AT410217B - Vektor und ein verfahren zur expression und selektion randomisierter peptid-sequenzen - Google Patents

Vektor und ein verfahren zur expression und selektion randomisierter peptid-sequenzen Download PDF

Info

Publication number
AT410217B
AT410217B AT0103700A AT10372000A AT410217B AT 410217 B AT410217 B AT 410217B AT 0103700 A AT0103700 A AT 0103700A AT 10372000 A AT10372000 A AT 10372000A AT 410217 B AT410217 B AT 410217B
Authority
AT
Austria
Prior art keywords
vector
randomized peptide
library
selection marker
sequence
Prior art date
Application number
AT0103700A
Other languages
English (en)
Other versions
ATA10372000A (de
Original Assignee
Cistem Biotechnologies Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cistem Biotechnologies Gmbh filed Critical Cistem Biotechnologies Gmbh
Priority to AT0103700A priority Critical patent/AT410217B/de
Priority to US10/297,969 priority patent/US20040110281A1/en
Priority to PCT/EP2001/006617 priority patent/WO2001096554A1/en
Priority to AU2001274097A priority patent/AU2001274097A1/en
Priority to EP01940566A priority patent/EP1290157A1/de
Publication of ATA10372000A publication Critical patent/ATA10372000A/de
Application granted granted Critical
Publication of AT410217B publication Critical patent/AT410217B/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Die Erfindung betrifft   emen   Vektor und   em   Verfahren zur Expression und Selektion randomi- sierter Peptid-Sequenzen. 



   Das Screenen randomisierter Fragmente von genomischer DNA ist einer der wichtigsten Punk- te der Genomik.   Em   spezifisches Problem ist, dass üblicherweise nur einer von drei Leserahmen erwünscht ist oder zu einem geeigneten Expressionsprodukt führt, wenn so eine genomische DNA gescreent wird Ausserdem hat eine DNA, die gescreent werden soll, zwei mögliche Leserichtun- gen, von welchen nur eine die Richtige ist 
Beim Einbau solcher randomisierter Peptidsequenzen in Fusionsproteine sind oft Leader- Peptide in Position 5' zum Fusions-Peptid/-Protein, das   expnmiert   werden soll, vorgesehen (z.B. wenn das Produkt seine Funktion im Penplasma ausüben muss oder wenn das Protein in die Aussenmembran eingebaut oder exportiert werden soll).

   Weiters werden Selektionsmarker verwen- det, die separat expnmiert oder zumindest als separate Proteine in einem gemeinsamen Operon exprimiert werden 
Wenn ein Leader-Peptid für das Screenen randomisierter Peptidsequenzen zusammen mit einem präsentierten Träger-Protein verwendet wird, gibt es achtzehn Möglichkeiten, eine DNA, die für ein randomisiertes Peptid kodiert, zwischen Leader-Peptid und Display-Peptid zu insertieren. 



  Daraus folgt, dass nur einer von achtzehn Klonen das richtige Insert aufweist. Für übliche Scree- ning-Methoden ist dies oft ein unwesentliches Problem Es gibt jedoch spezifische Screening- Systeme, in welchen solche Umstande unerwünscht sind, insbesondere, wenn seltene Elemente einer Bibliothek detektiert werden sollen oder verschiedene Screening-Durchgange mit verschie- denen Vektoren durchgeführt werden sollten. 



   Obwohl es bekannt ist, bestimmte Selektionsmarker, wie &num;-Lactamase, mit Signal-Peptiden anderer Proteine zu kombinieren, um die Signal-Marker an spezifische Stellen innerhalb der Zelle    zu leiten (s. Ghrayheb et al., EMBO J 3 (10) 2437-2442), wurde ein solcher Vektor niemals   bei der Selektion randomisierter Peptidsequenzen angewendet. 



   Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Vektor zur Expression und Selek- tion randomisierter Peptidsequenzen zu schaffen, wobei die randomisierte Peptidsequenz als Fusions-Protein mit dem Selektions-Marker exprimiert wird und wobei nur jene Sequenzen selek- tiert und exprimiert werden, die die richtige Orientierung und den richtigen Leserahmen aufweisen. 



  Diese Aufgabe alleine ist neu und war bisher im Stand der Technik unerkannt 
Diese Aufgabe wird durch einen Vektor zur Expression und Selektion randomisierter Peptidse- quenzen gelöst, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er . drei Restriktionsstellen RS1, RS2 und RS3 aufweist, die im Vektor jeweils nur einmal vorkom- men, wobei sich RS3 stromabwärts in Bezug auf RS1 und stromaufwärts in Bezug auf RS2 befindet, . ein Insert, das für   em   in randomisiertes, in RS3   inseriertes   Peptid kodiert, . ein Selektionsmarker-Gen, das sich stromabwärts von RS2 befindet, aufweist, und wobei .

