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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine Bakterienzelle, die ein DNA-Konstrukt integriert in ihr Genom umfasst,
einen Plasmidvektor, der das DNA-Konstrukt umfasst, und Verfahren
zur Integration des DNA-Konstrukts in bakterielle Genome.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Wenn zur Herstellung eines gewünschten
Polypeptids durch rekombinante DNA-Verfahren Bakterienzellen mit einem
rekombinanten Plasmidvektor transformiert werden, der insertierte
genetische Information trägt,
die für
das Polypeptid kodiert, dann ist oftmals beobachtet worden, dass
derartige Plasmide instabil werden, obwohl sie möglicherweise als solche stabil
in der Zelle vererbt werden. Diese Instabilität kann entweder die Form einer
instabilen Aufrechterhaltung des Plasmids in den Zellen, so dass
das Plasmid schließlich
aus der Zellpopulation verloren geht, oder eine Form, bei der die
für das
fragliche Protein kodierende DNA aus dem Plasmid deletiert wird,
annehmen. Ein herkömmlicher
Weg, um das erstgenannte Problem zu lösen, bestand darin, die transformierten
Zellen unter Selektionsdruck zu züchten, d. h. typischerweise
in Gegenwart eines Antibiotikums, gegenüber dem die fraglichen Zellen
aufgrund des Vorhandenseins eines Gens, das für ein Produkt kodiert, das
eine Resistenz gegenüber
dem Antibiotikum verleiht, auf dem durch Transformation in die Zellen
eingeführten
Plasmid resistent gemacht worden sind. Dieser Ansatz ist jedoch
weder wirtschaftlich durchführbar
bei einer Produktion im großen
Maßstab
aufgrund der hohen Kosten für
die fraglichen Antibiotika, noch ist er aus Umweltschutzgrunden
wünschenswert.
Die Verwendung von Antibiotika in Kulturmedium macht es auch schwieri ger,
eine Zulassung von den Gesundheitsbehörden oder dergleichen für das Produkt
zu erhalten.
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Es ist bereits vorgeschlagen worden,
Plasmide durch Insertion einer DNA-Sequenz, die für eine Verteilungsfunktion
kodiert, die eine gleichmäßige Verteilung
der Plasmide an die Nachkommenzellen bei der Zellteilung sicherstellt,
zu stabilisieren. Ein alternatives Verfahren, um eine stabile Vererbung
der klonierten DNA-Sequenzen zu erzielen, besteht darin, für eine Integration
derartiger DNA-Sequenzen
in das Genom des Wirtsbakteriums zu sorgen. Die Integration von
DNA-Sequenzen, die auf Plasmidvektoren vorhanden sind, kann durch
ein sogenanntes „Crossing-over" erfolgen, wie es
z. B. A. Campbell, Advances Genet., Bd. 11 (1962), S. 101–145 beschrieben
wird. Gemäß diesem
Verfahren wird der Plasmidvektor mit einer DNA-Sequenz versehen,
die homolog zu einer Region des bakteriellen Genoms ist, oder alternativ
mit zwei homologen Sequenzen, die auf beiden Seiten der heterologen
DNA-Sequenz, die integriert werden soll, angeordnet sind. In einem
nachfolgenden Rekombinationsereignis werden die homologe Sequenz
und die benachbarten Sequenzen auf dem Vektor in das Wirtsgenom
im Bereich der Homologie integriert. Als ein Beispiel beschreiben Kallio
et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Bd. 27 (1987), S. 64–71 die
Integration eines α-Amylasegens in das Genom
von Bacillus subtilis unter Anwendung dieser Technik.
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In einigen Fällen wurde jedoch festgestellt,
dass die integrierten DNA-Sequenzen bei Fehlen eines Selektionsdrucks
aus den Zellen deletiert werden, z. B. durch ein homologes Rekombinationsereignis ähnlicher Art
wie das, das für
die Integration der DNA verantwortlich war. Insbesondere ist bisher
beobachtet worden, dass die Rekombination zwischen homologen DNA-Sequenzen
durch die Nähe
replikativer DNA, die in oder nahe der in das Wirtszellgenom integrierten
DNA vorhanden ist, stimuliert wird; vgl. Ph. Noirot et al., J. Mol. Biol.,
Bd. 196 (1987), S. 39– 48;
und M. Young und S. D. Ehrlich, J. Bacteriol., Bd. 171/5 (Mai 1989),
S. 2653– 2656.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung
besteht darin, für
eine stabile Integration von DNA-Sequenzen in genomische DNA, z.
B. das Chromosom, von bakteriellen Wirtszellen zu sorgen.
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ZUSAMMENFASSENDE
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung basiert
auf dem Befund, dass eine stabile Integration von DNA-Sequenzen in
das Genom von Wirtsbakterien erzielt werden kann, indem das Vorhandensein
eines funktionellen Plasmidreplikationssystems in der integrierten
DNA vermieden wird.
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Dementsprechend betrifft die vorliegende
Erfindung gemäß einem
Aspekt eine Bakterienzelle, die zur Gattung Bacillus gehört und welche
nicht transformiert werden kann, indem sie kompetent gemacht wird,
und die in ihrem Genom ein integriertes nicht-replikatives DNA-Konstrukt
trägt,
das (1) eine DNA-Sequenz von Interesse, (2) eine DNA-Sequenz, die
homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, und (3) einen
Replikationsursprung umfasst, wobei aus dem DNA-Konstrukt ein Gen deletiert worden ist,
das für
einen Faktor kodiert, der erforderlich ist, um die Replikation von
dem Replikationsursprung zu initiieren, oder wobei das Gen, das
für den
Replikationsfaktor kodiert, modifiziert worden ist, so dass es für einen
inaktiven Replikationsfaktor kodiert.
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In der vorliegenden Zusammenfassung
soll der Ausdruck „nicht-replikatives
DNA-Konstrukt" eine DNA-Sequenz
bedeuten, die zur autonomen Replikation nicht imstande ist und die
daher zusammen mit dem Wirtszellgenom repliziert wird. Das Genom
umfasst das Chromosom und stabil vererbte extrachromosomale Elemente.
Der Ausdruck „DNA-Sequenz
von Interesse" wird
verwendet, um eine Sequenz zu bezeichnen, die für ein gewünschtes RNA- oder Proteinprodukt
(heterolog oder nativ für
die Wirtszelle) kodiert oder die als solche der Wirtszelle eine
gewünschte
Eigenschaft verleiht, z. B. einen mutierten Phänotyp, wie es nachstehend beschrieben
ist.
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Bei der homologen DNA-Sequenz kann
es sich typischerweise um eine Sequenz handeln, die aus dem Genom
der Wirtszelle abgeleitet ist, und sie kann homolog zu einer Region
des Genoms sein, die nicht essentiell für das Überleben oder die richtige
Funktion der Wirtszelle ist. Andererseits kann die homologe DNA-Sequenz auch so gewählt sein,
dass die Integration des DNA-Konstrukts durch homologe Rekombination zu
einer Zelle führt,
die einen mutierten Phänotyp
exprimiert (der dann als Marker für die Selektion von Zellen, in
die das DNA-Konstrukt
integriert worden ist), z. B. wenn das DNA-Konstrukt innerhalb einer
Transkriptionseinheit integriert wird und diese unterbricht, so
dass ein oder mehrere Gene, die in der Transkriptionseinheit enthalten
sind, dann nicht mehr exprimiert werden. Bei der homologen DNA-Sequenz
kann es sich alternativ um eine Sequenz handeln, die nicht nativ
für das
Wirtsgenom ist, sondern die aus einem anderen Organismus kloniert
oder die synthetisiert worden ist und anschließend in das Wirtsgenom nach
einem beliebigen geeigneten Verfahren, z. B. durch Crossing-over,
vor der Integration des DNA-Konstrukts eingeführt worden ist. Bei der homologen
DNA-Sequenz kann es sich um eine Sequenz handeln, die die DNA-Sequenz
von Interesse umfasst oder im Wesentlichen daraus besteht, ob es
sich nun um eine native oder fremde DNA-Sequenz für die fragliche
Wirtszelle handelt (nativ für
die Zelle z. B. in Zellen, in denen es gewünscht ist, die Kopienzahl der DNA-Sequenz
von Interesse in der Zelle zu erhöhen, siehe nachstehend). Es
ist darauf hinzuweisen, dass im vorliegenden Zusammenhang der Ausdruck „homolog" als eine Sequenzidentität von mindestens
9 aufeinanderfolgenden Basenpaaren definiert werden kann.
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Obwohl erfindungsgemäß eine stabile
Integration von DNA in bakterielle Genome für Plasmide mit einer besonderen
Art von Replikationssystem (die sogenannte „rolling circle"-Replikation, siehe
nachstehend) gezeigt worden ist, wird gegenwärtig erwartet, dass beliebige
Plasmide, bei denen die Replikaktion nach einem Mechanismus erfolgt,
bei dem ein oder mehrere in trans-wirkende Faktoren (d. h. RNA-
oder Proteinfaktoren) erforderlich sind, um die Replikation von
in cis wirkenden Sequenzen auf dem Plasmid zu initiieren (derartige in
cis wirkende DNA-Sequenzen werden zusammenfassend als Replikationsursprung
bezeichnet), sich für
den vorliegenden Zweck eignen. Faktoren, die für die Plasmidreplikation erforderlich
sind, werden nachstehend als Replikationsfaktoren bezeichnet. Wenn
dem DNA-Konstrukt ein funktionelles Gen fehlt, das für einen
Replikationsfaktor kodiert, der für den Replikationsursprung,
der in dem DNA-Konstrukt enthalten ist, erforderlich ist, dann wird
kein aktiver Replikationsfaktor gebildet, und dementsprechend wird
keine Replikation von dem Ursprung initiiert.
