JPS60501140A

JPS60501140A - 酵母による外因性ポリペプチドの分泌

Info

Publication number: JPS60501140A
Application number: JP59501817A
Authority: JP
Inventors: ビター，グラント　エイ．
Original assignee: アムジエン
Priority date: 1983-04-22
Filing date: 1984-04-18
Publication date: 1985-07-25
Also published as: EP0123294A1; DE3480939D1; EP0123294B1; WO1984004330A1; ATE49233T1; IL71615A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】「酵母による外因性ポリペプチドの分泌Ｊ豆量本発明は一般に、有用なポリペプチド生成物のコードを定める外因性遺伝子の微生物による発現を行い、かつ前述の生成物を微生物の細胞から回収するための、遺伝子組換え方法および材料に関する。

より具体的には１本発明は酵母細胞内における外因性のポリペプチドの形成、およびそのようにして形成された所望のポリペプチド生成物の分泌に関する。

真核性（例えば、哺乳類の）遺伝子生成物を、培養した原核細胞および真核細胞において、大規模に微生物的に製造するための組換えＤＮＡ方法の使用において最近数多くの大きな進展が見られた。

要約すると、これらの進展は一般に、細菌、酵母、およびより高度な真核性の「宿主（ｈｏｓｔ）Ｊ細胞培養に、ポリペプチドのコードを定めるＤＮＡ配列を導入することに関連し、そのコードは通常、例えば特殊な哺乳類の組繊細胞等によって少量生成されるだけの生物学的に活性を持つポリペプチドに見られるアミノ酸配列順序を全であるいは部分的に複製する。前述の導入が目的とするのは、宿主細胞を遺伝的に安定に形質転換して、外因性遺伝子によってコードが定められたポリペプチドが、細胞の蛋白質生成器官によって大量に生成されるようにすることにある。

この分野の研究者にとって、対象の外因性ポリペプチドの宿主細胞内での発現および安定した蓄積だけでなく、ポリペプチド生成物をそのまま宿主細胞の細胞質空間から微生物の細胞質周辺腔、あるいは、望ましくは細胞の外の細胞を取り巻く培地に分泌輸送することを可能とする方法および材料を考案することは２永年の課題であった。

特に、Ｅ、　ｃｏｌｉ　！生物細胞を微生物宿主として用いることに関しては、望みの外因性ポリペプチドを２例えば、β−ラクタマーゼ（β−１ａｃｔａｍａｓｅ）等の内因性酵素物質を含むいわゆる「融合（ｆｕｓｅｄ）Ｊポリペプチドの一部として発現させる試みが知られている。このような酵素は通常はＥ、　ｃｏｌｔ細胞質周辺腔に向かって移動するかあるいは細胞内で処理され、酵素配列を含む融合ポリペプチドはそれから幾分か容易に分離される。Ｔａｌｍａｄｇｅ等のＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、１１．３３６９−３３７３　、（１９８０）を参照されたい。所望の外因性ポリペプチドを精製した形で得るには、細胞外の化学的なあるいは酵素による切断が用いられる。例えば、　ＲｉｇｇｓのＵ、Ｓ、特許番号４，３６６．２４６を参照されたい。

現時点においては、酵母細胞（例えば、と匹血皿粒憇し並皿畦１憇）等の下位の真核宿主細胞による微生物合成手順にすぐに適用出来る類似の方法は見つかっていない。

哺乳類遺伝子生成物、特に小さな調節ポリペプチドが生成される仕方に関しては、かなりの知識が得られている。一般に、　Ｈｅｒｂｅｒｔ等の−Ｃａｌｌ　、　３０．１−２　（１９８２）を参照されたい。−例を挙げると、生合成の研究により、生物学的に活性のあるペプチドよりも１０倍以上の大きさの前駆体蛋白質からある種の調節ペプチドが得られることが明らかになっている。この事実は１分離した活性生成物が細胞から分泌される前に、相当な過程が細胞内で起きねばならないことを示唆している。ペプチドは前駆体から切り出されねばならず１時には分泌の前に活性のある形に化学的に変更される必要がある。前駆体からの切断、グリコジル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）　＋燐酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）等の化学的変更、および分泌は、新たに合成された蛋白質が。

生物学的に活性のある断片の分泌の前に、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓ＋ｗｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）　＋ゴルジ複合体、および小胞体の膜を通過する際に、一般によく定まった順番で起きるものと考えられている。

酵母細胞によって分泌されるポリペプチドの研究によって、少なくとも幾分かは類似した前駆体蛋白質の処理が、酵母細胞細胞質周辺腔へあるいは酵母の細胞壁の外へ分泌する前に起きていることが示唆されている。この問題に関するＳｃｈｅｋｍａｎ等の非常に最近の評論が、「酵母サソカロミケス属１代謝および遺伝子発言の分子生物学（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８２）の３６１〜３９３頁に掲載されている。要約すると、この評論およびそれに参照された文献によると、細胞質周辺腔に、あるいは細胞培地に、あるいは時にはそれらの両方に分泌された１１種の内因性酵母ポリペプチド生成物が明らかにされている。

通常に細胞の成長培地に分泌される酵母ポリペプチドには、２つの酵母フェロモン（ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）　、メイティング・ファクター（剛ａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）αおよび土、フェロモン・ペプチダーゼ（ｐｈ、ｅｒｏｍｏｎｅ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）　、およびｒキラー・トキシン（ｋｉｌｌｅｒ　ｔｏｘｉｎ）　Ｊがある。普通には細胞質周辺腔へのみ輸送される酵母ポリペプチドには、インベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）　、　Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）　＋および抑制性および構成性の酸性フォスファターゼ（ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）がある。細胞質周辺腔および酵母細胞培養培地から分離された酵母生成物の例を挙げると、α−ガラクトシダーゼ（α−ｇＢ１６ｃｔｏｓｉｄａｓｅ）　＋　エフソー１．３−β−グルカナーゼ（ｅｘｏ −１，３−β−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）　＋およびエンド−１，３−β−グルカナーゼ（ｅｎｄｏ−１，３−β−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）がある。細胞壁あるいは細胞外の位置を決定する機構はいまだ解明されていない。