   die randomisierte Peptidsequenz und das Selektions-Marker-Gen in frame expnmierbar sind, um ein Fusions-Protein zu bilden, das aus dem randomisierten Peptid und dem Selektions- 
Marker besteht 
Der Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung trägt die randomisierte Peptidsequenz so, dass sie nur selektiert wird, wenn der richtige Leserahmen und die richtige Orientierung vorhanden sind Ausserdem kann die randomisierte Peptidsequenz aus dem Vektor herausgeschnitten werden (durch Schneiden mit den Restriktionsenzymen RS1 und RS2) und in andere (Klonierungs)- Vektoren in einer bestimmten Orientierung und einem bestimmten Leserahmen transferiert werden Das vorliegende Expressions-/Selektionsvektor-System eignet sich daher besonders für das Screenen von Peptiden mit   Bindungsdomänen,   die (in einem späteren Stadium) exprimiert werden sollten,

   beispielsweise unter Verwendung von bakteriellem Phagen-Display oder Bakterien-Display, damit sie mit einem gegebenen Bindungspartner oder einer Bibliothek von Bindungspartnern (z B Antikörpern oder Antikörpermischungen) selektiert werden Das vorliegende System ist besonders bei einem Screening-System geeignet, wie es in WO 99/30151 beispielsweise für die Herstellung einer geeigneten Bibliothek von Epitopen beschrieben ist Solche   Bindungs-Epitope   können mit dem Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung vorselektiert und in der richtigen Richtung und im richtigen Leserahmen zu den anderen Bibliotheks-Vektoren transfenert werden Natürlich können die vorliegenden Vektoren zur Herstellung von Bibliotheken oder Populationen amplifizierbarer 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 Gen-Packungen verwendet werden,

   die bei Bakterien- oder Phagen-Display verwendet werden (wie beispielsweise in der EP 0 436 597 B1 geoffenbart). 



   Die Selektion von Klonen mit dem richtigen Leserahmen verringert die Komplexität der Biblio- thek, was bedeutet, dass weniger Elemente gescreent werden müssen. Für die Verwendung eines Screening-Systems, bei welchem es eine absolute Notwendigkeit ist, nur jene Zellen zu screenen, die ein gewünschtes Expressionsprodukt haben, ist das vorliegende Verfahren extrem wichtig Beispielsweise sollten beim Screening-System gemäss WO 99/30151 nur jene Zellen gescreent werden, die tatsächlich das Epitop an der Oberflache   prasentieren,   weil Zellen, die das Protein nicht an der Oberfläche exprimieren (weil beispielsweise die Fusion dazu fuhrt, dass kein geeigne- ter Leserahmen gegeben ist), durch das Selektionsmittel nicht getotet werden können. 



   Vorzugsweise umfasst der Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung eine Leader-Sequenz stromaufwärts von RS1 auf, die geeignet ist, in frame mit dem randomisierten Peptid und dem Selektions-Marker exprimiert zu werden und die geeignet ist, das Fusions-Protein, bestehend aus der Leader-Sequenz, dem randomisierten Peptid und dem Selektions-Marker, zu einer vorbe- stimmten Stelle zu leiten. Die Leader-Sequenz kann das exprimierte Fusions-Protein in das ge- wünschte Zell-Kompartement (in einer eukaryontischen Zelle) oder an eine spezifische Membran- stelle (z. B. die Aussenmembran oder das Penplasma in prokaryontischen Zellen) leiten.

   Die Leader- Sequenz kann die natürliche Leader-Sequenz für den Selektions-Marker sein, oder gemäss einer bevorzugten Ausführungsform, eine etablierte und starke Leader-Sequenz sein, die für den ver- wendeten Selektions-Marker heterogen ist 
Vorzugsweise sind RS1 und RS2 Restriktionsstellen, die selten sind und die beispielsweise spezifisch für den Organismus, aus welchem die randomisierten Peptidsequenzen stammen, ausgewählt sind (z. B. eine Restriktionsstelle, die im Genom dieses Organismus selten ist oder fehlt). Gemass einer bevorzugten Ausführungsform sind seltene Enzym-Schnittstellen als RS1 und RS2 vorgesehen.

   Insbesondere sind 8bp-Schnittstellen als RS1 und RS2 bevorzugt, wie Ascl-, Fsel-, Notl-, Pmel-, Sbfl-, Sfil-, Pacl- oder   SgrAI-Stellen.   RS3 ist vorzugsweise eine Stelle, die nach dem Schneiden direkt oder indirekt zu stumpfen Enden führt (z.B. Smal) 
Es ist insbesondere im Fall eines stumpfen Schnitts von RS3 bevorzugt, dass der Vektor ohne randomisiertes Peptidsequenz-Insert nicht in Rahmen ("in frame") in Bezug auf den Selektions- Marker ist, so dass nach   Religation   ohne Einbau einer randomisierten Peptid-Insertion der Selekti- onsmarker nicht vom Vektor   expnmiert   wird Das Klonieren könnte auch erfolgen, indem beispiels- weise eine Restriktionsstelle, die einen Überhang im Vektor zurücklässt,