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Um eine erfindungsgemäße Bakterienzelle
zu erhalten, die ein DNA-Konstrukt umfasst, dem ein funktionelles
Gen fehlt, das für
einen erforderlichen Replikationsfaktor kodiert, kann man entweder
das gesamte Gen deletieren oder es in einer solchen Weise modifizieren,
dass es für
einen inaktiven Replikationsfaktor kodiert. Eine derartige Modifikation
des Gens kann auf eine als solche bekannte Weise durch Deletion,
Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide der DNA-Sequenz
des Gens oder durch ähnliche
Modifikationen der transkriptionalen oder translationalen Start-
oder Stoppsignale erfolgen.
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Das vorstehend dargelegte Replikationssystem
kann bei einem Verfahren zur Konstruktion einer erfindungsgemäßen Bakterienzelle
genutzt werden. Gemäß einer
Ausführungsform
des Verfahrens wird ein Plasmidvektor, der für die vorliegenden Zwecke als
Elternvektor bezeichnet wird, zunächst konstruiert. Der Elternvektor
umfasst einen ersten Replikationsursprung und einen zweiten Replikationsursprung
in der gleichen Orientierung wie der erste Replikationsursprung,
wobei der erste und der zweite Replikationsursprung ausreichend ähnlich sind,
um ihre Funktion mit dem/den gleichen Replikationsfaktor(en) zu
erfüllen,
wobei der erste und der zweite Replikationsursprung den Vektor in
zwei Teile teilen, und zwar (i) einen ersten Teil, der den ersten
Replikationsursprung und ein oder mehrere funktionelle Gene, die
für den/die
für die
Plasmidreplikation von dem ersten und dem zweiten Replikationsurspung
erforderlichen Replikationsfaktor(en) kodieren, umfasst, und (ii)
einen zweiten Teil, der den zweiten Replikationsursprung, eine DNA-Sequenz
von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region
des Genoms der für
die Einführung
des Vektors vorgesehenen Zelle ist, umfasst. Es ist darauf hinzuweisen,
dass im vorliegenden Zusammenhang der Ausdruck „Plasmid" auch einen Bakteriophagen oder ein
anderes DNA-Molekül bezeichnen
soll, das imstande ist, als ein autonom replizierendes extrachromosomales
Element zu funktionieren.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann dieser Elternvektor dann in Bakterienzellen transformiert werden,
und die transformierten Zellen werden unter selektiven Bedingungen
kultiviert, wobei die Replikation des Elternplasmidvektors zur Bildung
eines ersten Nachkommenvektors, der den ersten Replikationsursprung
und ein oder mehrere funktionelle Gene, die für den/die Plasmidreplikation
von dem ersten und dem zweiten Replikationsursprung erforderlichen
Replikationsfaktor(en) kodieren, umfasst, und eines zweiten Nachkommenvektors
führt,
der den zweiten Replikationsursprung umfasst, dem jedoch ein funktionelles
Gen, das für
einen Replikationsfaktor kodiert, fehlt, und der außerdem eine
DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer
Region des Genoms der Zelle ist, umfasst, wobei ein fortgesetztes
Kultivieren der transformierten Zellen unter selektiven Bedingungen
zur Integration des zweiten Nachkommenvektors in das bakterielle
Genom durch homologe Rekombination und zum Verlust des ersten Nachkommenvektors
sowie des Elternvektors aus den Zellen führt.
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Die Bildung von zwei Nachkommenvektormolekülen aus
dem Elternvektor kann nach verschiedenen Mechanismen stattfinden;
entweder als Ergebnis der Art der Replikation des Plasmids, z. B.
der „rolling
circle"-Replikation
von einzelsträngigen
DNA-Plasmiden (siehe nachstehend), oder als ein Ergebnis einer homologen
Rekombination zwischen den DNA-Regionen, die die beiden Replikationsur sprünge, die
auf dem Plasmidvektor vorhanden sind, einschließen und/oder zu ihnen benachbart
sind.
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Wenn der zweite Ursprung sich in
der gleichen Orientierung auf dem Elternplasmid wie der erste Ursprung
befindet, dann sind die verschiedenen DNA-Sequenzen, die in das bakterielle Genom
integriert werden sollen und die sich stromabwärts von dem zweiten Ursprung,
jedoch stromaufwärts
von dem ersten Ursprung befinden (d. h. die DNA-Sequenz von Interesse
und die DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der
Zelle ist), auf dem zweiten Nachkommenvektor nach der Plasmidreplikation
vorhanden. Ein fortgesetztes Kultivieren der transformierten Zellen
kann spontan zu einer Integration des zweiten Nachkommenvektors
in das bakterielle Genom durch homologe Rekombination und Verlust
des ersten Nachkommenvektors aus den Zellen mit einer bestimmten
Häufigkeit
führen.
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Um die Selektion von Zellen, bei
denen der zweite Nachkommenvektor in das Genom integriert worden
ist, zu erleichtern, wird dieser Vektor vorzugsweise mit einem Selektionsmarker
versehen. In diesem Fall können
die Zellen unter selektiven Bedingungen kultiviert werden, d. h.,
dass nur Zellen, in denen der Selektionsmarker erhalten wird, überleben.
Bei dem Selektionsmarker kann es sich um ein Gen handeln, das für ein Produkt
kodiert, das den Zellen eine Antibiotikaresistenz verleiht (z. B.
dal-Gene, die in einem dal-Stamm eingeführt werden; vgl. B. Diderichsen
in Bacillus: Molecular Genetics and Biotechnology Applications,
A. T. Ganesan und J. A. Hoch (Hrsg.), Academic Press, 1986, S. 35–46). Unter
diesen Bedingungen überlebende
Zellen sind entweder Zellen, die den Elternplasmidvektor enthalten,
oder Zellen, die beide bei der Replikation des Elternvektor gebildeten
Nachkommenvektoren in einer Zelle enthalten, oder Zellen, bei denen
der zweite Nachkommenvektor, der das DNA-Konstrukt umfasst, integriert
worden ist. Es ist überraschenderweise
festgestellt worden, dass der Elternvektor und der erste Nachkommenvektor
schließlich
verloren gehen, während der
zweite Nachkommenvektor, der das DNA-Konstrukt umfasst, spontan
in das Wirtsgenom mit großer
Häufigkeit
integriert wird.
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Wenn es erwünscht ist, den Wirkungsgrad,
mit dem die Integration des DNA-Konstrukts
stattfindet, zu erhöhen,
dann kann man als Elternvektor ein Plasmid verwenden, das zur Replikation
unter bestimmten (permissiven) Bedingungen nicht imstande ist. Bei
dem Plasmid kann es sich z. B. um ein Plasmid handeln, das im Hinblick
auf die Replikation temperaturempfindlich ist. Daher kann sich in
einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
der Elternvektor nicht bei erhöhten
Temperatur replizieren, die aber dennoch das Wachstum der Wirtszelle
zulassen. Die Bakterienzellen werden zunächst bei einer Temperatur kultiviert,
die die Plasmidreplikation und die Bildung von zwei Nachkommenvektoren
erlaubt, und werden nach der Integration des zweiten Nachkommenvektors
in das Bakteriengenom bei einer Temperatur kultiviert, die eine
Plasmidreplikation erlaubt, so dass sowohl der erste Nachkommenvektor
als auch der Elternvektor aus der Zelle verloren gehen. Die Kultivierung
bei der nicht-permissiven Temperatur wird unter selektiven Bedingungen
durchgeführt,
um sicherzustellen, dass nur Zellen, die das integrierte DNA-Konstrukt
enthalten, das einen geeigneten Selektionsmarker umfasst, überleben.
Ein anderer Weg, um den Wirkungsgrad bei der Integration und dem anschließenden Verlust
des ersten Nachkommenvektors aus den Zellen zu erhöhen, besteht
in einer Behandlung der mit dem Elternvektor transformierten Zellen
mit einem Plasmidhärtungsmittel
(„plasmid-curing agent"), z. B. B. Novobiocin
(I. Gadó et
al., Zbl. Bakt. Hyg. A., Bd. 265 (1987), S. 136– 145) nach Kultivieren der
Wirtszellen unter selektiven Bedingungen, wie es vorstehend beschrieben
wurde.
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Es ist möglich, Replikationsursprünge von
zwei verschiedenen Plasmiden auf dem gleichen Elternvektor einzusetzen,
sofern diese ausreichend ähnlich
zu einander sind, so dass sie ihre Funktion mit dem/den gleichen
Replikationsfaktor(en) erfüllen,
der/die imstande sein sollte(n), die Replikation sowohl vom ersten
als auch vom zweiten Replikationsursprung zu initiieren. Alternativ
sollte der Plamidvek tor homologe Regionen enthalten, um zu einer
homologen Rekombination imstande zu sein, wie es vorstehend beschrieben
wurde. Es ist jedoch bevorzugt, dass der erste Replikationsursprung
(und das Gen, das für
den damit verbundenen Replikationsfaktor kodiert) vom gleichen Plasmid
wie der zweite Replikationsursprung abgeleitet ist, um sicherzustellen,
dass der Replikationsmechanismus, auf dem die vorliegende Erfindung
basiert, optimal funktioniert.