これらポリペプチドのある種のものの分泌に先立つ処理の研究によって、一般に、生成物はまず細胞内において前駆体ポリペプチドの形で発現することが分かっており、前述の前駆体ポリペプチドは。

ｒ信号（ｓｉｇｎａｌ）　Ｊ配列（即ち、小胞体への輸送において役割を持つと考えられる２０〜２２の配列の比較的に疎水性のアミノ酸残基）を含むアミノ結合範囲を有する前駆体ポリペプチド、および少なくとも幾つかの事例においては１分泌される前駆体分子の一部分から通常は蛋白質加水分解によって切断される「プロ（ｐｒｏ）　Ｊあるいは「ブレ（ｐｒｅ）　Ｊ配列を持つ。Ｔｈ１ｌ１等のＭｏ１．　＆　Ｃｅ１ｌ　Ｒ４ｏｔ、　３　、５７０−５７９　（１９８３）を参照されたい。

酵母細胞は、哺乳類細胞系において成される処理とＷｉ４ｍした仕方で、内因性前駆体ポリペプチドを細胞内で処理出来るという知識に基づき、酵母によるヒト・インターフェロン（ｈｕｍａｎ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）の分泌の可能性に関する研究が最近に成された。Ｈｉｔｚｅｍａｎ等、塾旦ｎｃｅ、　２１９．６２０−６２５　（１９８３）を参照されたい。要約すると、酵母５ａｃｃ熊胚ジ１組」肛印力式軸内におけるヒト・インターフェロンの合成のためのコードを定めるＤＮＡ配列を含んだ形質転換ベクター（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ）が作成された。報告によると、ヒトｒ分泌信号（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌｓ）　Ｊのためのコード決定配列を含むインターフェロン遺伝子の発現により、インターフェロン免疫活性を持つポリペプチド断片が酵母細胞培養培地に分泌された。培地のなかに見つかったインターフェロンの活性のレベルは非常に低く２分泌された物質のかなりの割合が誤って処理されていたが、これら研究の成果は、酵母のような低位の真核細胞が、内因性信号配列を扱うのと同じ仕方で、ヒト信号配列を未発達ではあるが細胞内で処理することが出来ることを確証するものであるとされた。

本発明の背景に特に関連があるのは、酵母オリゴペプチド・フェロモン（ｙｅａｓｔ　ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）、すなわちメイテイング・ファクター、一般にメイティング・ファクターα（’ＭＦαＪ）と呼ばれるものの合成および分泌に関する知識の増大である。酵母における交配は、細胞分裂サイクルのＧ１期に反対の種類の細胞の捕獲を起こす２種のオリゴペプチド・フェロモン（メイティング・ファクター）αと土とによって促進されるものと考えられる。α交配型の酵母細胞は、末端トリプトファン残基（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｒｅｓｉｄｕｅ）の有無によって異なるトリデカペプチド（ｔｒｉｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ）とドデカペプチド（ｄｏｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ）の形のＭＦａを生成するが、１型の細胞は、６番目のアミノ酸残基の種類が異なる２種のウンデカペプチド（ｕｎｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ）の形のＭＦａを生成する。

酵母ＭＦα遺伝子の構造は、釦旦、靭、　９３３−９４３　（１９８２）に報告されたＫｕｒｊａｎ等の最近の研究の課題であった。要約すると、酵母ゲノムＤ　Ｎ　Ａ　（ｙｅａｓｔ　ｇｅｎｏ＋＊ｉｃ　ＤＮＡ）の断片が、大きい複写番号プラスミド（ｈｉｇｈ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄ）ベクター（ＹＥｐ　１３）に挿入された。ベクターは、ＭＦａを分泌しなかった突然変異体（ｍｕ　ｔａｎ　ｔ）　ｍａｔα２，１ｅｕ２酵母細胞を形質転換するために用いられ、ＭＦα分泌活動が「回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）　Ｊ　Ｌ／ていないか培養培地が調べられた。１．７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片をもっと小さな１つ以上のゲノムＥｃｏＲＩ断片とともに含むこれらのプラスミドは、ＭＦα分泌機能を回復することが出来た。１．７　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片の部分の配列を調べた結果。

クローニングされた断片は、全部で１６５個のアミノ酸の長さがある推定上の前駆体ポリペプチド内の、４つの互いに間隔をおいたＭＦａのコピーのコードを決定するＤＮＡ配列を含むことが分かった。

）［ｕｒｊａｎ等によって記述された推定上の前駆体のアミノ末端領域は。

分泌の信号配列として作用すると思われる約２２個のアミノ酸の疎水性の配列で始まる。それに続く約６０個のアミノ酸の断片は、３つの潜在的なグリコジル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｙｉｏｎ）の部位を含む。前駆体のカルボキシル末端領域は、成熟アルファ・ファクター（ｍａｔｕｒｅ　ａｌｐｈａｆａｃｔｏｒ）の４つの縦に連なったコピーを含み、それぞれは６個あるいは８個のアミノ酸の「スペーサ（ｓｐａｃｅｒ）　Ｊペプチドが前についており、それらは蛋白質加水分解処理信号（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｓｉｇｎａｌ）を含んでいるものと考えられている。

