiivisuus johtuu pienestä polypeptidistä, jota kutsutaan hirudiiniksi (1). Tätä erittäin spesifistä ja tehokasta trombiini-inhibiittoria on viime aikoina tutkittu paljon, koska se edustaa mahdollisesti erittäin mielenkiintoista 15 terapeuttista ainetta. Kuitenkin sen eristäminen ja puhdistaminen on ollut äärimmäisen vaikeaa ja kallista, mikä on estänyt sen laajempaa käyttöä, ja jopa sen tutkimista kliinisellä tasolla.
Mahdollisuus tuottaa hirudiinia geenikloonauksen avulla, ja sen ilmentäminen yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla, on jo esitetty kloonaamalla 20 iilimadon luonnollista hirudiinia koodittava geeni ja ilmentämällä se mikro-organismissa E. coli (ranskalainen maaliskuun 27. 1984 hakijan nimessä jätetty patenttihakemus nro 84 04755). Vaikka on kin voitu tuottaa biologisesti aktiivista peptidiä E. coli.ssa, on erittäin tärkeää tuottaa hirudiinia muissa mikro-organismeissa. Itse asiassa hirudiinin kliininen käyttö vaatii tuotteen : : 25 erittäin korkeaa puhtautta, ja pyrogeenisten kontaminaatioiden poistaminen voi tuottaa ongelmia puhdistettaessa hirudiinia kolibakteeriekstraktista lähtien.
Lisäksi E. coli.n syntesoima hirudiini jää solunsisäiseksi, jolloin se täytyy puhdistaa erittäin suuresta E. coli.n peptidimäärästä. Näistä syistä olisi mielenkiintoista ilmentää hirudiinigeeni hiivassa, joka ei tuota ihmiselle 30 pyrogeenisiä tai toksisia aineita, ja joka pystyy erittämään proteiineja viljely-ympäristöön.
Hirudiinin vaikutusmekanismia antikoagulanttina on vasta osittain ymmärretty. Hirudiinin kiinnittymissubstraatti on trombiini, joka on proteolyyttinen entsyymi, joka aktivoiduttuaan (aktivoidun tekijän X toimesta) tsymogeeni-35 muodostaan, protrombiinista, poistaa fibriogeenin verenkierrosta muuttamalla sen fibriiniksi, jota tarvitaan verihyytymän muodostamiseksi. Trombiini-hirudiini- 2 104635 (1:1 )-kompleksin dissosiaatiovakio (0,8 x 10'10) osoittaa äärimmäisen vahvaa molekyylien välistä assosiaatiota (2). Käytännössä voidaan pitää näiden kahden molekyylien välistä ei-kovalenttista kompleksia dissosioimattomana in vivo.
Hirudiini on erittäin spesifinen trombiini-inhibiittori, jolla on paljon 5 korkeampi affiteetti kuin luonnollisella substraatilla, fibrinogeenilla. Lisäksi ei tarvita muita hyytymistekijöitä eikä muita plasman aineosia. Hirudiinin spesifinen ja erittäin tärkeä anti-trombiiniaktiivisuus antaa perustan sen kliiniselle käytölle antikoagulanttina.
Hirudiinin hyytymistä estäviä ominaisuuksia on tutkittu erittäin 10 tärkeällä tavalla eläimissä. Seikkaperäisin tutkimus (3) kuvaa hirudiinin aktiivisuutta laskimotromboosien, verisuonitukkeutumien ja suonensisäisten kasvavien hyytymien (DIC) ennaltaehkäisyssä rotassa. Rotat, koirat, kaniinit ja hiiret sietävät hirudiinia hyvin, kun se annetaan erittäin puhtaassa muodossa ja laskimonsisäisenä ruiskeena. Hiirillä LD50 on yli 500 000 U/kg ruumiinpainoa 15 (so. 60 mg/kg). Toinen tutkimus (4) osoittaa, että hiiret sietävät jopa 1 g/kg, ja että kaniinit sietävät sekä laskimonsisäisesti että ihonalaisesti jopa 10 mg/kg. Toistuvat ruiskeet kahden viikon aikana eivät johda altistumisreaktioihin hiirillä.
Lisäksi hirudiini poistuu nopeasti koe-eläimillä (puoliintumisaika suuruusluokkaa 1 tunti) yhä biologisesti aktiivisessa muodossa munuaisten 20 toimesta (3).
Kaksi muuta itsenäistä tutkimusta, joissa toisessa käytetään koiria (5) ja toisessa (6) osoitetaan hirudiinin aktiivisuutta DIC:n ennaltaehkäisyssä rotilla, ovat yhtäläisiä julkaisun Markwardt et ai. positiivisten tulosten kanssa. Nämä tutkijatovat hiljattain julkaisseet ensimmäisen in vivo -analyysin luonnollisen • r • : 25 hirudiinin vaikutuksista ihmisen hemostaattiseen systeemiin (7). Materiaali osoitti odotettuja biologisia vaikutuksia osoittamatta sekundaarisia toksisia vaikutuksia.
On myös voitu osoittaa, että hirudiini ennaltaehkäisee endotoksiinien aiheuttamaa DIC:iä sioilla (8) ja tarjoaa täten mahdollisen ratkaisun endotoksiineistä aiheutuvan epidemian erittäin vakavaan ongelmaan, joka 30 johtaa kohonneeseen kuolleisuuteen sioilla.
Vain yksi erittäin uusi julkaisu (9) kuvaa hirudiinin laskimonsisäistä ja ihonalaista antamista ihmiselle. On käytetty kuusi vapaaehtoista, kun on evaluoitu hirudiinin yksittäisannoksen 1 000 AT-U/kg) farmakokinetiikkaa ja vaikutusta hemostaattiseen systeemiin. Laskimonsisäisesti annettu hirudiini 35 osoittaa 50 minuutin puoliintumisajan ja 50 % hirudiinista löytyy aktiivisessa muodossa virtsasta 24 tunnin sisällä ruiskeen antamisesta. Todettiin 3 104635 hyytymisajan pidentymistä (mitattuna in vitro trombiinille, tromboplastiinille ja protrombiinille) suhteessa plasman hirudiinikonsentraatioon, mikä osoittaa, että molekyyli ylläpitää biologisen aktiivisuutensa kohteen verenkierrossakin Ei todettu muutoksia verihiutaleiden määrässä fibrinogeenisuhteessa eikä 5 fibrinolyyttisessä systeemissä. Sekä ihonalaiset että laskimonsisäiset hirudiiniruiskeet siedettiin hyvin, eivätkä ne aiheuttaneet sekundaarivaikutuksia. Kun tutkittiin mahdollisten allergisten reaktioiden ilmentymistä, annettiin kaksi ihoruisketta samoille kohteille neljän viikon välein; minkäänlaista herkistystä ei todettu. Lisäksi ei todettu mitään hirudiinin vasta-ainetta seerumissa.
10 Nämä tutkimukset osoittavat, että hirudiini voisi muodostaa kliinisesti mielenkiintoisen aineen anti-koagulanttina. Hirudiinin toiminnan korkeasta spesifisyydestä johtuen, sillä ei ole vaikutusta verenhyytymisen alkuvaiheeseen. Anti-trombiinivaikutus on riippuvainen annoksesta ja hirudiinin vaikutus on nopeasti palautuva johtuen sen nopeasta poistumisesta munuaisten kautta. On 15 voitu osoittaa, että hirudiini on paljon parempi kuin hepariini DIC:ien hoitoon (3, 6), kuten saattaa odottaa kun DIC-tilaa tunnistaa antitrombiinin-lll:n (hepariinin toimintaan tarvittava kofaktori) irti-kytkentä sekä kohonnut hyytymistekijä 4, jolla on erittäin tehokas anti-hepariinivaikutus.
Yksi tutkimus on osoittanut mahdollisuuden, että hirudiini voisi 20 absorboitua ihmisen ihon kautta (10), joskin saadut tulokset ovat hieman vaikeasti tulkittavissa.
On olemassa kaupallisia, soluvapaita, raakaa iilimatoekstraktia sisältäviä voiteita (Hirucreme, Societe Nicholas, Ranska; Exhirud-Blutgel, Plantorgan Werke, SLT), mutta tarvitaan vielä lisätestejä annoksen suhteen, : : 25 erityisesti korkeasti puhdistetulla aineella, jotta varmistetaan onko kyseessä mielenkiintoinen antomuoto. Yleisesti suosittuja antomuotoja ovat suonensisäisinä tai lihaksensisäisinä ruiskeina ja ihon kautta annettuna. Muitakin hirudiinin antomuotoja on raportoitu, erityisesti oraalinen (BSM no. 3 792 M).
30 Tätä tuotetta voidaan yhtäläisesti käyttää, yhdessä muiden yhdisteiden kanssa, psoriasiksen ja muiden samankaltaisten ihotautien hoidossa, kuten julkaisussa DOS 2 101 393 on esitetty.
Lisäksi hirudiinia voidaan käyttää anti-koagulanttina kliinisissä laboratoriotesteissä, sekä tutkimusvälineenä. Tässä tapauksessa korkea 35 spesifisyys verenhyytymisen erääseen määrättyyn vaiheeseen voi esittää 4 104635 huomattavaa etua verrattuna usein käytettyihin anti-koagulantteihin, joiden vaikutus on paljon vähemmän spesifinen.