   in Verbindung mit der Ligation der entsprechenden Linker an die Inserts verwendet wird 
Die randomisierte Peptidsequenz stammt vorzugsweise aus dem Genom eines Organismus, insbesondere aus dem Genom eines Pathogens. Der Derivatisierungsprozess ist vorzugsweise ein randomisiertes Schneiden mit einem häufig schneidenden Enzym, oder die Herstellung eines randomisierten DNA-Fragments mittels   DNAsel,   gegebenenfalls mit Adaptationen an die Restrikti- onsuberlappungen (z. B. Stumpfmachen, Einführen klebriger Enden, Linker-Addition usw). Ein anderer bevorzugter Derivatisierungsprozess umfasst das mechanische Aufbrechen der genomi- schen DNA, einschliesslich Ultraschallbehandlung oder Zerstäubung, zu DNA-Molekülen geeigneter Grosse. Vorzugsweise hat die in den Vektor insertierte Sequenz eine Länge von 20 bis 500 bp, vorzugsweise 100 bis 300 bp.

   Inserts, die langer oder kürzer sind, konnen ebenfalls vorgesehen werden, jedoch liegt bei solchen Inserts das Risiko vor, dass die Expressionseffizienz abnimmt. Es können natürlich auch cDNA-Bibliotheken, ESTs usw. in den Vektor als randomisierte Peptidse- quenzen eingeführt werden. 



   Das Genom, aus welchem die randomisierten Peptidsequenzen stammen, ist vorzugsweise aus viralen Pathogenen, insbesondere aus HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, EBV, HTLV-I oder HTLV-II aus einem bakteriellen Pathogen, insbesondere aus S.aureus, M.tuberculosis, C. pneumo- niae, S.typhimunum, Y.pestis, S epidermidis oder aus einem eukaryontischen Pathogen, insbe- sondere aus T.brucei 
Es ist auch moglich, "in frame"-Linker-Sequenzen zwischen der randomisierten Peptidsequenz und dem   Selektions-Marker-Gen,   sowie zwischen der Leader-Peptidsequenz und der randomisier- ten Peptidsequenz vorzusehen. 



   Der Selektions-Marker kann jeder beliebige Selektions-Marker sein, der auf dem Gebiet ver- wendet wird und geeignet ist, vorzugsweise wird eine Antibiotikum-Resistenz verwendet, wie kanR, 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 CanR,   Zeocin,   Neomycin usw. 



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird &num;-Lactamase als Selektionsmarker verwendet, gegebenenfalls in Kombination mit einer OmpA oder Lpp-Leader- Sequenz. 



   Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Selektion randomisierter Peptidsequenzen, welches die folgenden Schritte umfasst: . Vorsehen eines Vektors mit drei Restriktionsstellen, RS1, RS2 und RS3, die im Vektor jeweils nur einmal vorkommen, wobei RS3 in Bezug auf RS1 stromabwärts und in Bezug auf RS2 stromaufwärts gelegen ist, einem stromabwärts von RS2 befindlichen Selektionsmarker-Gen und gegebenenfalls einer Leader-Sequenz, die sich stromaufwarts von RS1 befindet, . Insertieren einer Bibliothek randomisierter Peptid-Sequenzen in RS3 zur Schaffung einer 
Vektor-Bibliothek, . Einführen der Vektor-Bibliothek in einen geeigneten Wirt, der ein Fusionsprotein bestehend aus randomisiertem Peptid und Selektionsmarker exprimieren kann, um eine Wirts-Bibliothek zu schaffen, .

   Züchten der   Wirts-Bibliothek   auf einem Medium, das in Bezug auf den Selektionsmarker selek- tiv ist, wodurch die Wirtsindividuen selektiert werden, die das Fusionsprotein exprimieren. 



   Dieses Verfahren führt zu einer Bibliothek selektierter Vektoren, bei welchen Leserahmen und Orientierung klar definiert waren, wodurch die randomisierte Peptidsequenz so herausgeschnitten werden kann, dass die bestimmte Orientierung und der bestimmte Leserahmen erhalten bleiben. 



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfin- 
 EMI3.1 
 einer selektierten Wirts-Bibliothek isoliert und mit RS1 und RS2-Restriktionsenzymen geschnitten, um ein Fragment zu erhalten, das die randomisierte Peptidsequenz in einem bestimmten Lese- rahmen und einer bestimmten Orientierung enthält. 



   Dieses RS1/RS2-Fragment kann in einen anderen Vektor insertiert werden, welcher mit RS1- und RS2-Restriktionsenzymen geschnitten worden ist (um eine RS1- und RS2-lnsertionsstelle zu erhalten), und ist - nach Insertion des RS1/RS2-Fragments der randomisierten Peptidsequenz - zur Expression dieses randomisierten Peptids in einer bestimmten Weise geeignet. 



