EP2183370A1 - Herstellung von genetisch modifizierten aktinomyceten durch rekombination - Google Patents

Herstellung von genetisch modifizierten aktinomyceten durch rekombination

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EP2183370A1
EP2183370A1 EP08715737A EP08715737A EP2183370A1 EP 2183370 A1 EP2183370 A1 EP 2183370A1 EP 08715737 A EP08715737 A EP 08715737A EP 08715737 A EP08715737 A EP 08715737A EP 2183370 A1 EP2183370 A1 EP 2183370A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
streptomyces
plasmid
cre
actinomycetes
dna
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08715737A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Bechthold
Andriy Luzhetskyy
Lutz Petzke
Elisabeth Welle
Marta Fedoryshyn
Martina Daum
Simone Herrmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Original Assignee
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
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Filing date
Publication date
Application filed by Albert Ludwigs Universitaet Freiburg filed Critical Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority to EP08715737A priority Critical patent/EP2183370A1/de
Publication of EP2183370A1 publication Critical patent/EP2183370A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid molecules replicable in host cells which contain novel DNA sequences which code for the Dre or Cre recombinase. Furthermore, the invention relates to a recombination system for altering DNA fragments (excision, integration, inversion or translocation) of the genome (target DNA) of actinomycetes. In addition, the invention relates to a process for the preparation of modified actinomycetes, as well as the modified microorganisms themselves, which were prepared by this method.
  • actinomycetes are understood as meaning gram-positive bacteria which have a high G + C ratio.
  • these are those bacteria that are naturally found in the soil and preferably belong to the species Streptomyces.
  • a recombination method it is necessary to introduce and express the nucleic acids encoding the recombinases into the host cell. This can be done for example by means of a plasmid, wherein the expression of the recombinases can be controlled when using inducible promoters. The recombinases can then effect the alteration of the genome of the host cell.
  • the nature of the recombination is determined here by the arrangement of the recognition sequences loxP and rox to each other on a DNA section.
  • the introduction of recognition sequences into the genome of the host cell can be carried out by conventional methods, for example by homologous recombination. In the presence of two identical recognition sequences, the recombinase can cause the excision of the DNA fragment located between these recognition sequences, whereby the excised DNA fragment can subsequently cyclize. Furthermore, it is possible to insert cyclic nucleic acid molecules which have a recognition sequence, for example in the form of a plasmid, into the genome of the host cell. For this purpose, a recognition sequence is also necessary in the genome of the host cell, whereupon the recombinase causes an exchange of the nucleic acid strands on the recognition sequences. Similarly, insertion of a cyclic nucleic acid molecule into E.
  • coli strains occurs using the recognition sequences attP (bacteriophage recognition sequence) and attB (bacterial recognition sequence, see Figure 2). This process is through two enzymes catalyzes: the phage protein integrase and the bacterial integration host factor (IHF).
  • the phage genome is present after integration as a prophage in the bacterial genome, and is flanked by the newly formed recombination sites.
  • the recombination systems presented above can be introduced into actinomycetes by means of plasmids and duplicated there.
  • the nucleotide sequences which code for the Cre and Dre recombinases, together with the necessary promoters and origins of replication, can be cloned into a suitable plasmid become.
  • This plasmid can be introduced, for example, by conjugation in a microorganism and reproduced there. It is critical if the recombinases are expressed in the host organisms.
  • the recombination systems introduced into the host organism should be able to insert, for example, DNA fragments into or out of the genome of a host organism. In this way it is possible, for example, to switch on or off genes of the host organism, which influences the production of the desired active substances or secondary metabolites.
  • a further preferred embodiment is the use of a recombination system for excising, integrating, inverting or translocating DNA fragments into actinomycetes. Furthermore, the invention relates to a modified microorganism prepared by the method according to the invention.
  • nucleic acid molecules of the invention encoding these proteins.
  • nucleic acid molecules are synthetic genes made by codon usage optimization. The most preferred are actinomycetes codons. Table 1 lists the preferred actinomycete codons.
  • the nucleic acid molecules have at least 70% of such codons, which are preferred by actinomycetes and listed in Table 1. More preferably, the nucleic acid molecules comprise at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, even more preferably at least 90% and most preferably at least 95% of actinomycetes preferred codons from Table 1.
  • the integration of the recognition sequences are carried out with plasmids containing no ori-rep (origin of replication actinomycetes), no int ⁇ C31 gene and no attP sequence.
  • Genes encoding recombinases are introduced into the strains with replicable plasmids containing no int ⁇ C31 gene and no attP sequence, or are introduced with integrative vectors containing an int ⁇ C31 gene and an attP sequence, and an inducible vector Promoter included, brought into the strains.
  • the vectors can be integrated into the chromosome of the target organism.
  • DNA fragments to be inserted includes any DNA sequences, regardless of their base pair number. Similarly, any nucleic acid molecule or fragment can be excised between two recognition sequences from the target DNA.
  • the DNA fragment to be inserted can preferably be introduced into the host cell by means of a plasmid.
  • the plasmid additionally preferably has a recognition sequence which corresponds to a recognition sequence in the target DNA.
  • the plasmid additionally preferably contains an origin of replication for actinomycetes and more preferably an origin of replication for E. coli.
  • the amplification of the plasmids in steps (a) and (b) can be accomplished using standard conditions. Furthermore, the plasmids are expressed in the actinomycetes and the recombinases produced thereby. The recombinases then recognize the recognition sequences in the target DNA and cause site-specific alterations of the target DNA.
  • the presence of at least two identical recognition sequences for a specific recombinase is necessary.
  • different recombination systems or recombinases are used.
  • at least two different recognition sequences selected from the loxP and rox recombination recognition sequences are inserted into the target DNA. This allows, for example, the subsequent insertion of two different DNA fragments adjacent to different recognition sequences, for example one DNA fragment using the rox recognition sequence and the Dre recombinase and the other DNA fragment using, for example, the loxP recognition sequence and the Cre recombinase can be inserted.
  • the method of modifying microorganisms is further elaborated in the examples.
  • a marker gene for the identification and selection of the modified host cells is also introduced into the target DNA.
  • marker genes are known to those skilled in the art and described in the literature (DeWet et al., Mol. Cell Biol., 1987, 7, 725-737, Goff et al., EMBO J., 1990, 9, 2517-2522, Kain et al., BioTechniques, 1995, 19, 650-655; Chiu et al., Current Biology, 1996, 6, 325-330).
  • biosynthetic gene cluster II The entire biosynthetic gene cluster (biosynthetic gene cluster II) of a natural product, whose synthesis is desired in large quantities, is also cloned with the new technology and then brought into the altered overproduction strain. It may be possible to previously exchange promoters on the biosynthetic gene cluster II. Thus, the synthetic power for the natural product I is transferred to the synthesis power for the natural product II.
  • Figure 1 relates to Cre-Iox reactions depending on the orientation and spatial arrangement of the loxP interfaces. Paired loxP recognition sequences (triangles) are directional and can be localized in cis (the same DNA strand) or trans (different DNA strands) array.
  • Figure 2 shows the activity of Cre recombinase in Streptomyces lividans. Schematically, it is shown how int ⁇ C31, the gene coding for the integrase of phage ⁇ C31, is introduced into the chromosome of S. lividans.
  • Figures 4A and 4B show the original sequences (gene sequences SEQ ID NO: 1 and
  • Figure 6 shows the recognition sequences loxP (SEQ ID NO: 8) and rox (SEQ ID NO: 9).
  • FIGS. 7A-D show the plasmids according to the invention pUWL-T, pUWL-A, pUWL-H, and pNL1, which can be used to introduce and express the recombinases in actinomycetes.
  • pUWL-T was obtained from pUW201 by introducing the oriT (sequence important for the conjugation process).
  • pUWL-A and pUWL-H were generated from pUWL-T by replacing the antibiotic resistance genes (T, thiostrepton, A, apramycin, H, hygromycin).
  • pNL1 was generated from pI8600 (cloning an Eco / RI-bamHI fragment containing the tipA promoter and the thiostrepton resistance gene) and pKC1139 (cloning an Eco / RI- ⁇ g / II fragment containing the temperature-sensitive replicon pSG5 and the apramycin resistance aac (3 IV).
  • ermE strong promoter for expression in actinomycetes
  • bla ⁇ -lactamase
  • ori CoIEI origin of replication necessary for replication in E. coli
  • ori pUC18 origin of replication necessary for replication in E. coli
  • tsr thiostrepton resistance gene
  • aac (3) IV apramycin resistance gene, hyg, hygromycin resistance gene , rep PIJ101 , origin of replication necessary for replication in actinomycetes.
  • pSG5 rep temperature-sensitive replication origin necessary for replication in streptomycetes, tipA, thiostrepton promoter;
  • Figures 7E and 7F show maps of plasmids incorporating the synthetic codon-optimized cre (a) gene of the present invention.
  • Figure 7E shows schematically the plasmid pNLCRE and
  • Figure 7F shows schematically the plasmid pUWLCRE.
  • Figures 8A and B show the plasmids of the present invention which can be used to delete and clone a natural product biosynthetic gene cluster.
  • Plasmid pDel1 and pDel2 were prepared by PCR fusion. Starting vectors for the PCR were pUC19 and plJ773 (Khodakaramian et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34, e20).
