JPH06503957A

JPH06503957A - 合成リーダー配列の構成方法

Info

Publication number: JPH06503957A
Application number: JP4502056A
Authority: JP
Inventors: クリスティアンセン，ラース
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1994-05-12
Also published as: SK62593A3; HU9301801D0; CZ119293A3; CA2098731A1; EP0563175A1; PT99848A; FI932831A0; MX9102684A; NZ241011A; DK300090D0; IL100408A0; FI932831A; AU9134891A; IE914433A1; HUT68751A; ZA919932B; KR930703450A; WO1992011378A1; AU660161B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】合成リーダー配列の構成方法発明の分野本発明は、酵母に非相同ポリペプチドを分泌するための合成リーダーペプチド配列を構成する方法、及びその方法に使用するための酵母発現ベクターに関する。

発明の背景酵母生物は、細胞内合成されるが、しかしその細胞外での機能を有する多くのタンパク質を生成する。そのような細胞外タンパク質は、分泌されたタンパク質として言及される。それらの分泌されたタンパク質は、小胞体（ＥＲ）の膜を通して発現された生成物の効果的な方向を確保するプレ配列を含む前駆体又はプレタンパク質形で、初期に細胞内に発現される。通常、シグナルペプチドと称されるプレ配列は一般的に、トランスロケーションの間、所望する生成物から分離される。分泌路に入った後すぐに、タンパク質は、ゴルジ体に輸送される。ゴルジ体から、タンパク質は、区画室、たとえば細胞液胞又は細胞膜に導びく種々の路に続き、又はそれは外部媒体に分泌される細胞から送られ得る（Ｐｆｅｆｆｅｒ、　Ｓ、Ｒ，ａｎｄ　Ｒｏｔｈｍａｎ、　Ｊ、Ｅ。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５６（１９８７）、８２９〜８５２）。

いくつかのアプローチが、酵母に対して非相同的なタンパク質の酵母における発現及び分泌のために提案されて来た。ヨーロッパ特許出願第８８６３２号は、酵母に対して非相同的なタンパク質が、所望するタンパク質及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡを有する発現ビークルにより酵母生物を形質転換し、その形質転換された生物の培養物を調製し、その培養物を増殖し、そして培養培地からタンパク質を回収することによって発現され、処理され、そして分泌される方法を記載する。シグナルペプチドは、所望するタンパクｆ自体のシグナルペプチド、非相同シグナルペプチド又は生来又は非相同シグナルペプチドのハイブリッドであり得る。

酵母に対して非相同シグナルペプチドの使用に関しての問題は、その非相同シグナルペプチドがシグナルペプチドの後、効果的なトランスロケーション及び／又は切断を確実にしないことである。

Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＭＦｃｒｌ　（ｃｒ−因子）は、３種のＮ−結合グリコシル化部位、続＜　（ＬｙｓＡｒｇ（Ａｓｐ／ＧＩｕ、ＡＩａ）ｚ−３α−因子）、を包含する、１９個のアミノ酸のシグナル−又はペプチド、続いて６４個のアミノ酸の゛リーダー”又はプロペプチドを含んで成る１６５個のアミノ酸のプレプロ形として合成される（Ｋｕｒｊａｎ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｈｅｒｓ−ｋｏｗｉｔｚ、　１．Ｃｅ旦　３０（１９８２）、９３３〜９４３）。そのブレブｏＭＦｃｒｌのシグナル−リーダ一部分は、Ｓ、セレビシアエにおける非相同タンパク質の合成及び分泌を得るために広く使用されて来た。

酵母に対して非相同のシグナル／リーダーペプチドの使用は、アメリカ特許第４，５４６，０８２号明細書、ヨーロッパ特許出願第１１６，２０１号、第１２３．２９４号、第１２３，５４４号、第１６３，５２９号及び第１２３，２８９号及びデンマーク特許出願第３６１４１８３号から知られている。

ヨーロッパ特許第１２３．２８９号においては、Ｓ、セレビシアエα−因子前駆体の利用が記載されており、そして−０８４１０１１５３号は、巳しビシアエインハーターゼングナルベブチドの使用を示唆し、そしてデンマーク特許第３６１４１８３号は、外来性タンパク質の分泌のためへのＳ、セレビシアエＰＩ（０５シグナルペプチドの利用を示唆する。

アメリカ特許第４．５４６，０８２号明細書、ＨＰ第１６．２０１号、第１２３，２９４号、第１２３５４４号及び第１６３５２９号は、Ｓ、セレビシアエからのα−因子シグナルリーダー（ＭＦαｌ又はＭＦα２）が酵母における発現された非相同タンパク質の分泌工程にｆ１１用される方法を記載する。鉦皇之ビシアエＭＦα１をコートするＤＮＡ配列を融合することによって、所望するタンパク質分泌及び所望するタンパク質のプロセッシングのための遺伝子の５′末端でのシグナル／リーダー配列が示された。

ＥＰ第２０６７８３号は、Ｓ、セレビシアエからのポリペプチドの分泌のためのシステムを開示し、それによってα−因子リーダー配列は、α−因子プロセソシング部位ＬｙｓＡｒｇＧＩｕＡＩａＧＩｕＡＩａを通して非相同ポリペプチドに融合されるリーダーペプチド自体を残すために、生来のリーダー配列上に存在する４種のα−因子ペプチドを排除するように切断されている。この構成は、より小さなペプチド（５０個以下のアミノ酸）の効果的な工程を導びくことが示されている。より大きなポリペプチドの分泌及びプロセッシングのためには、生来の α−因子リーダー配列が、リーダー配列とポリペプチドとの間に１又は複数のα −因子ペプチドを残すように切断されている。

多くの分泌されたタンパク質が、２つの連続的な塩基性アミノ酸のカルボキシ末端でペプチド結合を切断できるタンパク譬分解性プロセッシングシステムに暴露されるように定められている。この酵素活性は、ＫＥに２遺伝子によりコードされるＳ、セレビシアエにおいて存在するＵｕｌｉｕｓ、　Ｄ、Ａ、など、、Ｃｅ１１　３７（１９８４６）、１０７５）　、　ＫＥＸ２遺伝子生成物による生成物のプロセッシングは、活性Ｓ、セレビシアエ接合因子α１　（ＭＦα１又はα −因子）の分泌のために必要とされるが、しかし活性Ｓ、セレビシアエ接合因子 αの分泌には関与されない。