発表されたＭＦα遺伝子の約８３０個の塩基対配列内の推定蛋白質コード決定領域は下記の通りである。

蚤１表１　１０　２０　３０　４０ＡＴＧ　ＡＧＡ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＧＴＴ　ＴＴＡ　ＴＴＣＧＣＡ　ＧＣ八へｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌａ１０５０　６０　７０　８０ＴＣＣＴＣＣＧＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＴＣＡＡＣＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＴＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｈａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ０９０　１００　１１０　１２０ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　ＡＴＴ　ＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＧＴＣＡＴＣＧＧＴ　ＴＡＣＴＣＡＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　５ｅｒ３０　４０１３０’　１４０　１５０　１６０ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＴＴＣＧＡＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＴＴＴ　ＴＣＣＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ０１７０　１８０　１９０　２００　２１０ＡＡＣＡＧｃ　ＡＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＣＧＧＧ　ＴＴＡ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＴＴＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅ６０　７０２２０　２３０　２４０　２５０ＧＣＣＡＧＣＡＴＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＧＴＡ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ０２６０　２７０　２８０　２９０、　Ｈｉｎｄｌｌｌ。

ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　Ｇ−ＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＣＡＴ　ＴＧＧ　ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧＣＡｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｈ４ｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ０３００　３１０　３２０ＨｉｎｄＩ１１ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＡＴＧ　ＴＡＣＡＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＧＣＣＧＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＣＡＴＧｌｎ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｈ４５１０２１１１３４０３５０３６０３７０ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＣＣＡＡ　ＣＣＡ　ＡＴＧ　ＴＡＣＡＡＡ　ＡＧＡ　ＧＡＡＴｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ２３３８０　、４００　４１０　４２０Ｈｉｎｄｌｌ＋ｃｃｃ　［、ＡＣＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＣＡＴ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＣＡｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｈ４ｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ３２４３０　４４０　４５０　４６０、旧ｎｄｌＩＩ　。

ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＡＴＧ　ＴＡＣＡＡＡ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＧＣＣＧＡＣＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＣＡＴＧｌｎ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ１４４　１５３４７０　４８０　４９０ＴＧＧ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　ＴＴＡ　Ａ−ＡＡ　ＣＣＣＧＧＣＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＴＧ　ＴＡＣＴＡＡＴｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　５ｔｏｐ６５前述したように、　Ｋｕｒｊａｎ等、　■（ｓｕｐｒａ）に記載されたＭＦα遺伝子は、１．７キロベース（ｋｉｌｏｂａｓｅ）　ｔ！ｃｏＲＩ酵母ゲノム断片に含まれている。遺伝子生成物の生成は、エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩによる切断によって不活され、　Ｈｉｎｄｌ［［による切断によって、一般に下記のコード決定領域を含む小さな断片が生じたことが指摘された。前述のコード決定領域は、αファクター１　（アミノ酸９Ｏ −１０２）、スペーサ２；αファクター２（アミノ酸１１１−１２３）　、スペーサ３；αファクター３　（アミノ酸１３２−１４４）　、スペーサ４；スペーサ１およびαファクター４　（アミノ酸１５３−１６５）は大きな断片に止まった。

このように、カルボキシル末端コード決定領域内の各ＭＦαコード決定領域は、前に６個か８個のコドン（ｃｏｄｏｎ）　’スペーサ（ｓｐａｃｅｒ）Ｊコード決定領域を持つ。コードを決定された第１のスペーサは７−ＮＨ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＣＯＯ−の配列を持ち、第２のスペーサは、−Ｎｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−八１ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｃｏｏの配列を持つ。コード化された第３および第４のスペーサは、同じ配列のアミノ酸残基、即ち、　−ＮＨ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ −Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＣＯＯ−を持つ。

ＭＦαの分泌に到るＭＦα前駆体ポリペプチドの処理のモードに関するＫｕｒｊａｎ等の提案の１つは、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）内での処理のために、前駆体のアミノ末端領域にあると推定される２２個の疎水性アミノ酸「信号（ｓｉｇｎａｌ）　Ｊ配列（アミノ酸１−２２）によえた配列の運命は、前駆体の残り部分からの蛋白質加水分解切断であった。下記の約６０個のアミノ酸（残基２３−８３）の「プロ（ｐｒｏ）Ｊ配列は、その後の処理のための前駆体のそれに続く標的として働き。

「信号（ｓｉｇｎａｌ）　Ｊと同様な運命をたどるものと提案された。最後に。

ＭＦαの複数のコピーは最初にトリプシン様（ｔｒｉｐｓｉｎ−１ｉｋｅ）の酵素切断によって各ｒスベ・−サ（ｓｐａｃｅｒ）　Ｊの始めのリジン（ｌｙｓｉ ’ｎｅ）とアルキニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）残基との間で分離されること、第４のＭＦαコピーを除く全てのカルボキシル末端の残りのリジンは酵母力ルポキジベプチターゼ（ｙｅａｓｔ　ｃａｒｂｏ×ｙ　ｐ、ｅｐｔｉｄａｓｅ）によって消化切断されること、およびジアミノペプチターゼ酵素（ｄｉａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ｅｎｚｙ＋ｎｅｓ）は蛋白質加水分解によって残りの「スペーサ（ｓｐａｃｅｒ）　Ｊ残基を、４つのＭＦαコピーの少なくとも１つのアミノ末端から消去することが提案された。

Ｋｕｒｊａｎ等の研究は、酵母におけるＭＦαの合成および分泌に関する多くの貴重な情報および多くの貴重な提案をもたらすのに役立つものではあったが、特にＭＦαの分泌に関連するもの以外のシステムにこの情報を適用するのに必要な多くの問題は解明されないままになっている。そのような問題には、上記の１．７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ酵母ゲノム断片が、ＭＦαの合成を制御することが出来る自足的な配列をもっているかどうか（即ち、それが前駆体の合成のための全内因性プロモータ／レギュレータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）を含んでいるが、あるいは、その他のＤＮＡ配列を必要とするが）の問題が含まれる。

その他の未回答の問題には、ＤＮＡｒ反復（ｒｅｐｅａｔｓ）　Ｊの存在がＭＦ αの発現に必要かどうか、ＭＦαポリペプチドの特定のサイズが。

分泌処理現象に決定的な要因であるかどうが、および前駆体ポリペプチド内のすべての潜在的なＭＦαのコピーが、実際に酵母細胞によって分泌されるかどうかの各問題が含まれる。

