DD297187A5

DD297187A5 - Wirksame herstellung von mutantenproteasen

Info

Publication number: DD297187A5
Application number: DD90343328A
Authority: DD
Inventors: Johannes C Van Der Laan; Christiaan A G Van Eekelen
Original assignee: ��`��@�K@�Kk��
Priority date: 1989-08-11
Filing date: 1990-08-08
Publication date: 1992-01-02
Also published as: BG92653A; RU2060276C1; AU629970B2; ES2095233T3; FI110365B; CA2023094A1; KR0169978B1; GR3021669T3; KR910004805A; JP3490435B2; JPH03210177A; BR9003956A; CN1049866A; DK0414297T3; US20040014175A1; CA2023094C; PT94961B; DE69028890D1; IE902904A1; FI903927A0

Abstract

Die Erfindung betrifft die effektive Produktion von mutierten Proteasen. Es werden alkalophile Bacillus-Staemme zur Verfuegung gestellt, die effizient mutierte Bacillus-Proteasen produzieren und nicht in der Lage sind, die Wildtyp-Proteasen zu exprimieren. Verfahren zur Gewinnung derartiger Bacillus-Staemme werden ebenfalls beschrieben.

Description

Hierzu 22 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vorfahren zur Herstellung von mutierton Proteinon unter Nutzung von DNA-Rokombinationstochnikon. Insbosondero betrifft die Erfindung die effektive Produktion von unter Nutzung dor Proteintechnik produzierten Baclllus-Proteason mit Hilfe eines homologen Bacillus-Wirtsstammes, desson Fähigkeit zur Produktion der entsprechenden unverändernton Protease eliminiert worden ist.

Hintergrund der Erfindung

Bacilli finden breite Anwendung in der Produktion von industriell wichtigen Enzymen wie z. B. a-Amylasen, neutralen Proteasen und alkalischen (oder Serin-)Proteasen; siehe z. B. Debabov: „The industrial use of Bacilli" (Die industriolle Nutzung von Bacilli), in: The Molecular Biology of Bacilli (Die Molekularbiologie von Bacilli), Acad. Press, New York, 1982.

Die Hauptvorteile dor Verwendung von Bacilli bestehen darin, daß große Proteinmengen abgesondert und keine Schadstoffe produziert werden und daß sie in der Industrie seit langem gefahrlos verwendet werden. Mehrere Bacilll-Arten sind daher für die Produktion von für Nahrungsmittelzwecko bestimmten Proteinen zugelassen worden.

Palva et al., Gene, 19/1982, S.81-87, wiesen die Eignung von Bacillus subtllls als Expressionswirt für hereologe Proteine nach, indem sie die Expression des a-Amylasegens aus B. amylollquefaclens in B. subtllls vornahmen. Andere Quellen, die eine heterologe Genexpression in B. subtltlls beschreiben, sind z.B. Fahnestock und Fisher, J. Bacteriol 165/1986, S.796-804, die die Expression des Staphylococcus aureus-Protein-A-Gens nachwiesen; Schein et al., Biotechnology, 4/1986, S. 719-725, die die Expression von Human-Interferon α 2 offenlegten; und Wang et al., Gene, 69/1988, S. 39-47, die die Expression und Sekretion von atrialem Natriurese-a-Faktor beim Menschen nachwiesen. Um die ordnungsgemäße Sekretion dieser heterologon Proteine zu gewährleisten, bedienten sich die beiden erstgenannten Autoren der a-AmylAse-Signalsequenz und der letztgenannte Autor der Signalsequenz des mit dem zu exprimierenden Gen fusionierten B. subtills-Subtilisin-Gens (aprE).

Ein wesentliches Problem im Zusammenhang mit der Nutzung von Bacillus-Stämmon als Produktionswirte für rekombinante Proteine besteht darin, daß sie eine Vielzahl unterschiedlicher Proteasen bilden und sezernieren, die dazu neigen, die erzeugten heterologen Proteine abzubauen. Siehe z. B. Old und Primrose, „Principles of Gene Manipulation" (Prinzipien der Genmanipulation), 3.Auflage, 1985, S.289, Blackwell, Oxford.

In der Internationalen Patentanmeldung (PCT) WO89/04866 wird auf die Bedeutung extrazellulärer Proteasen verwiesen; etwa 90% der proteolytischen Aktivität sind demzufolge auf die neutrale Metalloprotease (npr) und die Serinprotease (alkalische Protease = apr) zurückzuführen.

Verschiedene Lösungen zur v. „orwindung dieses Abbauproblems sind vorgeschlagen worden.

Kawamura und Doi beschreiben im J. Bacteriol., 160/1984, S.442-444, eine B.subtllls-Doppelmutante, bei der gleichermaßen ein Mangel an extrazellulärer neutraler und alkalischer Protease besteht. Zunächst erfolgte die Herstellung einer neutralen Protease negativ aus B.subtilis DB100 durch Transfer der npr-R2- und der npr-E 18-Mutationen aus B.substilis NT 18.

Anschließend wurdo ein 178 bp-Fragment, das einen Teil des apr-Gens enthielt, mittels Genkonversion deletiert.

Fahnestock und Fisher beschreiben in Appl. Environ. Microbiol., 53Ί987, S.379-384, die Konstruktion eines apr-negativen B.substills-Stammes, ausgehend von einem npr-negativen Stamm. Sie verwendeten einen das apr-Gen enthaltenden Plasmidvektor und führten das cat-Gen (das die Chloramphenicol-Resistonz bewirkt) sowohl als Inaktivator als auch als selektierbaren Marker ein. Nachfolgend wurde das chromosomale apr-Gen durch diese Konstruktion ersetzt.

Sloma et al., J. Bacteriol., 170/1988, S. 5557-5563, entdeckten und sequenzierten ein drittes extrazellulöres Proteasegen (epr) aus B.subtilis. Eine partielle Deletion dieses Gens zeigte, daß es nur marginal an dieser extrazellulären Proteaseaktivität beteiligt

Bei näherer Prüfung der hergestellten Stämme scheint es, als ob keiner der genannten B.subtills-Stämme vollständig frei von extrazellulärer proteolytischer Aktivität war. Man braucht also auch weiterhin bessere Bacillus-Stämme mit Proteasemangel, die für die Herstellung von heterologon Proteinen verwendet werden können. Diese Forderung erhebt sich umso nachhaltiger, wenn das Ziel die Expression mutierter Proteasen ist.

In mehreren Veröffentlichungen wird die Herstellung von mutierten Proteasen unter Verwendung von Bacillus subtllls· Wirtsstämmen, mit denen das Wildtyp-Proteasegen nicht ausgedrückt werden kann, beschrieben, wobei so Mischungen aus mutierten Proteasen und Wildtyp-Proteasen vermieden werden.

In EP-A-0246678 (inhaltlich entspricht diese Anmeldung EP-A-0130756) wird ein B. subtllis-Stamm beschrieben, der kein enzymatisch aktives Subtilisin und keine neutrale Protease sezernieren kann, allerdings heterologe Proteasegene, die aus B.amyloliquefaciens isoliert oder abgeleitet wurden, exprimieit. Eine ortsspezifische Sättigungsmutagenese wurde am B.arnyloliquefaciens-Gen durchgeführt, und die Mutanten wurden exprimiert. Der negative Hintergrund der B.subtilis-Wirtsstämme wurde durch partielle Deletion eines oder beider der ursprünglichen Proteasegene bzw. durch N-Methyl-N'-nitro-

N-nitrosoguanldin(NTG)-Mutagenese erreicht. Ferner wurde unterstrichen, daß der beschriebene B.subtllis-Wirt in der Regel

sporenbildend ist und daß asporogene Mutanten sich für die Herstellung von (rokombinanton) Protoinen nicht sonderlicheignen.