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfin- dung enthalt das Züchtungsmedium, in welchem die Wirts-Bibliothek gezüchtet wird, ein Antibioti- kum und ist der Selektionsmarker eine Antibiotikum-Resistenz Bevorzugte Antibiotikum/Antibioti- kum-Resistenz-Paare sind &num;-Lactamase - Ampicillin, Aminoglycosidase-Phosphotransferase (Ace- tyltransferase, Nukleotidyltransferase) - Kanamycin (Neomycin), Chloramphenicol-Acetyltransfe- rase - Chloramphenicol, TetR-Tn10-Gen-Produkt - Tetracyclin, und Sh ble Gen-Produkt -   Zeocin.   



   Gemäss einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Erfindung auch eine Bib- liothek von Vektoren (d. h , eine Vielfalt von Vektoren mit verschiedenen randomisierten Peptidse- quenzen), die gemäss der vorliegenden Erfindung eine Bibliothek randomisierter in RS3 insertierter Peptidsequenzen aufweist, d. h. die Erfindung ist auch auf eine Bibliothek von Vektoren gemäss der vorliegenden Erfindung oder Zellen, die solche Vektoren enthalten, gerichtet 
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele und der zugehörigen Zeichnungsfiguren näher beschrieben, auf die sie jedoch nicht eingeschränkt werden soll 
Fig. 1 zeigt das Plasmid pMAL4   1 (1A)   und die Insertionsstelle im &num;-Lactamase-Gen (1B), Fig. 2A-C zeigt die Plasmide für die Konstruktion der Bibliothek, Fig. 3 zeigt die Konstruktion einer Bibliothek mit Leader-Sequenz;

   Fig 4 zeigt das Konzept der vorliegenden Erfindung 
BEISPIEL L Herstellung einer Bibliothek von S. aureus 
Ein Plasmid wird gemass Fig 1 hergestellt, welches eine Insertion an den stumpfen Enden ran- domisierter hergestellter DNA-Fragmente in einen Linker, der sich zwischen dem OmpA-Leader- Peptid und dem reifen &num;-Lactamase-Gen befindet, ermöglicht. Wenn das Plasmid an der Restrikti- onsstelle mit stumpfen Enden religiert wird, führt es zu einem out-of-frame &num;-Lactamase-Gen Eine Reihe von Vektoren wurde entworfen (pMAL4, pMAL4. 1, pMAL4.2, pMAL5), die Fsel/Notl (als RS1- und RS2-Stellen) und eine Smal-Stelle (pMAL4, pMAL4 1) oder ein Xbal (pMAL5) als eine RS3-Stelle enthalten (vgl Fig. 2). 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 



   Eine Bibliothek aus S. aureus wird in die Smal-Stelle von pMAL4.1 insertiert. 



   Insertionen, die zu einem out-of-frame &num;-Lactamase-Gen führen, können durch ihre Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin eliminiert werden Die insertierten DNA-Fragmente können mit zwei flankierenden Restriktionsstellen (im vorliegenden Fall Fsel und Notl) herausgeschnitten werden, was die Insertion dieser Fragmente in derselben Orientierung wie im ursprünglichen Plasmid ermöglicht 
Protokoll für die Konstruktion der pMAL4-1-Bibliothek 
Vektor-Herstellung 
25 ug Plasmid-DNA (pMAL4.1) 
 EMI4.1 
 Zugabe von H20 (Merck, HPLC-Qualität) auf 50 ul Zwei- bis fünfstündige Inkubation bei 25 C, Prüfung des Verdaus auf Agarose-Gel 20minütige Hitzeinaktivierung von Smal bei 65 C Trennung auf   1 %   Agarose-Gel (GTG-Agarose, FMC) in 1 x TAE-Puffer (TBE-Puffer) Elution des Vektors vom Gel unter Verwendung eines Gel-Extraktions-Kits (Qiagen)

   Transformation eines Aliquots in   DH10B-Zellen   über Elektroporation zum Testen des Verdaus dT-Tailing des Vektors 25 ul verdautes Plasmid 8 ul 25 mM   MgCI2   (Perkin Eimer) 5 ul 10x Stoffel-Puffer (Perkin Eimer) 
 EMI4.2 
 
30-minütige Inkubation bei 74 C
Trennung auf   1 %   Agarose-Gel (GTG-Agarose, FMC) in 1 x TAE-Puffer (TBE-Puffer)
Elution des Vektors vom Gel unter Verwendung eines Gel-Extraktions-Kits (Qiagen)
Prüfung der Effizienz durch Religation des Vektors und Transformation in DH 10B-Zellen über Elektroporation 
Insert-Herstellung 
Herstellung kleiner (50-60 bp)

   Fragmente 
 EMI4.3 
   Dreiminütige   Inkubation bei RT 
Prüfung auf 2% GTG-TAE-Agarose-Gel 
Massentrennung in 2% GTG-TAE-Agarose-Gel 
Herausschneiden des entsprechenden Grossenbereichs (Anreicherung der Fragmente sind im Bereich um 50-60 bp) 
Herstellung grosser Fragmente (200-400 bp) 
 EMI4.4 
   MgCI2).   