Lisäksi hirudiini voi olla erittäin käyttökelpoinen anti-koagulanttina kehonulkopuolisissa verenkierroissa sekä dialyysisysteemeissä, joissa se voi 5 edustaa huomattavia etuja verrattuna muihin antikoagulantteihin, varsinkin jos se voidaan immobilisoida aktiivisessa muodossa keinotekoisen kiertosysteemin pintoihin.
Lisäksi hirudiinin kiinnittymisaktiivisuus trombliniin mahdollistaa hyytymistekijöiden, kuten tekijän Vili, epäsuoran suojan puhdistuksen aikana.
10 Lopuksi leimatun hirudiinin käyttö voisi edustaa yksinkertaista ja tehokasta menetelmää mitata trombiinin ja protrombiinin suhteita. Erityisesti leimattua hirudiinia voitaisiin käyttää visualisoimaan muodostuvia hyvtymiä, koska hyytymisilmiö johtaa kierrossa olevan protrombiinin muuttumiseen troambiiniksi hyytymiskohdassa, ja kun leimattu hirudiini kiinnittyy tormbiiniin, 15 tämä mahdollistaa visualisoinnin.
Keksintö antaa käyttöön hirudiinia koodittavan DNA-sekvenssin sisältävän hiivan, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksintö koskee myös menetelmää hirudiinin valmistamiseksi tällä hiivalla. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä 20 patenttivaatimuksessa 16 esitetään.
Yhteenvetona, keksinnön mukaisesti tuotettu hirudiini esittää lukuisia mahdollisia sovelluksia: 1) antikoagulanttina kriittisissä tromboottisissa tiloissa, profylaktisesti sekä olemassa olevien tromboosien kasvun ehkäisynä; • f ?.' 25 2) antikoagulanttina hematoomien ja mustelmien vähentämiseksi mikrokirurgian jälkeen tiloissa, joissa käytetään eläviä iilimatoja; 3) antikoagulanttina kehonulkopuolisissa kiertosysteemeissä, sekä antikoagulanttina synteettisten biomateriaalien pinnoituksessa; 4) antikoagulanttina kliinisissä verinäytteissä laboratoriokokeissa; . 30 5) antikoagulanttina veren hyytymisen kliinisessä tutkimuksessa sekä » tutkimusvälineenä; ’ 6) mahdollisena paikallisesti vaikuttavana aineena iholle peräpukamien, suonikohjujen ja ödeemien hoidossa; 7) vaikutusaineena psoriasiksen ja muiden ihotautien hoidossa; 5 104635 8) lopuksi hirudiinia voidaan käyttää trombiinin kiinnittämiseen veren säilönnässä sekä verijohdannaisten (verihiutaleiden, tekijöiden Vili ja IC) valmistuksessa.
Vaikuttavana aineena hirudiinia voidaan käyttää terapeuttisissa 5 yhdisteissä 100 - 50 000 U antitrombiinia/kg päivässä vastaavina konsentraatioina.
Hirudiinin ollessa vesiliukoinen on helppoa tuottaa injisoitavia tai muulla tavoin annettavia farmaseuttisia yhdisteteitä käyttäen farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia ja väliaineita.
10 Viimein on mahdollista käyttää leimattua hirudiinia, joko radioaktiivisesti tai millä tahansa muulla tunnetulla entsymaattisella tai fluoresoivalla leimausmenetelmällä leimattuna, in vitro annostuksen määrittämiseksi tai in vivo seurantaan, varsinkin visualisoidakseen hyytymien muodostumista.
15 Kokonaisesta eläimestä lähtöisin olevaa hirudiinivalmistetta on käytetty määritettäessä proteiinin aminohapposekvenssiä (11, 12). Seuraavissa kokeissa on kloonattu geeni, joka ilmentyy lähetti-RNAtksi iilimatojen päässä paaston aikana. Tämä geeni kantaa erään proteiinin informaation (hirudiini-variantti 2 tai HV-2), jonka sekvenssi on oleellisesti erilainen kuin 20 eläimen kehosta löydetyn (HV-1:ksi kutsuttu proteiinivariantti). HV-1 ja HV-2 eroavat toisistaan 9 aminohappojäännöksen suhteen ja NH2terminaalien väliset erot (val-val tai ile-thr) selittänevät kirjallisuudessa esiintyneet eroavaisuudet koskien hirudiinin NH2-terminaalin päätä (13).
Kuvio 1 esittää yhdistelmäplasmidin pTH717 DNAsekvenssiä, joka i 25 sisältää HV-2 mRNA:ta vastaavan cDNA:n kopion, kuten myös DNA-sekvenssistä johdetun aminohapposekvenssin kohdassa b), sekä tämän sekvenssi ja HV-T.n aminohapposekvenssin väliset erot kohdassa c).
On tarpeellista huomioida, että cDNA-sekvenssi tuskin on täydellinen, ja että ennen sitä lisäksi voi esiintyä signaalisekvenssi toimivan proteiinin alussa.
30 HV-2 cDNA:n ilmentyminen mikro-organismeissa osoittaa, että v vastaavalla proteiinilla on antitrombiiniaktiivisuutta.
Vaikka seuraavat kokeet toteutettiin variantilla HV-2 tarkoitetaan seuraavassa "hirudiinilla" ja "hirudiinia koodittavalla geenillä" kumpaakin varianttia, so. HV-1 tai HV-2 kuten myöskin mahdolliset muut variantit, sekä niitä 35 vastaavia sekvenssejä, jollei muutoin ilmoiteta.
e 104635
Eräänä esillä olevan keksinnön aiheena on hirudiinin tuottaminen hiivassa.
Hiiva on yksisoluinen eukaryoottinen organismi. Hiivalaji Saccharomyces käsittää laboratorioissa biokemiallisesti ja geneettisesti 5 intensiivisesti tutkittuja kantoja; se käsittää myös elintarviketollisuudessa (leipä, alkoholijuomat, jne.) käytettyjä kantoja, joita tästä syystä tuotetaan erittäin suurissa määrissä.
Saccharomyces cerevisiae -soluja on helppo manipuloida geneettisesti, joko klassisilla menetelmillä tai geeniteknologisin keinoin, tai 10 edullisemmin yhdistämällä nämä molemmat tekniikat, ja kun lajilla on pitkä teollisuustausta siitä muodostuu mieluisa isäntä vieraiden polypeptidien tuotantoa varten.
Tästä syystä esillä oleva keksintö koskee erityisesti toimivaa DNA-fragmenttia, joka mahdollistaa hirudiinin tuotannon hiivassa, jolloin se 15 sisältää vähintään: hirudiinin tai jonkun sen variantin geenin (tästedes H-geeni); signaalisekvenssiä sisältävän DNA-sekvenssin (Str), joka mahdollistaa H-geenin transkription hiivassa.
Tämä toimiva fragmentti integroituna plasmidiin tai hiivan, edullisesti Saccharomyces-lajin, kromosomiin voisi mahdollistaa, edellämainitun hiivan 20 transformoinnin jälkeen hirudiinin ilmentämisen, joko aktiivisena muotona tai inaktiivisena hirudiiniaktivoinnilla regeneroivana prekursorimuotona.
Saccharomyces cerevisiae on mielenkiintoinen siksi, että tämä hiiva pystyy erittämään joitakin proteiineja viljely-ympäristöönsä; tästä ilmiöstä vastaavaa mekanismia tutkitaan jatkuvasti, ja on osoitettu että on mahdollista : 25 saada hiiva tarvittavan manipuloinnin jälkeen erittämään ihmisen hormoneja oikein prosessoituina ja täysin ihmisen seerumista löydettyjä vastaavina (14, 15).
Esillä olevassa keksinnössä hyväksikäytetään tätä ominaisuutta saavuttamaan hirudiinin erittymistä, koska tästä seuraa useita etuja.
30 Ensiksi hiiva erittää vain vähän proteiineja, josta on se etu, mikäli v pystytään ohjaamaan vieraan proteiinin erittymistä korkealle tasolle, että viljely-ympäristöön saadaan tuote, joka edustaa korkeaa osuutta erittyneestä ·-“ kokonaisproteiinimäärästä, jolloin tutkittavan proteiinin puhdistustyö helpottuu.
On olemassa useita hiivan erittämiä proteiineja tai polypeptidejä. 35 Kaikissa tunnetuissa tapauksissa proteiinit syntesoidaan pidempänä 104635 7 prekursorimuotona, jonka NH2-terminaalisekvenssi on ratkaiseva erittymiseen johtavan metabolisen reitin valintaan.
Jonkun prekursorin NH2-terminaaiia sekä sitä seuraavaa vieraan proteiinin sekvenssiä sisältävien hybridiproteiinien synteesi hiivassa voi joissakin 5 tapauksissa johtaa tämän vieraan proteiinin erittymiseen. Se, että vieras proteiini syntesoidaan prekursorimuodossa, ja täten yleensä inaktiivisena, mahdollistaa solun suojausta tutkitun molekyylin mahdollisia toksisia vaikutuksia vastaan, aktiivista proteiinia vapauttava pilkkominen tapahtuu vain Golgi-laitteessa muodostuneissa vesikkeleissä, jotka eristävät proteiinin sytoplasmasta.
10 Erittymiseen johtavien metabolisten reittien käyttämisellä vieraan proteiinin tuottamiseen hiivassa on täten useampia etuja: 1) se mahdollistaa suhteellisen puhtaan tuotteen talteenottamista viljelysupematantista; 2) se mahdollistaa solun suojaamista toimivan proteiinin mahdollisia 15 toksisia vaikutuksia vastaan.