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Aus praktischen Überlegungen mag es bevorzugt
sein, die anfängliche
Konstruktion des Plamidvektors in einem Organismus durchzuführen, in
dem eine Replikation vom ersten und zweiten Replikationsursprung
nicht initiiert werden kann oder in dem die Rate der Replikation
von diesen Ursprüngen
sehr gering ist. Bei dem Plasmidvektor kann es sich daher um einen
Shuttle-Vektor handeln, der mit einem zusätzlichen Replikationsursprung
versehen ist, so dass der Vektor zur Replikation in zwei verschiedenen
Organismen imstande ist. Der zusätzliche
Replikationsursprung kann z. B. ein Replikationsursprung sein, der
funktionell in Escherichia coli ist, wobei dieser Organismus gut
beschrieben und herkömmlicherweise
für rekombinante
DNA-Versuche verwendet wird und daher für die Konstruktion von Plasmiden
durch rekombinante DNA-Techniken geeignet ist. Der Shuttle-Vektor
kann auch einen zusätzlichen
Selektionsmarker für
die Selektion des Vektors in E. coli umfassen, z. B. ein Antibiotika-Resistenzgen.
Der zusätzliche
Replikationsursprung und der Selektionsmarker sollten dem ersten
Ursprung und/oder dem/den Repliakationsfaktor(en) folgen, jedoch
dem zweiten Ursprung vorausgehen, so dass bei Replikation des Vektors
vom ersten und zweiten Ursprung der erste Nachkommenvektor diese
zusätzlichen
Sequenzen trägt,
der schließlich
aus der bakteriellen Zelle, die mit dem Elternvektor transformiert
wurde, verloren geht.
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Bei einem alternativen Verfahren
zur Herstellung der erfindungsgemäßen bakteriellen Zelle werden Bakterienzellen
mit (i) einem ersten DNA-Vektor, der einen ersten Replikationsursprung
und ein oder mehrere funktionelle Gene, die für den/die für die Plasmidreplikation von
dem ersten Replikaktionsursprung erfor derlichen Faktoren) kodieren,
umfasst, und mit (ii) einem zweiten DNA-Vektor, der einen zweiten
Replikationsursprung umfasst, dem jedoch ein funktionelles Gen,
das für
einen Faktor kodiert, der für
die Plasmidreplikation von dem zweiten Replikationsursprung erforderlich
ist, fehlt, und der außerdem
eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog
zu einer Region des Genoms der Zelle ist, umfasst, transformiert, wobei
der erste und der zweite Replikationsursprung ausreichend ähnlich sind,
um mit dem/den gleichen Replikationsfaktor(en) initiiert wird, der/die
von dem/den auf dem ersten DNA-Vektor vorhandenen Genen) kodiert wird/werden.
Die erhaltenen Zellen werden unter selektiven Bedingungen kultiviert,
wie es vorstehend beschrieben wurde, was zur Integration des zweiten
DNA-Vektors führt.
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Auch der zweite DNA-Vektor ist vorzugsweise
mit einem Selektionsmarker versehen.
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Wie bei dem oben beschriebenen Verfahren,
bei dem zunächst
ein einzelner Plasmidvektor eingesetzt wird, kann es sich bei dem
ersten DNA-Vektor um einen Vektor handeln, bei dem die Replikation
von permissiven und nicht-permissiven Bedingungen für das Kultivieren
der mit dem Vektor transformierten Zellen abhängt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann es sich also bei dem ersten DNA-Vektor um einen Vektor handeln,
der nicht zur Replikation bei erhöhten Temperaturen imstande
ist, die jedoch ein Wachstum der Wirtszellen erlauben, wobei die
bakteriellen Zellen zunächst
bei einer Temperatur, die eine Plasmidreplikation erlaubt, und anschließend, nach
der Integration des zweiten DNA-Vektors
in das bakterielle Genom, bei einer Temperatur, die eine Plasmidreplikation
nicht erlaubt, so dass der erste DNA-Vektor aus den Zellen verloren geht,
unter selektiven Bedingungen kultiviert werden, so dass nur Zellen,
bei denen der zweite DNA-Vektor integriert ist, imstande sind, zu überleben.
Entsprechend können
die transformierten Zellen mit einem Plasmidhärtungsmittel behandelt werden,
wie es vorstehend beschrieben wurde.
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Ein Zwischenprodukt, das bei beiden
vorstehend erörterten
Verfahren zur Konstruktion einer Zelle, die das integrierte nicht-replikative
DNA-Konstrukt enthält,
gebildet wird, ist eine Bakterienzelle, die einen ersten DNA-Vektor,
der einen ersten Replikationsursprung, der mit einem oder mehreren
funktionellen Gen(en), das/die für
den/die für
die Plasmidreplikation von dem ersten Replikationsursprung erforderlichen
Faktoren) kodiert/kodieren, verbunden ist, umfasst und einen zweiten
DNA-Vektor, der einen zweiten Replikationsursprung sowie eine DNA-Sequenz
von Interesse umfasst, und eine DNA-Sequenz, die homolog zu einer
Region des Genoms der Zelle ist, umfasst, wobei dem zweiten Vektor
ein funktionelles Gen, das für
einen Replikationsfaktor kodiert, der für die Replikation von dem Replikationsursprung,
den der zweite Vektor trägt,
erforderlich ist, fehlt.
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Um einen Replikationsursprung auf
dem zweiten DNA-Vektor, dem ein funktionelles Gen, das für einen Replikationsfaktor
kodiert, der für
die Replikation von dem Ursprung erforderlich ist, fehlt, zu erhalten,
ist es möglich,
dieses Gen aus dem Vektor zu deletieren oder es auf die vorstehend
beschriebene Weise zu modifizieren. Insbesondere bei Verwendung
von zwei verschiedenen Replikationsursprüngen kann der erste DNA-Vektor,
auch mit einem Gen versehen werden, das für einen Replikationsfaktor
kodiert, der erforderlich ist, um die Replikation von dem zweiten
Replikationsursprung zu initiieren. Auf diese Weise hängt die
Replikation des zweiten DNA-Vektors von dem zweiten Replikationsfaktor
ab, der vom ersten DNA-Vektor gebildet wird, und der zweite Vektor
wird nicht replikativ, wenn der erste Vektor aus der Zelle verloren
geht. Der erste und der zweite Replikationsursprung können jedoch
auch vom gleichen Plasmid stammen, wobei in diesem Fall nur ein
Gen, das für
einen intakten Replikationsfaktor kodiert, auf dem ersten Vektor
erforderlich ist.
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Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann die Bakterienzelle, in
die der Plasmidvektor oder der erste und der zweite DNA-Vektor transformiert
werden, zwar sowohl gramnegativ als auch grampositiv sein, es handelt
sich jedoch bevor zugt um eine Zelle eines grampositiven Bakteriums,
da es im Allgemeinen einfacher ist, eine extrazelluläre Expression
von Polypeptiden aus grampositiven Organismen als aus gramnegativen
Organismen zu erzielen. Bei dem Bakterium kann es sich also um einen
Stamm handeln, der zur Gattung Bacillus oder Streptomyces gehört, insbesondere
einen Stamm von Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus
brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amzloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis oder Streptomyces
lividans.
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Es wird gegenwärtig angenommen, dass die vorliegende
Erfindung das einzig wirksame Verfahren ist, um für die stabile
homologe Integration von DNA-Sequenzen
von Interesse in Genome von Bakterien zu sorgen, die nicht transformiert
werden können,
indem sie kompetent gemacht werden (oder bei denen zumindest natürliche Kompetenzmechanismen
noch aufgezeigt werden müssen),
die jedoch nach Techniken unter Einschluss z. B. der Protoplastenbildung
oder der Elektroporation transformiert werden können, z. B. bestimmte Stämme von
Bacillus licheniformis oder Bacillus lentus. Das vorliegende Verfahren
ist daher von besonderem Interesse im Hinblick auf solche Organismen,
bei denen die Transformationshäufigkeit
gering ist, und zwar typischerweise 10 bis 50 Transformanten pro
1 μg DNA
(im Gegensatz z. B. zur Transformation von kompetenten E. coli-
oder B. subtilis-Zellen, wo die Anzahl der Transformanten typischerweise
in der Größenordnung von
106 bis 108 pro
1 μg DNA
liegt), was eine erfolgreiche Transformation und eine stabile Integration
der DNA in diese Organismen besonders wichtig macht.
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In der erfindungsgemäßen Bakterienzelle
handelt es sich bei der DNA-Sequenz von Interesse vorzugsweise um
eine Sequenz, die für
ein Polypeptid von Interesse kodiert, und die vorliegende Erfindung
betrifft dementsprechend ferner ein Verfahren zur Herstellung eines
Polypeptids von Interesse, das das Kultivieren einer erfindungsgemäßen Bakterienzelle,
die eine integrierte DNA-Sequenz enthält, die für das Polypeptid kodiert, unter
Bedingungen, die die Bildung des Polypeptids fördern, und die Gewinnung des
erhaltenen Polypeptids aus der Kultur umfasst. Bei dem nach dem
vorliegenden Verfahren hergestellten Polypeptid kann es sich um
ein beliebiges Polypeptid handeln, das vorzugsweise in Bakterien
hergestellt wird, wie ein Enzym, z. B. eine Protease, Amylase oder
Lipase.