In WO86/01825 (siehe Fahnestock und Fishor, a.a.O.) werden Baclllus-Stämme, Insbesondere von B.subtllis, mit verminderten Niveaus extrazellulärer Protease beschrieben. Das alkalische Proteasegen wird durch In vltro-lnsertion einer Gencodierung für

ein Protein, das auf den Mikroorganismus ein phänotypisches Merkmal überträgt, inaktiviert. Der das durch Insertion inaktivierte

Proteasegen enthaltende Plasmidvektor wird zu B.subtllis transformiert und das inaktivierte Gen tritt mitteis homologer Rekombination an die Stelle des nativen, chromosomalen Gens. In WO88/08033 werden Subtilisinanaloga aus Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin BPN', ein apr-Subtilisin aus B. subtllls

und ein Subtilisin aus B.mesenterlcus offengelegt. Diese Mutanten erhält man durch Austausch einor oder mohrerer

Aminosäuren am Ort oder in der Nähe der Calciumbindungsstelle durch negativ geladene Aminosäuren (z. B. Asp oder GIu). Die Mutanten werden in B.subtilis exprimiert. In WO 89/04866 wird ein B. subtllls-Stamm mit Proteaseaktivität mit geringer Sekretion beschrieben, der produziert wurde durch Einführung einer spoOH-Mutation in eine apr'npr'-Doppelmutante, wodurch der Stamm asporogen wird. Die so erhaltene Triplettmutante apr~npr~SpoOH~ wies eine Proteaseaktivität mit sehr geringer Sekretion auf. In den vorstehend erörterten Quellen werden die Expression homologer und heterologer Genein B. subtllls und die Konstruktion

von proteasenegativen B.substilis-Stämmen beschrieben. Dem Anschein nach weisen proteasenegative Stämme, die durchpartielle Deletion des Proteasegens oder durch Insertion eines anderen Gens in das Proteasegen produziert wurden, mehrere

Nachteile auf, wie z. B. folgende:

- das ursprüngliche Gen kann reaktiviert sein. Wird ein im Verhältnis zum inaktivierten chromosomalen Gen homologes Gen in die Zelle eingeführt (z.B. auf einem Plasmid), kann die homologe Rekombination eine Reaktivierung des Gens bewir! en.

- das ursprüngliche Gen ist zwar inaktiviert, kann aber zur Produktion partieller Expressionsprodukte führen, wenn dio Promotorregion noch aktiv ist. Das wirkt sich nachteilig auf die metabolische Effizienz aus.

- die Einführung unerwünschter phänotyplscher Merkmale, z. B Antibiotika-Rosistenz, in Abhängigkeit vom inserierten Gen.

- Plasmidinstabilität auf Grund der Homologie zwischen einer genomischen Sequenz und einem Teil des Plasmids. Daher ist eine Deletion aller Sequenzen mit möglicher Homolooie zwischen dem Chromosom und dem Plasmid wünschenswert.

Es bestehen aber auch andere Nachteile in bezug auf die Produktion von alkalischen Proteasen oder anderen Enzymen in B. subtilis. Zwar weisen Wells et al., Nucl. Acids Res., 11/1983, S. 7911-7925, nach, daß eine Expression von B. anyloliquefaclens-Subtitlisin-BPN' in B. subtilis mit Hilfe der eigenen Transkriptionssignale möglich ist, doch zeigen Jacobs et al., Nucl. Acids Res., 13/1985, S. 8913-8926, daß eine solche Strategie nicht generell anwendbar ist. Es wurde nachgewiesen, daß die 5'-Region des aus B.licheniformis abgeleiteten Subtilisin-Carlsberg-Gens keine Signale enthielt, die für die Transkription in B.subtllis funktionell sind. Um eine beachtliche Produktion zu erhalten, mußte ein B. subtills-Promotor vor dem betreffenden Gen inseriert werden. Ferner wird vermutet, daß nicht nur transkriptionsbezogene, sondern auch translatorische Sekretions- oder Reifungsprozesse auf weniger effiziente Art und Weise in heterologen Wirten auftreten könnten, und zwar auf Grund einer nicht perfekten Shine-Dalgarno-Sequenz oder sogar wegen einer Inkompatibilität zwischen Genprodukt und heterologem Wirt. Die vorstehend beschriebenen Expressionsprobleme können umgangen werden, wenn das Produkt in einem homologen Bacillus-Stamm, der nachweislich hohe Produktionskapazitäten hat, wobei eine hohe Effizienz hohe Produktionsniveaus nach sich zieht, synthetisiert wird.

Zusammenfassung der Erfindung Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren zur Produktion von Proteasen, die sich in mindestens einer Aminosäure von der Wildtyp-Protease unterscheiden, wobei dieses Verfahren die Nutzung eines homologen, alkalophilen Bacillus-Stammes als Expressionswirt beinhaltet und der genannte Stamm nicht in der Lage ist, die Wildtyp-Protease zu produzieren. In einem Punkt der vorliegenden Erfindung wird das stark alkalische Proteasegen aus dem Chromosom deletiert, der so erhaltene

proteasenegative Stamm kann als Wirt für die Expression homologer oder heterologer Proteasen verwendet werden.

In einem anderen Punkt der vorliegenden Erfindung wird das chromosomale, stark alkalische Proteasegen durch eine mutierte Kopie dieses Gens ersetzt. Ferner werden Verfahren für die Konstruktion der neuen, transformierten Stämme, dafür verwendete Vektoren und ein Verfahren

zur Produktion von mutierten Proteasen beschrieben.

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden mutierte Proteasen produziert, die eine starke Homologie zu den

ursprünglich mit Hilfe des entsprechenden Stammes produzierten Proteasen aufweisen.

Zu den bevorzugten Stämmen gehören die Bacillus novo-Spezies PB92, deren Abkömmlinge und eng damit im Zusammenhang

stehende Stämme, die durch ein mutiertes Protease-Codierungsgen transformiert wurden. Das Gen weist zumindest 30%,vorzugsweise 50% und im günstigsten Fall mindestens 80% Homologie mit dem Wildtyp-Gen der Codierungs-Serinproteasevon Bacillus PB92 auf. Das Gen wird vorzugsweise von einem Wildtyp-Gen eines alkalophilen Bacillus-Stammes abgeleitet.

Besonders bevorzugte Stämme sind asporogene, alkalophile Bacilli. Kurze Beschreibung der Figuren Fig. 1: zeigt die Konstruktion des Plasmids pm 58Δ, das Teile der 5'- und 3'-Flankierungsregionen des alkalischen Proteaseger

aus der Bacillus novo-Spezies PB92 enthält

Fig. 2: zeigt in schematischer Darstellung die Einführung des temperaturempfindlichen Replikationsstartpunktes vom PlasmidpE194neo-1 in das Plasmid ρΜ58Δ, wodurch das Plasmid pEM 58Δ entsteht.

Fiy 1: zeigt die Einführung des Plasmlds pEM 58 Δ in die 5'-Flankierungsregion des Proteasegens vom Baclllus-Stamm PBT110

mittels homologer Rekombination

Fig. 4: zeigt eine vereinfachte Restriktionskarte der Regionen im Umfeld des deletierten Proteasegens nach illegitimer

Rekombination. Zwei Stämme wurden erhalten, und zwar PBT125 und PBT126. Fig. 5: Nucleotidsequenz der Hind Ill-Fragmente von PBT125 (A) und PBT126 (B). Fig. 6: schematische Darstellung der Einführung des Proteasegens in M13 mp 18. Fig. 7: zeigt die Nucleotidsoquenz des Plasmids pBHA-1.