  • Figure 9 shows Table 1.
  • Table 1 shows the codon usage of actinomycetes. (Http://www.nih.go.jp/ ⁇ jun/act/codon/104.html).
  • the strain Streptomyces lividans TK24 was used as a model strain to carry out the expression of the native Cre and the synthetic Cre (a) genes.
  • E. coli strain DH5a was used and strain ET12567 / pUZ8002 was used to effect the conjugative transfer of unmethylated nucleic acid from E. coli to S. lividans.
  • the native Cre gene includes 145 codons which are used, for example, in Streptomyces coelicolor with a frequency of less than 1%. These codons can therefore be considered as rare codons. Because gene expression from rare codons can lead to errors in translation, modified genes according to the invention have been designed and synthesized (cre (a)) using the preferred codons of Streptomyces coelicolor. Genes of the genus Streptomyces have a GC content that is typically greater than 70%. The genes according to the invention preferably have a G + C content of more than 65%. Particularly preferred is a G + C content of 67.7% for cre (a).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die rekombinante Modifizierung von Mikroorganismen, insbesondere Aktinomyceten. Diese erfolgt unter Verwendung der Rekombinationssysteme Dre-rox und Cre-Iox. Die vorliegende Erfindung stellt neue Nukleotidsequenzen für die Rekombinasen der vorstehend genannten Rekombinationssysteme zur Verfügung. Hierbei wurden synthetische Gene hergestellt, die die von Aktinomyceten bevorzugten Codons aufweisen und daher in diesen Wirtsorganismen verwendet werden können. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Modifizierung von Mikroorganismen ist es möglich Überproduktionsstämme zu erzeugen, die von wirtschaftlicher Bedeutung für die Herstellung von medizinischen Wirkstoffen sind.

Description

Herstellung von genetisch modifizierten Aktinomyceten durch Rekombination
Die vorliegende Erfindung betrifft in Wirtszellen replizierbare Nukleinsäuremoleküle, die neue DNA-Sequenzen enthalten, die für die Dre- oder Cre-Rekombinase kodieren. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Rekombinationssystem zum Verändern von DNA- Fragmenten (Ausschneiden, Integrieren, Invertieren oder Translozieren) des Genoms (Ziel- DNA) von Aktinomyceten. Zudem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Aktinomyceten, sowie die modifizierten Mikroorganismen selbst, die durch dieses Verfahren hergestellt wurden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Aktinomyceten solche grampositiven Bakterien verstanden, die ein hohes G+C-Verhältnis aufweisen. Insbesondere handelt es sich hierbei um solche Bakterien, die natürlicherweise im Boden anzutreffend sind und bevorzugt zur Spezies Streptomyces gehören.
Fast die Hälfte aller Arzneistoffe auf dem Markt sind Naturstoffe oder sind von solchen abgeleitet. Eine Vielzahl der Wirkstoffe wird unter Verwendung von Mikroorganismen hergestellt. Einige erfolgreiche Beispiele auf dem Markt sind die Antibiotika Erythromycin, Tetracyclin oder die Immunsuppressiva Cyclosporin, FK506 und Rapamycin.
Ein Verfahren zur Herstellung von Naturstoffen bzw. Sekundärmetaboliten ist die "kombinatorische Biosynthese". In diesem Verfahren werden künstliche Biosynthesewege aus einer großen, ständig wachsenden Sammlung an Genen geschaffen, die an Naturstoffsynthesen beteiligt sind. Dazu ist zunächst die oftmals arbeitsintensive und zeitaufwendige Konstruktion von Mutanten eines Bakterienstammes notwendig. Diese Mikroorganismen sollen eine" Überproduktion an Sekundärmetaboliten aufweisen und damit eine kosteneffiziente Methode zur Herstellung von Wirkstoffen ermöglichen.
Die genetische Modifizierung von Mikroorganismen kann bekannterweise durch Rekombination erfolgen. Die Rekombinasen der Cre-lox- (bzw. Cre-loxP) und Dre-rox- Systeme können das Ausschneiden oder Integrieren sowie die Inversion oder Translokation von DNA-Fragmenten katalysieren, welche sich zwischen spezifischen Erkennungssequenzen befinden. Die Rekombinasen Cre und Dre benötigen hierbei keine zusätzlichen Cofaktoren (Buchholz et al., Nucleic Acids Res. 1996, 24, 3118-3119; Huang et al., J. Bactehol. 1997, 179, 6076-6083; Shimshek et al., Genesis, 2002, 32, 19-26).
Bei einem derartigen Rekombinationsverfahren ist es notwendig, die Nukleinsäuren, die für die Rekombinasen kodieren, in die Wirtszelle einzubringen und zu exprimieren. Dies kann beispielsweise mittels eines Plasmids erfolgen, wobei bei Verwendung von induzierbaren Promotoren die Expression der Rekombinasen gesteuert werden kann. Die Rekombinasen können dann die Veränderung des Genoms der Wirtszelle bewirken. Die Art der Rekombination wird hierbei durch die Anordnung der Erkennungssequenzen loxP und rox zueinander auf einem DNA-Abschnitt bestimmt.
Das Einbringen von Erkennungssequenzen in das Genom der Wirtszelle kann durch übliche Verfahren, beispielsweise durch die homologe Rekombination erfolgen. Bei Anwesenheit von zwei gleichen Erkennungssequenzen kann die Rekombinase das Ausschneiden des DNA-Fragments, das sich zwischen diesen Erkennungssequenzen befindet, bewirken, wobei das ausgeschnittene DNA-Fragment anschließend cyclisieren kann. Des Weiteren ist es möglich, cyclische Nukleinsäuremoleküle, die eine Erkennungssequenz aufweisen, z.B. in Form eines Plasmids, in das Genom der Wirtszelle einzufügen. Hierzu ist im Genom der Wirtszelle ebenfalls eine Erkennungssequenz notwendig, woraufhin die Rekombinase einen Austausch der Nukleinsäurestränge an den Erkennungssequenzen bewirkt. Auf ähnliche Weise erfolgt das Einfügen eines cyclischen Nukleinsäuremoleküls in E. co//-Stämmen unter Verwendung der Erkennungssequenzen attP (Erkennungssequenz eines Bakteriophagen) und attB (bakterielle Erkennungssequenz, siehe Abbildung 2). Dieser Vorgang wird durch zwei Enzyme katalysiert: dem Phagenprotein Integrase und dem bakteriellen Integration Host Factor (IHF). Das Phagengenom liegt nach der Integration als Prophage im bakteriellen Genom vor, und wird von den neugebildeten Rekombinationsstellen flankiert.
Abbildung 1 zeigt das Ausschneiden eines Genfragments (A), das Invertieren eines Genfragments (B) sowie die Translokation eines Genfragments (C). Hierbei werden richtungsabhängige loxP-Erkennungssequenzen und die Cre-Rekombinase verwendet. Die loxP-Erkennungssequenzen bestehen aus einer Basenregion (acht Basenpaare), die von zwei invertierten Wiederholungen (inverted repeats, 13 Basenpaare) flankiert wird, die als Erkennungssequenzen für die DNA-Bindung von Cre dienen (Mack et al., Nucleic Acid Res., 1992, 20, 4451-4455; Hoess et al., J. Mol. Biol., 1990, 216, 873-882). Das Rekombinationsereignis ist lediglich von diesen beiden Bestandteilen abhängig und wird mit absoluter Zuverlässigkeit durchgeführt.
Von besonderer Bedeutung für die Rekombination mittels Rekombinasen ist die Fähigkeit der Wirtszelle, die Rekombinasen zu exprimieren. Die Dre- und Cre-vermittelte Rekombination ist sowohl in E. coli als auch in eukaryotischen Zellen einschließlich Drosophila-, Maus-, Mais-, Reis-, Arabidopsis- und Tabakzellen möglich (Campo et al., Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68, 2359-2367; Golic et al., Ce//, 1989, 59, 499-509; Posfai et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 2392-2398; Sauer and McDermott, Nucleic Acid Res. 2004, 18, 6086-6095).
Sauer et al., Nucleic Acid Research (2004), S. 6086 - 6095, beschreiben die Anwendung der Cre-Rekombinase des Bakteriophagen P1 bei verschiedenen E. co//-Stämmen. Suzuki et al., Applied and Environmental Microbiology (2005), S. 8472 - 8480 und Appl. Microbiol. Biotechnol. (2005), S. 225 - 233, beschreiben ein Cre/loxP-vermitteltes Deletionssystem in Corynebacterium glutamicum. Das dort beschriebene System kann jedoch nicht ohne weiteres auf andere Bakterien mit hohem G+C-Gehalt übertragen werden.
Die oben dargestellten Rekombinationssysteme können mittels Plasmiden in Aktinomyceten eingebracht und dort vervielfältigt werden. Hierbei können die Nukleotidsequenzen, die für die Cre- und Dre-Rekombinasen kodieren, zusammen mit den notwendigen Promotoren und Replikationsursprüngen in ein geeignetes Plasmid kloniert werden. Dieses Plasmid kann beispielsweise mittels Konjugation in einen Mikroorganismus eingebracht und dort vervielfältigt werden. Kritisch ist, ob die Rekombinasen in den Wirtsorganismen exprimiert werden.