   Ultraschallbehandlung in Eppendorf-Rohrchen in Eiswasser wahrend 30-40 Impulsen (100% Leistung, 10 s/Impuls) 
Prufen der Fragmentierung und der Grossenbereichsverteilung auf 2% GTG-TAE-Agarose-Gel 
Massentrennung auf 2% GTG-TAE-Agarose-Gel 
Herausschneiden von Fragmenten und Fortsetzen der Endbehandlung zum Klonieren 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 dA-Tailing der Inserts Verwendung des dA-Tailing-Kits von Novagen   1 pg DNA    8,5 ul 10 x dA Tailing-Puffer (Novagen) 0,5 ul Tth DNA-Polymerase (2,5 E/ul, Novagen) Zugabe von H20 (Merck,   HPLC-Qualitat)   auf 85 ul   15-minutige   Inkubation der Reaktionsmischung bei 70 C Extraktion mit 1 Volumen CIAA (Sigma) 60 s langes, kraftiges Schuttein am Vortex,

     einminutiges   Zentrifugieren bei 12 000 g Lagerung bei -20 C Ligation 30 ul Ligations-Reaktionsmischung 50 ng Vektor-DNA 100 ng Insert-DNA 6 ul 5x Ligations-Puffer (Gibco) 
 EMI5.1 
 Zugabe von H20 (Merck,   HPLC-Qualität)   auf 30 ul Inkubation der Ligationsreaktionsmischung uber Nacht bei 16 C Ausfällung der Ligationsreaktionsmiscnung mit EtOH wie foigt 30 ug Ligationsreaktionsmischung 70 ul H2O (Merck, HPLC-Qualitat) 10 ul 3M Na-Acetat, pH 5,2 
 EMI5.2 
 
200 ul EtOH (Merck, molekularbiologische Qualitat)
Mindestens 60-minutige Inkubation bei -20 C
Suspendieren des Pellets in 10 ul H20 (Merck,   HPLC-Qualität)  
Aus den 30 ul Ligationsmischung wird 1/10 der Reaktionsmischung bei einer Transformation verwendet 
Transformation 
Zellen DH10B (Gibco), DH5a (Gibco) 
 EMI5.3 
 Kuvette 0,1cm Abstandsbreite,

   BioRad BioRAd E coh Genepulser Spannung 2,0 kV Übliche Zeitkonstante 5,0   Gewinnungsmedium   S 0 C , Zugabe zur Kuvette unmittelbar nach dem Impuls Gewinnungszeit 45 min Plattieren und Wachstum auf LB-Platte, die 50 ul/ml Kanamycin und Ampicillin enthalten 
Protokoll für den Transfer von
Fsel/Notl-Fragmenten von der pMAL4.1 Bibliothek auf pMAL5 Vektor-Herstellung 25 ug Plasmid-DNA (pMAL4.1) 5 ul 10 x Puffer (NEB 2) 
 EMI5.4 
 Zugabe von H2O (Merck, HPLC-Qualitat) auf 50 ul Inkubation uber Nacht bei 37 C, Prufung des Verdaus auf Agarose-Gel 20-minütige Hitzeinaktivierung der Enzyme bei 65 C 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 Trennung auf   1 %   Agarose-Gel (GTG-Agarose, FMC) in 1 x TAE-Puffer (TBE-Puffer) Elution des Vektors aus dem Gel unter Verwendung eines Gel-Extraktions-Kits (Qiagen)

   Transformation eines Aliquots in   DH10B-Zellen   über Elektroporation zum Testen des Verdaus Insert-Herstellung 25 ug pMAL4 1-Bibliotheks-DNA 5ul 10x Puffer (NEB2) 
 EMI6.1 
 
Zugabe von H2O (Merck, HPLC-Qualität) auf   50 pl   
Zwei- bis funfzehnstündige Inkubation bei 25 C, Prüfung des Verdaus auf Agarose-Gel 
20-minütige Hitzeinaktivierung der Enzyme bei 65 C 
Trennung auf   1 %   Agarose-Gel (GTG-Agarose, FMC) in 1 x TAE-Puffer (TBE-Puffer) 
Elution des Vektors aus dem Gel unter Verwendung von Elektroelution (Biotrap Schlei- cher & Schuell) 
Ausfallung mit Ethanol (wie für die Ligationsreaktion). 
 EMI6.2 
 



   Plattieren und Züchten auf LB-Platten, die 50 ug/ml Kanamycin enthalten. 