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Bei einer großen Gruppe von Plasmiden aus
gram-positiven Bakterien erfolgt die Replikation nach dem sogenannten „rolling
circle"-Replikationszwischenprodukt.
Die Replikation wird initiiert, wenn ein Plasmid-kodiertes Protein,
nämlich
Rep, eine Replikationsursprungssequenz erkennt (den Plus-Ursprung)
und einen Einzelstrangbruch in einem der DNA-Stränge (dem Plus-Strang) erzeugt.
Der Plus-Strang
wird dann verdrängt,
und ein neuer Plus-Strang wird ausgehend von dem Einzelstrangbruch
durch eine 3'-OH-Erweiterung polymerisiert.
Wenn das Rep-Protein
anschließend
eine Terminatorsequenz (die mit dem Plus-Ursprung überlappt)
erkennt, dann erzeugt es einen zweiten Einzelstrangbruch an der
gleichen Position wie der erste, um einen vollständig replizierten Strang und
ein einzelsträngiges
DNA-Monomer des verdrängten
Strangs, dessen Enden unter Bildung eines kreisförmigen Moleküls ligiert
werden, zu erzeugen. Wirtsfaktoren stellen dann die Umwandlung des
einzelsträngigen
DNA-Moleküls
in doppelsträngige
DNA sicher (für
eine ausführlichere
Beschreibung dieser Art von Plasmid vgl. A. Gruss und S. D. Ehrlich,
Microbiological Reviews, Bd. 53/2 (Juni 1989), S. 231– 241).
Für die
vorliegenden Zwecke werden Plasmide mit diesem Replikationssystem
als einzelsträngige
DNA-Plasmide bezeichnet.
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Es ist überraschenderweise festgestellt
worden, dass der „rolling
circle"-Replikationsmechanismus Bakterienzelle
erfindungsgemäß so herstellt,
dass sie ein DNA-Konstrukt enthält,
das, abgesehen von einer DNA-Sequenz von Interesse und einer DNA-Sequenz,
die homolog zu einer Region des Genoms der Zelle ist, einen Plus-Replikationsursprung
von einem einzelsträngigen
DNA-Plasmid enthält,
wobei dem DNA-Konstrukt ein funktionelles rep-Gen, das zum Plus-Replikationsursprung
gehört,
fehlt.
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Diese Bakterienzelle kann nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren
unter Verwendung eines Elternplasmidvektors konstruiert werden,
der einen ersten Plus-Replikationsursprung
von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid
und einen zweiten Plus-Replikationsursprung von einem einzelsträngigen DNA-Plasmid
in der gleichen Orientierung wie der erste Plus-Ursprung enthält, wobei
der erste und der zweite Plus-Replikationsursprung den Vektor in
zwei Teile teilt, und zwar einen ersten Teil, der den ersten Plus-Replikationsursprung
und ein funktionelles rep-Gen,
das für
einen Faktor kodiert, der für
die Replikation vom ersten und zweiten Plus-Replikationsursprung
erforderlich ist, umfasst, und einen zweiten Teil, der den zweiten
Plus-Replikationsursprung, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine
DNA-Sequenz, die homolog zu einer Region des Genoms der für die Einführung des
Plasmidvektors vorgesehen Zelle ist, umfasst.
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Bei Replikation des Elternvektors
werden der erste und der zweite DNA-Nachkommenvektor vermutlich nach folgendem
Mechanismus gebildet:
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Das Rep-Protein initiiert die Replikation
durch Bildung eines Einzelstrangbruchs am ersten Plus-Ursprung und
schreitet fort, um einen Einzelstrangbruch am zweiten Plus-Ursprung
zu erzeugen. Der verdrängte Strang
wird unter Bildung eines ersten Nachkommenvektors religiert, der
einen ersten Plus-Replikationsursprung
von einem einzelsträngigen
DNA-Plasmid und ein funktionelles rep-Gen, das zu dem ersten Plus-Ursprung
gehört,
enthält.
Entsprechend schreitet das Rep-Protein vom zweiten Plus-Ursprung
fort, um einen Einzelstrangbruch am ersten Plus-Ursprung zu erzeugen,
wobei auf diese Weise bei Religation des verdrängten Strangs und Umwandlung
der einzelsträngigen
DNA in doppelsträngige
DNA ein zweiter Nachkommenvektor gebildet wird, der einen zweiten
Plus-Replikationsursprung aus einem einzelsträngigen DNA-Plasmid, dem ein funktionelles
rep-Gen, das zu dem zweiten Plus-Replikationsursprung gehört, fehlt,
sowie eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog
zu einer Region des Genoms der Zelle ist, umfasst. Da der zweite
Nachkommenvektor kein funktionelles rep-Gen umfasst, hängt die
Replikation dieses Moleküls
vollständig
vom Rep-Protein ab, das in trans entweder vom ersten Nachkommenvektor
oder vom Elternvektor zur Verfügung
gestellt wird.
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Alternativ dazu könnten die beiden Nachkommenvektor
auch als Ergebnis der Rekombination zwischen den homologen DNA-Regionen,
die die beiden auf dem Elternvektor vorhandenen Ursprünge einschließen und/oder
dazu benachbart sind, gebildet werden.
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Ein zweiter Nachkommenvektor ohne
einen funktionellen Replikationsursprung kann gebildet werden, wenn
der erste Plus-Ursprung im Elternplasmid, das vorstehend beschrieben
wurde, durch ein kleines DNA-Fragment ersetzt wird, das aus der
Ursprungsregion stammt und ausreicht, um eine Termination der Plasmidreplikation
sicherzustellen, jedoch zu klein ist, um einen funktionellen Ursprung
darzustellen. Derartige Fragmente sind in pUB 110 (Boe et al., J.
Bacteriol., Bd. 171 (1989), S. 3366–3372) und in pC194 (Gros et
al., EMBO J., Bd. 6 (1987), S. 3863–3869) identifiziert worden.
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Die Bakterienzelle kann alternativ
nach einem erfindungsgemäßen Verfahren
konstruiert werden, das die Transformation der Wirtszelle mit einem
ersten DNA-Vektor,
der einen ersten Plus-Replikationsursprung aus einem einzelsträngigen DNA-Plasmid
und ein funktionelles rep-Gen umfasst, und die anschließende oder gleichzeitige
(durch Co-Transformation) Transformation der Wirtszelle mit einem
zweiten DNA-Vektor umfasst, der einen zweiten Plus-Replikationsursprung
aus einem einzelsträngigen
DNA-Plasmid umfasst, dem jedoch ein funktionelles rep-Gen, das zu dem zweiten
Plus-Replikationsursprung gehört,
fehlt, und der außerdem
eine DNA-Sequenz von Interesse und eine DNA-Sequenz, die homolog
zu einer Region des Genoms der Zelle ist, enthält. Der zweite DNA-Vektor kann
in der Zelle aufgrund des Vorhandenseins des Rep-Proteins, das vom ersten
DNA-Vektor zur Verfügung gestellt
wird, bewahrt werden.
-
Wenn der Elternvektor oder der zweite
DNA-Vektor ein modifiziertes rep-Gen umfassen, dann kann der zweite
Plus-Ursprung dem modifizierten rep-Gen vorausgehen oder sich im
modifizierten rep-Gen vorausgehen oder sich im modifizierten rep-Gen
befinden. Wie vorstehend beschrieben wurde, kann der zweite Plus-Ursprung
vom gleichen Plasmid oder von einem anderen Plasmid als der erste
Plus-Ursprung abgeleitet sein. In den Fällen, in denen der erste und
der zweite Plus-Ursprung von verschiedenen Plasmiden abgeleitet sind,
so dass die Replikation nicht von beiden Ursprüngen mittels des gleichen Rep-Proteins
initiiert wird, kann der erste DNA-Vektor zusätzlich ein rep-Gen enthalten,
das für
ein aktives Rep-Protein kodiert, das zur Initiation der Replikation
von dem zweiten Plus-Ursprung imstande ist. Der Elternvektor oder
der zweite DNA-Vektor können
auch einen Selektionsmarker umfassen, wie es vorstehend beschrieben
wurde.
-
Gemäß einer günstigen Ausführungsform
zur Förderung
des Integrationsprozesses kann ein Vektor eingesetzt werden, dessen
Replikation von permissiven Bedingungen unter Einschluss der Temperatur,
bei der die Wirtszellen kultiviert werden, abhängt. Wenn also ein Wirtsbakterium,
das den ersten und den zweiten DNA-Vektor enthält, bei der permissiven Temperatur
für die
Plasmidreplikation kultiviert wird, dann dient das Rep-Protein,
das vom ersten DNA-Vektor gebildet wird, dazu, den zweiten DNA-Vektor
in der Zelle zu bewahren. Bei nichtpermissiven Temperaturen, bei
denen der erste DNA-Vektor nicht repliziert werden kann, gehen der
erste Vektor und dementsprechend auch das Rep-Protein, das von ihm
gebildet wird, aus der Zelle verloren, so dass der zweite DNA-Vektor
ebenfalls nicht länger
zur Replikation imstande ist. Durch fortgesetztes Kultivieren unter
Selektionsdruck, z. B. in Gegenwart eines Antibiotikums, überleben
nur diejenigen Zellen, die in ihrem Genom das erfindungsgemäße insertierte
DNA-Konstrukt unter
Einschluss eines Gens, das für
einen Selektionsmarker kodiert, enthalten.