分泌されるように意図されたポリペプチドの分泌及び正しいプロセッシングは、上記引例に示されるようにして構成されたベクターにより形質転換される酵母生物を培養する場合に得られる。しかしながら、多くの場合、分泌のレベルはひじょうに低く、又は分泌は存在しなく、又はタンパク譬分解プロセンソングは不適切であり、又は不完全である。従って、非相同ポリペプチドのより効果的な発現及び／又はプロセッシングを確保するリーダーペプチドを供給することが本発明の目的である。

発明の要約種々の異なったＤＮＡ配列によりα−因子リーダー配列を置換し、それによって酵母に非相同ポリペプチドの分泌を得ることが可能であることが驚くべきことには見出された。この観察に基づけば、ランダムＤＮＡフラグメントが、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流及び非相同ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流の酵母ベクター中にクローン化される方法が開発された。前記ベクターによる形質転換の後、酵母細胞は、問題の非相同ポリペプチドの分泌のためにスクリーンされる。

より詳しくは、本発明は、酵母において非相同ポリペプチドを分泌するために合成リーダーペプチド配列を構成する方法に関し、ここで前記方法は、（ａ）下記配列：５’　−５Ｐ−Ｘｌｌ−３’　−Ｒ５−５’　−Ｘ＋ｍ−（ＮＺＴ）ｐ−Ｘｑ− ＰＳ−＊ｇｅｎｅ＊−３’〔配列中、ＳＰはシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、Ｘｌはｎ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｎは０又は１〜約１０のアミノ酸であり、Ｒ３はランダムＤＮＡ配列の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ認識部位であり、前記部位はＸ７及びＸｌの連結で供給され、Ｘ、はｍ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｍは０又は１〜約１０の整数であり、　（ＮＺＴ）、はＡｓｎ〜Ｘａａ−ＴｈｒをコードするＤＮＡ配列であり、ここでｐは０又は１であり、ｘ９は９個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここで９は０又は１〜約ＩＯの整数であり、ＰＳは酵母プロセッシング部位を定義するペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、そして寧ｇｅｎｅ率は非相同ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である）を含んで成る酵母発現ベクター中にランダムＤＮＡフラグメントを挿入し；（ｂ）段階（ａ）の発現ベクターにより酵母宿主細胞を形質転換し；（ｃ）適切な条件下で段階（ｂ）の形質転換された宿主細胞を培養し；そして（ｄ）非相同ポリペプチドの分泌のために段階（Ｃ）の培養物をスクリーニングすることを含んで成る。

本発明において、“リーダーペプチド”とは、その機能が、小胞体からゴルジ体及びさらに培地中への分泌のための分泌小胞に向けられる非相同ポリペプチド（すなわち、細胞壁を通して又は少なくとも細胞膜を通して細胞の細胞周辺腔中への発現されたポリペプチドの輸送）を可能にするペプチドを示唆することが理解される。リーダーペプチドと共に使用される用語“合成”とは、本発明により構成されるリーダーペプチドが天然において見出されないものであることを示唆することを意図する。

用語“シグナルペプチド”とは、天然において主に疎水性であり、そして酵母に発現される細胞外タンパク譬の前駆体形のＮ−末端配列として存在するプレ配列を意味する。シグナルペプチドの機能は、非相同タンパク質の小胞体中への侵入のためへの分泌を可能にすることである。シグナルペプチドは、本発明の間、通常切断される。

シグナルペプチドはタンパク質を生成する酵母生物に対して非相同又は相同であり得るが、しかし上記で説明されたように、シグナルペプチドのより効果的な切断は、それが問題の酵母生物に対して非相同である場合に得られる。

°゛非相同ポリペプチド°′とは、天然において宿主酵母生物により生成されないポリペプチドを意味する。本発明の方法においては、非相同ポリペプチドは好ましくは、その分泌が、形質転換された酵母細胞により、たとえば確立された標準方法、たとえば問題のポリペプチドと反応する抗体による免疫学的スクリーニングにより（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９）又は非相同ポリペプチドの特異的生物学的活性をスクリーニングすることによって、容易に検出され得るものである。スクリーニングの陽性結果は、酵母における非相同ポリペプチドの分泌のために有用なリーダーペプチドが構成されたことを示す。

゛′ランダムＤＮＡフラグメント°′とは、制限エンドヌクレアーゼによりゲノムＤＮＡ　（いづれかの生物の）を消化することによって、又はたとえばＳ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　ＬｅｔｔｅｒＳ２２、１９８１．１８５９〜１８６９により記載されるホスホアミジット方法により合成りＮＡを調製することによって得られる、少なくとも３個のヌクレオチドの長さのＤＮＡのいづれかの配列を示す。

゛（ＮＺＴ）　、”によりコードされるペプチドＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒはアスパラジン結合グリコジル化部位である。“Ｘａａ”は、Ｐｒｏを除く既知のアミノ酸のいづれか１つを示す。

もう１つの観点においては、本発明は、次の配列：５’　−５Ｐ−Ｘ、ｌ−３’ 　−Ｒ５−５’　−Ｘｓ−（ＮＺＴ）、−Ｘ、−ＰＳ−寧ｇｅｎｅ＊−３’（配列中、ＳＰ、　Ｘ、、、ｌ？ｓ、　Ｘ、−、（ＮＺＴ）、、、　Ｘ、、、ＰＳ及び”ｇｅｎｅ＊は上記の通りである］を含んで成る酵母発現クローニングベクターに関する。

二のベクターは、上記方法に従ってリーダーペプチド配列の構成に使用され得る。

もう１つの観点において、本発明は、下記配列：５’　−３Ｐ　Ｘ＋１−ｒａｎＤＮＡ−Ｘｓ−（ＮＺＴ）ｐ　Ｘ、ＰＳ一本ｇｅｎｅ＊−３’［配列中、ＳＰ、　Ｘ、、、　Ｘ、、、（ＮＺＴ）ｐ、、　Ｘ、、、ＰＳ及び本ｔＨｅｎｅ率は上記の通りであり、そしてｒａｎＤＮＡは、ｘ、、及びＸ、Ｉの連結点で供給される制限エンドヌクレアーゼ認識部位に挿入されるランダムＤＮＡフラグメントである］を含んで成る酵母発現ベクターに関する。

このベクターにおいて、リーダーペプチド配列（本発明の方法により同定されている）は、配列Ｘ、、−ｒａｎＤＮＡ−Ｘ＋ｍ−（ＮＺＴ）　ｐ−Ｘａから構成されるであろう。そのようなベクターは、対象の非相同ポリペプチドの生成に使用され得る。

さらにもう１つの観点において、本発明は、酵母において非相同ポリペプチドを生成するための方法にも関し、ここで前記方法は、非相同ポリペプチドを発現でき、そして本発明の方法により構成されるリーダーペプチド配列を包含する、上記のような酵母発現ベクターにより形質転換される酵母細胞を、非相同ポリペプチドの発現及び分泌を得るために通切な培地において培養し、この後、その培地から非相同ポリペプチドを回収することを含んで成る。