   Genomische S. aureus-Bibliothek: 
Anzahl der Zellen auf Kan (Komplexität der Bibliothek vor Selektion); 1.6   x 107   
Anzahl der Zellen auf Kan/Amp (Komplexität der Bibliothek nach Selektion):   1 x 106   
Anzahl der auf ein Insert getesteten Klone- 148 
Anzahl der Klonen mit Insert in-frame : 148 
Anzahl der Klone ohne Insert: 0 
Anzahl der Klone mit Insert out-of-frame : 0 
Dies zeigt, dass nur jene Klone selektiert werden, die tatsachlich ein Insert im richtigen Rah- men ("frame") aufweisen 
B E I S P I EL 2 : Herstellung einer Bibliothek von S. epidermidis unter Verwendung des 
Vektors pMAL4.31. 



   Ein Plasmid wird gemäss Fig. 3 erzeugt, welches die stumpfendige Insertion von zufällig er- zeugten DNA-Fragmenten in die Smal-Stelle ermöglicht, die sich zwischen dem OmpA-Leader- Peptid, gefolgt von einem Linker von 17 Aminosauren (HPETLVKVKDAEVAGLP) und dem reifen &num;-Lactamase-Gen befindet Jedes von der Bibliothek codierte Peptid wird daher mit 17 zusätzli- chen Aminosauren am N-Terminus in pMAL4. 31 exprimiert werden, im Vergleich zu 5   Aminosau-   ren in pMAL4. 1. Die zusatzliche Sequenz erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die meisten von der Bibliothek codierten Fusions-Proteine an das Penplasma geliefert werden, da die Netto-Ladung der ersten 18 Aminosauren der reifen Sequenz einen Einfluss auf die korrekte Translokation quer uber die Cytoplasma-Membran haben kann (A.V. Kajava et al , 2000, J. Bactenol., 182 :2163-9).

   Alle anderen Merkmale von pMAL4.31 sind dieselben, wie für pMAL4.1 beschrieben. 



   Zusatzlich wurden drei Plasmide so konstruiert, dass sie Inserts aufnehmen, die einer Lese- rahmen-Selektion entweder durch pMAL4. 1 oder durch pMAL4. 31 unterzogen wurden, wogegen 
 EMI6.3 
 kloniert werden. pMAL9 1 codiert für das lamB-Gen, pMAL10.1für das   btuB-Gen,   und pHIE11für das fhuA-Gen, zwecks Prasentation des Peptid-Inserts an der Bakterien-Oberflache 
Die Genom-DNA von S. epidermidis wurde zu einer Grösse von etwa 70bp fragmentiert.

   Die Genom-Fragmente wurden danach mit Smal verdauten pMAL4.31 ligiert, und die Klone wurden auf LB-Platten selektiert, die lediglich 50 ug/ml Kanamycin oder 50   ug/ml   Kanamycin und 50 ug/ml Ampicillin enthielten 
Anzahl der Zellen auf Kan (Komplexität der Bibliothek vor der Selektion)   3 x 107   
Anzahl der Zellen auf Amp und Kan (Komplexität der Bibliothek nach der Selektion)   2 x 106   
Anzahl der auf Insert getesteten Klone' 362 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 
Anzahl der Klone mit Insert in-frame- 356 
Anzahl der Klone ohne Insert- 0 
Anzahl der Klone mit Insert out-of-frame 6 
Die 6 Klone, von weichen bestimmt worden war, dass sie eine Sequenz out-of-frame hatten, wurden danach nicht auf eine Ampicillin-Resistenz getestet,

   da sie während der für die Sequenz- Analyse notwendigen Zeit nicht erhalten wurden Es ist daher durchaus möglich, dass die bestimm- te Sequenz fehlerhaft ist. Im Allgemeinen kann festgestellt werden, dass mehr als 98% aller getes- teten Klone den korrekten Leserahmen aufweisen 
PATENTANSPRÜCHE:

   
1 Vektor für die Expression und Selektion randomisierter Peptidsequenzen, dadurch ge- kennzeichnet, dass er . drei Restriktionsstellen RS1, RS2 und RS3, die im Vektor jeweils nur einmal vorkom- men, wobei sich RS3 stromabwarts in Bezug auf RS1 und stromaufwärts in Bezug auf 
RS2 befindet, 
 EMI7.1 
 . ein Selektionsmarker-Gen, das sich stromabwärts von RS2 befindet, aufweist, und wobei . eine randomisierte Peptidsequenz und das Selektions-Marker-Gen in frame   exprimier-   bar sind, um ein Fusions-Protein zu bilden, das aus dem randomisierten Peptid und dem Selektions-Marker besteht.