Ｊｕｌｉｕｓ等の最近の論文、と旦、　３２．８３９−８５２　（１９８３）は、ある種の膜に囲まれた。熱に対して安定したジペプチジール・ジアミノペプチダーゼ酵素（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ　ｄｉａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ）（’５ｔｅ１３」遺伝子によってコードが決定されるもの）を生成する能力が欠けている突然変異体酵母菌株（ｍｕｔａｎｔ　ｙｅａｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ）は＋　Ｋｕｒｊａｎ等が述べた「スペーサ（ｓｐａｃｅｒ）　Ｊ配列を複製する追加のアミノ末端残基を持つ不完全に処理された形のＭＦαを分泌することを指摘して。

Ｋｕｒｊａｎ等のＭＦα前駆前駆体板部分的に検証する役割を果たしている。この突然変異体が正しくＭＦαを処理する能力は、　５ｔｅ１３遺伝子の非突然変異体形のプラスミド担体（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）コピーによる細胞の形質転換によって回復することが実証された。

当技術の上記の説明から、当技術において、精製した形で生成物を分離するのに役立つ生成物のある程度の細胞内での分泌処理を伴う外因性ポリペプチド生成物の微生物による発現を可能とする方法および材料が必要であることは明白であろう。酵母が分泌するポリペプチドの合成および処理に関する種々の程度の知識にもかかわらず、また外因性の前駆体ポリペプチドの形での外因性遺伝子生成物の酵母分泌処理に関連する手順の幾分かの予備的成功にもかかわらず、当技術に対しては、外因性遺伝子生成物を合成し、かつ内因性前駆体ペプチドを適切に処理する酵母細胞の能力を活かして、形質転換した酵母細胞によって外因性遺伝子生成物が分泌されるのを可能とする手順はこ耗までもたらされてはいない。

翌旌本発明の１態様によると、一部分に９選択された外因性ポリペプチド・アミノ酸配列、および別の部分に、ある種の内因性酵母ポリペプチド・アミノ酸配列を含む新規のハイブリッド・ポリペプチド（ｈｙｂｒｉｄ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）の酵母細胞による合成のためのコードを定めるＤＮＡ配列がもたらされる。

より具体的にいうと１本発明のＤＮＡ配列によってコードを定められるハイブリッド・ポリペプチドは、それらのカルボキシル末端領域に、その中でハイブリッドが合成される酵母細胞によって分泌される外因性ポリペプチドを含む。

さらに、ハイブリッド・ポリペプチドのアミノ末端領域の一部分は。

酵母が分泌するポリペプチドの内因性ポリペプチド前駆体のアミン末端領域の「信号（ｓｉｇｎａｌ）　Ｊあるいは「プロ（ｐｒｏ）　Ｊあるいは「プレ（ρｒｅ）　Ｊ配列を複製するアミノ酸配列を含む（これらの配列は通常は、ポリペプチドが細胞質周辺腔へあるいは酵母細胞培養培地に分泌される前に、内因性前駆体から蛋白質加水分解によって切断される）。

本発明の別の態様によると１本発明のＤＮＡ配列によってコード解によって切断されるもの）を含むことが出来る。

本発明のハイブリッド・ポリペプチド内に複製された内因性酵母ＤＮＡ配列は５種々の酵母分泌ポリペプチド（ｙｅａｓｔ−ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）のポリペプチド前駆体（ｐｏｌｙｐｅｐｄｉｄｅｓ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）に存在するもの９例えば、メイティング・ファクター（ｍａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）α、メイティング・ファクターｌ、キラー・トキシン（ｋｉｌｌｅｒ　ｔｏｘｉｎ）、インベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）　＋抑制性酸性フォスターゼ（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ　ａｃｉｄｓ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）　、構成性酸性フォスターゼ（ｃｏｎｓ　ｔ　ｉ　ｔｕ　ｔｉｖｅ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）　、α−ガラクトシダーゼ（ｔｘ　−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ　−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）　、エフソー１゜３−β−グルカナーゼ（ｅｘｏ−１，３−β−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）　、エンド−１゜３−β−グルカナーゼ（ｅｎｄｏ　−１、３−β−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）　、およびフェロモン・ペプチダーゼ＜ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）の配列であってもよい。現時点で望ましい形においては１本発明のＤＮＡ配列は、酵母が分泌するＭＦαのポリペプチド前駆体に見、られる１つ以上のアミノ酸配列を複製する内因性ポリペプチドを含むハイブリッド・ポリペプチドのコードを定める。このように、複製された配列は２ＭＦα前駆体「信号（ｓｉｇｎａｌ）　ｉ配列の一部分あるいは全て、ＭＦα「プロ（ｐｒｏ）　Ｊ配列の一部分あるいは全て、お−よび／あるいはＫｕｒｊａｎ等、１ＩＩｕ（ｓｕｐｒａ）が述べた種々のＭＦα’スペーサ（ｓｐａｃｅｒ）　Ｊ配列の１つ以上の配列の一部分あるいは全てを含んでもよい。

本発明によるハイブリッド・ポリペプチドの外因性ポリペプチド構成要素は、どんな長さでもアミノ酸配列でもよいが、但し、酵母が分泌するポリペプチドの前駆体ポリペプチドの蛋白質加水分解切断の通常の構成部位となるアミノ酸配列は避けることが望ましい場合があろう。本発明の例示的かつ現時点で望ましい実施例においては、構成された新規のＤＮＡ配列例は、そのカルボキシル末端領域にヒトβ−エンドルフィン・ポリペプチド（ｈｕｍａｎ　β−ｅｎｄｒｏｐｈｉｎ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を含むハイブリッド・ポリペプチドのコードを定める。