Fig.8: zeigt die Einführung des Proteasegens vom Baclllus-Stamm PBT110 in das Plasri.id pBHA-1. Fig. 9: ' zeigt die Umorientierung des F1-0RI, der das Barn HI-Fragment von pBHA1-MXL et thält, wobei das Plasmid

pBHAR-MXL entsteht

Fig. 10: zeigt das Subklonieren der 3'-Soquenz der stark alkalischen Protease in das Plasm¹.1 pBHAR-MXL, wobei das Plasmid

pBHARB.MXL rjeblldet wird

Fig. 11: zeigt die Deletion der E.coll-Sequenz aus dem Plasmid pBHARB-MXL M 216Q, wobei das Plasmid pBHB-MXL M 216Q

gebildet wird

Fig. 12: zeigt die Umorientierung des Neomycin-Resistenzgens Im Plasmid pE194neo-1, wobei das Plasmid pE194neo-3 gebildet

wird

Fig. 13: zeigt in schematischer Darstellung die Einführung des temperaturempfindlichen Replikationsstartpunktes vom Plasmid

pE194neo-3 in das Plasmid pBHB-MXL M 216Q, wobei das Plasmid pEN₃Q gebildet wird. Fig. 14: zeigt in schematischer Darstellung die Konstruktion vom Baclllus-Stamm PEP 111. Fig. 15: zeigt in schematischer Darstellung die Konstruktion vom Baclllus-Stamm PEP211.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung Aus zur Bacillus-Gattung gehörenden Stämmen produzierte Serinproteasen werden in der Regel alkalische Proteasen genannt. Bei den In der vorliegenden Erfindung benutzten Proteasen handelt es sich um Abkömmlinge von alkalophilen Bacilli, die daher

als stark alkalische Proteasen bezeichnet werden.

Für die Produktion von stark alkalischen Proteasen werden vorzugsweise alkalophile Baclllus-Stämme als Wirtszellen benutzt. Für die großtechnische Produktion braucht man unbndingt industriell produzierte Stämme. Sie stammen aus Organismen, die

aus dem Boden isoliert bzw. über Depots oder andere Stellen bezogen werden können, und man erhält sie durch genetische

Modifikation derartiger Baclllus-Stämme. Industriell produzierte Baclllus-Stämme sind in EP-A-0134048 definiert. Sie sind durch Resistenz gegenüber genetischem Austausch, wie z. B. Phageninfektion oder -tranformation, gekennzeichnet. Die Stämme sind

stabil und können sporenbildend bzw. nicht sporenbildend sein. In der Regel sind sie phototroph und so modifiziert, daß einehohe Ausbeute an endogenen Proteinprodukten, wie z. B. a-Amylase der Enzyme und verschiedene Proteasen, erzielt wird. Die

Ausbeute an einem endogenen Proteinprodukt, das im Rahmen eines großtechnischen Produktionsprozesses gewonnen wird,

kann sich auf mindestens 5g/l (0,5% Gewichtsteile) belaufen.

Industriell produzierte Stämme sezernieren auch DNasen, die einen Abbau von DNA im Medium bewirken, womit ein Schutz

gegen genetischen Austausch besteht.

Es ist vorteilhaft, als Wirtsstamm den Stamm zu verwenden, aus dem das Proteasegen ursprünglich isoliert wurde, denn nur in

diesem Fall hat man die Gewähr, daß alle für die Expression erforderlichen Signale funktionell sind.

Ein weiterer Vorteil der Nutzung von alkalophilen Bacilli als Produktionsstämme besteht in der minimalen Gefahr einer Kontamination durch andere Mikroorganismen, was auf den alkalischen pH-Wert während der Fermentation zurückzuführen Der vorliegenden Erfindung gemäß wird ein Verfahren zur Deletion eines Baclllus-Protease-Codierungsgens aus dem Genom

offengelegt, die so erfolgt, daß eine Reversion unmöglich wird. Bei der Deletion kann es sich um eine partielle Deletion handeln(solange die im Chromosom verbleibenden Sequenzen für eine homologe Rekombination mit dem plasmidcodierten

Proteasegen zu kurz sind), doch vorzugsweise wird das Gen vollständig deletiert. Der mittels dieses Verfahrens erhaltene

proteasenegative Stamm wird für die Produktion von homologen, mutierten Proteasen nach Einführung eines

Expressionsvektors, auf dem sich das Gen befindet, das diese mutierte Protease codiert, verwendet. Selbstverständlich läßt sich

ein solcher proteasenegativer Stamm auch vorteilhaft bei der Expression anderer Proteine, die sowohl homolog als auchheterolog sein können, verwenden. In diesem Zuammenhang vertreten wir die Ansicht, daß es sich bei der Expression vonmutierten Proteasen, bei der als Wirtszellen die Zellen verwendet werden, aus denen das Wildtyp-Gen isoliert wurde, um einehomologe Expression handelt.

Es ist festgestellt worden, daß dann, wenn ein industriell produzierter, Protease produzierender Bacillus-Stamm als Wirt für die Produktion der Mutanten dieser Protease verwendet wird, die hohe Effizienz der Produktion der ursprünglichen Protease auf die

mutierte Protease transferiert wird. Das führt zu einer überraschend verbesserten Produktionseffizienz, verglichen mit

Laborstämmen. Eine Chromosomenkopie des mutierten Gens ergibt bei Expression und Sekretion in einem industriell

produzierten Stamm eine Ausbeute von mehr als 50 Plasmidkopien mit dem mutierten Gen im Vergleich zu einem

Laborstamm. Ein Aspekt der Erfindung besagt, daß mutierte Proteasen effizient mit Hilfe eines homologen Baclllus-Stammes durch Austausch

des Chromosomengens oder eines Teils davon gegen das entsprechende mutierte Gen produziert werden können. Auf diese Artund Weise wird die Produktionskapazität für die Wildtyp-Protease oliminiert und gleichzeitig eine Produktionskapazität für einemutierte Protease eingeführt.

Als Wirtszelle für die Expression mutierter Gene, die modifizierte bzw. sogenannte Proteiniechnik-Proteine codieren, werden

vorzugsweise Zellen benutzt, bei denen die Gene strukturell auf hohem Niveau exprimiert werden.

In bezug auf einen anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde überraschend festgestellt, daß asporogene Bacilli benutzt

werden können, um eine Expression des Proteasegens auf hohem Nivau zu erreichen.

Die vorliegende Erfindung zeigt auch (Tabelle 1), daß zur Erzielung einer hohen Produktion an stark alkalischer Protease, die von Bacillus PB92 in B. subtllls abgeleitet wurde, vorzugsweise vor dem Gen ein Promotor inseriert wird, der in B.subtliis aktiv ist. Falls aus anderen Bacilli abgeleitete Enzyme in B.subtliis produziert werden, kann die Insertion eines in B.subtliis aktiven Promotors oder anderer Expressionssignale erforderlich sei'-, wozu eine gesonderte Phase notwendig ist. Stark alkalische. Protease produzierende Bazillen sind taxonomisch nicht klar klassifiziert und werden in der Regel als alkalophile Baclllus-Stämme bezeichnet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung definieren wir alkalophile Bazillen aisBacillus-Stämrre, die unter alkalischen Bedingungen bei einem pH-Wert von 9-11 wachsen (Horikosh;, K., und T.Akiba, 1982, Alkalophilic microorganismus (Alkalophile Mikroorganismen), Springer Verlag, New York), Die durch solche Bazillen produzierten alkalische Proteasen werden auch als stark alkalische Proteasen bezeichnet. Beispiele für Baclllus-Stämme, die bei alkalischen pH-Werten wachsen können, werden z.B. in U.S. Patent Nr.3,723,250, Re.30,602 und 4,480,037 beschrieben. Ein Beispiel für »mon alkaiophiiöii Bacilius-Wirtsstamm ist die Bacillus novo-Sptuies PB92, die u. a. im U.S. Patent Nr. Re30,602 beschrieben wird. Abkömmlinge dioser alkalophilen Baclllus-Stämme, die für eine Proteaseproduktion optimiert worden sind, werden genutzt, um deren Proteasen im industriellen Maßstab (siehe EP-A-0284126) zu produzieren. Die Produkte werden in verschiedenen industriellen Anwendungsgebieten eingesetzt, z.B. als Zusatz in Waschmitteln. Beispiele für derartige Produkte sind Maxacal" (Glst-brocades/IBIS), Savisane" (NONO), Experase" (NOVO). Mutanten derartiger Produkte sind in WO89/06279, wo es heißt, daß sie von Bacillus lentus-Stämmen abgeleitet werden, sowie in der nicht vorveröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP-A-0328229 beschrieben worden.

Einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zufolge werden transformierte Baclllus-Stämme zur Verfügung gestellt, mit denen die in EP-A-0328229 und WO89/06279 beschriebenen Mutanten vorzugsweise im industriellen Maßstab produziert werden.

Der vorliegenden Erfindung gemäß empfiehlt sich die Nutzung eines Baclllus-Stammes, insbesondere eines alkalophilen Bacillus, vorzugsweise der Bacillus novo-Spezies PB92. Eine andere bevorzugte Gruppe von Baclllus-Stämmen sind die asporogenen Mutanten, von denen wiederum PBT110 und dessen Abkömmlinge am meisten bevorzugt werden. Die Transformation der alkalophilen Baclllus-Stämme beinhaltet vorzugsweise die Nutzung von Protoplasten der genannten Stämme. Allerdings funktioniert das von Chang, S., und S. M. Cohen in Molex. Gen. Genet., 168/1979, S. 111-115, beschriebene klassische Protoplastentransformationsprotokoll nicht bei alkalophilen Baclllus-Stämmen. Die für diese Stämme erforderlichen Protokolle sind in EP-A-0283075 offengelegt worden, auf die hierin verwiesen wird.Die Expression von mutierten Proteasegenen in homologen Wirten erfordert den Einsatz und/oder die Inaktivierung des Wildtyp-Gens. Einige Verfahren lassei sich anwenden.

A) Ein Verfahren ist die Klonierung des Gens oder eines Teils davon, gefolgt von Modifizierung durch gerichtete Mutagense und anschließender Wiedereinführung des (Teil)-gens in die Zelle auf einem Plasmid. Durch homologe Rekombination kann das Gen in das Chromosom eingeführt werden. Daraus resultiert eine Situation, in der ein Wildtygen und das mutierte Gen in Nachbarschaft zueinander plaziert sind. Nach einer zweiten Rekombination verbleibt die modifizierte Sequenz im Chromosom, womit die Mutation effektiv in das chromosomale Gen eingeführt worden ist (siehe Beschreibung in Figur 14).

B) Bei einem anderen Verfahren wird die chromosomale Genkopie durch Deletion inaktiviert. Entscheidet man sich für die Deletion des Gens als Strategie, so handelt es sich bei dem chromosomalen Genfragment, das deletiert wird, vorzugsweise um die gesamte Codierungsregion. Nach der Inaktivierung wird eine mutierte Kopie des inaktivierten Gens auf einem Klonierungsvektor in die Zelle befördert.

C) Bei einem anderen Verfahren wird die chromosomale Genkopie mutagenisiert. Im Prinzip ist es möglich, (spezifische) Mutationen in vivo nach Transformation von Bakterien mit mutagenen Oligonucleotiden zu erhalten. Ein solches Verfahren ist erfolgreich bei Hefe angewendet worden, siehe dazu Moerschell et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85/1988, S. 524-528. Wendet man ein solches Verfahren bei einem homologen, vorzugsweise einem homologen, alkalophilen Bacillus-Stamm an, so handelt es sich um ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft Bacillus-Stämme, die bekanntermaßen effiziente Proteaseproduzenten sind. Bei einem der bevorzugten Verfahren wird die gesamte stark alkalische Protease-Codierungsregion aus dem Chromosom deletiert. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird ein Vektor benutzt, der das alkalische Proteasegen, einschließlich der 5'- und 3'-Regionen ernhält. Das Proteasegen wird In vitro aus dem Vektor deletiert, so daß die 5'- und 3'-Flankierungssequenzen zurückbleiben. Dieser Vektor wird in den alkalophilen Bacillus-Stamm gebracht. Der Vektor wird mittels homologer Rekombination in der Flankierungsregion in das Chromosom integriert. Out-Rekombination und Abspaltung führen zu einem Bacillus-Stamm, bei dem das Proteasegen deletiert ist. Bei dem verwendeten Vektor handelt es sich vorzugsweise um ein Plasmid. Zwecks Ermöglichung einer Selektion wird ein selektierbarer Marker, vorzugsweise Antibiotika-resisient, z.B. Neomycin-resistent, in das Piasmid eingeführt. Vorzugsweise kann der Vektor selektiv in das Chromosom integriert werden, wobei dies erreicht wird durch Einführung eines induzierbaren Replikationsstartpunktes, z. B. eines temperaturempfindlichen Ausgangspunktes wie z. B. dem von pE 194. Das genannte Plasmid wird in eine homologe Wirtszelle eingeführt. Bei hoher Temperatur ist das Plasmid nicht zur Replikation in der Lage, so daß chromosomale Integranten ausgewählt werden können. Integranten werden bei hohen Temperaturen in Gegenwart des relevanten Antibiotikums (z. B. Neomycin) ausgewählt. Die Abspaltung des Plasmids vom Wirtschromosom kann dazu führen, daß die Flankierungsregionen im Chromosom verbleiben, wohingegen die Codierungsregion entfernt wird. Schließlich hat die so gebildete, ausgewählte Mutante das selektierbare Markergen (das Neomycin-empfindlich ist) verloren und ist proteasenegativ. Die endgültige Chromosomenkonfiguration wird mit Hilfe von Restriktionsanalyse Southern-Blotting bestimmt. In WO89/06623 sind die möglichen Integrationsmechanismen ausführlich beschrieben. Das durch gerichtete Mutagenese modifizierte Proteasegen wird nun in die proteasennegative Zelle auf einem geeigneten Expressionsvektor eingeführt. Es ist darauf zu achten, daß das Plasmid kurze bzw. vorzugsweise keine mit dem Chromosom homologen Sequenzen enthält, um eine Plasmidinstabilitätzu vermeiden.

Anstelle der Expression des mutierten Proteasegens aus einem Vektor kann man auch das mutierte Proteasegen in das Chromosom des proteasenegativen Stammes integrieren. Das läßt sich erreichen, indem die Flankierungsregionen des Proteasegens, die an das mutierte Proteasogen angrenzen, im Plasmid beläßt. Die Einführung eines solchen Plasmids kann zu

homologer Rekombination in den Fiankierungsregionen führen, wodurch das mutierte Proteasegen in das Chromosom desproteasenegativen Stammes eingeführt wird. Das erweist sich als besonders vorteilhaft, wenn sich herausstellt, daß das Plasmidinstabil ist. Die vorliegende Erfindung zeigt auch, daß die Menge der erhaltenen rekombinanten Mutante oder Wildtyp-Proteasevergleichbar oder sogar höher ist, wenn eine Kopie des Gens in das Genom integriert wird, al? wenn mehrere Kopien des durchein Plasmid codierten Gene vorhanden sind.

In einem weiteren Ausführungsbeispinl wirrt das chromosomalo, stark alkalische Proteasegen durch das mutierte Gen mittels

homologer Rekombination ohne vorherige Isolierung eines proteasenegativen Stammes ersetzt.