Claims (1)

  1. 2 Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Leader-Sequenz strom- aufwärts in Bezug auf RS1 aufweist, die dazu geeignet ist, in-frame mit dem randomisier- ten Peptid und dem Selektionsmarker exprimiert zu werden und die geeignet ist, das Fusi- onsprotein bestehend aus Leader-Sequenz, randomisiertem Peptid und Selektionsmarker zu einer vorbestimmten Stelle zu lenken 3 Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass RS1 und RS2 8 bp Restrik- tionsenzym-Schnittstellen sind.
    4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Schneiden von RS3 zu stumpfen Enden fuhrt 5 Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die randomisier- te Peptidsequenz aus dem Genom eines Organismus, insbesondere aus dem Genom eines Pathogens, stammt.
    6 Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die randomisier- te Peptidsequenz eine Lange von 20 bis 500 bp hat 7 Vektor nach einem der Anspruche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er eine in-frame- Linkersequenz zwischen der randomisierten Peptidsequenz und dem Selektionsmarker- Gen aufweist 8 Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektions- marker eine Antibiotikum-Resistenz ist.
    9 Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektions- marker &num;-Lactamase ist.
    10 Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass er eine OmpA- Leader-Sequenz enthält 11 Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die randomi- sierte Peptidsequenz eine Lange von 100 bis 300 bp hat 12 Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die randomi- sierte Peptidsequenz von einem viralen Pathogen, insbesondere von HAV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, EBV, HTLV-I oder HTLV-II, stammt.
    13 Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die randomi- sierte Peptidsequenz von einem bakteriellen Pathogen, insbesondere von S. aureus, M tuberculosis, C. pneumoniae, S typhimunum, Y. pestis oder S. epidermidis, stammt.
    14. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die randomi- <Desc/Clms Page number 8> sierte Peptidsequenz von einem eukaryontischen Pathogen, insbesondere von T. brucei, stammt 15 Verfahren zur Selektion randomisierter Peptidsequenzen, welches die folgenden Schritte umfasst : . Vorsehen eines Vektors mit drei Restriktionsstellen, RS1, RS2 und RS3, die im Vektor jeweils nur einmal vorkommen, wobei RS3 in Bezug auf RS1 stromabwärts und in Bezug auf RS2 stromaufwärts gelegen ist, einem stromabwärts von RS2 befindlichen Selektionsmarker-Gen und gegebenenfalls einer Leader-Sequenz, die sich stromauf- warts von RS1 befindet, . Insertieren einer Bibliothek randomisierter Peptid-Sequenzen : RS3 zur Schaffung einer Vektor-Bibliothek, .
    Einführen der Vektor-Bibliothek in einen geeigneten Wirt, der ein Fusionsprotein be- stehend aus randomisiertem Peptid und Selektionsmarker exprimieren kann, um eine Wirts-Bibliothek zu schaffen, . Züchten der Wirts-Bibliothek auf einem Medium, das in Bezug auf den Selektions- marker selektiv ist, wodurch die Wirtsindividuen selektiert werden, die das Fusionspro- tein expnmieren 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor der selektierten Wirts-Individuen isoliert und mit RS1- und RS2-Restriktionsenzymen geschnitten wird, um ein Fragment zu erhalten, welches die randomisierte Peptidsequenz in einem bestimmten Leserahmen und in einer bestimmten Orientierung enthält 17 Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment in einen ande- EMI8.1 ten worden ist, um eine RS1/RS2-lnsertionsstelle zu erhalten.
    18. Verfahren nach einem der Anspruche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Züch- tungsmedium ein Antibiotikum enthält und der Selektionsmarker eine Antibiotikum- Resistenz ist.
    19 Expressions-/Selektionsvektor-Bibliothek, dadurch gekennzeichnet, dass in einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 14 eine Bibliothek randomisierter Peptidsequenzen inser- tiert wird HIEZU 4 BLATT ZEICHNUNGEN
AT0103700A 2000-06-15 2000-06-15 Vektor und ein verfahren zur expression und selektion randomisierter peptid-sequenzen AT410217B (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0103700A AT410217B (de) 2000-06-15 2000-06-15 Vektor und ein verfahren zur expression und selektion randomisierter peptid-sequenzen
US10/297,969 US20040110281A1 (en) 2000-06-15 2001-06-12 Vector and a method for expression and selection of random peptide sequences
PCT/EP2001/006617 WO2001096554A1 (en) 2000-06-15 2001-06-12 A vector and a method for expression and selection of random peptide sequences
AU2001274097A AU2001274097A1 (en) 2000-06-15 2001-06-12 A vector and a method for expression and selection of random peptide sequences
EP01940566A EP1290157A1 (de) 2000-06-15 2001-06-12 Vektor und methode zur expression und selektion von zufälligen peptidsequenzen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0103700A AT410217B (de) 2000-06-15 2000-06-15 Vektor und ein verfahren zur expression und selektion randomisierter peptid-sequenzen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ATA10372000A ATA10372000A (de) 2002-07-15
AT410217B true AT410217B (de) 2003-03-25

Family

ID=3684449

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
AT0103700A AT410217B (de) 2000-06-15 2000-06-15 Vektor und ein verfahren zur expression und selektion randomisierter peptid-sequenzen