本発明のさらに別の態様によると、上記の新規なりＮＡ配列を取り込んだＤＮＡ形質形質転換ダクターＮＡ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ）が構成される。これらのベクターは安定的にかつ遺伝的に酵母細胞を形質転換するのに用いられ、前述の酵母細胞は望みのハイブリッド・ポリペプチドの発現を促進する条件のもとで培養される。所望のハイブリッドは、細胞内で処理され、その結果、望みの外因性ポリペプチド生成物が酵母細胞の細胞質周辺腔の中へおよび／あるいは酵母細胞壁の外の酵母細胞培養培地に分泌される。本発明のベクターにおいては、新規のＤＮＡ配列の発現は、適切なプロモータ／レギュレータ（ｐｒｏｍｏｔｏｒ　／ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列によって調節することができる。

本発明の例示的なりＮＡ形形質転換ツクター、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、　Ｒｏｃｋｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに契約に基づいて、それぞれＡＴＣＣ番号４００６８および４００６９として寄託されているプラスミドｐＹαＥおよびｐＹｃαＥを含む。これらのプラスミドはいずれも、酵母細胞によるＭＦαのゲノム発現（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に関連する配列を複製するプロモータ／レギュレータ配列の制御のもとにあるハイブリッド・ポリペプチド・コード決定領域を含む。プラスミドｐＹαＥ（ＡＴＣＣ番号４００６Ｂ）は１本発明に従い、適切な一違駈劇巳び１Ｌ逓王狙ｒｅｖｉｓｉａｅｌｆｌ！胞系（例えば、　ＧＭ３Ｃ−２等の全てのα＋　１ｅｕ２　菌株）を形質転換するのに用いることが出来８そのようにして形質転換された細胞を培養すると、細胞の培地にヒトβ−エンドルフィン（ｈｕｍａｎβ−ｅｎｄｒｏｐｈｉｎ）の１つ以上の生物学的な活性（例えば免疫活性）を持つポリペプチド生成物が蓄積する。

本発明のその他の態様および利点は、下記のその望ましい実施例の詳細な説明を考察すれば明らかになるものと思われる。

１里次幾更本発明によってもたらされる新規の生成物およびプロセスを下記の諸例において例示するが、これらの例はヒトβ−エンドルフィン（ｈｕｍａｎβ−ｅｎｄｒｏｐｈｉｎ）の１つ以上の生物学的活性を持つポリペプチド物質の酵母細胞による合成および分泌を実現する操作に関連する。より具体的には、第１例から第７例までは、（１）ＭＦαＦα遺伝子をＤＮＡ断片として、酵母ゲノム・ライブラリー（ｙｅａｓｔ　ｇｅｎｏｎ＋ｉｃ　１ｉｂｒａｒｙ）から分離すること、およびクローニングされた断片の部分的な配列確定、（２）ヒトβ−エンドルフィンのコードを定めるＤＮＡ配列の構成、（３）β−エンドルフィン・コード決定ＤＮＡ配列のＭＦαＦα遺伝子への結合、（４）その結果生じたＤＮＡ配列の形質転換へフタ−への挿入、（５）その結果生じたベクターを用いての酵母細胞の形質転換、（６）形質転換された細胞によって培地に分泌されたポリペプチド生成物の分離および特性把握、および（７）代替形質転換ベクターの構成にそれぞれ関連する。

ｌ区立り、内ノｊμｍ虹Ｐ閃透しμｍ虹卦力狙ゲノム・ライブラ！Ｊ　−（ｇｅｎｏｍｉｃ　１ｉｂｒａｒｙ）を合成オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション−プローブ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｂｅ）を用いて選別し１プローブに相補性があるプラスミドがクローン化された。このクローン化されたプラスミドから、プローブに相補性がある２、ｊ　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片がｐＢＲ３２２内でサブクローン化された。使用されたオリゴヌクレオチド・プローブは＋　ｋｕｒｊａｎ等＋　血度（ｓｕｐｒａ）の第５図に示された意味のある鎖ＤＮＡ配列の、後に名付られた４７４から４９８までの塩基の配列を複製する。分離された断片の約５００個の塩基対がまずマクサム−ギルバー）　（Ｍａｘａ＋ｍ−Ｇ１１ｂｅｒｔ）およびジデオキシ鎖末端技法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって配列を決められたが、基本的にｋｕｒｊａｎ等、　ＭＭＬ（ｓｕｐｒａ）が示したＭＦα構造遺伝子の蛋白質コード決定領域の配列に等しいことが分かった。２．１ｋｂ断片はＸｂａ　Ｉによって消化された。得られたより大きな消化断片は、　ＢａｍＨＩ　’リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）　Ｊ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列に結合され、　ＢａｍＨＩによって切断されたＥ、ｃｏｌｉ細菌プラスミド（ｐＢＲＡＨ，即ち、Ｈｉｎｄｌ１１部位を抹消して変更したｐＢＲ３２２）に挿入された。その結果生じたｐαＦｃと名付られたプラスミドは。

増幅された。

第１炭ヒト（Ｌｅｕ　’　）β−エンドルフィン・ポリペプチドのコードを定めるＤＮＡ配列が、　１９８２年５月６日に出願された同時係属出願合衆国特許出願番号３７５，４９３の手順に従って合成かつ構成された。構成された具体的な配列は下の第■表に示す。コード決定領域の外の末端塩基対配列は、以下に述べるようにＭＦα構造遺伝子への挿入を容品にするために付けられた。