3) Lisäksi joissakin tapauksissa erittyvät proteiinit voivat olla modifioituja (glykosyloituja, sulfatoituja, jne.).
Tästä syystä keksinnössä käytetyillä ilmentämisfragmenteilla on edullisimmin seuraava rakenne: 20 — S*— L*— Sd — H-geeni — jossa Lex koodittaa H-geeniä vastaavan proteiinin erittämiseen tarvittavaa "leader"-sekvenssiä; : 25 Sd on pilkkomiskohtaa koodattava DNA-sekvenssi; lisäksi, S^H-geeni-alue voi olla toistettuna useamman kerran.
On valittu erittämissysteemiin esimerkiksi alfaferomonia, toisin sanoen, yllä mainitussa sekvenssissä L^-sekvenssi edustaa hiivan alfa-sukupuoliferomonia, mutta muitakin systeemejä voisi käyttää (esimerkiksi 30 Killer-proteiinisysteemiä) (14).
Hiivan alfa-sukupuoliferomoni on 13 aminohapon peptidi (kehystetty kuviossa 2), joka erittyy viljely-ympäristöön S. cerevisiae -hiivan sukupuolisissa mata. Alfatekijä pysäyttää vastaavan sukupuolilajin (mata) solut G1-vaiheeseen ja indusoi solutyyppien yhtymiseen tarvittavat biokemialliset ja morfologiset 35 muutokset. Kurjan ja Herskowitz (17) ovat kloonanneet alfa-tekijän rakennegeenin ja ovat päätelleet geenin sekvenssistä, että tämä 13 β 104635 aminohapon tekijä syntesoidaan 165 aminohapon pre-pro-proteiiniprekursorina (kuvio 2). Prekursori sisältää 22 jäännöksen hydrofobisen aminotermiaalisekvenssin (katkoviivalla alleviivattuna), jota seuraa 61 aminohapon sekvenssi, joka sisältää 3 glykosylaatiokohtaa, jota lopuksi seuraa 5 alfatekijä 4 kopiona. "Spacer'-sekvenssit erottavat kopiot toisistaan ja toimiva proteiini vapautuu prekursorista seuraavan entsymaattisen toiminnan avulla: 1) katepsiini B:n kaltainen endopeptidaasi, joka leikkaa COOH-päästä dipeptidit Lys-Arg (leikkauskohta merkitty paksulla nuolella); 2) karboksipeptidaasi B:n kaltainen eksopeptidaasi, joka leikkaa 10 emäksiset jäännöset katkaistujen peptidien COOH-päästä; 3) dipeptidyyliaminopeptidaasi (A), joka poistaa jäännökset Glu-Ala ja
Asp-Ala.
Prekursorin nukleotidisekvenssi sisältää lisäksi 4 Hindlll-rest-riktiokohtaa, kuviossa merkittynä Hilla.
15 On toteutettu useita fuusioita α-feromonigeenin ja toimivan hirudiinisekvenssin välillä. Mata-tyyppiset hiivasolut pystyvät ilmentämään nämä fuusiogeenit. Vastaavat hybridiproteiinit voidaan täten prosessoida sisältämiensä signaalien johdosta, jotka sisältävät a-feromoniprekursorin pre-pro-sekvenssin. On siis odotettavissa, että viljelysupematantista voidaan 20 ottaa talteen polypeptidejä, joilla on hirudiinin sekvenssi.
Yhdessä konstruktiossa Sd-sekvenssi sisältää 3'-päässään H-geeniä edeltävän ATG-kodonin; fuusioproteiini sisältää täten metioniinin toimivan hirudiinin ensimmäisen aminohapon yläpuolella. Syanogeenibromidilla pilkkomisen jälkeen tämä polypeptidi muodostaa hirudiinimolekyylin, jota • 25 saatetaan aktiiviseen muotoon renaturaatiovaiheen jälkeen.
Toisissa konstruktioissa käytetään α-feromonin tuotannossa tavallisesti käytettyjä pilkkomissignaaleja tuottaakseen antitrombiiniaktiivisuutta omaavia polypeptidejä viljelysupernatanttiin. Tämä toteutuu kun Sd-sekvenssi sisältää 3'-päässään kaksi Lys-Arg koodittavaa kodonia, so. AAA tai AAG ja 30 AGA tai AGG; polypeptide pilkotaan endopeptidaasilla, joka pilkkoo Lys-Arg-dipeptidit COOH-päästä, jolloin hirudiini vapautuu.
Erityisesti esillä olevassa keksinnössä käytetään konstruktioita, joissa hirudiini-geeniä edeltävä sekvenssi koodittaa seuraavia aminohappo-sekvenssejä: 35 1) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gin Vai Asp Gly Ser Met hirudiini
... I
9 104635 2) Lys Arg Glu Ala Glu Ala hirudiini..., 3) Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg hirudiini..., 4) Lys Arg Glu Ala Glu Ser Leu Asp Tyr Lys Arg hirudiini... tai 5) Lys Arg hirudiini...
5 On tietysti mahdollista ajatella muiden aminohappotasolla entsyymillä selektiivisesti pilkottavien sekvenssien käyttöä, sillä ehdolla, että pilkkomiskohta ei esiinny myös itse hirudiinissa.
Lopuksi ilmentämisblokit voivat sisältää, H-geenin perässä hiivan lopetus-sekvenssin, esimerkiksi PGK-geenin lopetussekvenssin.
10 Yleisesti esillä olevassa keksinnössä käytetyt ilmentämisfragmentit voivat olla integroituna hiivassa, erityisesti Saccharomyces-lajissa, joko autonomisesti replikoituvassa plasmidissa tai hiivan kromosomissa.
Kun plasmidi on autonominen, se sisältää replikaatiota mahdollistavia rakenneosia, so. replikaation aloituskohdan esimerkiksi plasmidista 2μ. Lisäksi 15 plasmidi voi sisältää selektiota mahdollistavia elementtejä, kuten URA3tai LEU2-geenit, jotka varmistavat hiivakantojen ura3- tai leu2-komplementaation. Nämä plasmidit voivat myös, plasmidin ollessa ns. "sukkula"- plasmidi, sisältää osia, jotka mahdollistavat niiden replikaation bakteereissa, kuten pBR322:n replikaation aloituskohdan, markkeri-geenin kuten Ampr ja/tai muita alan 20 asiantuntijoille tunnettuja elementtejä.
Esillä oleva keksintö koskee myös mainituilla ilmentämisfragmenteilla transformoituja hiivakantoja, joissa fragmentti on joko plasmidissa tai integroituna kromosomeihin. Näistä hiivoista mainittakoon erityisesti
Saccharomyces-lajiin kuuluvat hiivat, erityisesti S. cerevisiae.
: 25 Kun promoottori on α-feromonigeenistä käytetään edullisesti sukupuolityyppiä Mata olevaa hiivaa. Käytetään esimerkiksi kantaa, joka genotyypiltään on ura3- tai Ieu2- tai muuta plasmidilla komplementoitavaa kantaa ylläpitääkseen plasmidi hiivassa sopivan selektiopaineen avulla.
Vaikka olisikin mahdollista tuottaa hirudiinia fermentoimalla yllä 30 mainittuja transformoituja kantoja muunnetussa kasvatusalustassa akkumuloimalla hirudiinia soluihin, on kuitenkin edullisempaa, kuten yllä olevasta esityksestä käy ilmi, saattaa hirudiini ympäristöön eritettäväksi, joko ..... toimivana muotona tai prekursori-muotona, jota täytyy prosessoida in vitro.
Tämä maturaatio voidaan suorittaa useassa vaiheessa. Ensiksi voi 35 olla tarpeellista pilkkoa määrättyjä Lex-sekvenssin translaatiosta peräisin olevia elementtejä, mikä suoritetaan Scl-sekvenssiä vastaavalla tasolla. Kuten edellä <n 104635 10 on esitetty toimivaa hirudiinia voi edeltää metioniini, joka pilkotaan selektiivisesti syanogeeni-bromidin avulla. Tämä menetelmä on käyttökelpoinen, koska hirudiinia koodatava sekvenssi ei sisällä metioniinia.
N-päässä voi myös olla Lys-Arg-dipeptidi, joka pilkotaan 5 COOH-päästä spesifisen endopeptidaasin avulla; tämä entsyymi toimii erittymisprosessin aikana, täten saadaan toimiva proteiini suoraan ympäristöön.
Mutta, määrätyissä tapauksissa, voi olla tarpeellista suorittaa entsymaattinen pilkkominen erittymisen jälkeen lisäämällä spesifistä entsyymiä.
Joissakin tapauksissa, varsinkin syanogeenibromidikäsittelyn jälkeen, 10 voi olla tarpeellista renaturoida proteiini disulfidisiltojen uudelleen muodostumista varten. Tällöin peptidi denaturoidaan, esimerkiksi guaniidikloorivedyn avulla, ja renaturoidaan pelkistetyn glutationin läsnäollessa ja hapetetaan.
Esillä olevan keksinnön muut erikoispiirteet ja edut ilmenevät seuraavien esimerkkien avulla.