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Es ist darauf hinzuweisen, dass die
Wirtszelle, sobald das DNA-Konstrukt in ihr Genom integriert worden
ist, in Abwesenheit eines Selektionsdrucks kultiviert werden kann
ohne daraus folgenden Verlust des DNA-Konstrukts oder von Teilen
davon aus der Zelle. Man nimmt an, dass dies der Tatsache zuzuschreiben ist,
dass die integrierte DNA nicht zur autonomen Replikation imstande
ist, sondern mit dem Wirtsgenom repliziert wird. Das Fehlen einer
autonomen Replikation der integrierten DNA impliziert, dass keine
Bildung des einzelsträngigen
DNA-Zwischenprodukts
stattfindet, von der man annimmt, dass sie für den Rekombinationsprozess
verantwortlich ist, durch den integrierte DNA aus dem Wirtsgenom
ausgeschnitten wird (vgl. Ph. Noiret et al., J. Mol. Biol, Bd. 196
(1987), S. 39–48;
und M. Young und S. D. Ehrlich, J. Bacteriol., Bd. 171/5 (Mai 1989), S.
2653– 2656).
-
Es ist festgestellt worden, dass
es möglich
ist, das integrierte DNA-Konstrukt durch Kultivieren von transformierten
Zellen unter erhöhtem
Selektionsdruck, d. h. bei erhöhten
Konzentrationen von Antibiotika, zu amplifizieren. Es ist früher festgestellt
worden, dass bei Fehlen eines Selektionsdrucks derartige amplifizierte Kopien
häufig
aus den Zellen verloren gehen. Im Gegensatz dazu stellt die vorliegende
Erfindung eine Bakterienzelle bereit, in der amplifizierte Kopien
von integrierten DNA-Sequenzen stabil in den Wirtszellen gehalten werden,
da, wie vorstehend erklärt
wurde, die integrierte DNA nicht replikativ ist. Die vorliegende
Erfindung ist zwar vorstehend hauptsächlich als geeignet für die Integration
von heterologen DNA-Sequenzen beschrieben worden, es ist jedoch
darauf hinzuweisen, dass das vorliegende Verfahren sich auch eignet,
um eine amplifizierte Kopienzahl eines Gens zu erhalten, das homolog
in Bezug auf die Wirtszelle ist, um die Produktion eines speziellen
Genprodukts zu erhöhen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNG
-
Die vorliegende Erfindung wird weiter
mit Bezug auf die beigefügte
Zeichnung erläutert,
in der
-
1 eine
Restriktionskarte des Plasmids pDN3000 zeigt;
-
2 eine
Restrktionskarte des Plasmids pE 194 zeigt;
-
3 eine
Restriktionskarte des Plasmids pPL1975 zeigt;
-
4 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSX120 zeigt;
-
5 eine
Restrktionskarte des Plasmids pPL2002 zeigt;
-
6 eine
Restriktionskarte des Plasmids pDN3060 zeigt;
-
7 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1085 zeigt;
-
8 eine
Restriktionskarte des Plasmids pUC 19 zeigt;
-
9 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1103 zeigt;
-
10 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1130 zeigt;
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11 eine
Restriktionskarte des Plasmids pSJ1136 zeigt;
-
12 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1137 zeigt;
-
13 eine
Restrktionskarte des Plasmids pPL1484 zeigt;
-
14 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1155 zeigt;
-
15 eine
Restriktionskarte des Plasmids psJ1157 zeigt;
-
16 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1259 zeigt;
-
17 eine
Restriktionskarte des Plasmids pDN2904 zeigt;
-
18 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1139 zeigt;
-
19 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1139a zeigt;
-
20 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJI139b zeigt;
-
21 eine
Restrktionskarte des Plasmids pDN3020 zeigt;
-
22 eine
Restriktionskarte des Plasmids pPL1878 zeigt;
-
23 eine
Restriktionskarte des Plasmids pPL1196 zeigt;
-
24 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ993 zeigt;
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25 eine
Restriktionskarte des Plasmids pSJ1163 zeigt;
-
26 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1136a zeigt;
-
27 eine
Restriktionskarte des Plasmids pSJ1136b zeigt;
-
28 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1259a zeigt;
-
29 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1555 zeigt;
-
30 eine
Restrktionskarte des Plasmids pSJ1555a zeigt; und
-
31 eine
Restriktionskarte des Plasmids pSJ1555b zeigt.
-
In allen Figuren bezeichnen Pfeile
die Richtung der Transkription.
-
Um die Lesbarkeit zu verbessern,
sind die Replikationsursprünge
(+ ori pUB110, + ori pE194, ori pUC19) durch die tatsächliche
Startstelle der Replikation bezeichnet, obwohl ein funktioneller
Ursprung aus einer größeren DNA-Region
besteht.
-
Die Erfindung wird in den nachstehenden
Beispielen weiter erläutert,
die jedoch den Umfang und den Geist der Erfindung, wie sie beansprucht
wird, nicht beschränken
sollen.
-
MATERIALIEN
UND METHODEN
-
Plasmide
-
pBD64: Beschrieben von Gryczan et
al., 1980.
-
pDN3060: Ein Klonierungssvektor,
der von dem Bacillus-Plasmid pDN1050 (B. Diderichsen, 1986) durch
Insertion von synthetischen Oligonucleotiden, die eine Anzahl nützlicher
Restriktionsstellen enthalten, abgeleitet ist. Die Restriktionskarte
ist in 6 gezeigt.
-
pDN2904: Ein Derivat des Bacillus-Plasmids
pUB110 (Gryczan et al., 1978), das sowohl ein Chloramphenicol-Resistenzgen
als auch Kanamycin-Resistenzgen enthält. Die Restriktionskarte ist
in 7 gezeigt.
-
pP11484: Ein pUC19-Derivat (Yanisch-Perron
et al., 1985), das eine modifizierte Polylinkerregion enthält, in die
ein 1,4 kb umfassendes BamHI-Fragment von pDN2904, das das Kanamycin-Resistenzgen
enthält, insertiert
ist. Die Restriktionskarte ist in 13 gezeigt.
-
pPL1878: pDN1380 (beschrieben in
Diderichsen und Christiansen, 1988), das ein 2,4 kb umfassendes HaeII-SphI-Fragment
enthält,
das für
eine Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase
(CGTase) kodiert, die aus Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 stammt.
Das Gen wurde ursprünglich
in das E. coli-Plasmid pBR322 auf einem 12,8 kb umfassenden EcoRI-Fragment
kloniert (Starnes et al., 1989). Die Restriktionskarte ist in 22 gezeigt.
-
Stämme:
-
E. coli SJ 6: Ein restiktionsdefizientes
Derivat von MC 1000 (Diderichsen et al., 1990).
-
Bacillus subtilis DN1885: Ein amyE,
amyR2, spo+, Pro+-Derivat
von Bacillus 168. (Diderichsen et al., 1990).
-
Bacillus subtilis DN1686: Ein spo–-Derivat
von DN1280, das eine chromosomale Deletion im dal-Gen enthält (Diderichsen,
1986).
-
Bacillus licheniformis AtCC 9789.
-
Bacillus lentus NCIB 10309.
-
-
TY9: Wie TY-Medium, der pH-Wert wurde
jedoch durch Zugabe von NaHCO3 (0,1 M) auf
8,5 eingestellt.
-
-
-
-
-
Allgemeine Methoden
-
Die experimentellen Techniken, die
zur Konstruktion der Plasmide angewandt wurden, waren Standardtechniken
auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie; vgl. T. Maniatis et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New
York, 1982.
-
Restriktionsendonucleasen wurden
von New England Biolabs und Boehringer Mannheim bezogen und verwendet,
wie es von den Herstellern empfohlen wird. T4-DNA-Ligase wurde von
New England Biolabs bezogen und verwendet, wie es vom Hersteller
empfohlen wird.
-
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus
allen Stämmen
wurde nach dem von Kieser, 1984, beschriebenen Verfahren durchgeführt.
-
Transformation von E.
coli:
-
Zellen von E. coli wurden kompetent
gemacht und transformiert, wie es von Mandel und Higa, 1970, beschrieben
wurde, oder sie wurden durch Elektroporati on transformiert, wie
es im Manual für
die BIO-RAD-Gene-Pulser-Elektroporationsvorrichtung
beschrieben wird.
-
Transformation von B.
subtilis:
-
Kompetente Zellen wurden hergestellt
und transformiert, wie es von Yasbin et al., 1975, beschrieben wird.
-
Transformation von B.
licheniformis:
-
Plasmide wurden in B. licheniformis
durch Polyethylenglykol-vermittelte Protoplastentransformation eingeführt, wie
es von Akamatzu, 1984, beschrieben wird.
-
Transformation von B.
lentus:
-
Plasmide wurden in B. lentus durch
Protoplastentransformation gemäß einem
geringfügig
modifizierten Verfahren nach Akamatzu (1984) eingeführt. Die
Modifikationen waren ein höherer
pH-Wert im Regenerationsmedium, z. B. wurde das HCP 1,5-Medium auf
einen pH-Wert von 8,5 durch Zugabe von 0,1 m NaHCO3 zu
dem Medium gepuffert.