Die in den Wirtsorganismus eingebrachten Rekombinationssysteme sollen in der Lage sein, beispielsweise DNA-Fragmente in das Genom eines Wirtsorganismus einzufügen oder aus diesem herauszuschneiden. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, Gene des Wirtsorganismus an- oder auszuschalten, wobei dies die Produktion der gewünschten Wirkstoffe bzw. Sekundärmetaboliten beeinflusst.
Besonders geeignete Mikroorganismen für die Produktion von Naturstoffen sind die Aktinomyceten und dabei besonders Stämme, die zur Gattung Streptomyces gehören. Kürzlich wurde ein Verfahren zur Verwendung des Cre-Iox-Systems in Streptomyces coelicolor entwickelt (Khodakaramian et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34, e20). Dieses System ist jedoch nur bedingt in anderen Stämmen einsetzbar. Es basiert auf dem Phagen φC31 , der nicht alle Stämme transfizieren kann. Außerdem ist der Umgang mit Phagen im Zusammenhang mit Streptomyceten nicht einfach, so dass eine Routineanwendung nicht möglich ist. Versuche, die Flp-Rekombinasen in Aktinomyceten zu exprimieren, waren bisher nicht erfolgreich (Khodakaramian et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34, e20).
Des Weiteren ist die heterologe Expression von Proteinen oft schwierig. Beobachtet wird, dass Transkription und Translation erfolgreich verlaufen, die Faltung der Proteine jedoch nicht gelingt. Proteasen können die fremden Proteine erkennen und zerstören. Überraschenderweise war es nun möglich, die oben dargestellten Rekombinationssysteme an Aktinomyceten dadurch anzupassen, dass die Codon-Usage der Gene, die für die Rekombinasen kodieren, optimiert wurde. Durch die Verwendung von Codon-Usage optimierten synthetischen Genen ist es nun möglich, eine Expression der Gene in Aktinomyceten zu ermöglichen, die für das Rekombinationssystem essentiell sind. Dadurch werden die vorteilhaften Rekombinationsverfahren für die Aktinomyceten anwendbar.
Des Weiteren ist es nicht nur von Nachteil, wenn ein System zur Rekombination nur in einem speziellen Stamm anwendbar ist, sondern es ist auch von Nachteil wenn nur ein System zur Rekombination in diesem Stamm funktioniert. Da nicht beliebig viele Erkennungssequenzen in ein Chromosom eingebaut werden können - dies führt zu unerwünschten sekundären Effekten -, sind komplexe Modifikationen, die den Austausch mehrerer Genfragmente benötigen, nicht mit einem Rekombinationssystem alleine möglich. Es wäre daher wünschenswert, komplexe Modifikationen an Mikroorganismen dadurch zu ermöglichen, dass verschiedene Rekombinationsverfahren in Kombination eingesetzt werden können.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Cre-lox- bzw. Dre-rox- Rekombinationssysteme für die Gattung der Aktinomyceten anwendbar zu machen. Insbesondere soll hierbei eine Kombination von verschiedenen Rekombinationssystemen zur Herstellung eines Überproduktionsstammes möglich werden.
Diese Aufgabe wird daher durch die erfindungsgemäßen Rekombinationssysteme mit neuen Nukleinsäuresequenzen, die für die Rekombinasen kodieren, gelöst. Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb in Wirtszellen replizierbare Nukleinsäuremoleküle und zugehörigen Erkennungssequenzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in Wirtszellen replizierbare Nukleinsäure- molekül dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i) DNA-Sequenzen, die über die ganze Länge mindestens 80% Identität zu der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweisen und für eine Dre-Rekombinase kodieren, ii) DNA-Sequenzen, die über die ganze Länge mindestens 80% Identität zu der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweisen und für eine Cre-Rekombinase kodieren, enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die DNA-Sequenzen mindestens 90% Identität und noch bevorzugter mindestens 95% Identität zu den Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr.4 bzw. 5 auf.
Das in Wirtszellen replizierbare Nukleinsäuremolekül aus der Gruppe i) - ii) weist Nukleotidtripletts auf, die zu mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80% und besonders bevorzugt mindestens 90% solche Codons darstellen, die von Aktinomyceten bevorzugt sind. Das in Wirtszellen replizierbare Nukleinsäuremolekül kann dadurch bevorzugt in Wirtszellen, wie einem Escherichia coli- und einem oder mehr Λto/nomyceteπ-Stämmen repliziert werden. Vorteilhafterweise kann es in einem Aktinomyceten-Stamm nicht nur vervielfältigt, sondern auch exprimiert werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Rekombinationssystem in Wirtszellen replizierbar, wobei die Wirtszellen einen Streptomyceten -Stamm darstellen, wobei Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamonensis, Actinoplanes sp. SE50/110, Streptomyces galilaeus, Streptomyces nodosus, Actinosynnema pretiosum subsp. Auranticum, Streptomyces virido-chromogenes Tü57, Streptomyces echinatus, Streptomyces avermitilis MA-4680, Micromonospora echinospora, Streptomyces sp. FR-008, Streptomyces chartreusis, Streptomyces bikiniensis, Streptomyces roseochromogenes subsp. oscitans DS12.976, Streptomyces griseus subsp. griseus, Streptomyces neyagawaensis, Streptomyces olindensis, Streptomyces rishiriensis DSM 40489, Streptomyces venezuelae, Streptomyces peucetius, Streptomyces olivaceus TÜ2353, Saccharopolyspora erythraea, Micromonospora carbonacea var. Africana ATCC39149, Streptomyces griseoflavus GÖ3592, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces violaceoruber Tü22, Amycolatopsis orientalis, Amycolatopsis orientalis, Amycolatopsis mediterrane! (balhimycinä) DSM5908, Micromonospora echinospora ATCC 15835, Streptomyces griseoruber, Streptomyces aureofaciaens Tü11 , Streptomyces antibioticus Tü99, Streptomyces antibioticus TÜ1718, Streptomyces sp. TÜ2187, Streptomyces sp. TÜ1156, Streptomyces sp. FU107, Streptomyces sp. FU36, Streptomyces venezuelae ISP5230, Streptomyces kanamyceticus, Streptomyces cyanogenus S 136, Streptomyces aureofaciens Tu 117, Streptomyces rochei, Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces sp. AM-7161 , Micromonospora megalomicea, Streptomyces argillaceus, Streptomyces carzinostaticus ATCC 15944, Streptomyces fradiae NCIB 8233, Streptomyces spheroides, NCIMB 11891 , Streptomyces noursei ATCC 11455, Streptomyces antibioticus, Actinoplanes teichomyceticus, Streptomyces natalensis, Streptomyces sp. Tu 6071 , Streptomyces diastato-chromogenes TÜ6028, Lechevalieria aerocolonigenes ATCC39243, Saccharothrix espanaensis, Micromonospora sp. TCi 6368, Streptomyces antibioticus TÜ6040, Streptomyces nogalater, Sorangium cellulosum So ce12, Saccharopolyspora, Spinosa, Streptomyces sp. TP-A0274, Streptomyces steffisburgensis NRRL 3193, Streptomyces griseus, Streptomyces fradice, Streptomyces fradiae TÜ2717, und Streptomyces halstedii HC-34 bevorzugt sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist das in Wirtszellen replizierbare Nukleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet, dass es ein Plasmid darstellt.
In einer anderen Ausführungsform ist das in Wirtszellen replizierbare Nukleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet, das Plasmid einen ErmE- oder tipA-Promotor aufweist.
Weiter bevorzugt ist das in Wirtszellen replizierbare Nukleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: pUWL- T-Dre, pUWL-A-Dre, pUWL-H-Dre, pNL1-Der, pML1-Dre und pAL1-Dre, pUWL-T-Cre, pUWL-A-Cre, pUWL-H-Cre, pNL1-Cre, pML1-Cre und pAL1-Cre.
Die Erfindung betrifft ein Rekombinationssystem zum Ausschneiden, Integrieren, Invertieren oder Translokieren von DNA-Fragmenten aus/in dem/das Genom (Ziel-DNA) von Acetomyceten, das mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül und mindestens eine Erkennungssequenz in der Ziel-DNA aufweist. Weiter bevorzugt umfasst das Rekombinationssystem ein DNA-Fragment, das in das Genom der Aktinomyceten eingefügt werden soll. Weiter bevorzugt wird das einzufügende DNA-Fragment mittels eines Plasmids in die Wirtszelle eingebracht. Bevorzugterweise umfasst das Plasmid hierbei eine Erkennungssequenz, die einer Erkennungssequenz in der Ziel-DNA entspricht. Weiter bevorzugt umfasst das Plasmid zusätzlich die notwendigen Replikationsursprünge für Aktinomyceten und für E. coli. Noch weiter bevorzugt weist das einzufügende DNA- Fragment eine Länge von wenigstens 1000 Basenpaaren auf.
Das Rekombinationssystem weist eine Erkennungssequenz auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: loxP- und rox-Erkennungssequenzen.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Rekombinationssystem dadurch gekennzeichnet, dass die Ziel-DNA mindestens zwei Erkennungssequenzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus loxP- und rox-Erkennungssequenzen, enthält. Weiter bevorzugt enthält die Ziel-DNA zwei unterschiedliche Erkennungssequenzen aus der vorstehend genannten Gruppe. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Rekombinationssystem dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuremoleküle, die für die Rekombinasen kodieren, in einem Plasmid enthalten sind und das Plasmid in einen Escherichia co//-Stamm vermehrt und/oder >4M//7omyceteΛ7-Stamm eingeführt und dort repliziert und/oder exprimiert wird.
Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Aktinomyceten, umfassend die folgenden Schritte: a) Einfügen von mindestens einer Erkennungssequenz in das Genom (Ziel-DNA) des Aktinomyceten, wobei die Erkennungssequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus loxP- und rox-Erkennungssequenzen, b) Einbringen mindestens eines Plasmids in den Aktinomyceten, wobei das Plasmid ein replizierbares Nukleinsäuremolekül enthaltend eine codonoptimierte Rekombinase darstellt, und c) Vervielfältigen des Plasmids aus b) und Exprimieren der Rekombinase, die für die Erkennungssequenz(en) der Ziel-DNA spezifisch ist, ein DNA-Fragment der Ziel- DNA ausschneidet, transloziert, invertiert oder ein DNA-Fragment in die Ziel-DNA einfügt.
In einer anderen Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Erkennungssequenzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus loxP- und rox-Erkennungssequenzen in die Ziel-DNA eingefügt werden.
Weiter bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei unterschiedliche erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle verwendet werden. Hierbei ist es bevorzugt, dass mindestens zwei verschiedene DNA-Fragmente durch mindestens zwei verschiedene erfindungsgemäße Rekombinationssysteme in die Ziel-DNA eingefügt oder aus dieser herausgeschnitten werden können.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung eines Rekombinationssystems zum Ausschneiden, Integrieren, Invertieren oder Translokieren von DNA-Fragmenten in Aktinomyceten. Des Weiteren betrifft die Erfindung einen modifizierten Mikroorganismus, hergestellt durch das erfindungsgemäße Verfahren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle ermöglichen erstmals das Herstellen von Plasmiden, die in Aktinomyceten und Streptomyceten vervielfältigt werden können. Die Expression der neuen erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen bzw. Nukleinsäuremoleküle in den Wirtsorganismen führt zu den Rekombinasen, die eine Veränderung des Genoms der Wirtszelle durch Rekombination ermöglichen.
Besonders vorteilhaft ist dabei, dass die Rekombinationssysteme Cre-lox und Dre-rox nun für alle Aktinomyceten geeignet sind. Dadurch wird es insbesondere möglich, die verschiedenen Systeme zur Rekombination miteinander zu kombinieren um die Möglichkeiten hinsichtlich des Austausches mehrerer Fragmente in einem Genom zu erweitern.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht des Weiteren auf vorteilhafte Weise die Deletion und das gleichzeitige Klonieren von Biosynthesegenclustern. Dies wiederum ermöglich die schnelle Generierung von Mutanten und somit die schnelle und effiziente Generierung neuer Naturstoffe.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, dass Überproduktionsstämme, die Naturstoffe, Wirkstoffe bzw. Sekundärmetaboliten produzieren, in kürzester Zeit hergestellt werden können.
Im Nachfolgenden werden die Rekombinationssysteme mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen bzw. Nukleinsäuremolekülen detailliert erläutert.
"Ziel-DNA", so wie hier verwendet, bezeichnet das Genom des Aktinomyceten oder ein extrachromosomales Plasmid des Aktinomyceten, das modifiziert werden soll. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird in einem ersten Schritt mindestens eine Erkennungssequenz in die Ziel-DNA eingefügt. Diese Erkennungssequenzen können von den Rekombinasen erkannt werden, woraufhin die Rekombinasen die Modifizierung der Ziel-DNA bewirken. Das Einfügen von loxP- und rox-Erkennungssequenzen kann durch Techniken erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind (siehe Beispiele). Eine Möglichkeit zum Einbringen von Erkennungssequenzen in das Genom der Wirtszelle ist in Abbildung 2 dargestellt. Hierbei wird zunächst ein Plasmid in den Mikroorganismus, hier vom Stamm Streptomyces lividans, eingebracht. Dieses Plasmid (Abb. 2A) umfasst die Erkennungssequenzen (loxP) und eine Bakteriophagenrekombinationsstelle (attP), die an die Region attB (attachment side on the bacterial chromosome) des Chromosoms der Wirtszelle binden kann. Es erfolgt eine Rekombination und das Nukleinsäuremolekül des Plasmids wird in das Genom der Wirtszelle integriert. Wie aus Abbildung 2 ersichtlich, sind nun zwei loxP-Erkennungssequenzen in der Ziel-DNA enthalten. In Abbildung 2 stellt der Teil A) eine schematische Darstellung des Plasmids mit der Bezeichnung plNT13 dar. In Zeile B) wird die Integration des Plasmides plNT13 in das Chromosom von S. lividans dargestellt.
Abbildung 2 C) zeigt die Entfernung eines Apramycin-Resistenz-Gens (aac(3)IV), das von den beiden loxP-Stellen flankiert ist mit Hilfe der Cre-Rekombinase. Bei loxP handelt es sich um die Erkennungssequenz für die Cre-Rekombinase. Im übrigen bedeuten die Abkürzungen in Abbildung 2: oriT: Origin of plasmid transfer, bla: Ampicillin-Resistenz-Gen; intφC31: Gen kodierend die Integrase des Phagen φC31 , die erforderlich ist für die Integration des Plasmids plNT13 in das Chromosom von S. lividans; attP: Anheftungsstelle des Phagen φC31 ; attB: φC31 attachment site im S. //V/dans-Chromosom.
Abbildung 3 verdeutlicht die Aktivität der Dre-Rekombinase in Streptomyces lividans. Abbildung 3 A) zeigt eine Karte des Plasmids plNT33, wobei rox Zielsequenz für die Dre- Rekombinase darstellt, bla bedeutet das Ampicillin-Resistenz-Gen und aac(3)IV bedeutet das Apramycin-Resistenz-Gen. oriT ist der Origin des Plasmidtransfers, int φC31 das Gen kodierend für die Integrase des Phagens φC31 , das erforderlicht ist für die Integration des Plasmids plNT33 in das Chromosom des Ziel-Aktinomyceten. attP ist die Anheftungsstelle des Phagen φC31 und attB- φC31 ist die Anheftungsstelle im Aktinomyceten-Chromosom. Nach einer spezifischen Integration wird das Plasmid in das Chromosom des Zielorganismus S. lividans integriert. Dies ist schematisch in Abbildung 3 B) dargestellt. Wenn die Integrase Dre korrekt im Zielorganismus exprimiert wird, findet nun durch Rekombination ein Ausschneiden der zwischen den beiden rox-Stellen befindlichen Nukleinsäuresequenz (hier oriT und aac(3)IV) statt. Das Rekombinationsprodukt ist in Abbildung 3C dargestellt. Bevorzugterweise enthält die Ziel-DNA nach dem Einfügen von Erkennungssequenzen mindestens eine, weiter bevorzugt mindestens zwei, noch weiter bevorzugt mindestens drei und am meisten bevorzugt mindestens vier Erkennungssequenzen, die von einer Rekombinase erkannt werden können. Weiter bevorzugt ist es hierbei, dass die Ziel-DNA dann mindestens zwei Erkennungssequenzen aufweist, die jeweils von unterschiedlichen Rekombinasen erkannt werden können. Weiter bevorzugt werden mindestens drei, weiter bevorzugt mindestens vier, noch weiter bevorzugt mindestens fünf Erkennungssequenzen in die Ziel-DNA eingefügt, wobei mindestens zwei Erkennungssequenzen von unterschiedlichen Rekombinasen erkannt werden können.
Zur Durchführung von Modifizierungen der Ziel-DNA sind Rekombinasen notwendig. Diese werden durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die für diese Proteine kodieren, zur Verfügung gestellt. Diese Nukleinsäuremoleküle sind synthetische Gene, die durch Codon-usage-Optimierung hergestellt wurden. Hierbei wurden die von Aktinomyceten bevorzugten Codons verwendet. In Tabelle 1 sind die von Aktinomyceten bevorzugten Codons aufgeführt.
Um die synthetischen Gene zu erhalten, wurden die nicht von Aktinomyceten bevorzugten Tripletts in den natürlichen Genen der Cre- und Dre-Rekombinasen gegen Codons ausgetauscht, die von Aktinomyceten bevorzugt sind. Die natürlichen Nukleotidsequenzen der Dre-Rekombinase (SEQ ID Nr: 1 , Genbank-Nr. AAV84949), der Cre-Rekombinase (SEQ ID Nr:2, Genbank-Nr. YP_006472), sind bekannt. In den Abbildungen 4A und 4B sind die Sequenzen der Rekombinasen und Rekombinasegene dargestellt (SEQ ID Nr: 10-12).
Durch Austausch aller von Aktinomyceten nicht bevorzugten Codons der natürlichen Nukleotidsequenzen gegen Codons, die gemäß Tabelle 1 von Aktinomyceten bevorzugt sind, wurden die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen der Dre-Rekombinase (SEQ ID Nr:4) sowie der Cre-Rekombinase (SEQ ID Nr:5) erhalten. In Abbildung 5 sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen dargestellt.