Die Protease wird exprimiert und kann entweder aus den Zellen oder aus dem Medium isoliert werden, wenn das Protein

sezerniert wird. Nach Rückgewinnung kann die Protease gereinigt und daraus eine Waschmittelzusammensetzung formuliertwerden. Da im beschriebenen Produktionssystem das Wildtyp-Gen vollständig deletiert worden ist, ist die mutierte

Proteasezubereitung vollkommen froi von der Wildtyp-Protease. Das entsprechend der Beschreibung in EP-A-0284126 konstruierte Plasmid pM 58 enthält das stark alkalische Proteasegen. Zwecks Erhalt des Inaktivierungsplasmids wird die Codierungsregion des Proteasegens mittels BaI I/Hpa I-Doppeldigestion

deletiert. Der temperaturempfindliche Replikationsstartpunkt von pE194neo-1 wird anschließend eingeführt. Die KonstruktionpEM 58 wird in den Baclllus-Stamm PBT110 eingeführt.

Die Integration des sogenannten Campbell-Typ-Mechanismus erfolgte in der 5'-Flankierungsregion des Proteasegens, wodurch

es zur Bildung eines proteasepositiven Stammes kommt, der den gesamten Plasmidvektor in seinem Chromosom am Protease-

Locus (siehe Figur 3) trägt. Eine anschließende Selektion im Hinblick auf proteasenegative Abkömmlinge dieses Stammes ergab zwei Stämme, nämlich PBT125 und PBT126, die das Proteasegen und den Neomycin-Marker verloren hatten. Eine weitergehende Analyse ergab, daß

in dieser zweiten Phase eine illegitime Rekombination stattgefunden hatte.

Da bei den erhaltenen Baclllus-Stämmen keine nachweisbare Proteaseaktivität zu erkennen war, konnten sie für die Expression

der veränderten Proteasegene verwendet werden. Natürlich sind PBT125 und PBT126 nur Beispiele. Da bei illegitimer

Rekombination andere Ergebnisse vorliegen, wird es wesentlich sein zu bestimmen, ob das gesamte Gen deletiert worden ist. Zwecks Erhalt spezifischerer Stämme hätte eine homologe Rekombination vorgenommen werden können. Mit den hier angeführten Beispielen werden im wesentlichen zwei spezifische Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben. Zum einen handelt es sich um die Produktion der Plasmid-codierten, mutierten Protease aus einem proteasenegativen Stamm. Zum anderen geht es um die Produktion mutierter Protease, wodurch das mutierte Gen mittels Genaustausch in das Genom

eingeführt worden ist. Daraus ergibt sich für jeden Fachmann zwangsläufig, daß andere Ausführungsbeispiele möglich sind, so

z. B.: chromosomale Integration in einen proteasenegativen Stamm, mutiorto Genkopie auf einem Plasmid und in das

Chromosom integriert, mehr als eine Kopie des mutierten Gens, wobei die Kopien in Nachbarschaft zueinander oder an

verschiedenen Stellen im Chromosom plaziert sind. Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und stellennur eine Auswahl dar.

Experimenteller Abschnitt Beispiel 1 Konstruktion von Inaktivierungsplasmid ρΕΜ58Δ Das Plasmid pM 58 (siehe EP-A-0284126) wurde mit Hilfe der Restriktionsenzyme BaI I und Hpa I digeriert. Das große Fragment,

das einenTeil der Flankierungssequenzen des Proteasegens enthält, wurde gereinigt (Maniatis, Molecular cloning: ALaboratory

Manual (Molekulare Klonierung ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor, 1982) und ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zu Bacillus subtilis (Kawamura und Doi, J. Bacteriol., 160/1984, S.442-444) DB104 transformiert (Spizizen et al., J. Bacteriol.,

81/1961, S.741-746) und in bezug auf Neomycin-resistente und proteasenegativeTransformanten auf Minimalplatten, die0,4%

Casein und 20μς/ιηΙ Neomycin enthielten, selektiert. Das Plasmid pM 58 Δ wurde isoliert und mittels Restriktionsenzymanalyse charakterisiert. Aus Figur 1 ist ersichtlich, daß das Plasmid ρΜ58Δ die Flankierungssequenzen des stark alkalischen Proteasegens, die Gencodierung für die Neomycin-Resistenz

und einen Bacillus-Replikationsstartpunkt enthält.

Zwecks Konstruktion eines Integrationsplasmids, das einen temperaturempfindlichen Replikationsstartpunkt enthält, wurde

ρΜ58Δ mit den Restriktionsenzymen Xbal und BgIII digeriert. Das die stark alkalischen Proteaseflankierungssequenzenenthaltende Fragment wurdo gereinigt und mit dem (gereinigten) Xbai/Bgiii-Fragment von pE194neo-1 (EP-A-0284126), das dentemperaturempfindlichen Replikationsstartpunkt enthielt, ligiert, aus pE194 abgeleitet (Jordanescu et al., Plasmid, 1/1978,

S.468-479), nachdem das genannte Fragment auf die vorstehend beschriebene Art und Weise gereinigt wurde. Das Ligationsgemisch wurde auf B. subtilis DB104 transformiert und im Hinblick auf Neomycin-Resistenz (siehe oben) selektiert. Das Plasmid pEM 58 Δ wurde isoliert und charakterisiert (Figur 2). Es enthält das Neomycin-Resistenzgen, den

temperaturempfindlichen Replikationsstartpunkt von pE 194 und die Flankierunyssequenzen des alkalischen Proteasegens.

Dieses Plasmid pEM 58Δ wurde für die Transformation des Bacillus-Stammes PBT110 benutzt. Beispiel 2 Konstruktion eines proteasenegativen, alkalophllen Bacillus-Stammes A. Protoplastentransformation von Bacillus PBT110 durch Plasmid ρΕΜ58Δ Der Baclllus-Stamm PBT110 ist eine asporogene Mutante der Bacillus novo-Spezies PB 92 (U.S. Patent Nr. Re. 30,602) und wurde

mit Hilfe klassischer (UV) Mutationsverfahren erhalten. Dieser Stamm wurde mit dem Plasmid pEM 58Δ mit einem ähnlichen

Verfahren wie dem in EP-A-0284126 beschriebenen transformiert. Vor Durchführung der Integrationsversuche wurde mittels Restriktionsenzymanalyse geprüft, ob die Transformanten das relevante Plasmid enthielten. B. Integration von ρΕΜ58Δ In das Baclllus-PBTHO-Chromosom

Dig Integration von ρΕΜ58Δ in das Chromosom des Bacillus-Stammes PBT110 erfolgte auf die in EP-A-0284126 beschriebene Art und Weise. Die Selektion im Hinblick auf Integranten erfolgte bei einer Neomycin-Konzentration von 1 pg/ml. Der genetische Aufbau des Integranten wurde mittels Restriktionsenzymanalyse, gefolgt von Southern-Blotting und Hybridisierungsanalyse, ermittelt und ist in Figur 3 dargestellt. Anscheinend fand die Integration von pEM 58Δ mittels eines sogenannten Campbell-Typ-Mechanismus durch homologe Rekombination in der 5'-Flankierungsregion des alkalischen Proteasegens statt, wodurch es zur Bildung des Baclllue-Stammos PBT110-INT5 kam.

C. Selektion in bezug auf proteasenegatlve Stemme Dor Baclllus-Stamm PBT110-INT5 wurde in 100ml tryptische Sojabrühe (TSB), die 1 ug/ml Neomycin enthielt, eingeimpft und

24 Stunden bei 50°C inkubiert.

Nach 24 Stunden wurden 0,1 ml der erhaltenen Kultur in ein 500-ml-Schüttelgefäß eingeimpft, in dem sich 100ml PBT-Minimalmedium befanden: KjHPO₄,17,42g/l; Glutamat, 13,36g/l; Natriumeitrat · H₂0,2g/l; FeSO₄ · 7H₂0,0,05g/l; ZnSO₄ · 7H₂0,1 mg/l; MnSO₄ · H,0,1 mg/l; CaCI₂ · 2H₂0,10mg/l; MgSO₄ · 7H₂0,0,2g/l; CuSO₄ · 5H₂0,0,5mg/l; H₃BO₃,

0,5mg/l; Na₂MoO₄- 2H₂0,0,5mg/l; CoCI₂ · 6H₂O,0,5mg/l; Biotin,0,5mg/l; Saccharose, 20g/l; (pH 8,0,20min bei 120°Csterilisiert). Nach dem Sterilisieren wurde 1 mg/l Thiamin zugesetzt.