-
BEISPIEL 1
-
Stabile Integration
eines nicht-replikativen DNA-Moleküls in das Bacillus lentus-Chromosom
-
Klonierung des Subtilisin-309-Gens
-
Das für die als Subtilisin 309 bezeichnete
Protease-kodierende Gen wurde aus einer Isolierung des B. lentus-Stamms
NCIB 10309, der in WO 89/06279 be schrieben wird, kloniert. Weiteres
Subklonieren führte
zu dem Plasmid pSX120, das den Replikationsursprung von pUB 110,
das Chloramphenicol-Resistenzgen (cat) aus pC194, die beiden Promotoren
PAMYM und PAMYQ und
das für
die Subtilisin 309-Protease kodierende Gen enthielt (vgl. 4 und die internationale
Patentanmeldung PCT/DK90/00164).
-
Konstruktion des Integrationsplasmids
pPL2002
-
Das Plasmid pDN3000 wurde durch Restriktionsverdau
von pUC19 (Yanisch-Perron
et al.) mit EcoRI und Insertion der folgenden Oligonucleotidsequenz
(die nach der Phosphoamiditmethode, die von Beaucage und Caruthers,
Tetrahedron Letter, Bd. 22 (1981), S. 1859–1869 beschrieben wird, in
einem DNA-Syntheseautomaten
hergestellt wurde):
in das
linearisierte pUC19, gefolgt von einer Ligation, konstruiert. Das
Ligationsgemisch wurde dann verwendet, um kompetente E. coli SJ6-Zellen
zu transformieren, und die Transformanten wurde auf LB-Platten mit einem
Gehalt an 100 μg/ml
Ampicillin selektiert. Die Orientierung des insertierten Linkers
in pDN3000 ist durch Orientierung der Restriktionsstellen in
1 angegeben.
-
Das Plasmid pPL1975 wurde durch Restriktionsverdau
von pDN3000 mit BglII, gefolgt von einer Ligation dieses linearisierten
Plasmids an das MboI-Fragment, das die DNA aus Position 1 bis 1585,
die durch Restriktionsverdau von pE194 (2, Horinouchi und Weisblum) mit MboI
erhalten wurde, enthielt, konstruiert. Das Ligationsgemisch wurde
anschließend
verwendet, um kompetente E. coli SJ6-Zellen zu transformieren, und
die Transformanten wurden auf LB-Platten mit einem Gehalt an 100 μg/ml Ampicillin
selektiert. Die Orientierung der Verbin dung dieser beiden Fragmente
ist so, wie sie in 3 angegeben
ist. pPL1975 enthält
also einen funktionelle E. coli-Replikationsursprung und ein pE194-DNA-Fragment, das einen
intakten Plus-Ursprung (+ ori pE194) und ein verkürztes repF-Gen
(repF') (Villafane
et al., 1987) umfasst.
-
Das Plasmid pPL2002 (5) wurde durch Restriktionsverdau von
pPL1975 (3) mit EcoRI
und BamHI und Ligation des linearisierten Plasmids an das 3,3 kb
umfassende EcoRI (partiell)-BglII-Fragment von pSX120 (4) konstruiert, das das
subtilisin 309-Gen und das cat-Registenzgen enthielt. Das Ligationsgemisch
wurde dann verwendet, um kompetente E. coli SJ6-Zellen zu transformieren,
und die Transformanten wurden auf LB-Platten mit einem Gehalt an
100 μg/ml
Ampicillin selektiert.
-
Stabile Integration des
pPL2002-Plasmids in das Chromosom von B. lentus
-
Eine Isolierung des B. lentus-Stamms
NCIB 10309 wurde durch Protoplastentransformation mit dem temperaturempfindlichen
Plasmid pE194 (vgl. 1)
transformiert; die Selektion auf Erythromycin-Resistenz (5 μg/ml) erfolgte
bei 30 °C
(permissive Temperatur). Der erhaltene Stamm wurde als PL2156 bezeichnet.
-
PL2156 wurde anschließend einer
Protoplastentrasformation mit dem Plasmid pPL2002 unterzogen; die
Selektion auf Chloramphenicol-Resistenz (8 μg/ml) und auf Erythromycin-Resistenz
(5 μg/ml)
bei 30°C führte zum
Stamm PL2157, der die beiden Plasmide pE194 und pPL2002 enthielt.
In diesen Zellen hängt
die Replikation des Plasmids pPL2002 vollständig vom Vorhandensein des
Plasmids pE194 ab, das für
das für
die pPL2002-Replikation unabdingbare Replikationsprotein repF kodiert.
-
Der Stamm PL2157 wurde über Nacht
in TY9-Medium gezüchtet,
und Verdünnungen
wurden auf TY9-Platten bei 45°C
(nicht-permissive Temperatur) plattiert, wobei auf Chloramphenicol-Resistenz
(10 μg/ml) selektiert
wurde.
-
Eine dieser Chloramphenicol-resistenten
Kolonien wurde als PL2158 bezeichnet.
-
Die Southern-Hybridisierung zeigte,
dass in dem Stamm PL2158 das Plasmid pPL2002 in das Chromosom durch
homologe Rekombination zwischen dem vom Plasmid getragenen und dem
chromosomalen Subtilisin 309-Gen integriert und anschließend auf
etwa 4 Kopien amplifiziert worden war. Es wurden keine Hinweis auf
vollständige
pE194-Plasmidsequenzen gefunden.
-
Die Stabilität der chromosomal integrierten
Kopien von pPL2002 im Stamm PL2158 wurde bei Fermentationen im großen Maßstab (1500
1) ohne Antibiotika getestet.
-
Nach der Fermentation wurden Proben
verdünnt
und auf TY9-Platten plattiert; 100 Kolonien wurden auf TY9-Platten
mit einem Gehalt an 10 μg/ml
Chloramphenicol replikaplattiert. 98 der getesteten Kolonien war noch
resistent gegenüber
Chloramphenicol, was zeigt, dass das Plasmid pPL2002 noch in das
Chromosom integriert war. 20 dieser Kolonien wurden anschließend durch
Southern-Hybridisierung
untersucht, die zeigte, dass das Plasmid pPL2002 noch integriert
war, und zwar offensichtlich mit der gleichen Kopienzahl (etwa 4 Kopien)
in allen getesteten Kolonien.
-
BEISPIEL 2
-
Konstruktion von Plasmidvektoren
die zwei pUB110-Replikationsursprünge enthalten
-
Das Plasmid pSJ1085 (7) wurde durch Restriktionsverdau von
pDN3060 (das einen Replikationsursprung (+ ori pUB110) und das rep-Gen
(rep) aus pUB110 und ein Chloramphenicol-Resistenzgen (cat) aus
pC194 enthielt) mit BamHI und
-
-
EcoRI und Insertion der folgenden
Oligonucleotidsequenz (die nach der Phosphoamiditmethode, die von
Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 189–1869 beschrieben
wird, in einem DNA-Syntheseautomaten hergestellt wurde):
in
das linearisierte pDN3060, gefolgt von Ligation und Transformation
von B. subtilis DN1885, konstruiert.
-
Das Plasmid pSJ1103 (9) wurde durch Restriktionsverdau von
pSJ1085 ( 7) mit EcoRI
und Insertion des gesamten linearisierten Plasmids in das einem
entsprechenden Restriktionsverdau unterworfene Plasmid pUC 19 (8), gefolgt von Ligation
und Transformation von E. coli SJ6, konstruiert. Das erhaltene Plasmid
pSJ1103 enthält
den Plus-Ursprung und das rep-Gen aus pUB110, das cat-Gen aus pC194,
den pUC 19-Repliaktionsurspurng (ori pUC 19) und das β-Lactamase-Gen
(Ampicillin-Resistenz) (bla).
-
Das Plasmid pSJ1130 (10) wurde von pSJ1103 (9) durch Deletion eines 1,6 kb umfassenden NsiI-PstI-Fragments
abgeleitet, was im Wesentlichen zu einem pUC 19-Plasmid führte, das
einen pUB 110-Plus-Ursprung und ein verkürztes rep-Gen (rep) enthielt.
Diese Plasmid wurde in E. coli SJ6 transformiert.
-
Ein 1,4 kb umfassendes HindIII-Fragment
aus pDN3060 (6), das
den Plus-Ursprung
gefolgt vom intakten rep-Gen enthielt, wurde anschließend in
die einzige HindIII-Stelle von pSJ1130 (10) inseriert, und das ligierte Plasmid
wurde in E. coli als SJ6 transformiert, was zu pSJ1136 (11) führte. Bei diesem Experiment
wurde das Fragment in pSJ1136 in zwei Tandemkopien insertiert. Eine dieser
Kopien wurde anschließend
durch Verdau von pSJ1136 mit NsiI, Religation des 5,1 kb umfassenden
Fragments und Transformation von E. coli SJ6 deletiert, was zu pSJ1137
(12) führte, das
einen pUB110-Ursprung benachbart zum verkürzten rep-Gen und einen pUB110-Ursprung
benachbart zu einem intakten rep-Gen enthält.