Verfahren zur Herstellung von synthetischen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben (Hoover und Lubkowski, Nucleic Acids Res., 2002 30 (10), e43). Zur Ableitung der Primersequenzen wurde die Software „DNA Works" (http://molbio.info.nih.gov/dnaworks) eingesetzt. Dieses Programm berechnet ausgehend von der gewünschten Aminosäuresequenz, den Daten aus einer artspezifischen Codongebrauchstabelle (Tabelle 1) und der gewünschten Länge und Schmelztemperatur der Oligonukleotide die „optimalen Primer".
Um das erfindungsgemäße Verfahren zur Modifizierung von Aktinomyceten durchführen zu können, ist es nicht notwendig, dass der Codon-Usage zu 100 % an die Aktinomyceten angepasst wird. Programme zur Erstellung von DNA-Sequenzen, die Codon-Usage optimiert sind, sind dem Fachmann bekannt (beispielsweise "Prot2DNA"). Die Synthese der berechneten Sequenzen kann beispielsweise unter Verwendung von Primern mit 20 Basenpaaren erfolgen. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen weisen daher eine Identität von mindestens 80 %, weiter bevorzugt von mindestens 85 %, weiter bevorzugt von mindestens 90 %, noch weiter bevorzugt von mindestens 95 %, weiter bevorzugt von mindestens 98 % und am meisten bevorzugt von 100 % mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr.4-5 auf.
Der Ausdruck, dass eine DNA-Sequenz eine "Identität zu einer Nukleotidsequenz" aufweist, bedeutet, dass die zu vergleichenden Sequenzen, unter Verwendung eines üblichen Programms zum Vergleich von Nukleotidsequenzen, bei Standardparametern die spezifizierte prozentuale Übereinstimmung aufweisen.
Noch weiter bevorzugt weisen die Nukleinsäuremoleküle zu mindestens 70 % solche Codons auf, die von Aktinomyceten bevorzugt und in Tabelle 1 aufgeführt sind. Weiter bevorzugt weisen die Nukleinsäuremoleküle zu mindestens 75 %, weiter bevorzugt zu mindestens 80 %, noch weiter bevorzugt zu mindestens 85 %, noch weiter bevorzugt zu mindestens 90 % und am meisten bevorzugt zu mindestens 95 % von Aktinomyceten bevorzugte Codons aus Tabelle 1 auf.
Die Transformation (Aufnahme von DNA in prokaryotische Zellen) der Wirtszellen erfolgt mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, den einzufügenden DNA-Fragmenten sowie den Erkennungssequenzen bevorzugt unter Verwendung von Plasmiden. Hierbei können einerseits Plasmide verwendet werden, die die Nukleotidsequenzen enthalten, die für die Rekombinasen kodieren. Des Weiteren können Plasmide verwendet werden, um Erkennungssequenzen oder DNA-Fragmente in das Genom der Wirtszelle einzufügen.
Diese Plasmide tragen bevorzugt Gene die es ermöglichen, DNA-Fragmente in Aktinomyceten einzubringen: Bei replizierenden Vektoren (Beispiel: pUWL-T): ori-Rep (E. coli), Replikationsursprung; ori-Rep (Actinomycef), Relikationsursprung; Antibiotika- Resistenzgen (E. coli); Antibiotika-Resistenzgen {Actinomycet); oriT - Sequenz notwendig für die Konjugation von E. coli zu den Actinomyceten (dies wird bei Transformationen nicht benötigt (dann Verwendung von pUWL201 möglich).
Bei integrierenden Vektoren: (Beispiel: plnt): intφC31 - Integrase kodierendes Gen des Phagen φC31 notwendig für die Integration des Vektors in das Genom; attP, Erkennungssequenz des Plagen C31 notwendig für die Integration des Vektors in das Genom; ori-Rep (E coli), Relikationsursprung; Antibiotika-Resistenzgen (E. coli); Antibiotika-Resistenzgen (Actinomycet); oriT - Sequenz notwendig für die Konjugation von E. coli zu den Actinomyceten (Bierman et al., Gene 1992, 116, 43).
Dies geschieht mit der sogenannten Konjugation, bei der ein Plasmid von einem E. coli- Stamm in einen Streptomyceten eingebracht wird. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen liegen hierbei im Plasmid zusätzlich bevorzugt hinter einem ErmE- Promotor, der einen konstitutiven Promotor darstellt. Dadurch wird das Gen ständig exprimiert. Zusätzlich bevorzugt umfasst das Plasmid einen Replikationsursprung für Aktinomyceten. Zusätzlich bevorzugt enthält es auch einen Replikationsursprung für die Replikation in E. coli. Zusätzlich bevorzugt enthält das Plasmid auch ein Antibiotikum- Resistenzgen wie z.B. das Thiostreptonresistenzgen (tsr), das Apramycinresistenzgen (apr), das Hygromycinresistenzgen (hyg). Zusätzlich bevorzugt enthält das Plasmid auch einen induzierbaren Promoter (z.B. einen mit Thiostrepton induzierbaren Promoter) (Takano et al., Gene 1995, 166, 133.)
Geeignete Plasmide sowie notwendige Promotoren, Replikationsursprünge usw. sind dem Fachmann bekannt und können von diesem für die Transformation bzw. Konjugation von Aktinomyceten ausgewählt werden. Besonders bevorzugte Plasmide, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind pUWL201 , pSET152, pKC1218 etc. (Bierman et al., Gene 1992, 116, 43.)
Erfindungsgemäß bevorzugte Plasmide sind pUWL-T, pUWL-A, pUWL-H, pNL1 , pML1 und pAL1. Ein Plasmid kann aber durchaus ein, zwei oder drei Gene enthalten, die für unterschiedliche Rekombinasen kodieren). Mit den erfindungsgemäßen Rekombinationssystemen ist das Ausschneiden, Integrieren, Invertieren oder Translokieren von DNA-Fragmenten möglich.
Die Integration der Erkennungssequenzen werden mit Plasmiden durchgeführt, die keinen ori-Rep (Replikationsursprung Aktinomyceten), keine intφC31-Gen und keine attP-Sequenz enthalten. Gene, die für Rekombinasen kodieren, werden mit replizierbaren Plasmiden, die keine intφC31-Gen und keine attP-Sequenz enthalten, in die Stämme gebracht oder sie werden mit integrativen Vektoren, die ein intφC31-Gen und eine attP-Sequenz enthalten, und einen induzierbaren Promoter enthalten, in die Stämme gebracht. Dort können die Vektoren in das Chromosom des Zielorganismus integriert werden.
Der Begriff "Ausschneiden" von DNA-Fragmenten bedeutet, dass die Nukleotidsequenz zwischen zwei Erkennungssequenzen der Ziel-DNA von den Rekombinasen herausgeschnitten wird.
Die Erkennungssequenz für die Cre-Rekombinase ist die loxP-Erkennungssequenz mit der SEQ ID Nr.7, die Erkennungssequenz der Dre-Rekombinase ist die rox- Erkennungssequenz mit der SEQ ID Nr.8. Die Synthese der Erkennungssequenzen bzw. der entsprechenden Nukleinsäuremoleküle kann nach üblichen Verfahren erfolgen und ist dem Fachmann bekannt (Hunkapiller et al., Nature 1984, 310, 105.) Die loxP- und rox- Sequenzen sind in Abbildung 6 dargestellt.
Der Ausdruck "Integrieren" bedeutet, dass das einzufügende DNA-Fragment in einem Nukleinsäuremolekül zu einer Erkennungssequenz benachbart ist und von der Rekombinase in die Ziel-DNA integriert wird, wobei die Ziel-DNA ebenfalls diese Erkennungssequenz aufweist. Der Ausdruck „Invertieren" bedeutet, dass das zu invertierende DNA-Fragment in einem Nukleinsäuremolekül zu einer Erkennungssequenz benachbart ist und von der Rekombinase invertiert, also umgedreht wird. Damit ändert sich die Orientierung des DNA- Fragments.
Der Ausdruck "Translozieren" bedeutet, dass ein DNA-Fragment auf der Ziel-DNA benachbart zu einer Erkennungssequenz, die Position mit einem weiteren DNA-Fragment auf der selben Ziel-DNA, ebenfalls benachbart zu einer Erkennungssequenz, tauscht.
Der Ausdruck "einzufügende DNA-Fragmente", so wie hier verwendet, umfasst jegliche DNA-Sequenzen unabhängig von ihrer Basenpaaranzahl. Analog dazu kann jedes Nukleinsäuremolekül bzw. jedes DNA-Fragment zwischen zwei Erkennungssequenzen aus der Ziel-DNA ausgeschnitten werden. Das einzufügende DNA-Fragment kann bevorzugt mittels eines Plasmids in die Wirtszelle eingebracht werden. Das Plasmid weist hierbei zusätzlich bevorzugt eine Erkennungssequenz auf, die einer Erkennungssequenz in der Ziel-DNA entspricht. Des Weiteren enthält das Plasmid zusätzlich bevorzugt einen Replikationsursprung für Aktinomyceten und weiter bevorzugt einen Replikationsursprung für E. coli.