Diese Kultur wurde 4 Tage bei 37⁰C inkubiert. Nach 4 Tagen wurde 1 ml der Kultur in 10OmI desselben Mediums verdünnt und

4 Tage inkubiert. Nach 4 Tagen wurde die Kultur auf PBT-Minimalmediumplatten, die zusätzlich 0,4% Casein und 15g/l Agarenthielten, ausgestrichen. Kolonien, bei denen ein nachweisbares Proteasehalo fehlte, wurden als proteasenegativ eingestuftund auf Fehlen des Gens, das die alkalische PBT110-Protease codiert, untersucht.

D. Charakterisierung von proteasennegatlven Stammen

Stämme, bei denen kein nachweisbarer Halo auf den im vorstehenden Abschnitt beschriebenen Caseinplatten zu erkennen war, wurden zunächst in bezug auf die Anwesenheit eines Neomycin-empfindlichen und asporogenen Phänotyps untersucht. Zwei Stämme, und zwar Bacillus PBT125 und PBT126, die den proteasenegativen und asporogenen Phänotyp enthielten, wurden im Hinblick auf Proteaseproduktion in 500ml-Schüttelgefaßen untersucht, die 100ml Proteaseproduktionsmedium enthielten, siehe dazu U.S. Patent Nr. Re. 30,602. Keiner der Stämme produzierte nachweisbare Proteasemengen. Der genetische Aufbau der beiden Stämme wurde mittels Restriktionsenzymanalyso und Chromosomen-Blotting ermittelt und ist in Figur 4 dargestellt. Es hatte keine homologe, sondern eine illegitime Rekom oination stattgefunden, die zur Bildung von zwei Stämmen mit vollständig deletierten Protease- und Neomycin-Resistenzgpnen führte. Allerdings verblieb anscheinend ein kleines Plasmidfragment in dem Chromosom nach der Deletion des Proteaseyens. Die Sequenz dieses Fragments der Stämme PBT125 und PBT126, die die Plasmid-Chromosom-Verbindungsstellen enthalten, wurden im Phagenvektor M13 mp 18 (Messing et al., Nucl., Acids Res., 9/1981, S. 303-321) ligiert und entsprechend dem von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69/1972, S.2110-2114, beschriebenen Verfahren in E. coil JM101 transfektioniert. Nach der Phagenübertragung in E.coll JM101 wurde ssDNA isoliert (Heidecker et al., Gene, 10/1980, S.69-73).

Die Inserts wurden mit Hilfe des von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74/1977, S. 6463, beschriebenen Verfahrens sequenziert. Die Ergebnisse sind den Figuren 5A und 5B zu entnehmen.

Beispiel 3 Konstruktion von Proteaseproduktions· und Mutationsvektoren A. Subklonleren des PB92-Proteasegens im Phagen M13 mp18

Das Plasmid pM58 wurde mit Hpal und Ball digeriert. Nach der Reinigung des das Proteasegen enthaltenden DNA-Fragmentes (Maniatis, 1982) wurde dieses Fragment in den Phagen M13 mp 18 ligiert, der mit Smal digeriert wurde. Das Ligationsgemisch wurde in E.coli JM101 transfektioniert (Cohen et al., s.o.). Nach der Phagenübsrtragung in E.coll JM101 wurde dsDNA entsprechend dem von Birnboim und DoIy (Nucl. Acids Res., 7/1979, S. 1513-1523) beschriebenen Verfahren isoliert. Das Insert und dessen Orientierung wurden mittels Restriktionsenzymanalyse überprüft. Der Vektor mp18MXL wurde für weitere Subklonierungsversuche benutzt, die Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt.

B. Subklonierung des PB92-Proteasegens im Plasmid pBHA1 Figur 7 zeigt die Nucleotidsequenz des Plasmids pBHAL Dieses Plasmid wird aus dem Zwillingsvektorsystem pMa/c5-8

abgeleitet, das von Stanssens et al. (Nucl. Acid Res., 17/1989, S.4441-4454) beschrieben wurde und bei dem ein zusätzlicher

Promotor inseriert wurde. Das Plasmid BHA1 besteht aus den folgenden Fragmenten: Pos. 11-105: Bakteriophage FD, Terminator Pos. 121-215: Bakteriophage, Terminator Pos. 221-307: ein Teil des Plasmids pBR322 (viz. Pos. 2 069-2153) Pos. 313-768: Bakteriophage F1, Replikationsstartpunkt (viz. Pos. 5482-5943) Pos. 772-2 571: Teil des Plasmid pBR322, viz. Replikationsstartpunkt und -Lactamasegen Pos. 2 572-2 685: Transposon Tn903, vollständiges Genom Pos.2719-2772: Tryptophan-Terminator(doppelt) Pos. 2 773-3 729: Transposon Tn9, das Chloramp'ienicolace-tyltransferase (= caOgen. Die Nucleotide an den Pos. 3 005 (A),

3038 (C),3302 (A) und 3 409 (A) unterscheiden sich von der Wildtyp-cat-Codierungssequenz. Die Mutationen wurden eingeführt, um die Nco I-, BaI I-, Eco Rl- und Pvu Il-Stellen zu eliminieren.

Pos.3730-3804: multiple Klonierungsstelle

Pos. 3 807-7 264: Teil des Plasmids pUB 110 (viz. Replikationsfunktion und Kanamycin-Resistenzgen, Eco Rl- Pvu Il-Fragment) (McKenzie et al., Plasmid, 15/1986, S.93-103, und Plasmid, 17/1987, S.83-85)

Pos. 7 267-7 331: multiple Klonierungsstelle.

Die Fragmente wurden mit Hilfe bokanntor Kloniorungsverfahren, z.B. Füllen der kohäsiven Enden mit Klonow, Adepterkloniorung usw., vorbundon. Alle Daten stammten von Gonbank" National Nucleic Acid Sequence Data Bank' Mh,

Das Plasmid pMcB-8 wurde unter DSM4568 gelagert.

Vor den Mutationsverfahren wurde das Zwillingsvektorsystem pBHA/C-1 so modifiziert, daß man das Zwillingsvektorsystem pBHARB-MXL/pBHCRB-MXL erhielt, und zwar folgendermaßen:

1. Der Vektor mp 18 MXL wurde mit Kpn I und Hincll digeriert. Das das Proteasegen enthaltende DNA-Fragment wurde gereinigt und in pBHA1 ligiert, das mit Eco RV und Kpn I digeriert wurde. Das Ligationsgemisch wurde in E.coll JM101 (Maniatis, 1982) transformiert und auf LC*-Platten ausgestrichen, die 10g/l Trypton, 5g/l Hefeextrakt (Difco), 8g/l NaCI, 25mg/l Thymin, 1 g/l MgSO₄ 7H₁O, lOOpg/ml Ampillicin und 20pg/ml Neomycin (pH7,0) enthielten. Die Plasmid-DNAder Transformanten wurde isoliert (Bimboim, s. o.) und mittels Restriktionsenzymanalyse charakterisiert. Auf diese Art und Weise wurde pBHAl MXL isoliert (siehe Figur 8).