-
Das für Kanamycin-Resistenz kodierende
Gen (kan) wurde aus dem Plasmid pPL1484 (13) auf einem 1,4 kb umfassenden SphI-Fragment
ausgeschnitten und in jeder der beiden möglichen Orientierungen in die
SphI-Stelle von pSJ1137 (12)
insertiert, gefolgt von einer Transformation von E. coli SJ6, wobei
man pSJ1155 (14) und
pSJ1157 (15) erhielt.
pSJ1157 enthielt das kan-Gen in zwei Tandemkopien. Eine Kopie wurde
mit BamHI ausgeschnitten, und das 6,5 kb umfassende Fragment wurde
religiert und in E. coli SJ6 transformiert, wobei pSJ1259 (16) erhielt.
-
Das Plasmid pSJ1139 (18) wurde auf folgende Weise konstruiert:
Das Bacillus-Plasmid pDN2904 (17),
das eine Chloramphenicol-Resistenzgen (cat), ein Kanamycin-Resistenzgen
(kan) und den pUB 110-Plus-Ursprung mit dem entsprechenden rep-Gen
enthielt, wurde mit SphI verdaut und an pSJ1130 (10) ligiert, das ebenfalls mit SphI verdaut
worden war. Das erhaltene Plasmid pSJ1139 enthält einen pUB110-Ursprung, der
mit einem verkürzten
rep-Gen verbunden ist, und einen pUB110-Ursprung, der mit einem
intakten rep-Gen verbunden ist.
-
BEISPIEL 3
-
Bildung von DNA-Nachkommenvektoren
aus Plasmiden die zwei pUB110-Replikationsursprunge
enthalten in Bacillus subtilis
-
Das Plasmid pSJ1139 (18) (hergestellt aus E. coli SJ1139 in
einer als solches bekannten Weise) wurde in B. subtilis DN1885 transformiert,
wobei die Selektion auf Kanamycin-Resistenz (10 μg/ml) erfolgte, und Plasmid-DNA
wurde aus mehreren Transformanten hergestellt. Eine Agarosegel-Elektrophorese
dieser Plasmide zeigte, ob sie unverdaut oder mit einer Reihe von
Restriktionsenzymen verdaut waren, das Vorhandensein von zwei kleineren
DNA-Molekülen
von 5,1 kb sowie eine kleine Menge des Volllängenplasmids pSJ1139 von 7,5
kb. Die erhaltenen Restriktionsmuster entsprachen den erwarteten
Mustern für
die Bildung von zwei Nachkommenvektoren pSJ1139a (19) und pSJ1139b (20), und zwar durch homologes Crossing-over
zwischen den beiden rep-Sequenzen auf pSJ1139 oder durch Einwirkung
des Rep-Proteins, das einen Einzelstrangbruch am pUB 110-Plus-Ursprung
im Plus-DNA-Strang erzeugt, der dann verdrängt und erneut zum Kreis geschlossen
wird, wie es in A. Gruss und S. D. Ehrlich, a.a.O., beschrieben
wird (beide Mechanismen können
zu den beiden gleichen Nachkommenvektoren führen).
-
Diese Vektoren wurden weiter durch
erneute Transformation in den B. subtilis-Stamm DN1885 und Ausplattieren auf LB-Platten
mit einem Gehalt an entweder 10 μg/ml
Kanamycin oder 6 μg/ml
Chloramphenicol, gefolgt von Replikaplattieren jeder Platte auf
eine neue Platte mit einem Gehalt von dem anderen Antibiotikum,
analysiert. Vektoren wurden anschließend aus jedem Typ von Transformant
isoliert und durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert, wobei man
die folgenden Ergebnisse enthielt:
-
Transformanten, die sowohl gegenüber Chloramphenicol
als auch gegenüber
Kanamycin resistent sind, enthalten alle drei Vektorspezies (pSJ1139
mit 7,5 kb, pSJ1139a mit 2,4 kb und pSJ1139b mit 5,1 kb). Transformanten,
die gegenüber
Chloramphenicol resistent und gegenüber Kanamycin resistent, jedoch
gegenüber
Chloramphenicol empfindlich sind, wurden nicht erhalten. Der kleine
Nachkommenvektor pSJ1139a mit 2,4 kb ist also zur autonomen Replikation
in B. subtilis nicht imstande.
-
BEISPEIL 4
-
Stabile Integration eines
nicht-replikativen DNA-Moleküls
in das B. subtilis-Chromosom
-
Konstruktion eines B.
subtilis-Stamms, der eine chromosomale Kopie eines Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase-Gens
(CGTase-Gens) enthält
-
Das CGTase-Gen (CGT) wurde aus dem
Plasmid pPL1878 (22)
auf einem 2,5 kb umfassenden BamHI-SphI-Fragment ausgeschnitten
und an das BamHI-SphI-verdaute
Plasmid pDN3020 (21)
unter Bildung des Plasmids pPL1896 (23)
ligiert. pDN3020 ist ein Derivat von pDN1313 (Dederichsen, 1986), das
durch Insertion eines synthetischen, SphI-enthaltenden Oligonucleotidlinder
(hergestellt, wie es im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben wurde)
in die EcoRI-Stelle
des Plasmids pDN1380 (Diderichsen und Christiansen, 1988) erhalten
wurde, was zum Plasmid pDN1620 führte.
Die Promotorregion von einer maltogenen Amylase aus B. stearothermophilus
(PamyM), die auf pDN1620 (B. Diderichsen und L. Christiansen, a.a.O)
vorhanden ist, wurde anschließend
auf SphI-BamHI-verdautes
pUC19 auf einem ungefähr
200 by umfassenden BamHI-SphI-Fragment übertragen, was zum Plasmid
pDN2977 führte.
Die Promotorregion wurde aus pDN2977 auf einem ungefähr 200 by
umfassenden BglII-SacI-Fragment ausgeschnitten, das in die Polylinkerregion
von pDN1313 insertiert wurde, wobei das Plasmid pDN3020 erzeugt
wurde. Das CGTase-Gen auf pPL1896 ist von zwei Fragmenten von chromosomaler
B. subtilus-DNA flankiert, die in 23 als
dal und dfs bezeichent werden. dal ist das für D,L-Alaninracemase von B.
subtilis kodierende Gen (Diderichsen, 1986).
-
Das Plasmid pPL1896 wurde in den
B. subtilis-Stamm DN1686 transformiert. Bei Selektion allein auf Dal+-Transformanten wurden mehrere Stämme erhalten,
die Chloramphenicol-empfindlich, CGTase+ waren. Sie
wurden durch ein doppeltes homologes Crossing-over zwischen pPL1896
und dem DN1686-Chromosom ge bildet, wie es von Diderichsen, 1986,
beschrieben wurde. Ein derartiger Stamm ist PL1887, der eine chromosomal
integrierte Kopie des CGTase-Gens enthält.
-
Konstruktion eines Integrationsvektors,
der das CGTase-Gen enthält
-
Das CGTase-Gen wurde aus pPL1878
(22) auf einem 2,5 kb
umfassenden BamHI-NotI-Fragment ausgeschnitten. Ein Expressionsvektor
wurde durch Insertion eines 0,6 kb umfassenden SphI-PstI-Fragments, das
die Promotorregion des α-Amylasegens
enthielt, das aus einem α-Amylase überproduzierenden
Derivat von B. licheniformis ATCC 9789 kloniert wurde, das durch
herkömmliche
Mutageneseverfahren erhalten wurde, in einen von pUB110 abgeleiteten
Vektor, der den pUB 110-Ursprung und das für Kanamycin-Resistenz kodierende
Gen enthielt, konstruiert. Das CGTase-Gen (cgt) wurde stromabwärts von
diesem Promotor zwischen der BamHI-Stelle und der NotI-Stelle insertiert,
was zu pSJ993 (24) führte.
-
Ein 4 kb umfassendes BglII-Fragment
von pSJ993 wurde in die BglII-Stelle von pSJ1155 (beschrieben im
vorstehenden Beispiel 1, 14)
insertiert, wobei das erhaltene Plasmid in den E. coli-Stamm SJ6
transformiert wurde. Ampicillin-resistente,
CGTase-bildende Transformanten von E. coli SJ6 wurden durch Plattieren
von Transformanten auf LB-Platten, die 100 μg/ml Ampicillin und 0,5% lösliche Stärke enthielten,
und Absuchen auf die Bildung von klaren Höfen um die Kolonien, nachdem
die Platten mit Ioddampf angefärbt
waren, isoliert. Ein Transformant, der das Plasmid pSJ1163 (25) enthielt, in dem das
Kanamycin-Resistenzgen wiederhergestellt
worden war, wurde für
weitere Experiment aufbewahrt.
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Bildung von Nachkommenvektoren
aus pSJ1163 in den B. subtilis-Stämmen DN1885 und PL1897
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pSJ1163 (25) wurde in DN1885 transformiert, und
Vektor-DNA wurde aus Kanamycin-resistenten Transformanten isoliert
und durch Agarosegel-Elektrophorese
analysiert. Dabei zeigten sich Spuren eines 10,5 kb umfassenden
Plasmidmoleküls,
das pSJ1163 entsprach, und von zwei Nachkommenvektormolekülen pSJ1163b
mit 4,1 kb (27) und
pSJ1163a mit 6,4 kb (26)
in ungefähr
gleicher Menge bzw. in weitaus größerer Menge, die Nachkommenvektoren
entsprachen, die durch homologe Rekombination zwischen den beiden
rep-Sequenzen von
pSJ1163 oder durch Einwirkung des Rep-Proteins auf jeden Plus-Ursprung bei einer „rolling
circle"-Replikation
entstanden waren, wie es vorstehend beschrieben wurde. Die Bildung
der Nachkommenvektoren, wie sie vorstehend beschrieben wurde, wurde
auch beobachtet, wenn pSJ1163 in PL1897 transformiert wurde, und
zwei derartige Transformanten wurden für weitere Experimente als Stämme SJ1168 und
SJ1170 aufbewahrt.