発明の詳細な説明発現ベクターに挿入されるランダムＤＮＡフラグメントの長さは特に臨界ではない。しかしながら、操作可能な長さのものであるためには、フラグメントは好ましくは、１６〜約６００塩基対の長さををする。より好ましくは、そのフラグメントは、約１５〜約３００塩基対の長さを有する。フラグメントの適切な長さは約３０〜約１５０塩基対であると思われる。

ランダムＤＮＡフラグメントは好ましくは、高い割合の極性アミノ酸をコードする。それらは、Ｇｌｕ、　Ａｓｐ、　Ｌｙｓ、　Ａｒｇ、　Ｈｉｓ、　Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ、　Ａｓｎ及びＧｉｎから成る群から選択される。本発明において、用語“扁い割合の°とは、ＤＮＡ　フラグメントが対応する長さの他のＤＮＡ配列よりも多くの数の極性アミノ酸をコードすることを示す。それとは別に、又はその他に、フラグメントは少なくとも１つのプロリンをコードすることが好都合である。

配列５’　−５Ｐ４．ｌ−３’　−Ｒ５−５’−Ｘ＋−（ＮＺＴ）ｐ−Ｘａ−ＰＳ−＊ｇｅｎｅ傘−３’において、ｎ及び／又はｍ及び／′又は９は好まじくは１以上である。特にすべてのｎ、ｍ及びｑは１以上である。

リーダー配列におけるアスパラジン−結合グリコジル化部位の存在は、リーダーペプチドに高い分泌効率を付与できることを支持するある証拠が存在する（Ｗ０８９１０２４６３を参照のこと）。従って、配列５’　−５Ｐ−Ｘ＋＋−３’　 −Ｒ５−５’−Ｘ＋ｍ−（ＮＺＴ）、−Ｘ、−ＰＳ一本ｇｅｎｅ率−３’において、ｐは好ましくは、１である。

シグナルペプチト配列（ＳＰ）は、細胞の分泌路中への発現された非相同ポリペプチドの効果的な指図を確保するいづれかのシグナルペプチドをコードできる。

ソゲナルペプチドは、天然に存在するシグナルペプチド又はその機能的な部分であり、又はそれは合成ペプチドであり得る。適切なシグナルペプチドは、α−因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、変性されたカグナルペプチド、又はそれらの誘導体であることが見出された。マウス唾液アミラーゼシグナル配列は、Ｏ，Ｈａｇｅｎｂｊｃｈｅなど、、Ｎａｔｕｒｅ２８９、１９８１．　ｐｐ、　６４３〜６４６により記載される。カルボキシペプチダーゼシグナル配列は、Ｌ、Ａ、Ｖａｌｌｓなど、、Ｃｅ１ｌ　４８，１９８７．　ｐｐ８８７〜８９７される。

ＤＮＡＮＡ配列によりコードされる酵母プロセッシング部位は、適切には、Ｌｙｓ及びＡｒｇのいづれかの対での組合せ、たとえばＬｙｓ−Ａｒｇ。

Ａｒｇ−Ｌｙｓ、　Ｌｙｓ−Ｌｙｓ又はＡｒｇ−Ａｒｇであり得、ここでそれは、Ｓ、セレビ之ヱエのにＥＸ２プロテアーゼ又は他の酵母種における相当のプロテアーゼによる非相同ポリペプチドのプロセッシングを可能にする。

ＫＥＸ２プロセッシングが便利でない場合、たとえばそれがポリペプチド生成物の分解を導びく場合、ポリペプチド生成物に見出されないアミノ酸の組合せ、たとえばＦＸ、のためのプロセッシング部位、すなわちｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ− Ａｒｇを含んで成る、もう１つのプロテアーゼのためのプロセッシング部位が代わりに選択され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）。

本発明の方法により生成される非相同タンパク質は、酵母に都合良く生成され得るいづれかのタンパク質であり得る。そのようなタンパク質の例は、アプロチニン、組織因子路インヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、組織プラスミノーゲン活性化因子、形質転換性増殖因子α又はβ、血小板由来の成長因子、酵素又はそれらの機能的類似体である。本発明において、用語“ 機能的類似体”とは、天然のタンパク質と類似する機能を有するポリペプチドを意味する（これは、天然のタンパク質の生物学的活性のレベルよりもむしろ性質に関連するものとして理解されるべきである）。ポリペプチドは、天然のタンパク質に構造的に類似し、そして天然のタンパク質のＣ−及びＮ−末端のいづれか又は両者への１又は複数のアミノ酸の付加、天然のアミノ酸配列における１又は複数の異なった部位での１又は複数のアミノ酸の置換、天然のタンパク質のいづれか又は両端で又はアミノ酸配列におけるｌ又はいくつかの部位での１又は複数のアミノ酸の欠失、又は天然のアミノ酸配列における１又は複数の部位での１又は複数のアミノ酸の挿入により天然のタンパク質に由来する。そのような変性は、上記いくつかのタンパク質のために良く知られている。

ランダムＤＮＡ７ラグメント及び配列５’　−３Ｐ−Ｘ、、−３’　Ｒ３−５’ 　−Ｘ、−（ＮＺＴ）、−Ｘ、−ＰＳ−＊ｇｅｎｅ１３′　は、確立された標準の方法、たとえばＳ几、Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａｈｅｃ　ｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２．１９８１．ｐｐ。

１８５９〜１８６９により記載されるホスホアミジット法、又はＭａｔｔｈｅｓなど、、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３．１９８４．　ｐｐ、８０１〜８０５により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジット法によれば、オリゴヌクレオチドが、たとえば自動ＤＮＡ合成機により合成され、精製され、アニールされ、連結され、そして酵母発現ベクター中にクローン化される。配列５’　−３Ｐ−χ、ｌ−３’　−Ｒ５−５’　−Ｘ、、１−（ＮＺＴ）ｌ、−Ｘ、−ＰＳ−＊ｇｅｎｅ申−３′　は単一の操作で調製される必要はないが、しかしこの態様で合成的に調製される複数のオリゴヌクレオチドからアセンブリーされ得ることが注目されるべきである。

ランダムＤＮＡフラグメント又は配列５’　−５Ｐ−Ｘ、ｌ−３’　−Ｒ５−５ ’　−Ｘ、−（ＮＺＴ）、−Ｘ、−ＰＳ−寧ｇｅｎｅ＊−３’の１又は複数の部分はまた、標準技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８９）に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてのハイブリダイゼーションにより、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリィ−を調製し、そして前記部分（典型的にはＳＰ又は本ｇｅｎｅ本）をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られるゲノム又はｃＤＮＡ起原の６のでもあり得る。