2. Zwecks Sequenzierung von in das Proteasegen eingeführten Mutationen mit einer verfügbaren Reihe von Oligonuclootidon mußte die Orientierung des F1-Ausgangspunktes im Vergleich zum Proteasegen umgekehrt werden. Das wurde folgendermaßen durchgeführt: das Plasmid pBHA1-MXL wurde mit Bam Hl digeriert und religion. Das Ligationsgemisch wurde in E. toll WK6 {Maniatis, s.o.) transformiert und in bezug auf Neomycin- bzw. Ampicillin-Resistenz selektiert, und zwar auf LC*-Platten, die 10g/l Trypton, 5g/l Hefeoxtrakt (Difco), 8g/l NaCI, 25mg/l Thymin, 1 g/l MgSO₄ · 7 HjO, lOOpg/ml Ampicillin und 20μα/ηιΙ Neomycin, pH 7,0, enthielten. Die Plasmid-DNA der Transformanten wurde isoliert (Birnboim, 8. o.) und mittels Restriktionsenzymanalyse charakterisiert. Auf diese A₁I und Weise wurde pBHAR-MXL isoliert, das sich von pBHA-MXL dadurch unterscheidet, daß die Orientierung der E.coll-Sequenz umgekehrt ist (siehe Figur 9).

3. Zwecks Einführung zusätzlicher Flankierungssequenzen in das Plasmid pBHAR-MXL wurden die folgenden Digestionen vorgenommen. Plasmid pM 58 wurde mit Sphl und Hlndlll digeriert. Plasmid pBHAR-MXL (Figur 10) wurde mit Sphl und Hlndlll digeriert. Das größere Fragment wurde gereinigt. Die beiden Digests wurden ligiert und in B.subtills DB104 transformiert und anschließend im Hinblick auf Neomycin-Resistenz und Proteaseaktivität selektriert, und zwar auf Minimalplatten, die 10pg/ml Neomycin und 0,4 % Casein enthielten. Die Transformanten wurden mittels Restriklionsenzymanalyse charakterisiert. Eine davon, nämlich pBHARB-MXL (Figur 10), wurde für weitere Experimente verwendet.

C. Mutageneso des PB92-Qons Im Plasmid pBHARB-MXL

Die Mutagenese erfolgte mit Hilfe des Zwillingsvektorsystems pBHARB-MXL/pBHCRB-MXL (Stanssens, s.o.).

Ein auf der „gapped/duplex"-Methode (Kramer et al., Nucl. Acids Res., 12/1984, S. 9441) beruhendes Verfahren und Plasmid (Phagen-/Plasmidhybrid) wurden benutzt. Im wesentlichen beruht das Verfahren auf einem „gapped-duplex"-DNA-Zwischenprodukt, das aus einem „gapped" Strang (-Strang) besteht, der einen Wildtyp-Antibiotika-Resistenzmarker und einen Matrizenstrang (+Strang) enthält, der eine Amber-Mutation in dem Gen trägt, das die Antibiotika-Resistenz bewirkt. Nach dem Aufschmelzen wird das mutageneOligonucleotid in den „gapped" Strang im Rahmen von invitro-Lückenfüllung und-versiegeln eingebaut. Die dabei entstandenen Moleküle werden benutzt, um einen Reparaturmangel (Mut S)wirt mit fehlender Übereinstimmung zu transformieren, bei dem die Verknüpfung zwischen der angestrebten Mutation und dem Antibiotika· Resistenzmarker erhalten bleibt. Die Phasmid-Mischpopulation, die aus diesem Stamm isoliert wurde, kann sich anschließend in einem suppressornegativen Wirtsstamm aufspalten. Transformanten werden auf antibiotikahaltigem Medium ausgestrichen, womit eine Selektion in bezug auf vom .gapped" Strang stammende Abkömmlinge zwingend wird.

Im Vektor des Typs pMa wird das Nucleotid 3409 von G zu A verändert und im Vektor des Typs pMc wird das Nucleotid 2238 von G zu C verändert, wodurch Amber-Stopcodons im Chloramphenicolacetyltransferasegen und im ß-Lactamasegen gebildet werden, die die Gene inaktivieren.

Zwecks Durchführung der Mutagenese wird das Ziel-DNA-Fragmengt in die multiple Klonierungsstelle von pMa5-8 oder eines Derivats davon Moniert. Ein „gapped" Doppelstrang zwischen pMa5-8, der die Ziel-DNA enthält, und pMc5-8 wird anschließend konstruiert.

Die Einzelstranglücke, die aus der Ziel-DNA besteht, kann einer Mutagenese mit einem mutagenen Oligonucleotid unterzogen werden, wobei lange synthetische Oligonucleotide einen niedrigen Gehalt an falsch eingebauten Nucleotiden aufweisen; es kommt eine chemische oder enzymatische Fehlinkorporation von Nucleotiden zur Anwendung. Eine ausführliche Beschreibung findet man bei Ausübet et al., Current Protocols in Molecular Biology (Aktuelle Protokolle in der Molekularbiologie), John Wiley & Sons Inc., New York, 1987 und bei B.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (Praktische Hinweise zum molekularen Klonieren, 2. Auflage, John Wiley & Sons Inc., New York, 1988.

D. Konstruktion von Vektoren für die industriell·) Proteaseproduktlon

Nach Einführung der gewünschten Mutation(en) in das Piasmid pBHARB-MXL wurden die unerwünschten E.coli-Sequenzen aus dem Plasmid folgendermaßen deletiert: das die relevante Mutation beinhaltende Plasmid pBHARB-MXL wurde mit Bam Hl digeriert und unter Verdünnungsbedingungen religiert. Das Ligationsgemisch wurde in B.subtills DB104 transformiert und in bezug auf Neomycin-Resistenz und Proteaseaktivität auf Minimalplatten, die 20pg/ml Neomycin und 0,4% Casein enthielten, selektiert. Die DNA der Transformanten wurde isoliert und mittels Restriktionsenzymanalyse charakterisiert. Auf diese Art und Weise wurden Vektoren ohne E.coli-DNA isoliert, die sich für eine kommerzielle Produktion von Proteinen eignen. Das vorstehende Verfahren ist in Figur 11 veranschaulicht, wobei die Mutation M216Q als Beispiel dient, wodurch das Plasmid pBHB-MXLM2160 gebildet wird. M 216Q, aber auch M216S, S160D und N212D, auf die nachfolgend Bezug genommen wird, sind mutierte Proteasen von Bacillus PB92, beschrieben in EP-A-0328229.

Beispiel 4

Protoplastentransformatlon von Bacillus PBT125 durch Abkömmlinge vom Plasmld pBHB-MXL Der Bacillus-Stamm PBT125 wurdo mit dem Plasmld pBHB-MXL bzw. davon abstammendon Plasmidon, die mutierto Proteasegnne onthiolton, entsprechend dem In EP-A-0284126 beschriebenen Transformationsvorfahren transformiert. Vor

Produktionsuntersuchungon erfolgte eine Überprüfung der Trensformanton mit Hilfe dor Rostriktionsonzymanalyso, und zwar im Hinblick darauf, ob sie das relevante Plasmid enihiolton.

Beispiel 5

Konstruktion von Proteüeelntegratlonsvektoron

A. Integrationsvektor pENjQ

Das Plasmid pE194neo-1 (EP-A-0284126) wurde mit Sail digeriert und roliglert. Das LigationsgemischwurdozuB.snbtllls DB104 transformiert und im Hinblick auf eine Neomycln-Rosistenz auf Minimalplatten, die 20,ig/ml Neomycin onthiolton, selektiert. Das Plasmid pE 194 neo-3 wurdo isoliert und in bozug auf das Vorhandensein des Neomycin-Reslstenzgons in umgekohrtor Orientierung (siehe Figur 12) geprüft. Das Plasmid pE 194neo-3 wurde mit Hpal und BgIII digeriert. Das den temperaturempfindlichen Replikationsstartpunkt enthaltende Fragment wurdo gereinigt (Maniatis, s.o.). Das Plasmid pBHB-MXL M216Q (siehe Beispiel 3 und Figur 11) wurde mit BgIII und Ball digeriert. Das das Protoasegen enthaltende Fragment wurde gereinigt. Beide Fragmonto wurden ligiert. Das Ligationsgemisch wurdo zu B.subtilis DB104 transformiert und in Hinblick auf Proteaseaktlvltät und Noomycln-Reslstonz auf die vorstehend beschriebene Art und Weise selektiert. Die Transformanten wurden mittels Restriktionsenzymdigerien charakterisiert. Eine davon, die das l'lasmid pEN₃Q enthielt, wurde selektiert (Figur 13). Diesos Plasmid enthielt das Neomycl.i-Resistenzgen, den temperaturempfindlichon Replikationsstartpunkt vom Plasmid Pe 194neo-3 und die M216O-Mutation in dom PB92-Protoasegen.