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20040110281A1 (de)
EP (1) EP1290157A1 (de)
AT (1) AT410217B (de)
AU (1) AU2001274097A1 (de)
WO (1) WO2001096554A1 (de)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992011378A1 (en) * 1990-12-19 1992-07-09 Novo Nordisk A/S A method of constructing synthetic leader sequences
WO1996007745A2 (fr) * 1994-09-02 1996-03-14 Institut Pasteur Vecteurs de criblage et/ou d'expression fonctionnels chez les mycobacteries
WO1996040987A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0109428B1 (de) * 1982-05-25 1988-04-06 Brandeis University Klonierungsvektoren die Indikatorgene enthalten, welche durch eine Änderung des Leserasters inaktiviert worden sind
US4503142A (en) * 1982-06-25 1985-03-05 Litton Bionetics, Inc. Open reading frame vectors
WO1992022657A1 (en) * 1991-06-13 1992-12-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Antigen-enzyme conjugate expression and detection system
US5348867A (en) * 1991-11-15 1994-09-20 George Georgiou Expression of proteins on bacterial surface
JP2879303B2 (ja) * 1993-01-14 1999-04-05 佑 本庶 ｃＤＮＡライブラリーの作製方法、および新規なポリペプチドとそれをコードするＤＮＡ
US5536637A (en) * 1993-04-07 1996-07-16 Genetics Institute, Inc. Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast
PL181916B1 (en) * 1993-07-30 2001-10-31 Pfizer Method of obtaining natural avermectin

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992011378A1 (en) * 1990-12-19 1992-07-09 Novo Nordisk A/S A method of constructing synthetic leader sequences
WO1996007745A2 (fr) * 1994-09-02 1996-03-14 Institut Pasteur Vecteurs de criblage et/ou d'expression fonctionnels chez les mycobacteries
WO1996040987A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001274097A1 (en) 2001-12-24
WO2001096554A1 (en) 2001-12-20
US20040110281A1 (en) 2004-06-10
EP1290157A1 (de) 2003-03-12
ATA10372000A (de) 2002-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69818458T2 (de) Ribosom-komplexe als selektionspartikel für die in vitro anzeige und evolution von proteinen
DE3587814T2 (de) Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
DE69133437T2 (de) Siebtestverfahren für Genbanken (recombinant libraries)
DE60221801T3 (de) Cpg-freie synthetische gene und bakterielle plasmide
DE60025824T2 (de) VERFAHREN ZUR PRäSENTATION VON HETERODIMEREN PROTEINEN AUF FILAMENTöSEN PHAGEN UNTER VERWENDUNG VON PVII UND PIX, ZUSAMMENSETZUNGEN, VEKTOREN UND KOMBINATORISCHE BIBLIOTHEKEN
DE69633065T2 (de) Herstellung einer multikombinatonischen bank von antikörpergenen exprimierendenvektoren
DE69133430T2 (de) Oberflächen lokalisierte expressionsbanken von zufälligen peptiden
DE3889021T2 (de) Verfahren zum Transformieren von Zellen.
DE69614510T2 (de) Verbesserte methode zur selektion spezifischer bakteriophagen
DE60024659T2 (de) Vektoren und verfahren für rekombinante proteinexpression
DE69534941T2 (de) Herstellung einer multikombinatorischen bank von antikörpergene-exprimierende vektoren
DE69013811T2 (de) Verfahren zur Herstellung von antiviralem Protein unter Benützung von E.coli-Transformant, das Gen, das für dieses Protein kodiert und E.coli-Vektor benützt in diesem Verfahren.
WO1999047536A2 (de) Verfahren zur synthese von nucleinsäuremolekülen
EP2228456B1 (de) Selektion kodierender Nukleinsäure-Konstrukte auf Abwesenheit von Frameshift-Mutationen
AT410217B (de) Vektor und ein verfahren zur expression und selektion randomisierter peptid-sequenzen
WO1999020780A1 (de) Positiv-negativ-selektion bei der homologen rekombination
DE3110031A1 (de) Verschmolzene gene, ihre herstellung und verwendung derselben
EP2625275A1 (de) Verfahren zur semi-synthetischen herstellung hochreiner &#34;minicircle&#34; dna-vektoren aus plasmiden
EP0093948B1 (de) Doppelstrangiger Vektor und ihn verwendendes Verfahren
DE3586652T2 (de) Kloniertes streptomyces-beta-galaktosidase-promoter-fragment.
DE3128669A1 (de) &#34;plasmid p svh 1 und seine verwendung&#34;
EP0161629A1 (de) Signalpeptid für die Exkretion von Peptiden in Streptomyceten
WO2024018050A9 (de) Verfahren zur optimierung einer nukleotidsequenz durch austausch synonymer codons für die expression einer aminosäuresequenz in einem zielorganismus
DE10140030C1 (de) Einsatz mutierter Erkennungssequenzen für mehrfache aufeinander folgende Rekombinase-vermittelte Rekombinationen in einem genetischen System
DE102015006187B4 (de) Klonierungssystem und Verfahren zur Identifizierung von Interaktionspartnern in Proteinkomplexen

Legal Events

Date Code Title Description
ELJ Ceased due to non-payment of the annual fee