15 Liitteenä olevat kuviot:
Kuvio 1 esittää plasmidiin pTG 717 kloonatun hirudiinin cDNA-fragmentin nukleotidisekvenssiä; kuvio 2 esittää a-sukupuoliferomonin prekursorin nukleotidisekvenssiä; 20 kuvio 3 kuvaa plasmidin pTG834 konstruktion; kuvio 4 kuvaa plasmidin pTG880 konstruktion; kuvio 5 kuvaa plasmidin pTG882 konstruktion; kuvio 6 kuvaa faagin MI3TG882 konstruktion; kuvio 7 kuvaa plasmidin pTG874 konstruktion; . 25 kuvio 8 kuvaa plasmidin pTG876 konstruktion; kuvio 9 kuvaa plasmidin pTG881 konstruktion; kuvio 10 kuvaa plasmidin pTG886 konstruktion; kuvio 11 kuvaa plasmidin PTG879 konstruktion; kuvio 12 esittää PM>1000 omaavia proteiineja sisältävää akryyli- 30 amidielektroforeesigeeliä, jotka on eristetty plasmideilla pTG886 ja pTG897 • « * transformoidun hiivan kasvatusympäristöstä; kuvio 13 esittää PM>1000 omaavia proteiineja sisältävää akryyliamidielektroforeesigeeliä, jotka on eristetty plasmideilla pTG886 ja pTG897 transformoidun hiivan kasvatusympäristöstä; 35 kuvio 14 kuvaa plasmidin pTG1805 konstruktion; 104635 11 kuvio 15 esittää PM>1000 omaavia proteiineja sisältävää akryyliamidielektroforeesigeeliä, jotka on eristetty plasmideilla pTG847 ja pTG1805 transformoidun hiivan kasvatusympäristöstä; kuvio 16 on luonnos, jossa verrataan ensimmäisen pilkkomiskohdan 5 (Lys-Arg) alapuolella ("en aval") esiintyviä aminohapposekvenssejä eri konstruktioissa.
Aminohapposekvenssit ja nukleotidisekvenssit eivät ole liitettyinä esillä olevaan esitykseen, mutta ovat silti osana siitä.
Esimerkki 1 10 Plasmidin PTG822 konstruktio
Pilkottiin plasmidi pTG717 entsyymillä Pstl, sitten entsyymeillä Hinfl ja Ahalll. minkä jälkeen eristettiin hirudiinin HV-2 cDNA-fragmentti geelistä. Entsyymi Hinfl pilkoo hirudiini-HV-2 sekvenssin ensimmäisen kodonin alapuolelta. Entsyymi Ahalll leikkaa noin 30 emäsparia hirudiinisekvenssin 15 lopetuskodonin takaa (3'). Täten saatu Hinfl-Ahalll-fragmentti eristettiin agaroosiogeelissä ja eluoitiin geelistä.
Toimivaa proteiinia koodittava sekvenssi liitettiin vektoriin pTG880. Vektori pTG880 on vektorin pTG838 johdannainen (kuvio 3). Plasmidi pTG838 on identtinen pT833:n kanssa, paitsi Ballllk-kohdan suhteen, joka sijaitsee 20 PGK:n transkription lopetuskohdan lähellä. Tämä kohta on inaktivoitu Klenow-polymeraasin avulla jolloin saatiin pTG838.
Plasmidi pTG833 on hiivan ja E. colin sukkulaplasmidi. Tämä plasmidi on konstruoitu ilmentämään vieraita geenejä hiivassa. Tämän vektorin (kuvio 3) perusyksikköjä ovat seuraavat: URA3-aeeni hiivan selektiomarkkerina, 25 hiivan 2μ-plasmidin replikaation aloituskohta, E. colin ampisilliiniresistenssigeeni ja pBR322- plasmidin replikaation aloituskohta (nämä viimeksi mainitut yksiköt mahdollistavat plasmidin tuotannon selektion kolibakteerissa), hiivan PGK-geenin 5'-puoleinen alue, jossa on tätä geeniä koodittavaa sekvenssiä Sali-kohtaan saakka, pBR322:n Sall-Pvull-fraamentti sekä PGK-geenin 30 lopetuskohta (20). Tämä plasmidi on aikaisemmin kuvattu toukokuun 9. 1984 jätetyssä FR-patentti-hakemuksessa 84 07125 hakijan nimessä.
Plasmidi pTG880 on konstruoitu pTG838:sta lähtöisin (kuvio 4), insertoimalla lyhyt polylinkkerialue (peräisin bakteriofaagista M13) entsyymeillä EcoRI ja Bgllll pilkottuun plasmidiin pTG838, mikä mahdollistaa seuraavien 35 kloonauskohtien sarjan, BGIII, Pstl, Hindlll, BamHI, Smal ja EcoRI, liittämistä välittömästi hiivan PGK-geenin viereisen 5'-puoleisen alueen jälkeen. Plasmidin 12 104635 pTG880 DNA digeroitiin entsyymeillä Bglll ja Smal, ja digestiossa muodostunut suuri fragmentti eristettiin ja eluoitiin geelistä. Plasmidin pTG717 Hinfl/Ahalll-fragmentti, joka sisältää hirudiinia HV-2 koodittavan sekvenssin pääosan, sekoitettiin pilkotun pTG880:n kanssa yhdessä 3 synteettisen 5 oligonukleotidin (kuvio 5) kanssa, joiden oli tarkoitus rekonstruoida hirudiinisekvenssin NH2-pään, ja yhdistää vektorin Bglll-kohdan hirudiinia sisältävän fragmentin Hinfl-kohtaan. Tämä seos alistettiin ligaatio-käsittelyyn, ja käytettiin sen jälkeen transformoidakseen E. coli -soluja. Transformanteista otettiin talteen plasmidi pTG882.
10 Tätä plasmidia käytettiin transformoimaan hiivasoluja, tarkoituksena tuottaa hirudiinia PGK-promoottorin kontrollin alaisena. Ei kuitenkaan todettu mitään hirudiinin aktiivisuutta tällä vektorilla transformoitujen solujen raakaekstraktissa. Syy aktiivisen hirudiinin tuoton puuttumiseen ei vielä ole selvä. Kuitenkin pTG882 on toiminut hirudiinia koodittavan sekvenssin lähteenä 15 alla olevien hiivan erittämisvektoreiden konstruktiossa.
Esimerkki 2 PTG886 ia dTG897 konstruktio
Ensin siirrettiin hirudiinin sekvenssiä sisältävä pTG882:n Bglll-EcoRI-fragmentti (230 bp) bakteriofaagiin M13mp8 (kuvio 6) kohtien 20 BamHI ja EcoRI väliin. Täten saatiin faagi M13TG882, josta voitiin eristää EcoRIHindlll-fraqmentti (noin 245 bp) Tämä fragmentti sisältää hirudiini-HV-2 koodittavan kokonaissekvenssin, BamHI/ Bqllll-liittymiskohdan ja kohesiiviset päät (Hindll-EcoRI) mahdollistavat kloonauksen hiivan erittymisvektoriin pTG881 (kuvio 9).
25 Plasmidi pTG881 (10 kb) on E. coli/hiivan sukkulaplasmidi, joka replikoituu autonomisesti sekä E. colissa että Saccharomyces cerevisiae, uvarum ja carlbergensiskannoissa.
Plasmidin siirtäminen E. coliin tuo ampisilliinin (ja muiden β-laktaamityyppisten antibioottien) resistenssin. Lisäksi tämä plasmidi sisältää 30 hiivan LEU2- ja URA3-aeenit. jotka ilmentyvät E. coli- ja • l ’. Saccharomyces-kannoissa. Täten plasmidin läsnäolo E. colissa tai f
Saccharomykeksessä mahdollistaa B-isopropyylimalaattidehydrogenaasi- tai OMP-dekarboksylaasi-vapaiden kantojen komplementaation.
Plasmidi pTG881 konstruoitiin seuraavalla tavalla: 104635 13 Lähtöplasmidina oli pTG848 (identtinen FR-patentissa 83 15716 esitetyn pTG849:n kanssa, paitsi ura3-geenin suhteen, joka on toisin päin), joka koostuu seuraavista DNAfragmenteista (kuvio 7): 1) Noin 3,3 kb EcoRI-Hindlll-fragmentti, plasmidista pJDB207 (18).
5 Hindlll-kohta vastaa koordinaattia 105 2μ-ρΐ38ΓΤ^ίη B-muodossa, EcoRI-kohta vastaa koordinaattia 2243. Tässä fragmentissa on LEU2-geeni insertoituna polydesoksiadenylaatti/polydesoksitymidi-laattiekstension avulla 2 u:n B-muo-don fragmentin Pstl-kohtaan.
2) URA3-geenin Hindlll-fragmentti (19).
10 3) pBR322:n iso EcoRI(koordinaatti 0)-Sall(koordinaatti 650)-frag- mentti. Tämän fragmentin Pvull-kohtaan insertoitiin 510 emäsparin EcoRI-HINDIII-fragmentti (jonka päät oli ensin tylpistetty Klenowin avulla 4 nukleotidin läsnäollessa), joka vastaa PGK-geenin loppuosaa (20). PGK-geenin tylpistetty EcoRI-pää regeneroi EcoRI-kohdan kun se liitetään pBR322:n 15 Pvull-päähän.
4) PGK-geenin Hindlll-Sall-fragmentti (2,15 kb) (20).
Plasmidi pTG848 pilkottiin Hinduilla ja täten muodostuneiden fragmenttien päät typistettiin Klenow-käsittelyllä 4 desoksiribonukleotidin läsnäollessa. Fragmentit ligoitiin ja ligaatioseos käsiteltiin Hinduilla ennen 20 transformaatiota, jolloin poistuu kaikki yhden (tai kahden) Hindill-kohdan säilyttäneet plasmidit. Transformoitiin E. coli -kanta BJ5183 (pyrF) ja selektoitiin transformantit ampisilliiniresistenssinsa sekä pyr’-ominaisuutensa suhteen.