この場合、シグナルペプチドをコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列は、非相同タンパク質をコードするゲノム又二まｃＤＮＡ配列に連結され、これ後、ＤＮＡ配列が、良く知られた方法に従って、配列Ｘ、−３’　−Ｒ３−５’Ｘ、（ＮＺＴ）　、−Ｘ、−ＰＳをコードする合成オリゴヌクレオチドの挿入により変性され得る。

最後に、ランダムＤＮＡフラグメント及び／又は配列５’−５Ｐ−Ｘ、、３’− ＲＳ−５’−Ｘｓ−（ＮＺＴ）ｐ−Ｘ、−ＰＳ−率ｇｅｎｅ本−３’は、標準の技法に従って、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起原（６のな場合）のフラグメント（完全なりＮＡ配列の種々の部分に対応する）をアニールすることによって調製される、混合された合成及びゲノム、混合された合成及びｃＤＮＡ又は混合されたゲノム及びｃＤＮＡ起原の６のであり得る。従って、シグナルペプチド又は非相同ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ起原の６のであり、そして配列Ｘ、、−３’　−Ｒ３−５’　−Ｘ、−（ＮＺＴ）、−χ、−ｐｓは合成的に調製され得ることが予測される。

インスリン前駆体をコードする好ましいＤＮＡ構造体又はその適切な変性は、配列番号１〜１３に示されている。ＤＮＡ配列の適切な変性の例は、タンパク質の他のアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかしＤＮＡ構造体が挿入される酵母生物のコドン使用法に相当するヌクレオチド置換、又は種々のアミノ酸及び従って、たぶん、異なったタンパク質構造体を生ぜしめるヌクレオチド置換である。可能な変性の他の例は、３種又は複数の３種のヌクレオチドの配列中への挿入、配列のいづれかの末端での３種又は複数の３種のヌクレオチドの付加及び配列のいづれかの末端又は配列内での３種又は複数の３種のヌクレオチドの欠失である。

配列５’　−５Ｐ−Ｘ＋１−３’　−Ｒ５−５’−Ｘｓ−（ＮＺＴ）、−Ｘ、− ＰＳ−率ｇｅｎｅ傘−３’又は５′−５Ｐ−Ｘ、−ｒａｎＤＮＡ−Ｘｓ−（ＮＺＴ）　、−Ｘ９−ＰＳ−率ｇｅｎｅ＊−３’を担持する組換え発現ベクターは、酵母生物において複製できるいづれかのベクターであり得る。そのベクターにおいて、いづれかのＤＮＡ配列が適切なプロモーター配列に操作的に連結されるべきである。プロモーターは、酵母において転写活性を示すいづれかのＤＮＡ配列であり、そして酵母に対して相同の又は非相同のタンパク質をコードする遺伝子に由来され得る。プロモーターは、好ましくは、酵母に対して相同のタンパク質をコードする遺伝子に由来する。適切なプロモーターの例は、Ｓ、セレビシアエＭＦα１．　ＴＰＴ、　ＭＤＩ（又はＰＧＫプロモーターである。

上記に示される配列は、適切なターミス−ター、たとえばＴＰ＋　ターミネータ −に操作的に連結されるべきである（丁、Ａ］ｂｅｒ　ａｎｄ　Ｇ、Ｋａｗ−ａｓａｋｉ、Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　Ｉ、Ｇｅｎｅｔ、ｌ　１９８２．ｐｐ、４１９〜４３４）。

本発明の＆１１換え発現ベクターはさらに、酵母においてベクターのｉ製を可能にするＤＮＡ配列を含んで成る。そのような配列の例は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子１？ＥＰ　１．−３及び？１［製の起点である。そのベクターはまた、選択マーカー、たとえばＰ、Ｒ，Ｒｕ５ｓｅ１１．堕肚　■。

１９８５、　ｐｐ、１２５〜１３０により記載されるような影を土任互虹亙加■ ｙｕ且び工り畦ＬＴＰＩ遺伝子をまた含をする。

配列５’　−５Ｐ−Ｘ、−３’　−Ｒ５−５’　−Ｘ、−（ＮＺＴ）ｐ−Ｘ、− ＰＳ一本ｇｅｎｅ訃３’　、ランダムＤＮＡフラグメント、プロモーター及びターミネータ−をそれぞれ連結し、そしてそれらを、酵母復製のために必要な情報を含む適切な酵母ベクター中に挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ。

■記を参照のこと）。ベクターは、完全な配列５’　−５Ｐ−Ｘ、−３’　−Ｒ３−５’−Ｘｓ−（ＮＺＴ）ｐ−Ｘ９−ＰＳ一本ｇｅｎｅ＊−３’を含むＤＮＡ構造体をまず調製し、そして続いて、そのフラグメントを適切な発現ベクター中に挿入することによって、又は個々の要素（たとえばシグナルペプチド、配列Ｘ、−３’　−Ｒ５−５’−Ｘ、Ｉ−（ＮＺＴ）、−Ｘ、又は非相同ポリペプチド）ニツイての遺伝子情報を含むＤＮＡフラグメントを挿入し、続いて連結することによって、構成され得ることが理解されるであろう。

本発明の方法に使用される酵母生物は、培養に基づいて、問題の非相同ポリペプチドを多量に生成するいづれかの適切な酵母生物であり得る６ａ切な酵母生物の例は、酵母種、す７・カロマイセス　セ旦（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｕｖａｒｕｍ）の株であり得る。酵母細胞の形質転換はたとえば、それ自体既知の手段で、プロトプラスト形成、続く形質転換によりもたらされ得る。細胞を培養するために使用される培地は、酵母生物を増殖するために適切ないづれが従来の培地であり得る。分泌された非相同タンパク質（正しく処理された形で培地にその存意な割合が存在するであろう）は、遠心分離又は濾過による培地からの酵母細胞の分離、塩、たとえば硫酸アンモニウムにょる上清液又は濾液のタンパク質性成分の沈殿、続く種々のクロマトグラフィ一方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は同様のものによる精製を包含する従来の方法により培地から回収され得る。