Der Ausdruck "Wirtszellen" sowie "Wirtsorganismus" bezeichnet Zellen, die in der Lage sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zu exprimieren. Dies sind alle Mikroorganismen, bei denen die gleichen Codons wie bei den Aktinomyceten bevorzugt werden (siehe Tabelle 1). Insbesondere umfasst der Ausdruck "Wirtszellen" bzw. "Wirtsorganismus" daher bevorzugt Aktinomyceten, weiter bevorzugt Streptomyceten (als Gattung der Aktinomyceten), weiter bevorzugt die spezifischen Stämme Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamonensis, Actinoplanes sp. SE507110, Streptomyces galilaeus, Streptomyces nodosus, Actinosynnema pretiosum subsp. Auranticum, Streptomyces virido-chromogenes Tü57, Streptomyces echinatus, Streptomyces avermitilis MA-4680, Micromonospora echinospora, Streptomyces sp. FR-008, Streptomyces chartreusis, Streptomyces bikiniensis, Streptomyces roseochromogenes subsp. oscitans DS12.976, Streptomyces griseus subsp. griseus, Streptomyces neyagawaensis, Streptomyces olindensis, Streptomyces rishiriensis DSM 40489, Streptomyces venezuelae, Streptomyces peucetius, Streptomyces olivaceus Tü2353, Saccharopolyspora erythraea, Micromonospora carbonacea var. Africana ATCC39149, Streptomyces griseoflavus GÖ3592, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces violaceoruber Tü22, Amycolatopsis orientalis, Amycolatopsis orientalis, Amycolatopsis mediterranei (balhimycina) DSM5908, Micromonospora echinospora ATCC 15835, Streptomyces griseoruber, Streptomyces aureofaciaens Tü11 , Streptomyces antibioticus Tü99, Streptomyces antibioticus TÜ1718, Streptomyces sp. TÜ2187, Streptomyces sp. TÜ1156, Streptomyces sp. FU107, Streptomyces sp. FU36, Streptomyces venezuelae ISP5230, Streptomyces kanamyceticus, Streptomyces cyanogenus S136, Streptomyces aureofaciens Tü117, Streptomyces rochei, Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces sp. AM-7161 , Micromonospora megalomicea, Streptomyces argillaceus, Streptomyces carzinostaticus ATCC 15944, Streptomyces fradiae NCIB 8233, Streptomyces spheroides, NCI MB 11891 , Streptomyces noursei ATCC 11455, Streptomyces antibioticus, Actinoplanes teichomyceticus, Streptomyces natalensis, Streptomyces sp. Tü 6071, Streptomyces diastato-chromogenes TÜ6028, Lechevalieria aerocolonigenes ATCC39243, Saccharothrix espanaensis, Micromonospora sp. Tü 6368, Streptomyces antibioticus TÜ6040, Streptomyces nogalater, Sorangium cellulosum So ce12, Saccharopolyspora, Spinosa, Streptomyces sp. TP-A0274, Streptomyces steffisburgensis NRRL 3193, Streptomyces griseus, Streptomyces fradice, Streptomyces fradiae TÜ2717, und Streptomyces halstedii HC-34.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von modifizierten Mikroorganismen umfasst das Einfügen von mindestens einer Erkennungssequenz, bevorzugt von zwei Erkennungssequenzen, in das Genom (Ziel-DNA) des Aktinomyceten (Schritt (a)), das Einbringen mindestens eines Plasmids mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül in den Aktinomyceten (Schritt (b)), sowie das Vervielfältigen des Plasmids und Expression der Rekombinasen, die die Ziel-DNA modifiziert/modifizieren (Schritt (c)).
Schritt (a): In diesem Schritt werden Erkennungssequenzen in die Ziel-DNA eingefügt, wobei die Erkennungssequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus loxP- und rox-Erkennungssequenzen. Das Einfügen der Erkennungssequenzen erfolgt bevorzugterweise unter Verwendung von Plasmiden. Das Einfügen der Nukleinsäuremoleküle, die die Erkennungssequenzen enthalten, kann beispielsweise über homologe Rekombination unter Verwendung homologer DNA erfolgen, die bevorzugterweise ebenfalls im Plasmid enthalten ist. Zusätzlich bevorzugt enthält das Plasmid des Weiteren notwendige Promotoren und Replikationsursprünge für E. coli- Stämme.
Schritt (b): In einem anschließenden Schritt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in die Aktinomyceten eingebracht. Bevorzugterweise erfolgt dies ebenfalls unter Verwendung von Plasmiden. Das Einbringen der Plasmide in die Aktinomyceten erfolgt wie in Schritt (a) mittels Transformation (bzw. Konjugation). Bevorzugterweise umfassen diese Plasmide die notwendigen Promotoren und Replikationsursprünge für Aktinomyceten und E. co//-Stämme, weiter bevorzugt für Aktinomyceten.
Schritt (c): In einem anschließenden Schritt wird das Plasmid aus Schritt (b) in dem Aktinomyceten vervielfältigt. Das Vervielfältigen der Plasmide in den Schritten (a) und (b) kann unter Verwendung üblicher Bedingungen erreicht werden. Des Weiteren werden die Plasmide in den Aktinomyceten exprimiert bzw. die Rekombinasen dadurch hergestellt. Die Rekombinasen erkennen dann die Erkennungssequenzen in der Ziel-DNA und bewirken ortsspezifische Veränderungen der Ziel-DNA.
Wird in Schritt (c) des obigen Verfahrens mindestens ein DNA-Fragment in die Ziel-DNA eingefügt, so wird hierzu zusätzlich bevorzugt ein weiteres Plasmid verwendet, das das einzufügende DNA-Fragment und eine Erkennungssequenz enthält, wobei die Erkennungssequenz der Ziel-DNA entspricht. Werden mehr als ein DNA-Fragment in die Ziel-DNA eingefügt, so können dazu mehrere Plasmide verwendet werden. Bevorzugt enthalten diese Plasmide zusätzlich die notwendigen Promotoren und Replikationsursprünge für die Vervielfältigung in Aktinomyceten.
Die Bedingungen zur Transformation (bzw. Konjugation) von Wirtszellen sind dem Fachmann aus der Literatur bekannt (Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, 2000).
Für das Ausschneiden von DNA-Fragmenten ist das Vorhandensein von mindestens zwei gleichen Erkennungssequenzen für eine spezifische Rekombinase notwendig. Bevorzugterweise werden beim Einfügen von mehr als einem DNA-Fragment verschiedene Rekombinationssysteme bzw. Rekombinasen verwendet. Hierbei werden bevorzugt mindestens zwei verschiedene Erkennungssequenzen, ausgewählt aus den loxP- und rox- Rekombinationserkennungssequenzen in die Ziel-DNA eingefügt. Dies ermöglicht beispielsweise das anschließende Einfügen von zwei verschiedenen DNA-Fragmenten, die zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen benachbart sind, wobei beispielsweise ein DNA-Fragment unter Verwendung der rox-Erkennungssequenz und der Dre-Rekombinase und das andere DNA-Fragment beispielsweise unter Verwendung der loxP- Erkennungssequenz und der Cre-Rekombinase eingefügt werden kann. Das Verfahren zur Modifizierung von Mikroorganismen ist in den Beispielen weiter ausgeführt.
Zusätzlich ist es bevorzugt, dass ein Markergen zur Identifizierung und Selektion der modifizierten Wirtszellen ebenfalls in die Ziel-DNA eingebracht wird. Derartige Markergene sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur beschrieben (DeWet et al., Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 725-737; Goff et al., EMBO J., 1990, 9, 2517-2522; Kain et al., BioTechniques, 1995, 19, 650-655; Chiu et al., Current Biology, 1996, 6, 325-330). Geeignete Markergene sind beispielsweise Gene die Antibiotikaresistenz vermitteln, wie beispielsweise Apramycin, Thiostrepton, Chloramphenicol, Methodrexate, Hygromycin, Streptomycin, Spectinomycin oder Bleomycin (Herrera Estrella et al., EMBO, J. 1983, 2, 987-992; Herrera Estrella et al., Nature, 1983, 303, 209-213; Meijer et al., Plant. Mol. Biol., 1991, 16, 807-820; Waldron et al., Plant Mol. Biol., 1985, 5, 103-108; Zhijian et al., Plant Science, 1995, 108, 219-227; Jones et al., Mol. Gen. Genet, 1987, 210, 86-91 ; Bretagne- Sagnard et al., Transgenic Res., 1996, 5. 131-137; HiIIe et al., Plant Mol. Biol., 1990, 7, 171-176; Guerineau et al., Plant Mol. Biol., 1990, 15, 127-136).
Das erfindungsgemäße Rekombinationssystem der vorliegenden Erfindung zum Modifizieren von Mikroorganismen umfasst mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, das für eine Rekombinase kodiert. Des Weiteren enthält es eine Ziel- DNA, die mindestens eine Erkennungssequenz aufweist. Für das Rekombinationssystem können alle im Vorangegangenen beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, Plasmide und jede Ziel-DNA verwendet werden. Bevorzugt werden Apramycin oder Hygromycin als Antibiotika verwendet. Der erfindungsgemäße, modifizierte Mikroorganismus kann unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Aus einem bekannten Überproduktionsstamm, der einen bestimmten Naturstoff in großen Mengen herstellen kann, wird mit der neuen Technologie das Biosynthesegencluster (Biosynthesegencluster I) für den Naturstoff entfernt. Das gesamte Biosynthesegencluster (Biosynthesegencluster II) eines Naturstoffes, dessen Synthese in großen Mengen erwünscht ist, wird ebenfalls mit der neuen Technologie kloniert und anschließend in den veränderten Überproduktionsstamm gebracht. Es kann möglich sein, zuvor Promotoren auf dem Biosynthesegencluster Il auszutauschen. Somit überträgt man die Syntheseleistung für den Naturstoff I auf die Syntheseleistung für den Naturstoff II.