Täten saatiin plasmidi pTG874 (kuvio 7), jossa molemmat Hindlll-kohdat on inakitivoitu, URA3-aeenin orientaatio antaa transkription samassa orientaatiossa 25 kun fosfoglyseraattikinaasigeeni (PGK).
Plasmidi pTG874 pilkottiin Smal-ja Sali-entsyymeillä ja 8,6 kb fragmentti eristettiin agaroosigeelistä. Plasmidi pTG864, joka sisältää MF 1-geenin EcoRI-Sall-fragmentin (noin 1,4 kb) kloonattuna pBR322:n samoihin kohtiin, pilkottiin EcoRI:llä. Täten linearisoidun plasmidin päät 30 typistettiin Klenow-käsittelyllä 4 nukleotidin läsnäollessa. Tämän jälkeen suoritettiin Sall-digestio ja MF 1-geeniä vastaava EcoRI(tylpistetty)-Sall-fragmentti eristettiin. Viimeksi mainittu fragmentti ligoitiin pTG874:n i
Smal-Sall-palaan (8,6 kb), jolloin saatiin plasmidi pTG876 (kuvio 8).
Inaktivoidakseen MFa1-promoottorisekvenssista proksimaalinen I
35 Bglll-kohta suoritettiin plasmidille pTG876 partiaalinen digestio Bgllllla, jota seurasi Klenow-käsittely 4 desoksiribonuksleotidin läsnäollessa. Saatu uusi 104635 14 plasmidi, pTG881 (kuvio 9), mahdollistaa vieraiden koodittavien sekvenssien insertion MFa1-geenin ensimmäisen Hindlll-kohdan ja PGK-geenin lopussa olevan Bglll-kohdan väliin.
Kun vieraan koodittavan DNA:n liittyminen Hindlllkohtaan 5 mahdollistaa translaation samassa lukuvaiheistuksessa, saatu hybridiproteiini sisältää alfa-feromonin pre-pro-osat.
Hirudiinigeeniä sisältävän Hindlll-EcoRI-fragmentin kloonaus pTG881-plasmidiin antaa plasmidin pTG886 (kuvio 10). Kun kloonaus on suoritettu löytyy Bglll-kohta fragmentin alapuolelta, mikä mahdollistaa 10 fragmentin irrottamisen Hinfl-Bglll-muodossa, jolloin Hinfl-kohta on sama kuin yllä käytetty. Bglll esiintyessä vain kerran pTG881:ssä on erittäin helppoa rekonstruoida hirudiinia koodittavan sekvenssin 5'-pää käyttäen 3 oligonukleotidia, jotka rekonstruoivat hirudiinin 5-pään ja mahdollistavat α-feromonin pre-pro-sekvenssin ja sitä seuraavan toimivan hirudiinin oikean 15 lukuvaiheistuksen.
Tämä uusi plasmidi kutsutaan pTG897:ksi (kuvio 11).
Esimerkki 3
Hirudiinin ilmentäminen hiivassa
Plasmidin pTG897 DNA käytettiin transformoidakseen hiiva TGY1sp4 20 (Mata, ura3 -251 - 373 - 328, his3 - 11- 15) ura+-muodoksi yllä esitettyä menetelmää käyttäen (21).
Poimittiin transformoitu pesäke ja inokuoloitiin 10 ml:aan minimaalialustaa, johon oli lisätty kasaminohappoja (0,5 %). Viljelyä jatkettiin 20 tuntia, jonka jälkeen solut sentrifugoitiin, supernatantti dialysoitiin tislattua vettä ·.. . 25 vastaan ja väkevöitiin haihduttamalla (sentrifugoitiin vakuumissa).
Rinnakkain käsiteltiin samalla tavalla pTG886-plasmidilla transformoitu TGY1sp4-viljelmä ja TGY1sp4-viljelmä, joka oli transformoitu plasmidilla ilman hirudiinisekvenssiä (TGY1sp4 pTG856). Kuivat pelletrt otettiin 50 pl:aan vettä ja 20 μΙ keitettiin 2,8 % SDS.n ja 100 mM merkaptoetanolin 30 läsnäollessa, ja asetettiin akryyliamidi-SDS-geeliin (15 % akryyliamidia; 0,1 % m V SDS) (22). Kiinnityksen ja Coomassieblue-värjäyksen jälkeen, voitiin osoittaa TGY1sp4/pTG886 ja TGY1sp4/pTG897 viljelmien supernatant-tiin kerääntyneet polypeptidit, jotka puuttuvat kontrolliviljelmän supematantista (kuvio 12). Lisäksi ylimääräiset peptidisarjat leimautuvat vahvasta 35S-kysteiinillä, kuten saattaakin 35 odottaa hirudiinipeptidiltä, koska tämä molekyyli on erittäin kysteiini-rikas (kuvio 10).
is 104635
Kuvioissa 12 ja 13 esitetyt elektroforeesit suoritettiin seuraavasti:
Kuvion 12 kohdalla uutteet valmistettiin seuraavasti: 10 ml minimaalialustaan (Yeast Nitrogen Base Difco ilman aminohappoja (6,7 g/l), glukoosia (10 g/j), johon on lisätty kasaminohappoja 0,5 %, inokuloitiin erilaisia 5 kantoja, ja viljeltiin 20 tuntia (stationääri vaihe). Solut sentrifugoitiin, supematantti dialysoitiin vettä vastaan (minimiretentio: PM 1000) ja kuivattiin sentrifugoimalla vakuumissa. Näytteet otettiin sitten 50 μΙ geelipuskuriin, josta 20 μΙ käsiteltiin kuten yllä esitetty, ja siirrettiin akryyliamidi-SDS-geeliin (15 % akryyliamidia, 0,1 % SDS) (22).
10 Käytetyt kannnat olivat:
Kaista 2: TGY1sp4 transformoitu plasmidilla, joka ei sisällä hirudiinisekvenssiä (kontrolli);
Kaista 3: pTG886:11a transformoitu TGY1sp4;
Kaista 4: pTG897:11ä transformoitu TGY1sp4; 15 Kaista 1: tähän kaistaan lisättiin referenssimerkit (Pharmacian LMW Krt; ylhäältä alas; 94 000, 67 000, 43 ooo, 30 000, 20100,14 000). ,..
Vyöhykkeet detektoitiin värjäämällä Coomassie-blue R-250:llä.
Kuvion 13 kohdalla näytteet valmistettiin seuraavasti: 100 ml 20 minimaalialustaan + histidiiniä 40 mg/ml inokuloitiin erilaisia kantoja ja viljeltiin yli yön. Kun solutiheys saavutti noin 5 x 10® (oletettu eksponenttivaihe) lisättiin 40 μΙ 35-kysteiiniä (9,8 mCI/ml; 1 015 Ci/mmol) joka viljelmään. 10 minuutin jälkeen solut sentrifugoitiin, otettiin talteen 10 ml täydelliseen alustaan (30 °C) ja inkuboitiin 30 °C:ssa ravistellen. Kolmen tunnin jälkeen dialysoitiin 10 ml:n 25 supematantti vettä vastaan ja konsentroitiin 0,5 ml.ksi kuten kuvion 12 kohdalla on esitetty. Noin 35 000 cpm (40 μΙ) siirrettiin akryyliamidi-SDS-geeliin (15 % akryyliamidia, 0,1 % SDS). Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin fluorografialla.
Käytetyt kannat olivat:
Kaista 2: TGY1sp4 transformoitu plasmidilla, joka ei sisällä . , 30 hirudiinisekvenssiä;
Kaista 3: pTG886:lla transformoitu TGY1sp4;
Kaista 4: pTG897:llä transformoitu TGY1sp4;
Kaista 1: tähän kaistaan lisättiin markkerit joiden PM on ilmoitettu (x103).
35 Vastaavasti, kun polypeptidejä sisältävät supernatantit testattiin antitrombiiniaktiivisuuden suhteen, ei todettu mitään aktiivisuutta.
104635 16 TGY1sp4/pTG886-kannan erittämän polypeptidin kohdalla oli, normaalilla menetelmällä pilkottaessa -feromoniprekursori, odotettavissa hirudiinimolekyyli, jolla on 8 ylimääräistä aminohappoa NH2-päässään. Ei siis ole hämmästyttävää, että TGY1sp4/pTG886- solujen erittämä polypeptidi ei ole 5 aktiivinen.
Toisaalta TGY1sp4/pTG897:n erittämän polypeptidin kohdalla on odotettavissa, että polypeptidi on identtinen luonnollisen proteiinin kanssa ja siten aktiivinen. Useat hypoteesit voivat selittää aktiivisuuden puuttumista: 1) Proteiinin naturaatio ei ole täydellinen, voi vielä esiintyä 10 Glu-Ala-jäännöksiä NH2-päässä, kuten EGF:n kohdalla on esitetty (16).
2) Proteiini ei ole aktiivinen, koska sillä ei ole oikea konformaatio tai viljelysupematantissa on proteiineja tai muita molekyylejä suuruudeltaan PM 1000, jotka inhiboivat aktiivisuutta.
3) Proteiini ei ole täydellinen, koska se on läpikäynyt solunsisäisen 15 jaAai -ulkoisen proteolyysin.