図面の簡単な説明本発明は、添付図面によりさらに例示され、ここで図１は、ｐＭＴ７４２δの構成を図的に示し；図２は、ｐＬａｃ２０２の構成を図的に示し；図３は、ランダムＤＮＡフラグメントのためのｐＬａｃ２０２におけるクローニング部位でのＤＮＡ配列及び由来するアミノ酸配列を示しくその配列はユニークＣＩａＩ部位において切断され、そしてランダムＤＮＡの挿入を伴わないでの連結が読み取り枠の変化を導びくであろうことがン主目されるべきである）；図４はｐＬｓｃ６３１５Ｄ１１の構成を図的に示す。

本発明は、次の例によりさらに記載されるが、但し、それらの例は本発明の範囲を限定するもので：まない。

例フ゛ラスミド′　びＤＮＡ　コすべての発現プラスミドはＣ−ＰＯＴタイプのものである。そのようなプラスミドは、ＥＰ特許出願第１７１１４２号に記載され、そしてプラスミド選択及び安定化のためにシゾサノカロマイセス　ポンへ　トリオースホスフェート　イソメラーゼ遺伝子（ＰＯＴ）を含む二とで’ｗｅづけられている。ＰＯＴ−遺伝子を含むプラスミドは、寄託されたＬユびターミネータ−（ＰＴＦ＋及びＴＩＰＩ　）を含む。それらはｐＭＴ７４２（Ｍ、Ｅｇｅｌ−Ｍｉ　ｔａｎｉなど、、Ｇｅｎｅ　７３．１９８８．　ｐｐ、１１３〜１２０）と同一である（図１を参照のこと）。但し、Ｐ、□を包含する５ｐｈ−Ｘｂａｒ制限部位により定義される領域及びシグナル／リーダー／生成物のためのコード頭載を除く。

ＦＴＰ　＋は、構成作業を促進するためにのみ、ｐＭＴ７４２に見出される配列に関して変性された。内部５ｐｈｌ’ＭＪ限部位は、Ｓｐｈ　Ｉ切断、−末鎖テールの除去及び連結により排除された。さらに、プロモーターの上流であり、そしてそのプロモーターに対していづれの衝撃も有さないＤＮＡ配列が、Ｂａ１３１エキソヌクレアーゼ処理、続＜５ｐｈｌ制限部位リンカーの付加により除去された。３７３ｂｐの５ｐｈｌ−ＥｃｏＲＩフラグメント上に存在するこのプロモーター構造体をＰＴ□　δと命名し、そしてすでに記載されたプラスミドに使用される場合、このプロモーター変性は、プラスミド、たとえば、、’ｌ　Ｔ　７４２δ（図１）へのδの付加により示される。

種々の１）ＮＡフラグメントのアセンブリーが、上記ＦＴＰ＋に関して変性された前記ｐ７７タイプ（’ｄ０８９１０２４６３を参照のこと）のより小さなＬ１茎プラスミド、すなわちｐＴ７δに時々、生した。上記ランダムクローニングのためには、種々の８原のゲノムＤＮＡを使用した。

Ｓ、セレビンアよりＮＡを、？ＩＴ６３３株（寄託番号ＤＳＭ　６２７６　トＬテ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｅｐｏｓｉｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｌｗｓｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに基づくブタペスト条約の規定下で、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓｏｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ａｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔ−ｕｒｅｎで１２月７日に寄託された）がら単離した。Ａ、オリザエ（紅虹■−鮒）　ＤＮＡを、Ａ１５６０株（ＩＦＯ４１７７）から単離した。

最後に、多くの合成りＩＩＩＡフラグメントが使用され、ここでそのすべては、ホスホラミジット化学及び市販の試薬を用いて自動ＩＩＮＡ合成１（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０４）上で合成された（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃ−ａｇｅ　ａｎｄ　Ｍ、に、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．１８５９〜１８６９）。オリゴヌクレオチド′を、変性条件下でポリアクリルアミＦ′ゲル電気泳動により精製した。そのようなＩ）ＮＡ単一鎖の相補的対のアニーリングの前、それらをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰによりキナーゼ処理した。

使用されるすべての他の方法及び材料は、技術的に知られている（Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、１９８９）。

■上具」ｌ肥」λｌ戊ｐＴ７１９６δ（ＷＯ８９１０２４６３、図５を参照（７）　コト）　（７）４９０ｂｐ　（７）ＳｐｈＴ−ＡｐａＩ及びｐＴ７．　αＭ！３（ＷＯ８９１０２４６３、図１を参照のこと）の１７９ｂｐのＨｉｎｆｌ−Ｘｂａｌを、下記合成アダプターを通してｐＭＴ７４２の１ｌｋｂのＸｂａＩ−ｓｐｈ　ｒフラグメントに連結し：Ｎ０Ｒ３６７／３７３：　ＣＡＡＣＣＡＴＣＧＡＴＡＡＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＡＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＡＡプラスミドｐ　ＬａＣ２０２（図２及び３並びに配列番号１）をもたらした。

ユニークＣ１ａ１部位を含むこのヘクターは、ランダムＤＮＡ　クローニングヘクターの１つの８ｐ１を構成し、ここで生成物遺伝子はインスリン前駆体旧３（Ｂ（１−２ａ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ（１−２１））をコードする。次の例は、この構成体を通してクローン化されたリーダーに関する。

几ＹがｌむＬａＣ２０２全ＤＮＡを、Ｓ、セレビシアエ株ＭＴ６６３から単離し、そしてＴａｑｌ。

ＨｉｎＰＩ又はＴａｑｌ＋Ｈ４ｎＰＩにより消化した。その消化物を１％アガロースゲル上でサイズに従って分離し、そして６００ｂｐよりも小さなフラグメントを個々の３種の消化から単離した。

前もってＣ１ａｌにより消化され、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）により、すなわち脱リン酸化により自己連結を妨かれたｐＬａＣ２０２を、上記フラグメントプールと共に混合し、そして連結した。

Ｅ、コリ株門Ｔ１７２（門Ｔ１７２　”ＭＣｌ０００ｍ”　ｒ−ａｒａ”　１ｅｕＢ−６：ＭＭＣｌｏｏＯ（、Ｃａ５ａ−ｄａｂａｎ　ａｎｄ　Ｓ、Ｃｏｈｅｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１３８．１９８０．ｐ１７９を参照のこと））を、上記連結混合物により形質転換し、そして個々の混合物に関して約５０００Ａｐ ”の形質転換体を得た０組換えプラスミドを、すべての５０００の形質転換体を包含するプールにおける個々の３種のタイプから調製した。それらのプラスミドプールを用いて、Ｓ、セレビシアエ株ＭＴ６６３を形質転換し、そして得られるＴＰｌ形質転換体を１３分泌について免疫スクリーンした。