Abbildung 1 betrifft Cre-Iox-Reaktionen in Abhängigkeit der Orientierung und räumlichen Anordnung der loxP-Schnittstellen. Gepaarte loxP-Erkennungssequenzen (Dreiecke) sind richtungsabhängig und können in eis- (gleicher DNA-Strang) oder trans- (verschiedene DNA-Stränge) Anordnung lokalisiert werden.
(A) Falls die loxP-Erkennungssequenzen ein DNA Segment in Cis-Anordnung flankieren und in der gleichen Richtung orientiert sind, vermittelt Cre-Rekombination das Ausschneiden und die Zirkularisierung des Segmentes.
(B) Falls die loxP-Erkennungssequenzen ein DNA Segment in Cis-Anordnung flankieren und in entgegengesetzter Richtung orientiert sind, vermittelt Cre- Rekombination eine Inversion des Segmentes.
(C) Falls die loxP-Erkennungssequenzen auf verschiedenen DNA-Strängen lokalisiert und in der selben Richtung orientiert sind, vermittelt Cre-Rekombination eine Verschiebung des Segmentes auf den jeweils anderen Strang.
Abbildung 2 zeigt die Aktivität der Cre-Rekombinase in Streptomyces lividans. Schematisch wird dargestellt, wie intφC31, das Gen kodierend für die Integrase des Phagen φC31, in das Chromosom von S. lividans eingebracht wird.
Abbildung 3 zeigt die Aktivität der Dre-Rekombinase in Streptomyces lividans. Abbildung 3A stellt eine schematische Darstellung des Plasmids plNT33 dar. Abbildung 3B zeigt die Integration des Plasmides plNT33 in das Chromosom von S. lividans über attB, das die Anheftungsstelle für den Phagen φC31 im Actinomycetenchromosom darstellt. Abbildung 3C zeigt die Entfernung des Apramycinresistenzgens, das flankiert ist durch die rox-Stellen mit Hilfe der Dre-Rekombinase. Bei den rox-Stellen handelt es sich um die Zielsequenzen für die Dre-Rekombinase. Das Beispiel zeigt die Insertion des Ampicillinresistenzgens (bla). Das Gen intφC31 stellt das Gen kodierend für die Integrase des Phagens φC31 dar, das erforderlich ist zur Integration des plNT33-Plasmids in das Chromosom von Actinomyceten.
Abbildungen 4A und 4B zeigen die Originalsequenzen (Gensequenzen SEQ ID Nr: 1 und
2 sowie die Proteinsequenzen SEQ ID Nr:10-11) der Rekombinasen Cre und Dre.
Abbildung 5 zeigt die erfindungsgemäßen Gensequenzen der Rekombinasen, Dre (SEQ ID Nr:4) und Cre (SEQ ID Nr:5).
Abbildung 6 zeigt die Erkennungssequenzen loxP (SEQ ID Nr:8) und rox (SEQ ID Nr:9).
Abbildungen 7A - D zeigen die erfindungsgemäßen Plasmide pUWL-T, pUWL-A, pUWL- H, und pNL1 , die man einsetzen kann, um die Rekombinasen in Aktinomyceten einzubringen und zu exprimieren. pUWL-T wurde erhalten aus pUW201 durch einbringen des oriT (Sequenz wichtig für den Konjugationsvorgang). pUWL-A und pUWL-H entstanden aus pUWL-T durch Austausch der Antibiotikaresistenzgene (T, Thiostrepton; A, Apramycin, H, Hygromycin). pNL1 entstand aus plJ8600 (Klonierung eines Eco/RI-ßamHI- Fragmentes, das den tipA Promotor und das Thiostreptonresistenzgen enthält) und pKC1139 (Klonierung eines Eco/RI-ßg/ll-Fragmentes, das das temperatursensitive Replikon pSG5 und das Apramycinrseistenzgen aac(3)IV enthält).
Verwendete Abkürzungen: ermE, starker Promotor für die Expression in Aktinomyceten; bla, ß-Lactamase; ori CoIEI , Replikationsursprung notwendig für die Replikation in E. coli; ori pUC18, Replikationsursprung notwendig für die Replikation in E. coli; tsr, Thiostreptonresistenzgen; aac(3)IV, Apramycinrseistenzgen, hyg, Hygromycinresistenzgen, repPIJ101, Replikationsursprung notwendig für die Replikation in Aktinomyceten. pSG5 rep, temperatursensitiver Replikationsursprung notwendig für die Replikation in Streptomyceten, tipA, Thiostrepton Promotor;
Die Abbildungen 7E und 7F zeigen Karten von Plasmiden, die das erfindungsgemäße synthetische codonoptimierte cre(a)-Gen beinhalten. Abbildung 7E stellt schematisch das Plasmid pNLCRE und Abbildung 7F zeigt schematisch das Plasmid pUWLCRE dar.
Abbildungen 8A und B zeigen die erfindungsgemäßen Plasmide, die man einsetzen kann, um ein Naturstoffbiosynthesegencluster zu deletieren und zu klonieren. Plasmid pDel1 und pDel2 wurden durch PCR-Fusion hergestellt. Ausgangsvektoren für die PCR waren pUC19 und plJ773 (Khodakaramian et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34, e20).
Verwendete Abkürungen:
FRT, Erkennungssequenz der Flp-Rekombinase; carb, ß-Lactamasegen; oriT, Sequenz notwendig für die Konjugation von E. coli zu den Actinomyceten; ori, Sequenz notwendig für die Replikation in E. coli; lacZ und lacZ', Sequenzen des ß-Galaktosidasegens; loxP, Erkennungssequenz der Cre-Rekombinase (zusätzliches DNA-Element, das derzeit nicht benötigt wird); apra, Apramycin-Resistenzgen. Abbildung 4b zeigt die Generierung einer Mutante des Phenalinolactom-Produzenten bei gleichzeitiger Klonierung des Phenalinolactombiosynthesegenclusters. Die Frt-Erkennungssequenzen sind als Dreiecke dargestellt. Amr, Apramycinresistenzgen; oripUC, Replikationsursprung, notwendig für die Replikation in E. coli.
Abbildung 9 zeigt Tabelle 1. Tabelle 1 zeigt den Codongebrauch von Aktinomyceten. (http://www.nih.go.jp/~jun/act/codon/104.html).
Beispiel 1 - Synthese der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle
Die Synthese der Moleküle wurden von der Firma DNA 2.0 (Cre) und der Firma Genscript (Dre) durchgeführt. Beispiel 2 - Synthese der Plasmide mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäure- molekülen
Der Stamm Streptomyces lividans TK24 wurde als Modellstamm verwendet, um die Expression der nativen Cre- und der synthetischen Cre(a)-Gene durchzuführen. Zum Klonieren wurde der E. co//-Stamm DH5a verwendet und der Stamm ET12567/pUZ8002 wurde verwendet, um den konjugativen Transfer von nichtmethylierter Nukleinsäure von E. coli auf S. lividans zu bewirken.
Mit Hilfe von üblichen Methoden der Molekularbiologie wurden die beiden erfindungsgemäßen Plasmide pNLCRE und pUWLCRE, wie in Abbildung 7E und F dargestellt, hergestellt. Beide Plasmide beinhalten die synthetischen Cre(a)-Gene.
Beispiel 3 - Einfügen von Erkennungssequenzen in die Ziel-DNA
Plasmide können mittels Konjugation oder Transformation in die Aktinomycetenstämme eingebracht werden. Versuchsbeschreibung finden sich in Kieser et al. (Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, 2000).
Beispiel 4 - Induzierung der Rekombination
Die Induktion der Rekombinase, die hinter den tipA-Promoter kloniert wurde, erfolgt durch Zugabe von Thiostrepton (3.5 μg/ml).
Beispiel 5 - Einfügen und Ausschneiden einer Apramycinresistenzkassette
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass das native Cre-Gen 145 Codons beinhaltet, die beispielsweise bei Streptomyces coelicolor mit einer Frequenz von weniger als 1% verwendet werden. Diese Codons können daher als seltene Codons angesehen werden. Weil die Genexpression von seltenen Codons zu Fehlern in der Translation führen kann, wurden erfindungsgemäß modifizierte Gene entworfen und synthetisiert (cre(a)) unter Verwendung der bevorzugten Codons von Streptomyces coelicolor. Die Gene des Genus Streptomyces haben einen GC-Gehalt, der typischerweise größer ist als 70%. Die erfindungsgemäßen Gene haben bevorzugt einen G+C-Gehalt von mehr als 65%. Besonders bevorzugt ist ein G+C-Gehalt von 67,7% für cre(a). Um die Aktivität und Wirksamkeit der nativen Rekombinase cre und der Codon-optimierten synthetischen cre-Rekombinase cre(a) zu vergleichen, wurde das Plasmid plNT13, das das Integrationssystem des Phagen φC31 beinhaltet, und das Apramycinresistenzgen flankiert von loxP-Stellen aufweist, konstruiert (Abbildung 2). Das Plasmid plNT13 wurde durch Konjugation in S. lividans eingeführt und stabil über die <pC37-attB-Stelle integriert. S. lividans mit dem Plasmid plNT13 wurde unter nicht-selektiven Bedingungen angezogen und 230 Klone wurden auf Apramycinresistenz überprüft. 100% der Klone beinhalteten plNT13. Um die Aktivität der Cre-Rekombinase zu testen, wurden die Plasmide pUWLCRE, pUWLCREN, pNLCRE und pNLCREN in S. lividans plNT13 transformiert. Nach einer Passage von S. lividans plNT13 enthaltend pUWLCRE unter nicht-selektiven Bedingungen wurden 743 Klone auf Resistenz gegenüber Apramycin gestestet. Überraschenderweise hat jeder überprüfte Klon den Resistenzmarker verloren.