隼ｌ巌Ｈ４ｎｄｌｌｌＴｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ＴｈｒＡＧＣＴ　ＴＡＣＧＧＴ　ＧＧＴ　ＴＴＣＴＴＧ　ＡＣＣＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＡＣＴＡＴＧ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＡＡＣＴＧＧ　ＡＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＣＡにＡ　ＧＴＴ　ＴＧＡＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｉｅ　ｌｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＡｌａＣＣＡ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＴＴＧ　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＡＣＧＣＴ　ＡＴＣＡＴＩＣＡＡＧ　ＡＡＣＧＣＴＧＧＴ　ＡＡＣＣＡＡ　ＴＧＡ　ＡＡＣＡＡＧ　ＴＴＣＴＴＧ　ＣＧＡ　ＴＡＧ　ＴＡＧ　ＴＴＣＴＴＧ　ＣＧＡＴｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｅｒ　ＴｅｒＴＡＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＡＡ　ＴＡＡ　ＧＣＴＴＧＡＴＧ　ＴＴＣＴＴＣＣＣＡ　ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＣＧＡＡＣＣＴＡＧＨｉｎｄｌｌ　ＢａｍＨＩ構成された配列は、旧ｎｄｌｌ［およびＢ　ａ　ｍ　Ｈ４によって切断されたＲｆＭ１３ｏ＋ｐ９にクローニングされ、配列は確認された。その結果得られたＲｆ　Ｈ１３ＤＮＡは、Ｍ１３／βＥｎｄ７−９と名付けられ、精製された。

芽じ１舛プラスミドｐαＦｃはＨ３ｎｄｌ［［によって消化され、４つのＭＦαコード決定領域のうちの３つが除去された。第１表のＭＦα構造遺伝子の蛋白質のコードを定める領域の配列から分かるように、このようなエンドヌクレアーゼ処理（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の後には、Ｈ３ｎｄｎＩ付着端１つが第１の「スペーサノアミノ酸配列（Ａｌａｓ９）の末端部に、そしてＨｉｎｄｎｌ付着端１つが最後のＭＦα配列（Ｔｒｐ”３）の直前に残った。

Ｍ１３／βＥｎｄ−９は＋　（Ｌｅｕ’）β−エンドルフィン遺伝子を含むが、同様にＨｉｎｄｌｌ［によって消化され、得られた１０７個の塩基対断片は精製されて＋　Ｈ１ｎ　ｄ　Ｉ［［で切断したｐαＦｃに結合されて、プラスミドｐｃｘＥを生みだした。このようにして生みだされたＤＮＡ配列は、新規のハイブリッド・ポリペプチドの合成のコードを定めることが分かる。新規のハイブリッド・ポリペプチドにおいては、カルボキシル末端位に、外因性ポリペプチド、即ち、（Ｌｅｕ’〕β−エンドルフィンが含まれている。新規のハイブリッド・ポリペプチド内には１選択された酵母分泌ポリペプチド（即ち、ＭＦα）の内因性ポリペプチド前駆体のアミノ酸末端領域に存在し、かつ分泌に先立って前駆体の酵母分泌ポリペプチド部分から通常は蛋白質加水分解によって切断される１つ以上の配列の複製であるアミノ酸残基の配列が含まれる。

ここで１本発明によって得られる代替構成において、縦方向に連なったβ−エンドルフィン遺伝子あるいはその他の選択された遺伝子を構成して、）（ｉｎｄｌｌで切断したｐαＦｃに挿入することが出来ることにお気づきであろう。そのような縦方向に連なる遺伝子の構成においては、第１のβ−エンドルフィンコード決定配列の末端コドンは抹消され、第１のコード決定配列は第２の配列から１例えば３代替ＭＦαｒスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）　Ｊポリペプチド型の１つの一部分あるいは全部のコードを定めるＤＮＡ配列によって分離されるであろう。Ｈｉｎｄｌｌ［制限部位が残らないように、スペーサを第２のβ−エンドルフィン配列に接合する領域に代替コドンを用いることが望ましいであろう。その結果、　Ｈｉｎｄｌｌｌ制限部位はのこらないであろう。上記のように挿入すると、新規のＤＮＡ配列は１つのハイブリッド・ポリペプチドのコードを定め、このハイブリッド・ポリペプチドはさらに、そのカルボキシル末端領域に、即ち、２つのβ −エンドルフィン類似ポリペプチドの間に１通常は蛋白質加水分解によって切断される内因性の酵母ハイブリッドを含む。同様に。

選択された外因性遺伝子の複数の反復を９種々のスペーサのいずれかの一部分あるいは全部によって別々に組み込むことが出来る。

黒土勇プラスミドｐＬｘＥはＢａｍ１（Ｉによって消化され、得られた小さな断片は、高コピー数の酵母／ｆ！、ｃｏｌｉシャトル・ベクター（ｓｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒ）ｐＧＴ４１　（ＢａｍＨＩによって切断されたもの）に結合されて、プラスミドｐＹαＢ　（ＡＴＣＣ番号４００６８）を形成し、この形成されたプラスミドはＥ、ｃｏ旦内で増幅された。

第１拠プラスミドｐＹαＥを用いて＋　Ｌｅｕ２”表現型が被形質転移体の選択を可能とする適切な知胚加嬰遍匹竺」ｙμｍ牡耗（ＧＭ３Ｃ−２）のα。

Ｌｅｕ２−菌株が形質転換された。形質転換された細胞は３０℃において。

アミノ酸を含まない０．６７酵母窒素ベース（Ｉｌｉｆｃｏ）、２％グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）＋　１％ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）および１％トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）の中で培養された。さらに、β−エンドルフィン遺伝子が反対向きであることを除いては、ｐＹαＥと同じのプラスミドを用いて形質転換された菌株ＧＭ３Ｃ−２が、対照として同一条件において培養された。

隼工勇形質転換された細胞および対照細胞の培養が集められ、遠心分離機に掛けられ、上澄はヒトβ−エンドルフィン〔ニュー・イングランド・ヌークリヤー・カタログ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃａｔａｌｏｇ）番号ＮＥＫ− ００３）の競合的ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によりβ−エンドルフィン活性が存在するがどうかを試験された。対照培地には活性は全く検出されなかったが、　０．０．リットル当たり２゜Ｏマイクログラムの生成物の程度の相当なβ−エンドルフィン活性が、形質転換された細胞の培養の培地に見つかった。