驚くべき多数の陽性形質転換体の中で、明らかに最っとも効果的な８個を再！ｉＩＭＩ、、そしてプラスミド内容物をそれらから単離した。

この方法の結果として、得られる酵母形質転換体のほとんどはプラスミドの非相同集団を有し、そして従って、真のクローンを得るために、プラスミド再単離の段階を行なった。８個の再単離された酵母形質転換体の個々からのプラスミド調製物を甲いて、Ｅ、コリ株ＭＴ１７２をＡｐＨに形質転換した。８個の酵母単離物の個々のための１２個のＥ、コリ形質転換体からのプラスミドを、それぞれ用いて、酵母株ＭＴ６６３を形質転換し、ＴＰＩ形譬転換体をＭ［３分泌性形質転換体について免疫スクリーニングにより同定した。

８個の単離されたｐＬａｃ２０２ＬａＣ２０２体の配列決定は、３種の異なツタ配列を示し、ソノ中０）　２１１１　（Ｄ　ｐＬｓｃ６３１５及びｐＬｓｃ５２ＬＯカＭｒ３分泌を最っとも効果的に支持する。クローン化されたＤＮＡ及びフランキング領域の配列を、それぞれ配列番号２及び４に示す。

五主匹銭競■生斐立ｐＬｓｃ６３１５を、クローン化された合成リーダー配列の追加の変性のために選択した。

ｐＬｓｃ６３１５を、Ａｐａｌルミｌエンドヌクレアーゼ消化し、続いてエンドヌクレアーゼＢａ１３１により処理した。フェノール抽出の後、得られるＤＮＡをＸｂａｌにより消化し、そして元の３６７ｂｐのＡｐａｌ−Ｘｂａｌフラグメントよりも小さなりＮＡ　フラグメントを単離した。

ρＬａＣ２０２をＣ１ａｌにより消化し、そして生成される一本Ｂｃｃ＠を除去し、続いてＸｂａ　Ｉにより消化し、そして１ｌｋｂのＸｂａｌ−Ｃ１ａｌ　フラグメントの単離は、一本鎖端が削除されたことを示す。このフラグメントを、上記で単離されたｐＬｓｃ６４１５フラグメントと共に混合し、そして連結した（図６）。

例２に記載される形質転換及びスクリーニング方法をくり返し、そし７　ｐＬｓｃ６３１５Ｄ３及びｐＬｓｃ６３１５Ｄ７を、元ノｐＬＳＣ６３１５よりも一層効果的にＭＩ３分泌を支持するプラスミドとして単離した（それぞれ配列番号６及び８を参照のこと）。

外± 匹捜Ｗ成− 了−スペルギラスニ（Ｌ覧盈株Ａ１５６０からの全ＤＮＡを、例２においてＳセレビシアよりＮＡについてこれまで記載されたようにして処理し、そしてクローニング及び再クローニングを例２に記載されるように５で正確に行なった。但し、第１クローニングにおけるＥ、ＵＩＪ形貧転換体の数を、連結混合物当たり約３０００個に滅した。この実験は、ｐＬａｃ２０２ＬａＣ２０２て、Ｓ、セレビシアエからのインスリン前駆体ＭＩ３の分？ｉを仲介するＡ、オリザよりＮＡの５個のクローンの単離をもたらした。

挿入体の配列決定は、５個の異なった配列を示し、そのうち２種（ｐＬＡＯ２及びｐＬＡＯ５）は、Ｍ＋３１３分間与される場合、より効果である。ｐＬＡｏ２＆びｐＬＡＯ５におけるＤＮＡ挿入体の配列が、フランキング領域お共に、それぞれ配列番号１０及び１２に示される。

倒」− 上記のようなプラスミドを有する酵母株を、ＹＰＤ培地において増殖した（Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｆ、など、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８１）　ａ個々の株に関して、６種の個々の５−培１’物を３０°Ｃで６０分間、振盪し、そして約１５の最終ＯＤ６゜。を有した。

遠心分離の後、上清液をＨＰＬＣ分析のために取り、それによって、分ｄされたインスリン前駆体の濃度を、Ｌｅａ　Ｓｎｅ＋など、、　（１９８７）Ｃｈｒｏｔｍａ−ｔｏｇｒａｐｈｉａ　２４，３２９〜３３２により記載される方法により測定した。

表１において１よ、本発明に従って単離されたリーダー配列の使用によるインスリン前駆体旧３の発現レベルが、Ｓ、セレビシアエのＭＦα（１）リーダーを用いて、ｐＭＴ７４２δの形質転換体により得られるレベルの％として与えられる。