Im Gegensatz dazu wurden nur drei sensitive Klone unter 198 überprüften Klonen aufgefunden, wenn pUWLCREN anstelle von pUWLCRE verwendet wurde.
Die Effizienz des synthetischen Gens cre(a) nach Expression von dem Plasmid pNLCRE wurde also überprüft. Alle 227 Klone von S. lividans plNT13 und dem Plasmid pNLECRE wuchsen nicht auf Apramycin enthaltenden Platten. Dies spricht für einen Verlust des Apramycinresistenzgens mit einer Frequenz von 100%.
Demgegenüber wuchs nur ein einziger Klon aus 169 Klonen, die das native Cre-Gen enthielten, exprimiert von dem Plasmid pNLCREN nicht auf Apramycin enthaltenden Platten. Dies spricht für einen Verlust des Apramycinresistenzgens mit einer Frequenz von weniger als 1%.
Da das Apramycinresistenzgen durch loxP seitenflankiert ist, ist der Verlust der Resistenz die Konsequenz der Cre-Aktivität.
Durch Sequenzieren des chromosomalen Abschnitts der DNA von S. lividans wurde ermittelt, dass das Gen spezifisch an den roxP-Seiten ausgeschnitten wurde. Dieses Experiment zeigt klar, dass das erfindungsgemäß eingesetzte synthetische Gen cre(a) in S. lividans effizient exprimiert werden kann und die Funktion erfüllt, wohingegen dies nicht der Fall ist bei dem Wild-Typ-Gen (cre). Beispiel 6 - Herstellen eines Überproduktionsstammes
Zur Herstellung eines Überproduktionsstammes nimmt man einen Aktinomycetenstamm, der große Mengen eines Naturstoffs produziert. Aus diesem Stamm wird das Biosynthesegencluster mit den beschriebenen Methoden entfernt. Biosynthesegencluster der Naturstoffe, die nun in großen Mengen produziert werden sollen, werden in die generierte Mutante gebracht. Denkbar ist, dass die Promotoren auf den einzubringenden Clustern durch Promotoren auf dem ursprünglichen Cluster ersetzt werden müssen. Die Produktion großer Mengen eines Naturstoffs wird dann gelingen, wenn die Biosyntheseausgangsverbindungen des ursprünglichen Naturstoffs und des neuen Naturstoffs identisch sind.

Claims

Patentansprüche
1. Rekombinationssystem zum Ausschneiden, Integrieren, Invertieren oder Translozieren von DNA-Fragmenten aus/in dem/das Genom (Ziel-DNA) von Aktinomyceten, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein in Wirtszellen replizierbares Nukleinsäuremolekül, enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: i) DNA-Sequenzen, die über die ganze Länge mindestens 80% Identität zu der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 4 aufweisen und für eine Dre-Rekombinase kodieren, ii) DNA-Sequenzen, die über die ganze Länge mindestens 80% Identität zu der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 5 aufweisen und für eine Cre-Rekombinase kodieren, und mindestens eine Erkennungssequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: loxP- und rox-Erkennungssequenzen in der Ziel-DNA aufweist.
2. Rekombinationssystem gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidtripletts aus der Gruppe i) und ii) zu mindestens 70% solche Codons darstellen, die von Aktinomyceten bevorzugt sind.
3. Rekombinationssystem nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Escherichia coli- oder /4/tf/no/77yceteA7-Stamm verwendet werden kann.
4. Rekombinationssystem nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Streptomyceten -Stamm vervielfältigt werden kann.
5. Rekombinationssystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtszellen Streptomyceten-Stamm ausgewählt ist aus:
Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamonensis, Actinoplanes sp. SE50/110, Streptomyces galilaeus, Streptomyces nodosus, Actinosynnema pretiosum subsp. Auranticum, Streptomyces virido-chromogenes Tü57, Streptomyces echinatus, Streptomyces avermitilis MA-4680, Micromonospora echinospora, Streptomyces sp. FR-008, Streptomyces chartreusis, Streptomyces bikiniensis, Streptomyces roseochromogenes subsp. oscitans DS12.976, Streptomyces griseus subsp. griseus, Streptomyces neyagawaensis, Streptomyces olindensis, Streptomyces rishiriensis DSM 40489, Streptomyces venezuelae, Streptomyces peucetius, Streptomyces olivaceus Tü2353, Saccharopolyspora erythraea, Micromonospora carbonacea var. Africana ATCC39149, Streptomyces griseoflavus Gö'3592, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces violaceoruber Tü22, Amycolatopsis orientalis, Amycolatopsis orientalis, Amycolatopsis mediterranei (balhimycina) DSM5908, Micromonospora echinospora ATCC15835, Streptomyces griseoruber, Streptomyces aureofaciaens Tü11 , Streptomyces antibioticus Tü99, Streptomyces antibioticus TÜ1718, Streptomyces sp. Tü2187, Streptomyces sp. Tü 1156, Streptomyces sp. FU 107, Streptomyces sp. FU36, Streptomyces venezuelae ISP5230, Streptomyces kanamyceticus, Streptomyces cyanogenus S136, Streptomyces aureofaciens Tü117, Streptomyces rochei, Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces sp. AM-7161 , Micromonospora megalomicea, Streptomyces argillaceus, Streptomyces carzinostaticus ATCC 15944, Streptomyces fradiae NCIB 8233, Streptomyces spheroides,
NCIMB 11891 , Streptomyces noursei ATCC 11455, Streptomyces antibioticus, Actinoplanes teichomyceticus, Streptomyces natalensis, Streptomyces sp. Tü 6071 , Streptomyces diastato-chromogenes TÜ6028, Lechevalieria aerocolonigenes ATCC39243, Saccharothrix espanaensis, Micromonospora sp. Tü 6368, Streptomyces antibioticus TÜ6040, Streptomyces nogalater, Sorangium cellulosum So ce12, Saccharopolyspora, Spinosa, Streptomyces sp. TP-A0274, Streptomyces steffisburgensis NRRL 3193, Streptomyces griseus, Streptomyces fradice, Streptomyces fradiae Tü2717, Streptomyces halstedii HC- 34.
6. Rekombinationssystem nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Plasmid darstellt.
7. Rekombinationssystem nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid einen ErmE- oder tipA-Promotor aufweist.
8. Rekombinationssystem nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: pUWL- T-Dre, pUWL-A-Dre, pUWL-H-Dre, pNL1-Der, pML1-Dre und pAU-Dre, pUWL-T-Cre, pUWL-A-Cre, pUWL-H-Cre, pNL1-Cre, pML1-Cre und pAL1-Cre.
9. Rekombinationssystem gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Ziel- DNA mindestens zwei Erkennungssequenzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: loxP-, und rox-Erkennungssequenzen, enthält.
10. Verfahren zur Herstellung von modifizierten Aktinomyceten, umfassend die folgenden Schritte: a) Einfügen von mindestens einer Erkennungssequenz in das Genom (Ziel-DNA) des Aktinomyceten, wobei die Erkennungssequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe betsehend aus loxP- und rox-Erkennungssequenzen, b) Einbringen mindestens eines Plasmids in den Aktinomyceten, wobei das Plasmid ein replizierbares Nukleinsäuremolekül kodierend für eine codonoptimierte Rekombinase darstellt, und c) Vervielfältigen des Plasmids aus b) und Exprimieren der Rekombinase, die für die Erkennungssequenz(en) der Ziel-DNA spezifisch ist, ein DNA-Fragment der Ziel- DNA ausschneidet, translokiert, invertiert oder ein DNA-Fragment in die Ziel-DNA einfügt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Einfügen der Erkennungssequenzen in die Ziel-DNA unter Verwendung eines weiteren Plasmids erfolgt, wobei das Plasmid die Erkennungssequenz und eine attP-Erkennungssequenz enthält.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Erkennungssequenzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: loxP- und rox-Erkennungssequenzen in die Ziel-DNA eingebracht werden.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei unterschiedliche Nukleinsäuremoleküle gemäß Anspruch 1 verwendet werden.
14. Verwendung eines Rekombinationssystems gemäß einem der Ansprüche 1 - 9 zum Ausschneiden, Integrieren, Invertieren oder Translozieren von DNA-Fragmenten in Aktinomyceten.
15. Modifizierter Mikroorganismus, hergestellt durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 - 13.
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