Esimerkki 4
Aktivointi svanoaeenibromidilla pilkkomisen avulla
Jos aktiivisuuden puuttuminen iohtuu ylimääräisistä NH2-terminaa-lisista aminohapoista, pitäisi olla mahdollista aikaansaada aktiivisuus alistamalla 20 TGY1sp4/pTG886:n erittämä peptidi syanogeenibromidikäsittelyyn. Tämä reagenssi on spesifinen metioniinijäännöksille ja pTG886:n koodittama fuusioproteiini ei sisällä yhtään metioniinia. Tämä reaktio suoritettiin seuraavalla tavalla: hiivasolut, jotka sisälsivät joko plasmidia pTG886 tai kontrolliplasmidia, joka ei sisällä hirudiini-inserttiä, viljeltiin 10 ml alustassa 24 tuntia. Tällöin viljelmä 25 oli saavuttanut tiheyden 7 - 10 x 107 solua/ml. Supematantti erotettiin soluista, dialysoitiin tarkoin tislattua vettä vastaan ja lyofilisoitiin. Kuiva jauhe liuotettiin 1 ml 70 % muurahaishappoa ja osa käytettiin kokonaisproteiinimäärän määrittämiseen (käyttäen Coomassie-blue -värjäysmenetelmää, Bioradilta ostetuilla reagensseillä); loput näytteestä käsiteltiin 1 ml:lla tuoretta 30 syanogeenibromidiliuosta (30 mg/ml) 70 % muurahaishapossa.
t
Happi poistettiin typpipuhalluksella, ja putket inkuboitim pimeässä 4 tuntia huoneenlämmössä. Kaikki toimenpiteet syanogeeni-bromidin läsnäollessa suoritettiin tarpeellisia varotoimenpiteitä huomioiden ja vetokaapissa. Syanogeenibromidin pilkkomisreaktio pysäytettiin lisäämällä 10 volyymiä 35 tislattua vettä, jonka jälkeen liuos lyofilisoitiin.
17 104635
Pilkottu peptidi liuotettiin uudestaan 10 ml tislattua vettä ja lyofilisoitiin taas kaksi kertaa. Lopuksi peptidit liuotettiin pieneen määrään tislattua vettä ja osa käytettiin antitrombiiniaktiivisuuden määrittämiseen. Loput näytteestä lyofilisoitiin ja alistettiin alla esitettyihin renaturaatiovaiheisiin.
5 Koska hirudiinin aktiivisuus on riippuvainen disulfidisidosten läsnäolosta molekyylissä (1), vaikuttaa todennäköiseltä että syanoqeeni-bromidilla pilkottu peptidi pitää renaturoida oikealla tavalla, jotta biologinen aktiivisuus esiintyisi. Siksi pilkotut peptidit alistettiin denaturaatioon 5 M GuHCUIä, jonka jälkeen seurasi renaturaatio, alan asiantuntijoille tunnettua 10 menetelmää käyttäen.
Yhteenvetona lyofilisoidut peptidit liuotettiin 400 pl:aan 5 M guanidiinivetykloridia (GuHCI) 250 mM TrisHCLssä, pH 8,9; sitten liuos saatettiin 2 mM:ksi pelkistetyn glutationin suhteen ja 0,2 mM:ksi hapetetun glutationin suhteen, loppumäärässä 2,0 ml (loppukonsentraatiota on 1,0 M GuHCI ja 50 15 mM Tris).
16 tunnin inkubaation jälkeen 23 °C:ssa pimeässä, näytteet dialysoitiin 24 tuntia kolme kertaa 2 l ila 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCI vastaan 23 °C:ssa, ja lopuksi dialyysiliuos kirkastettiin sentrifugoimalla.
Mitattiin supematanttien antitrombiiniaktiivisuus. Tämän kokeen tulos, 20 joka esitetään taulukossa I, esittää selvästi antitrombiini-aktiivisuuden nousua niiden solujen supematantissa, jotka Gli infektoitu plasmidilla pTG886, kun taas ei esiinny aktiivisuutta kontrolliplasmideilla.
TAULUKKO I
: , 25 Hiivavilielmien supematanttien antitrombiiniaktiivisuus
Spesifinen
Supematanttinen Aktiivisus aktiivisuus U/mg
Plasmidi aktiivisuus U/ml_lähtöproteiinia pTG886 a) pilkkomisen jälkeen, ennen renaturaatiota <0,3
• i I
*·' b) pilkkomisen ja rena- turaation jälkeen 2,46 102,5 kontrolli a) pilkkomisen jälkeen, ennen reaturaatiota <0,3 b) pilkkomisen ja rena- turaation jälkeen <0,15 <5,6 18 104635
Johtopäätöksenä hiivasolut, joilla on yhdistelmäplasmidi, voivat erittää pilkkomisreaktion ja renaturaation jälkeen hirudiinin biologista aktiivisuutta omaavaa peptidiä. Tämä osoittaa, että ylimääräisten aminohappojen läsnäolo NH2-terminaalissa riittää selitykseksi polypeptidien aktiivisuuden puuttumiseen 5 viljelmissä TGY1sp4/pTG886 ja ehkä myöskin TGY1sp4/pTG897-viljelmien tapauksessa (GluAla toisto).
Esimerkki 5
Uuden pilkkomiskohdan lisäys juuri ennen ensimmäistä aminohappoa hirudiini-HV2 koodittavassa sekvenssissä - plasmidissa oTG1805 10 Konstruktiossa pTG897 on vaarana, että erittyvässä peptidissä on yhä Glu-Ala-häntiä NH2-päässä, mikä selittäisi antitrombiini-aktiivisuuden puuttumisen tässä materiaalissa. Jos tämä hypoteesi vastaa todellisuutta, täytyy olla mahdollista aktivoida peptidi suoraan supernatantissa luomalla pilkkomiskohta Glu-Ala-jäännösten ja hirudiiniHV-2:n ensimmäisen aminohapon 15 (isoleusiini) väliin. Tämä aikaansaadaan lisäämällä dipeptidiä LysArg koodittava sek-venssi, joka on endopeptidaasin tunnistuskohta ferominiprekursorin maturaatiossa (kuvio 2). Konstruktio saatiin täsmälleen samalla tavalla kun on esitetty plasmidin pTG897 tapauksessa, paitsi 2 synteettisen oligonukleotidin suhteen (kuvio 14). Saatu plasmidi kutsuttiin pTG1805:ksi. Plasmidi käytettiin 20 transformoimaan TGY1sp4-kanta ura+:ksi. Supematanttiin erittynyt materiaali analysoitiin elektroforeesigeelissä, kuten yllä on esitetty, ja verrattiin TGY1sp4/pTG897:11ä saatuun materiaaliin (kuvio 15).
Käytetyt kannat olivat:
Kaista 1: kuviossa 12 käytettyjen kanssa identtiset markkerit; 25 Kaista 2: pTG897:llä transformoitu TGY1sp4;
Kaista 3: pTG1805:lla transformoitu TGY1 sp4;
Kaista 4: kontrolli, joka ei tuota hirudiinia.
Kannalle TGY1sp4/pTG1805 spesifiset polypeptidit liikkuvat hitaammin kuin kannalle TGY1sp4/pTG897 spesifiset. Tämä tulos osoittaa, että 30 vastaava endopeptidaasi ei käytä tehokkaasti uutta pilkkomiskohtaa. Kuitenkin hirudiinin taso supernatantissa biologisena aktiivisuuten mitattuna paljastaa, että pieni osa materiaalista on aktiivisessa muodossa, päinvastoin kun TGY1 sp4/pTG987:n tapauksessa, joka on selvästi inaktiivinen (taulukko II).
19 104635
TAULUKKO II
Hiivavilielmien supematanttien (10 ml) antitrombiini-aktiivisuus Selektiivinen aktiivisuus Kokonaisaktiivisuus
Plasmidi_U/mg_U (10 ml) pTG856 ei mitattavissa pTG897 ei mitattavissa pTG1805 21 2,0
Esimerkki 6 5 Uusi konstruktio, jossa on uusi tehokkaampi pilkkomiskohta. ioka mahdollistaa toimivan hirudiinin vapautumisen
Edellisessä konstruktiossa (pTG897) ei saatu kun vähäistä hirudiinin aktiivisuutta supernatanttiin, todennäköisesti siitä syystä, että toinen pilkkomiskohta, joka vapauttaa toimivan hirudiinin, tunnistetaan matalalla 10 teholla. Siksi on tehty uusi konstruktio, jonka tarkoituksena on saattaa tämä lisäpilkkomiskohta endopeptidaasiherkemmäksi lisäämällä sen yläpuolelle, kolmen aminohapon, Ser Leu Asp, sekvenssi, joka luonnollisesti esiintyy ensimmäisen LysArg-dipeptidin yläpuolella (kuviot 2 ja 16).
Käytetty menetelmä on sama kun edellämainittu, paitsi 15 oligonukleotidien suhteen, joiden sekvenssit olivat seuraavat: 26-meeri 15-meeri 5'-AGCTTCTTTGGATAAAAGAATTACGT^TACAGACTGCACAG* 20 .AGAAACCTATTTTCTTAATGCATATGTCTGACGTGTCTTA, 40-meeri 25 Pilkkomiskohdan aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 12.
*·; Vastaava plasmidi kutsutaan pTG1818:ksi, ja se erottuu pTG1805:stä vain kodonien Ser-Leu-Asp vastaavien nukeleotidien insertin suhteen: 5-TTG GAT AAA.