表　ＩｐＭＴ７４２　１００％ｐＬｓｃ６３１５　１００％ｐＬｓｃ５２１０　６０％ｐＬｓｃ６３１５Ｄ３　１７５％ｐＬｓｃ６３１５０７　１２０％ｐＬＡＯ２１２０％ｐＬＡ０５　６０％配列の列挙（１）−穀情報：（１）出願者：　Ｎ０ＶＯＮｏｒｄｉｓｋ　Ａ／５（１１）発明の表題二合成リーダー配列の構成方法（ｉｎ）配列の数：１３（１ｖ）通信住所：（Ａ）住所：　Ｎ０ＶＯＮｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｄｅｐａｒｔｓｅｎｔ（Ｂ）通り：　Ｎ０ＶＯＡ１１ｅ（Ｃ）市：　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ（Ｄ）国：　Ｄｅｎｍａｒｋ（Ｅ）郵便番号：　ＤＫ−２８８０（Ｖ）コンピューター読み取り可能フオーム（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−００５／ＭＳ−００５（Ｄ）ソフトフェアー：、Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　１１１．０．ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ｖｉ）出願日：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（ｖｉ）アトニー／エージｊ、ント情報：（Ａ）名称：　Ｔｈａｌｓｏｅ−Ｍａｒｌｓｅｎ、　Ｂｉｒｇｉ　ｔ（Ｃ）参照／ドケノト番号：　３５４０．２０４ −臀０（ｉｘ）テレコミ１ニゲーソヨン情報：（Ａ）電話：　＋４５４４４４８８８８（Ｂ）テレファンクス：　（−４５４４４９３２５６（Ｃ）テレックス：　３７３０４（２）配列番号１についての情報：（１）配列時＠：（Ａ）長さ２３３５個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニー零頷（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮ八（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ＝４９２個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ　）配列の種類：　ｃＤＮ＾（ＩＸ）特徴；（Ａ）名称／キー：　ＣＤ５（Ｂ）位置：　７Ｇ、　、４６８（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ｓｉｇペプチド（Ｂ）位置：　７６、．３０９（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ｍａｔペプチド（Ｂ）位置：　３１０．．４６８（ｘｉ）配列：配列番号２：（２）配列番号３についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ７１３１個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｘｉ　）配列：配列番号３：Ｈｉｓ　エユｅ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　１工ｅ　Ｌｇｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ｎａ　Ｇｌｕ−３０−２５−２０− 工５Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ工１ｅ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｉａｕ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　≧Ｇｌｕ　ＡｓｎＴ′ｙｒＣｙＳＡｓｎ（２）配列番号４についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ２４２０個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ＣＤ５（Ｂ）　イ立２　ニア６、．３９６（ｉｘ）待＠：（Ａ）名称／キー：ｓｉｇペプチド（Ｂ）位置：　７６、．２３７（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ｍａｔペプチド（Ｂ）位置：　２３８．．３９６（ｘｉ　）配列：配列番号４：ＧＧｒ　Ｔ′ｒｃ　Ｔ丁ＣＴＡＣＡＣＴ　ＣＣＴ　ＡＡＧ　ＧＣｒ　ＧＣｒ　ＭＧ　Ｇσｒ　ｍ　ｔｚ　ＧＡＡ　ＣへＡＴｔ；Ｃ３５１読工Ｇ圓ω父鳩ズτ鳳　４２０（２）配列番号５につしＸての情４！：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ；１０７個のアミノ酸（Ｂ）型】アミノ酸（Ｄ）トポロジー；直鎖状（ｉｉ　）配列の種類；タンノぐり質（ｘｉ）配列；配列番号５；（２）配列番号６につし）での情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ１４５３個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）ｔｉミニ−重鎖Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：　ｃＯＮＡ（ｉｘ　）特＠：（Ａ）名称／キー：　にＤＳ（Ｂ）位置：　７６、．４２０（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ｓｉｇペプチド（Ｂ）位置：　７６、．２７０（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ｍａｔペプチド（Ｂ）位置：　２７１．．４２０（ｘｉ　）配列：配列番号６：二馬阻に馬田−ζｊＫい層表ｄ父面Ａ氏τコα富　３９９πｍ　ＴＡＣＣＡＡ　Ｔπ＾蔀ＣＴＡごズ品Ｃ旭Ｕふの×■広に口　４５０（２）配列番号７についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ２１１５個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ＩＩ）配列の種類：タンパク質（ｘｉ　）配列：配列番号７：Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ（２）配列番号８についての情報；（１）配列時＠：（Ａ）長さ１４５９個の塩基対（Ｂ）型；核酸（Ｃ）鎖−一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（＋１）配列の種類：　ｃＯＮＡ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／′主キー　Ｃ０５（Ｂ）位置：　７６、．４３５（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ｓｉｇペプチド（Ｂ）位置：　７６、．２７６（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キーｘｓａｔペプチド（Ｂ）位置：　２７７、．４３５（ｘｉ　）配列：配列番号８：（２）配列番号９についての情報：（ｉ）配列特徴；（Ａ）長さ＝１２０個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二車鎖状（１１）配列の種Ｗ４＝タンパク質（ｘｉ）配列：配列番号９：Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｆｈａ　シｕＬａｕ　Ｉｉｕ　Ｓａｒ　ｕｕ工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｆｈｅ　Ｃ％　Ｔｒｐ　Ａｌａ　ＧｌｎＰｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ工１ｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｌｘ　）ｕｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＡｌａ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｆｈａ　ＰｈｅＴｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＡｌａ　Ａｈａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ工１ｅ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ（２）配列番号１０についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ＝４０８個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニー・末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎮状（１夏）配列の種類：　ｃＤＮ＾（ＩＸ）特＠：（Ａ）名称／キー：ＣＤ５（Ｂ）位置：　７６、．３８４（ＩＸ）特徴：（Ａ）名称／キー：ｓｉｇペプチド（Ｂ）位置：　７６、．２２５０Ｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ｍａｔペプチド（Ｂ）位置：　２２６．．３８４（ｘｉ　）配列：配列番号１０：ＴＧＣＴＣＣＴ丁（、ＴへＣＣへへ　ＴＴＧ　ＧＡＡ　ＡＡＣＴへＣＴＧＣＡＡＣＴへＣＡＱｆへｃｃｃｃｃｃンばズスごｒｅ　４０４ＴＡＧＡ　４０Ｂ（２）配列番号１１についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ：１０３個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二車鎖状（１１）配列の種類：タンパク貫（ｘｉ　）配列：配列番号１１：（２）配列番号１２についての情報＝（ｉ）配列時ｌｆｌ［：（Ａ）長さ２３７２個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二直鎖状（＋１）配列の種類：　ｃＤＮ＾（ｉｘ　）特＠：（Ａ）名称／キー：　ＣＤ５（Ｂ）位置：　７６、．３４Ｂ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ｓｉｇペプチド（Ｂ）位置：　７６、．１８９（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：＋ｓａｔペプチド（Ｂ）位置：　１９０．．３４８（ｘｉ）配列：配列番号１２：ＴＡＧＡ（ＩＩ；ＣへＺ　ｍ　ＴＡＧＡ　コア２（２）配列番号１３についての情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ：９１個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列二配列番号１３：Ｍａｔ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｆｈｅ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｌａｕ工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　ＧｉｎＦＩＧ、４補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年６月２１日