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Isolierung von Integranden,
die nicht-replikative DNA-Moleküle
enthalten
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Die Stämme SJ1168 und SJ1170 wurden
in 10 ml TY-Medium mit einem Gehalt an 5 μg/ml Kanamycin überimpft
und über
Nacht bei 37°C
inkubiert. 100 μg
jeder Kultur wurde anschließend
in frisches TY-Medium überimpft,
und die Inkubation wurde wiederholt. Nach vier derartigen Zyklen
von Inkubationen über
Nacht wurde Plasmid-DNA aus beiden Kulturen hergestellt und durch
Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Es wurden keine Plasmid-Moleküle beobachtet.
Wenn die Plasmidzubereitung verwendet wurde, um E. coli bei Selektion auf
Ampicillin-Resistenz zu transformieren, dann wurden keine Transformanten
erhalten, was zeigt, dass weder das ursprüngliche, 10,5 kb umfassende
pSJ1163 noch das 4,1 kb umfassende Nachkommenvektormolekül pSJ1163b
vorhanden waren. Die Kanamycin-resistenten, plasmid-freien Stämme wurden
für weitere
Experimente als pSJ1223 und pSJ1237 aufbewahrt.
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Amplifikation
von integrierter DNA
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Durch Selektion auf Wachstum in TY-Medium
mit einem Gehalt an allmählich
steigenden Konzentrationen an Kanamycin wurden Stämme isoliert,
die zum Wachstum bei 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200
und 1400 μg/ml
Kanamycin imstande waren. Bei chromosomaler DNA aus Stämmen, die
resistent gegenüber
mehr als etwa 400 μg/ml
Kanamycin waren, zeigte der Verdau mit NheI oder NotI eine DNA-Bande der
Größe, die
für den
Verdau des 6,4 kb umfassenden Nachkommenvektor pSJ1163a mit diesen
Enzymen zu erwarten war. Diese Bande trat nicht beim Verdau von
DNA auf, die aus Stämmen
mit einem geringeren Grad an Kanamycin-Resistenz hergestellt wurde.
Eine konservative Abschätzung
ist, dass mindestens 5 bis 10 Kopien an integrierter DNA vorhanden
waren, wenn diese Bande auftrat.
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Stabilität der integrierten
DNA
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Stämme, die resistent gegenüber 400 μg/ml Kanamycin
waren, wurden eine Woche bei 37°C
in Schüttelkolben
mit einem Gehalt an BPX-Medium ohne zugegebenes Kanamycin gezüchtet. Sie
wurden anschließend
auf LB-Platten plattiert und sodann auf Platten mit einem Gehalt
an 10 μg/ml
Kanamycin replikaplattiert. Von etwa 100 Kolonien waren alle Kanamycin-resistent,
was die stabile Vererbung des Kanamycin-Resistenzgens, das in der
integrierten DNA vorhanden ist, in Abwesenheit eines Selektionsdrucks
zeigt.
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Stabilität eines
plasmidgetragenen CGTase-Gens in B. subtilis
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Das Plasmid pPL1892 ist im Wesentlichen
identisch zu pSJ993 (24),
wobei der einzige Unterschied darin besteht, dass eine andere Polylinderregion
stromabwärts
vom CGTase-Gen vorhanden ist. Dieses Plasmid wurde in DN1885 eingeführt, und
der erhaltene Stamm SJ984 wurde eine Woche bei 37°C in Schüttel kolben
mit einem Gehalt an BPX-Medium ohen zugegebenes Kanamycin gezüchtet.
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Das Ausplattieren auf Platten mit
einem Gehalt an Kanamycin (10 μg/ml)
ergab eine 10-fach geringere Zellenzahl als auf Platten ohne Kanamycin,
was zeigt, dass 90% der Zellen ihr Plasmid verloren hatten. Dies wird
auch durch den Befund widergespiegelt, dass weniger als 10% der
Kolonien auf Platten ohne Kanamycin CGTase bildeten.
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BEISPIEL 5
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Bildung von Nachkommenvektoren
aus pSJ1156 in B. licheniformis ATCC 9789
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Das Plasmid pSJ1156 ist identisch
zu pSJ1157, das in 15 gezeigt
ist. pSJ1156 wurde in B. licheniformis ATCC 9789 durch Protoplastentransformation
bei Selektion auf Kanamycin-Resistenz eingeführt, wobei man den Stamm pSJ1199
erhielt. Die Analyse des Plasmidgehalts von pSJ1199 durch Restriktionsenzymverdau
und Agarosegel-Elektrophorese zeigte das Vorhandensein von zwei
Plasmidmolekülen.
Eines war identisch zu pSJ1259 (16)
und wurde mit größter Wahrscheinlichkeit
durch Deletion einer Kopie des kan-Gens durch homologe Rekombination
gebildet. Das andere entsprach pSJ1259a (28), also einem der beiden Nachkommenmoleküle, die
entweder durch homologe Rekombination zwischen den beiden rep-Sequenzen
von pSJ1259 oder durch Einwirkung des Rep-Proteins an jedem Plus-Ursprung
bei einer „rolling
circle"-Replikation,
wie sie vorstehend beschrieben wurde, gebildet werden.
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BEISPIEL 6
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Stabile Integration eines
nicht-replikativen DNA-Moleküls
in das B- licheniformis ATCC 9789-Chromosom
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Konstruktion
eines Integrationsvektors
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Das Plasmid pSJ1260 ist identisch
zu pSJ1259, das in 16 gezeigt
ist. Chromosomale DNA aus B. licheniformis ATCC 9789 wurde mit PstI
+ BamHI verdaut, und Fragmente zwischen 2 und 4 kb wurden aus einem
Agarosegel isoliert. Diese Fragmente wurden in pSJ1260, das mit
PstI + BamHI verdaut worden war, ligiert, und in E. coli SJ6 bei
Selektion auf Ampicillin-Resistenz transformiert. Ein erhaltener
Transformant enthielt ein Insert von 2,1 kb, und das Plasmid wurde
als pSJ1555 (29) bezeichnet.
E. coli SJ6 mit einem Gehalt an pSJ1555 wurde bei der National Collection
of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 23 St. Machar Drive, Aberdeen,
AB2 1RY, Schottland, Vereinigtes Königreich, am 12. Dezember 1990
gemäß den Bestimmungen
des Budapester Vertrages zum Zweck von Patentverfahren unter der
Hinterlegungsnummer NCIMB 40346 hinterlegt. Dieses Plasmid besitzt
die Fähigkeit
zur Bildung von zwei Nachkommenmolekülen pSJ1555a (30) und pSJ1555b (31).
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Isolierung eines B. licheniformis-Integranden,
der ein nicht-replikatives DNA-Molekül enthält
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pSJ1555 wurde in B. licheniformis
ATCC 9789 durch Protoplastentransformation bei Selektion auf Kanamycin-Resistenz
eingeführt.
Ein erzeugter Kanamycin-resistenter
Transformant (SJ1613) war plasmidfrei, wie durch Gelelektrophorese
einer Plasmidzubereitung aus diesem Transformanten gezeigt wurde,
und die Plasmidzubereitung war nicht imstande, B. subtilis zu einer
Kanamycin-Resistenz zu transformieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass
sich das nicht-replikative Nach kommenmolekül pSJ1555a gebildet hatte und
das ATCC 9789-Chromosom integriert war.
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Amplifikation
und Stabilität
von integrierter DNA
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Der Stamm SJ11613 wurde nacheinander
in 10 ml umfassenden TY-Kulturen mit einem Gehalt 10, 20, 50, 100,
200, 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000 und 5000 μg/m1 gezüchtet, und
Stämme, die
bei jeder dieser verschiedenen Konzentrationen wuchsen, wurden für die weitere
Untersuchung aufbewahrt. Stämme,
die resistent gegenüber
20, 200 und 1500 μg/ml
Kanamycin waren, wurden weiter analysiert. Chromosomale DNA aus
den beiden letztgenannten Stämmen
zeigte bei Verdau mit BamHI eine ausgeprägte Bande von 4,5 kb, die bei
DNA aus dem ersten Stamm fehlte, wie für Stämme zu erwarten ist, die mehrfache Kopien
von pSJ1555a integriert in das Chromosom aufweisen.
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Alle Stämme wurden in BPX-Schüttelkolben
bei 37°C
für 7 Tage
ohne Kanamycin gezüchtet
und anschließen
auf LB-Platten ausgestrichen. Replikaplattierungen von LB-Platten
auf Kanamycin-Platten (10 μg/ml)
zeigten keine Kanamycin-empfindlichen Kolonien. Koloniezählungen
auf den Platten mit und ohne Kanamycin (10 μg/ml) wurden für die drei
Stämme,
die gegenüber
20, 200 und 1500 μg/ml
Kanamycin resistent waren, erhalten, und in allen Fällen betrugen
sie 1010 ml–1,
was die Stabilität
des integrierten kan-Gens zeigt.
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