濃縮した活性培地を肝ＬＣ分析した結果、３つの主なＲＩＡ活性ピークが明らかになった。もっとも顕著なピークは、全β−エンドルフィン活性の約１７３を表すものである。このピークを分離しアミノ酸配列を調べた結果、ヒトβ−エンドルフィンの最後の１２個のアミノ酸残基の配列を複製するポリペプチドの基本的に純粋な試料であることが分かった。１２個のアミノ酸の生成物が、形質転換された細胞による細胞内での蛋白質加水分解処理によるものであるのか、あるいは培養培地を取り扱った際に起きた細胞外の蛋白質加水分解切断によって生みだされた人工物質であるのかを決定する実験手順が現在進行中である。後者によるものであることが分かれば、今後の分離処理においては培地にプロテアーゼ・インヒビター（ｐｒｏｔｅａｓｅ　１ｎｈｉｂｊｔｏｒ）を培地に加えることになる。

隼工桝形質転換された細胞による酵母合成β−エンドルフィン！（Ｕ体の分泌プロセスが生成されたハイブリッド・ポリペプチドの量を減らすことによって促進されるか否かを確認するために、ｐαＥからＢａｍＨＩ断片を挿入して単複写プラスミドｐＹＣαＥ　（ＡＴＣＣ番号４００６９）が作成された。このベクターによって形質転換された酵母の細胞培地の分析が現在行われている。

今後の実験的研究において、入手可能な分泌プロセス酵素の潜在的な分泌率限定効果を確認する予定である。そのような手順の１つとして５本発明のベクターを用いて形質転換された酵母細胞を形質転換して＋　Ｊｕｌｉｕｓ等、　ＭＪ！１Ｌ（ｓｕｐｒａ）が述べた３ｔｅ１３遺伝子を組み込み、ＭＦα分泌プロセスに関連があると考えられる熱安定性のジペプチジール・アミノペプチダーゼ（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ　ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）の超過生成を行わせるようにする。

これまで述べた諸実例はＭ、Ｆαのポリペプチド前駆体内に存在するｒ信号（ｓｉｇｎａｌ）　Ｊおよび「プロ（ｐｒｏ）　Ｊおよび「スペーサ（ｓｐａｃｅｒ）ｓポリペプチド配列のコードを定めるＤＮＡ配列の構成に関するものであるが、前述の配列の１つあるいは２つだけのコードが定められた場合、あるいは前述の配列の一部分だけ（例えば、スペーサのＬｙｓ−Ａｒｇ部分のみ）のコードが定められた場合に有益な結果が得られるものと考えられる。同様に、外因性ポリペプチド生成物の分泌的発現に選択された酵母菌株はα表現型であったが、必須の分泌およびプロセス活性は土細胞においても見られるので、１表現型が宿主として不適当であるとは必ずしもいえない。最後に、上述した諸実例における新規のＤＮＡ配列の発現は、クローニングされたゲノムのＭＦα指定ＤＮＡのコピー内の内因性のＭＦαプロモータ／レギュレータによって制御されるが、その他の酵母プロモータＤＮＡ配列を適切に用いることも出来ると考えられる。適切なプロモータの例には、酵母ＰＧＫおよびＡ’ＤＨ−１プロモータあるいは１９８２年８月３日に出願した本出願者の同時係属合衆国特許出願番号４１２゜７０７のＣ，３ＰＤＨプロモータがある。

上記の諸例は、酵母細胞培養培地への内因性ＭＦαの分泌に関与するＤ’ＮＡ配列に関わる構成に特に関連するが、達成された成果は。

その他の酵母分泌ポリペプチド（上記のように）に関連するＤＮＡ配列を使用すれば、成功する見込みが大きいことを示していることがお分かりであろう。この点に関して、外因性ポリペブチの酵母細胞培養培地および酵母培養培地への細胞内分泌プロセスは、ポリペプチドの分離に相当な利益があるものと思われる。

上記の実例によって示された本発明の様々な改良あるいは変更を当業者は思゛いつかれることと考えられるので９本発明は添付した請求の範囲のみによって限定されるものである。