Mitattu aktiivisuus TGY1sp4/pTG1818-viljelmien supernatantissa 30 aikaisemmin esitettyjä standardiolosuhteita noudattaen, on noin 200 yksikköä 10 ml viljelmää kohden, mikä on noin 100 kertaa korkeampi kuin edellisessä 104635 20 esimerkissä. On todettava, että määritys voidaan suorittaa 10 pl:sta ei-konsentroitua viljelyliuosta.
Esimerkki 7
Konstruktio, ioka johtaa prekursorin synteesiin, josta puuttuu 5 Glu-Ala-Glu-Ala-sekvenssi
Kahdessa edellisessä esimerkissä on esitetty, että uuden Lys Arq -kohdan lisääminen juuri toimivan hirudiinin sekvenssin alun yläpuolelle, mahdollistaa aktiivisen materiaalin vapautumisen supematanttiin. Kuitenkin, näissä esimerkeissä voidaan saada viljelyalustaan raskaampi inaktiivinen 10 kontaminaatio, muodostuen NH2-päästään pidennetyistä hirudiiniketjuista, mikäli prekursorin pilkkoutuminen tapahtuu ensimmäisellä LysArg-kohdalla (distaali-sesti toimivan sekvenssin alkamiskohdasta). Tämä on erityisen selvää TGY1sp4/pTG1805-viljelmien kohdalla, jossa inaktiivinen kontaminantti on enemmistönä. Tämä on kuitenkin yhtä mahdollista TGY1sp4/pTG1818-15 viljelmien kohdalla, jossa inaktiivinen kontaminantti ei ole enemmistönä, mutta missä se voi esiintyä, kuten muut ovat esittäneet EGF.n tapauksessa (15). Jotta vältettäisiin tätä tappiota saannossa, joka muodostuu inaktiivisen materiaalin syn-tesoinnista, päätettiin suorittaa uusi konstruktio, joka antaa prekursorin, joka ei erotu TGY1sp4/pTG897-solujen syntesoimasta muutoin 20 kuin että Glu-Ala-Glu-Ala-sekvenssi puuttuu Lys-Arg:n pilkkomiskohdan ja toimivan hirudiinisekvenssin ensimmäisen aminohapon välistä.
Seuraavat kannat on tallennettu INSTITUT PASTEUR:n kokoelmaan "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM)", 28 Rue du Docteur-Roux, PARIS 15'eme, huhtikuun 30,1985: • . 25 TGY1sp4/pTG1818: Saccharomyces cerevisiae, kanta TGY1sp4 (Mata ura3-251-373-328-his 3-11-15) transformoitu ura+-kannaksi plasmidilla pTG1818; talletus nro 1441.
TGY1sp4/pTG886: Saccharomyces cerevisiae, kanta TGY1sp4 Mata ura3-251-373-328-his 3-11-15) transformoitu ura+-kannaksi plasmidilla 30 pTG886; talletus nro 1442.
*
Viitteet 1. BAGDY D., BARABAS E., G RAF L, PETERSEN T.E. ja MAGNUSSON S. (1976) Methods in Enzymology part B, voi. 45, pp. 669-678.
35 2. MARKWARDT F. (1970) Methods in Enzymology, ed. Perlman G.E. ja Lorand L, Academic Press., voi. 19, pp. 924-932.
104635 21 3. MARKWARDT F., HAUPTMANN J., NOWAK G., KLESSEN Ch. ja WALSMANN P. (1982) Thromb. Hemostasis (Stuttgart) 47,226-229.
4. WALSMANN P. ja MARKWARDT F. (1981) Die Pharmazie 10, 653-660.
5. KLOSS Th. ja MITTMANN U. (1982) Longenbecks Arch. Chirurg. 358. 548.
5 6. ISHIKAWA A., HAFTER R., SEEMULLER U„ GOKEL J.M. ja GRAEFF M.
(1980) Thrombosis Research 19, 351-358.
7. MARKWARDT F., NOWAK G., STURZEBECKER J„ GREISBADI U„ WALSMANN P. ja VOGEL G. (1984) Thromb. Hemostasis (Stuttgart) 52.
160-163.
10 8. NOWAK C. ja MARKWARDT F. (1980) Expt. Path. 18, 438-443.
9. MARKWARDT F„ NOWAK G., STURZENBECKER J„ GREISSBACK U., WALSMANN P. ja VOGEL G. (1984) Thromb. Hemostasis 52,160-163.
10. SUTOR A.H., KNOP S. ja ADLER D. (1981) Kontralle Antithrombotica, 23rd Symp. Blutgerinnung, Hamburg, pp. 117-123.
15 11. PETERSEN T.E., ROBERTS H.R., SOTTRUP-JENSEN L, MAGNUSSON
S. ja BADGY D. (1976) Protides Biol. Fluids, Proc. Colloq. vol. 23, pp.
145-149.
12. CHANG J-Y. (1983) Febs Lett. 164, 307-313.
13. BASKOVA I.P., CHERKESOVA D.U. ja MOSOLOV V.V. (1983) Thromb.
20 Res. 30, 459-467.
14. BUSSEY H., SAVILLE D., GREENE D. ja al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1362-1370.
15. BRAKE A.J., MERRYWEATHER J.P., COIT D.G., HEBERLEIN U.A., MARIARZ F.R., MULLENBACH G.T., URDEA M.S., VALENZUELA P. ia • . 25 BARR P.J. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4642-4646.
16. BITTER G.A., CHEN K.K., BANKS A.R.ja LAI P.H. (1984) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81, 5330-5334 17. KURJAN J. ja HERSKOWITZ I. (1982) Cell 2Ω, 933-943.
18. BEGGS J. (1981) Genetic Engineering 2,175-203.
30 19. BACH M.L., LACROUTE F. ja BOTSTEIN D. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci.
\ (USA) 7§, 386-390.
20. HITZEMAN R.A., HAGIE E.F., HAYFFLICK J.S. ja al. (1982) Nucleic Acids
Res. 10,7791-7808. ______________ - 21. ITO H., FUKUDA Y., MURATA K. ja KIMURA A. (1983) J. Bacteriol. 153, 35 163-168.
22. LAEMMLI V.K.C. (1970) Nature 227, 680-685.
Claims (17)
1. Hiiva, joka on transformoitu toimivalla DNA-fragmentilla integroituna plasmidiin, joka sisältää replikaation aloituskohdan hiivassa, tai integroituna 5 mainitun hiivan kromosomiin, tunnettu siitä, että fragmentti sisältää ainakin: - hirudiinia koodatavan DNA-sekvenssin, (geeni H), - vähintään yhden pilkkomiskohdan (Sd), joka sijaitsee välittömästi ylävirtaan geenistä H, - leader-sekvenssin (L^, joka sisältää tarvittavat elementit geeni- 10 tuotteen erittymisen aikaansaamiseksi, - DNA-sekvenssin (S*), joka sisältää signaalit, jotka varmistavat H-geenin transkription hiivan toimesta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transformoitu hiiva, tunnettu siitä, että mainittu toimiva fragmentti sisältää ainakin seuraavat sekvenssit, 5'- 15 päästä 3-päähän: - sekvenssin (S*), joka sisältää signaalit, jotka varmistavat H-geenin transkription hiivan toimesta, - leader-sekvenssin (L^), joka sisältää tarvittavat elementit geeni-tuotteen erittymisen aikaansaamiseksi,
20. HVr tai HV2-hirudiinia koodittavan DNA-sekvenssin, jonka koodaa- : ma aminohapposekvenssi on esitetty kuvion 1 riveillä (c) ja (b) vastaavasti, ja jota edeltää pilkkomiskohta Sd.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että sekvenssi Lw on hiivan alfa-sukupuoliferomonin sekvenssi, joka on esitetty 25 kehistettynä kuviossa 2.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että leader-sekvenssi sisältää hiivan alfa-sukupuoliferomonin pre-frag-mentin, joka on esitetty katkoviivoilla kuviossa 2.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen hiiva, tunnettu 30 siitä, että fragmentti sisältää hiivan alfa-sukupuoliferomonin pre-pro-sekvenssin 104635 H-geenin 5'-päässä, joka sekvenssi on esitetty kuviossa 2 ja joka koodaa aminohapot 1-83.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että H-geeniä seuraa hiivan lopetussekvenssi.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että hii van lopetussekvenssi on PGK-geenin lopetussekvenssi.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että pilkkomiskohta on dipeptidi Lys-Arg, jonka DNA-sekvenssi on AAA tai AAG yhdessä AGA:n tai AGG:n kanssa. io 9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että toimiva fragmentti on integroitu plasmidiin, joka sisältää ainakin yhden replikaation aloituskohdan hiivoissa.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että replikaation aloituskohta on 2p-plasmidin replikaation aloituskohta.
11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että plasmidi sisältää lisäksi selektio-ominaisuuden.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että selektio-ominaisuus johtuu URA3-geenistä.
13. Jonkin patenttivaatimuksen 1 -12 mukainen hiiva, tunnettu 20 siitä, että se kuuluu Saccharomyces-sukuun. : _ 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että se edustaa Matalfa-sukupuolityyppiä.