Claims

【特許請求の範囲】

１．酵母に非相同ポリペプチドを分泌するための合成リーダーペプチド配列の構成方法であって、（ａ）下記配列：５′　−ＳＰ−Ｘｎ−３′　−ＲＳ−５′　−Ｘｍ−　（ＮＺＴ）ｐ−Ｘｑ−ＰＳ−＊ｇｅｎｅ＊−３′〔配列中、ＳＰはシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、Ｘｎはｎ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｎはＯ又は１〜約１０のアミノ酸であり、ＲＳはランダムＤＮＡ配列の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ認識部位であり、前記部位はＸｎ及びＸｍの連結で供給され、Ｘｍはｍ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｍはＯ又は１〜約１０の整数であり、（ＮＺＴ）ｐはＡｓｎ−Ｘａａ−ＴｈｒをコードするＤＮＡ配列であり、ここでｐはＯ又は１であり、Ｘｑはｑ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｑはＯ又は１〜約１０の整数であり、ＰＳは酵母プロセッシング部位を定義するペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、そして＊ｇｅｎｅは非相同ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である〕を含んで成る酵母発現ベクター中にランダムＤＮＡフラグメントを挿入し；（ｂ）段階（ａ）の発現ベクターにより酵母宿主細胞を形質転換し；（ｃ）適切な条件下で段階（ｂ）の形質転換された宿主細胞を培養し；そして（ｄ）非相同ポリペプチドの分泌のために段階（ｃ）の培養物をスクリーニングすることを含んで成る方法。
２．前記ベクターにおける挿入されたランダムＤＮＡフラグメントがゲノム又は合成起原のものである請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記ランダムＤＮＡフラグメントが６〜約６００個の長さの塩基対を有する請求の範囲第１又は２項記載の方法。
４．前記ランダムＤＮＡフラグメントが高い割合の極性アミノ酸をコードする請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の方法。
５．前記ランダムＤＮＡフラグメントが少なくとも１つのプロリンをコードする請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の方法。
６．前記ｎ及び／又はｍ及び／又はｑが１以上である請求の範囲第１項記載の方法。
７．前記ｐが１である請求の範囲第１項記載の方法。
８．前記ＳＰが、ａ−因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド又はヒユミコラ　ラヌギノサリパーゼシグナルペプチド、又はそれらの誘導体をコードするＤＮＡ配列である請求の範囲第１項記載の方法。
９．前記ＰＳが【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，又は【配列があります】をコードするＤＮＡ配列である請求の範囲第１項記載の方法。
１０．前記非相同ポリペプチドが、アプロチニン、組織因子路インヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、組織プラスミノーゲン活性化因子、形質転換性増殖因子ａ又はβ、血小板由来の成長因子、酵素又はそれらの機能的類似体から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の方法。
１１．下記配列：５′−ＳＰ−Ｘｎ−３′−ＲＳ−５′−Ｘｍ−（ＮＺＴ）ｐ−Ｘｑ−ＰＳ−＊ｇｅｎｅ＊−３′〔配列中、ＳＰはシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、Ｘｎはｎ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｎはＯ又は１〜約１０のアミノ酸であり、ＲＳはＸｎ及びＸｍの連結部で供給される制限エンドヌクレアーゼ認識部位であり、Ｘｍはｍ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｍはＯ又は１〜約１０の整数であり、（ＮＺＴ）ｐはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ　をコードする　ＤＮＡ配列であり、ここでｐはＯ又は１であり、Ｘｑはｑ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｑはＯ又は１〜約１０の整数であり、ＰＳは酵母プロセッシング部位を定義するペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、そして＊ｇｅｎｅ＊は非相同ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である〕を含んで成る酵母発現クローニングベクター。
１２．前記ｎ及び／又はｍ及び／又はｑが１以上である請求の範囲第１１項記載のベクター。
１３．前記ｐが１である請求の範囲第１１項記載のベクター。
１４．前記ＳＰが、ａ−因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド又はヒユミコラ　ラヌギノサ　リパーゼシグナルペプチド、又はそれらの誘導体をコードするＤＮＡ配列である請求の範囲第１１項記載のベクター。
１５．前記ＰＳが【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】又は【配列があります】をコードするＤＮＡ配列である請求の範囲第１１項記載のベクター。
１６．前記非相同ポリペプチドが、アプロチニン、組織因子路インヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、組織プラスミノーゲン活性化因子、形質転換性増殖因子ａ又はβ、血小板由来の成長因子、酵素又はそれらの機能的類似体から成る群から選択される請求の範囲第１１項記載のベクター。
１７．下記配列：５′−ＳＰ−Ｘｎ−ｒａｎＤＮＡ−Ｘｍ−（ＮＺＴ）ｐ−Ｘｑ−ＰＳ−＊ｇｅｎｅ＊−３′〔配列中、ＳＰはシグナルペプチドをコードする　ＤＮＡ配列であり、Ｘｎはｎ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｎはＯ又は１〜約１０のアミノ酸であり、ｒａｎＤＮＡはＸｎ及びＸｍの連結部で供給される制限エンドヌクレアーゼ認識部位におけるランダムＤＮＡフラグメントであり、Ｘｍはｍ個のアミノ酸をコードする　ＤＮＡ配列であり、ごこでｍはＯ又は１〜約１０の整数であり、（ＮＺＴ）ｐはＡｓｎ−Ｘａａ−ＴｈｒをコードするＤＮＡ配列であり、ここでｐはＯ又は１であり、Ｘｑはｑ個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、ここでｑはＯ又は１〜約１０の整数であり、ＰＳは酵母プロセッシング部位を定義するペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、そして＊ｇｅｎｅ＊は非相同ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である〕及びリーダーペプチド配列をコードする配列Ｘｎ−Ｘｑを含んで成る酵母発現ベクター。
１８．前記ベクターにおける挿入されたランダムＤＮＡフラグメントがゲノム又は合成起原のものである請求の範囲第１７項記載の方法。
１９．前記ランダムＤＮＡフラグメントが６〜約６００個の長さの塩基対を有する請求の範囲第１７又は１８項記載の方法。
２０．前記ランダムＤＮＡフラグメントが高い割合の極性アミノ酸をコードする請求の範囲第１７〜１９のいづれか１項記載の方法。
２１．前記ランダムＤＮＡフラグメントが少なくとも１つのプロリンをコードする請求の範囲第１７〜２０のいづれか１項記載の方法。
２２．前記ｎ及び／又はｍ及び／又はｑが１以上である請求の範囲第１７項記載の方法。
２３．前記ｐが１である請求の範囲第１７項記載の方法。
２４．前記ＳＰが、ａ−因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド又はヒユミコララヌギノサリパーゼシグナルペプチド、又はそれらの誘導体をコードするＤＮＡ配列である請求の範囲第１７項記載の方法。
２５．前記ＰＳが【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】又は【配列があります】コードするＤＮＡ配列である請求の範囲第１７項記載の方法。
２６．前記非相同ポリペプチドが、アプロチニン、組織因子路インヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、組織プラスミノーゲン活性化因子、形質転換性増殖因子ａ又はβ、血小板由来の成長因子、酵素又はそれらの機能的類似体から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の方法。
２７．非相同ポリペプチドを発現でき、そして請求の範囲第１１〜１６のいづれか１項記載の酵母発現ベクターにより形質転換される酵母細胞。
２８．非相同ポリペプチドを発現でき、そして請求の範囲第１７〜２６のいづれか１項記載の酵母発現ベクターにより形質転換される酵母細胞。
２９．酵母に非相同ポリペプチドを生成するための方法であって、非相同ポリペプチドを発現でき、そして請求の範囲第１項記載の方法により構成されたリーダーペプチド配列を含む、請求の範囲第１７〜２６のいづれか１項記載の酵母発現ベクターにより形質転換される酵母細胞を、非相同ポリペプチドの発現及び分泌を得るのに適切な培地において培養し、その後、非相同ポリペプチドをその培地から回収することを含んで成る方法。