図面の簡単な説明

Claims

【特許請求の範囲】

１．　ハイブリッド・ポリペプチドの酵母細胞による合成のためのコードを定めるＤＮＡ配列で。前述のハイブリッド・ポリペプチドのカルボキシル末端領域の一部分が、その中でハイブリッド・ポリペプチドが合成される酵母細胞によって分泌される外因性ポリペプチドから成り。前述のハイブリッド・ポリペプチドのアミノ末端領域の一部分は内因性酵母ポリペプチドを含み、前述の内因性酵素ポリペプチドは、（１）選択された酵母分泌ポリペプチドの内因性ポリペプチド前駆体のアミノ末端領域内に存在する。かつ
（２）通常は分泌に先立って内因性ポリペプチド前駆体の酵母分泌ポリペプチド部分から蛋白質加水分解によって切断される１つ以上の配列の複製であるアミノ酸残基の配列を含むことを特徴とするもの。２、請求の範囲第１項のＤＮＡ配列で、前述のコードを定められたハイブリッド・ポリペプチドのアミノ末端領域の一部分を成す内因性酵母ポリペプチドが。メイティング・ファクターα、メイティング・ファクター見。フェロモン・ペプチダーゼ、キラー・トキシン、インベルターゼ抑制性酸性フォスファターゼ、構成性酸性フォスファターゼ、α−ガラクトシダーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、エフソー１．３−β−グルカナーゼ、およびエンド−１，３−β −グルカナーゼから成るグループから選択された酵母分泌ポリペプチドのポリペプチド前駆体のアミノ末端領域に存在す′る１つ以上の配列の複製であるアミノ酸残基の配列を含むもの。３、請求の範囲第２項のＤＮＡ配列で、前述のコードを定められたハイブリッド・ポリペプチドのアミノ末端領域の一部分を成す内因性酵母ポリペプチドが、酵母メイティング・ファクターαのポリペプチド前駆体のアミノ末端領域に存在する１つ以上の配列の複製であるアミノ酸残基の配列を含むもの。４、請求の範囲第３項のＤＮＡ配列で、複製されたアミノ酸配列が。ＮＨＩ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ− ＾１ａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−＾１ａ−＾１ａ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ａｌａ− Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｏｏ−であるもの・５、請求の範囲第３項のＤＮＡ配列で、前述のハイブリッド・ポリペプチド内の複製されたアミノ酸配列が。 −ＮＨ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｕ−Ａｓｐ−Ｇ　１　ｕ−Ｔｈｒ−Ａ　１　ａ　−Ｇ　ｌｎ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａ　ｌａ　−Ｇｌｕ−Ａｌａ −Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ −Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−＾１ａ−Ｖａｌ−’Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ａｌａ−３ｅｒ−１１ｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＣＯＯ−であるもの。６、請求の範囲第３項のＤＮＡ配列で、前述のハイブリッド・ポリペプチド内の複製されたアミノ酸配列が。 −ＮＨ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−＾１ａ−ＣＯＯ−或いは− ＮＨ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｇｌｕ−＾１ａ−ＣＯＯ−或いは−ＮＨ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−＾ｓｐ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＣＯＯ−から成る一群から選択されるもの。７、請求の範囲第３項のＤＮＡ配列で、前述のハイブリッド・ポリペプチド内の複製されたアミノ酸配列が。１　１ＯＮＨ２−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ− Ａ　１　ａ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａ　Ｉａ−０Ａ　１ａ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ａｌ　ａ−Ｐｒ６− Ｖａ　１−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌｕ−０４０Ａｓｐ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｔｈｒ−Ａ　１　ａ−Ｇｌ　ｎ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ　−Ａ　１ａ−Ｖａｌ　−１１ｅ−Ｇ　１ｙ−Ｔｙｒ−０Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ　−Ａ　１ａ−Ｖａ　Ｉ　−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ａｓｎ− ５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉ　ｌｅ−＾ｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＣＯＯ−であるもの。請求の範囲第１項のＤＮＡ配列で、前述のコードを定められたハイブリッド・ポリペプチドのカルボキシル末端領域の一部分が内因性ポリペプチドをも含み、前述の内因性ポリペプチドは、（１）酵母分泌ポリペプチドの内因性ポリペプチド前駆体のカルボキシル末端領域内に存在する。かつ（２）通常は分泌に先立ってポリペプチド前駆体の酵母分泌部分から蛋白質加水分解によって切断される１つ以上の配列の複製であるアミノ酸残基の配列を含むことを特徴とするもの。請求の範囲第８項のり、ＮＡ配列で、前述のコードを定められたハイブリッド・ポリペプチドのカルボキシル末端領域の一部分を成す内因性酵母ポリペプチドが、酵母メイテイング・ファクターαのポリペプチド前駆体のカルボキシル末端領域に存在する１つ以上の配列の複製であるアミノ酸残基の配列を含むもの。請求の範囲第９項のＤＮＡ配列で、前述のノ祠ブリ・ノド・ポリペプチド内の複製されたアミン酸配列が。 −ＮＨ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−へＩａ−ＧＬｕ−＾１ａ−Ｇｌｕ−八１ａ− ＣＯＯ−および−ＮＨ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＣＯＯ−から成る一群から選択されるもの。請求の範囲第１項のＤＮＡ配列で、コードを定められたノ＼イブリッド・ポリペプチドのカルボキシル末端領域内の外因性ポリペプチドが哺乳類ポリペプチドであるもの。請求の範囲第１１項のＤＮＡ配列で、′＠乳類ポリペプチドがヒトβ−エンドルフィンであるもの。請求の範囲第１項のＤＮＡ配列を持つ酵母細胞形質転換ベクタ請求の範囲第１３項の酵母細胞形質転換ベクターで、前述のＤＮＡ配列の発現が１選択された前駆体ポリペプチドの内因性の発現を調節するプロモータ／レギュレータＤＮＡ配列の複製によって調節されるもの。請求の範囲第１３項の酵母細胞形質転換ベクターがプラスミドｐＹαＥ、　ＡＴＣＣ番号４００６８であるもの。請求の範囲第１３項の酵母細胞形質転換ベクターがプラスミドｐＹｃＣｔＥ、＾ＴＣＣ番号４００６９であるもの。酵母細胞内で選択された外因性ポリペプチドを生成する方法で。酵母細胞を請求の範囲第１３項のＤＮＡベクターで形質転換すること。酵母細胞の成長および増殖、前述のベクターを成すＤＮＡ配列の複写および転写、および前述の選択された外因性ポリペプチドを酵母細胞細胞質周辺腔および／あるいは酵母細胞培養培地に分泌するための細胞内処理を促進する条件において前述の形質転換された酵母細胞を培養すること、および選択された外因性ポリペプチドを酵母細胞細胞質周辺腔および／あるいは酵母細胞培養培地から分離することから成るもの。酵母細胞内でヒトβ−エンドルフィンの生物学的活性の１つ以上を示すポリペプチドを生成することを可能とする方法で。酵母細胞を請求の範囲第１５項あるいは第１６項のＤＮＡベクターで酵母細胞を形質転換すること。酵母細胞の成長および増殖、前述のベクター内でのハイブリッド＋（Ｌｅｕ５）　β−エンドルフィンをふ（むポリペプチドのコードを定める前述のＤＮＡ配列の転写および複写、およびβ−エンドルフィンの生物学的活性の１つ以上を示すポリペプチドを酵母細胞培養培地に分泌するために細胞内処理を促進する条件において前述の形質転換された酵母細胞を培養すること、および所望のポリペプチドを酵母細胞培養培地から分離することから成るもの。