15. Jonkin patenttivaatimuksen 12-14 mukainen hiiva, tunnettu siitä, että se on S. cerevisiae -kanta.
16. Menetelmä hirudiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että fermentoidaan jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaista hiivaa viljelyalustassa ja otetaan muodostunut hirudiini talteen viljelyalustasta.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 104635 a) viljellään viljelyalustassa hiivakantaa, joka sisältää toimivan DNA-fragmentin plamidissa tai integroituna mainitun hiivan kromosomiin, joka fragmentti käsittää ainakin sekvenssin:
5 -S*—Lex-Sd—H-geeni-ter jossa - S* on DNA-sekvenssi, joka sisältää signaalit, jotka varmistavat H-geenin transkription hiivan toimesta, 10. l_ex on leader-sekvenssi, joka mahdollistaa kypsän hirudiinin erittymisen tai hi-rudiinin erittymisen hirudiiniprekursorina, joka kypsyy in vitro, - Sd on DNA-signaali, joka koodittaa pilkkomiskohtaa, joka on valittu ATG:stä ja Lys-Arg:ia koodatavista sekvensseistä, b) otetaan muodostunut hirudiini talteen viljelyalustasta kypsänä 15 muotona tai hirudiiniprekursorin muodossa, joka kypsyy in vitro. 25 104635
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8506672A FR2593518B1 (fr) | 1985-05-02 | 1985-05-02 | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| FR8506672 | 1985-05-02 | ||
| PCT/FR1986/000153 WO1986006406A1 (fr) | 1985-05-02 | 1986-05-02 | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| FR8600153 | 1986-05-02 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI865303L FI865303L (fi) | 1986-12-23 |
| FI865303A0 FI865303A0 (fi) | 1986-12-23 |
| FI104635B true FI104635B (fi) | 2000-03-15 |
Family
ID=9318888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI865303A FI104635B (fi) | 1985-05-02 | 1986-12-23 | Hirudiinia tuottava transformoitu hiiva ja menetelmä hirudiinin valmistamiseksi sillä |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0200655B1 (fi) |
| JP (2) | JP2580141B2 (fi) |
| KR (1) | KR870700234A (fi) |
| AT (1) | ATE121778T1 (fi) |
| AU (1) | AU600667B2 (fi) |
| BG (1) | BG49717A3 (fi) |
| CA (1) | CA1341501C (fi) |
| CZ (1) | CZ282928B6 (fi) |
| DE (1) | DE3650306T2 (fi) |
| DK (1) | DK174837B1 (fi) |
| ES (1) | ES8703930A1 (fi) |
| FI (1) | FI104635B (fi) |
| FR (2) | FR2593518B1 (fi) |
| HU (1) | HU202919B (fi) |
| IE (1) | IE67136B1 (fi) |
| MC (1) | MC1785A1 (fi) |
| NO (1) | NO302375B1 (fi) |
| PL (1) | PL155074B1 (fi) |
| PT (1) | PT82490B (fi) |
| RU (1) | RU1774950C (fi) |
| WO (1) | WO1986006406A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA863261B (fi) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-01-22 | Ciba Geigy Ag | Thrombin inhibitors |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| FR2607516B2 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-12-22 | Transgene Sa | Vecteurs perfectionnes d'expression d'un variant de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| FR2607517B2 (fr) * | 1986-12-01 | 1989-12-22 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression de variants de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| FR2611723B1 (fr) * | 1987-02-27 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteur d'expression d'adn recombinant codant pour l'hirudine, cultures de cellules de mammiferes infectees ou transformees, procede de preparation de l'hirudine et proteine obtenue |
| WO1988010299A1 (en) * | 1987-06-24 | 1988-12-29 | Novo-Nordisk A/S | A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation |
| US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| DE3819079A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
| EP0387319B1 (en) * | 1988-07-23 | 1996-03-06 | Delta Biotechnology Limited | Secretory leader sequences |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| US5053453A (en) * | 1988-11-01 | 1991-10-01 | Baxter International Inc. | Thromboresistant materials and methods for making same |
| CA2000887A1 (en) * | 1988-11-01 | 1990-05-01 | Cecilia S.L. Ku | Thromboresistant materials and methods for making same |
| FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| DK0592358T3 (da) * | 1992-09-04 | 2001-02-05 | Novartis Ag | Fremgangsmåde til fremstilling af proteaseinhibitorer |
| ZA954983B (en) * | 1994-06-17 | 1996-02-14 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US6500645B1 (en) | 1994-06-17 | 2002-12-31 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| DE19529997C1 (de) | 1995-08-16 | 1997-04-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen |
| DE19543737A1 (de) | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
| DE19544233A1 (de) * | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur Nutzung des Hefe-ADH II-Promotorsystems zur biotechnologischen Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten |
| ZA9610456B (en) * | 1995-12-20 | 1997-06-20 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| DE69624087T2 (de) | 1996-01-31 | 2003-06-05 | Sumitomo Bakelite Co. Ltd., Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von in Epoxyharz eingekapselter Halbleitervorrichtung |
| US6265204B1 (en) | 1997-01-17 | 2001-07-24 | Genencor International, Inc. | DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides for secretion of polypeptides in filamentous fungi |
| US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| DE10149678A1 (de) | 2001-10-09 | 2009-03-12 | Novel Science International Gmbh | Organische Verbindungen mit biologischer Wirkung als Thrombinhemmer und ihre Verwendung |
| DE10301255A1 (de) | 2003-01-15 | 2004-07-29 | Cpi Creative Pharma International Gmbh | Organische Verbindungen mit biologischer Wirkung als Thrombinhemmer und ihre Verwendung |
| US7795205B2 (en) | 2004-04-12 | 2010-09-14 | Canyon Pharmaceuticals, Inc. | Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3382547D1 (de) * | 1983-01-12 | 1992-05-27 | Chiron Corp | Sekretorische expression in eukaryoten. |
| AU572125B2 (en) * | 1983-03-17 | 1988-05-05 | Mabco Limited | Monoclonal antibodies with specificity for crosslinked fibrin and their diagnotic uses |
| WO1984004330A1 (en) * | 1983-04-22 | 1984-11-08 | Amgen | Secretion of exogenous polypeptides from yeast |
| NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
| JPS6041487A (ja) * | 1983-04-25 | 1985-03-05 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用 |
| JPS59227899A (ja) * | 1983-05-25 | 1984-12-21 | チロン・コ−ポレイシヨン | 成長ホルモン放出因子の製造方法 |
| EP0158564B1 (fr) * | 1984-03-27 | 1992-07-15 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformées et procédé de préparation de l'hirudine |
| ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) * | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
-
1985
- 1985-05-02 FR FR8506672A patent/FR2593518B1/fr not_active Expired
-
1986
- 1986-04-30 CA CA000508053A patent/CA1341501C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-30 PT PT82490A patent/PT82490B/pt unknown
- 1986-04-30 ZA ZA863261A patent/ZA863261B/xx unknown
- 1986-05-02 IE IE118386A patent/IE67136B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-05-02 JP JP61502537A patent/JP2580141B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-02 ES ES555121A patent/ES8703930A1/es not_active Expired
- 1986-05-02 WO PCT/FR1986/000153 patent/WO1986006406A1/fr not_active Ceased
- 1986-05-02 EP EP86400961A patent/EP0200655B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-02 HU HU863185A patent/HU202919B/hu unknown
- 1986-05-02 PL PL1986259298A patent/PL155074B1/pl unknown
- 1986-05-02 DE DE3650306T patent/DE3650306T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-02 MC MC86FR8600153D patent/MC1785A1/xx unknown
- 1986-05-02 KR KR860700971A patent/KR870700234A/ko not_active Ceased
- 1986-05-02 AU AU57787/86A patent/AU600667B2/en not_active Expired
- 1986-05-02 AT AT86400961T patent/ATE121778T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-05-04 CZ CS863217A patent/CZ282928B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1986-07-10 FR FR868610090A patent/FR2601383B2/fr not_active Expired
- 1986-12-19 BG BG077615A patent/BG49717A3/xx unknown
- 1986-12-23 FI FI865303A patent/FI104635B/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-12-30 RU SU864028760A patent/RU1774950C/ru active
- 1986-12-30 DK DK198606343A patent/DK174837B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-12-30 NO NO865336A patent/NO302375B1/no not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-03-26 JP JP8070208A patent/JP2779930B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI104635B (fi) | Hirudiinia tuottava transformoitu hiiva ja menetelmä hirudiinin valmistamiseksi sillä | |
| EP0180615B1 (en) | Novel atrial natriuretic/vasodilator polypeptides | |
| US4764504A (en) | Novel atrial natriuretic/vasodilator polypeptides | |
| EP0158564B1 (fr) | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformées et procédé de préparation de l'hirudine | |
| US5212286A (en) | Atrial natriuretic/vasodilator peptide compounds | |
| US5516656A (en) | Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same | |
| IE61526B1 (en) | DNA sequences coding for proteins having the biological activity of HUSI-type I inhibitors, biotechnological methods for the preparation of said proteins and pharmaceutical compositions containing said proteins | |
| IL88925A (en) | Hirudin derivative and pharmaceutical composition containing same | |
| US5705355A (en) | Hirudin, pharmaceutical compositions comprising it and their use | |
| US5498600A (en) | Biologically active mosaic proteins | |
| AU685835B2 (en) | High molecular weight desulphatohirudin | |
| US5821079A (en) | Vectors for the expression and secretion of hirudin by transformed yeasts | |
| JP2696316B2 (ja) | ヒルジンの発現のためのベクター、形質転換細胞及びヒルジンの製造方法 | |
| US5258368A (en) | Atrial natriuretic/vasodilator peptide compounds | |
| HK1006183B (en) | Expression and secretion vectors for hirudine by way of transformed yeasts | |
| CA1340264C (en) | Recombinant dna expression of novel diuretic/vasodilator compounds | |
| CA1340282C (en) | Atrial natriuretic/vasodilator polypeptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| MA | Patent expired |