B. Integrationsvektor pENjS

Auf die selbe Art und Weise wie boim Integrationsvektor pEN₃Q wurde pEN₃S unter Nutzung von pBHARB-MXL M216S als Ausgangsvektor konstruiert.

Beispiel 6

Konstruktion der Baclllus-Stamme PEP 111 und PEP 112

A. Protoplastentransformatlon von Bacillus PBT110 durch das Plasmld pENjQ

Der Baclllus-Stamm PBT110 wurde mit dem Plasmid pEN₃Q auf die in EP-A-0284126 beschriebene Art und Weise transformiert. Vor den Integrationsexperimenten wurde mittels Restriktionsenzymanalyse geprüft, ob die Transformanten das relevante Plasmid enthielten.

B. Integration von pENjQ In das Baclllus-PBT 110-Chromosom

Integrationsversuche mit dem Plasmid pEN₃Q im Chromosom des Baclllus-Stammes PBT110 wurden entsprechend der Beschreibung in EP-A-0284126 durchgeführt. Eine Selektion in bezug auf Integranten erfolgte bei einer Neomycin-Konzentration von 1 pg/ml bei nicht zulässigen Temperaturen (5O⁰C) im Hinblick auf Plasmidreplikation. Um die Integration von PEN₁Q in das Chromosom zu prüfen, wurde die chromoAomale DNA der potentiellen Integranten isoliert, mit Hind III und CIa I digeriert, auf 0,8%-DNA-Agarosegel gegeben und auf Nitrocellulose geblottot (Southern, J. Mol. Biol., 98/1975, S. 503-517) und mit "p-markierter, Nick-translatierter pEN₃Q-DNA hybridisiert (Maniatis, 1982).

Es wurde nachgewiesen, daß der Einbau von pENjQ durch homologe Rekombination erfolgt war, wobei ein Stamm (PBT 110 M/Q) mit zwei in Nachbarschaft zueinander auf dem Chromosom plazierten Proteasegenen (ein Wildtyp und eine Mutante M 216Q) gebildet wurde. Demzufolge erfolgte die Integration von pENjQ durch einen sogenannten Mechanismus des Campbell-Typs, dargestellt in Figur 14 (siehe auch EP-A-0284126).

C. Selektion von Neomycln-empflndllchen Rekombinanten

Neomycin-empfindliche Rekombinanten wuraen selektiert, die entweder das Wildtyp- oder das mutierte Proteasegen in dem Chromosom enthalten (nachfolgend Out-Rekombinanten genannt). Das Selektionsverfahren ist ähnlich dem im vorstehenden Beispiel 2C beschriebenen Verfahren.

Der Stamm PBT110 M/Q wurde als Ausgangsstamm benutzt. Nach Inkubation des Stammes PBT110 M/Q in PBT-Minimalmedium wurde die Kultur auf PBT-Minimalmediumplatten ausgestrichen, die 0,4% Casein und 15g/l Agar enthielten. Diese Platten wurden 48h bei 37⁰C inkubiert und mittels Replika-Plattierung auf Heart-Infusionsplatton (HI-Platten) gebracht, die 1 pm/ml Neomycin bzw. kein Neomycin enthielten. Neomycinempfindliche Kolonien wurden als Out-Rekombinanten betrachtet.

D. Charakterisierung von Neomycln-empfindllchen Rekombinanten

Die chromosomale DNA potentieller Out-Rekombinanten wurde isoliert, mit CIa I odor Hind III digeriert, auf 0,5%-Agarosogel gegeben, auf Nitrocellulose geblottet (Southern, 1975) und mit "p-markierter Nick-translatiorter pENjQ (Maniatis, 1982) hybridisiert. Da Mutations-M216Q zur Entfernung einer CIs I-Stelle führt, lassen sich die Stämme, die ein Wildtyp-Protoasegon oder ein mutiertes Proteasegen enthalten, und der intermediäre Stamm PBT110M/Q leicht unterscheiden (siehe Figur 14). Es wurde eine Out-Rekombinante, die das M 216Q-Mutanten-Protoasegen von PB 92 enthielt, isoliert. Nachdem nachgewiesen wurde, daß ein Genaustausch von der PB92-Wildtyp-Protease zur PB92-Mutanten-Protease stattgefunden hatte, wurde das Produkt des Stammes anhand seiner biologischen Parameter (k<.„, KJ, Oxydationsbeständigkeit, spezifische Aktivität und Waschleistung, charakterisiert (siehe EP-A-0328229). Alle Ergebnisse stimmten mit denen für eine Kontroll-Proteaso M 216Q überein, was darauf schließen läßt, daß es sich bei dem Produkt des transformierten Stammes tatsächlich um die PB 92-Protease handelte, die die Mutation M216Q enthält. Dieser transformierte Stamm v> ird mit Bacillus PEP 111 bezeichnet. Ähnliche Experimente wurden unter Nutzung des Vektors pEN₃S zur Konstruktion des Baclllus-Stammes PEP 112, der die PB92-Protease mit der Mutation M 216S enthält, durchgeführt.

Beispiel 7 Konstruktion der BaclllucStAmme PEP211 und PEP212 Oer Bacillus-Stamm PEP 111 wurde mit dem Plasmid pENjQ nach dem In ΕΡ-Α-028Ί126 beschriebenen Verfahren transformiert. Vor der Integration wurdo mittels Restriktionsonzymanalyso goprüft, ob die Transformenten das rolevanto Plasmid enthalton. Dio Integration und die Soloktion in bezug auf Intogranton (boi oiner Noomycin-Konzontration von 2Ομο/ηιΙ bei unzulässigen Temperaturen (50°C) im Hinblick auf Plasmidroplikation) erfolgte gomäß der Boschroibung in EP-A-0284126. Zwocks Prüfung dor Integration des Plasmids pEN₃Q in das Chromosom wurde die chromosomalo DNA dor potontiollon Integranten isoliert und mit Hind III digoriort, auf 0,8%-Agarosogel gegeben, auf Nitrocolluloso goblottot (Soulhorn et al., 1979)

und mit "P-markiortom Nick-translatlortem pEN₃Q hybridisiort. Es wurdo nachgewioson, daß ein Stamm, der zwoi mutierte(M216Q) PB92-Protoasegono enthält, die einzeln auf dem Chromosom plaziert sind, isoliert wurde.

Dieser Stamm wurdo mit PEP 211 bozoichnet. Sein chromosomalor Aufbau ist Figur 15 zu entnohmon. Um elnon analogon Stamm zu orhalton, der zwoi Proteasegono mit dor Mutation M 216 S enthält, wurdo dor Stamm PEP 112, dor

ein mutiertos Gon (M 216S) nach Gonsubstilulion dos Wilcltyp-Gons onthiolt, mit dom Plasmid pENjS transformiert, und oswurden die vorstehend boschriobenon Verfahron durchgeführt. Diese Exporimento führten zur Bildung dos Stammos PEP212,der zwoi gesondert auf dem Chromosom plazierte, mutiorto PB92 M216S-Protoasogeno onthiolt.

Beispiele Produktion von mutierten Proteasen Die Produktion von Proteasomutanten orfolgte mit transformierten Bacillui-Stämmon, bei donon dos mutierte Proteaso- Codierungsgon entweder auf einem Plasmid oder auf einem Chromosom plaziert war. Für dio Plasmid-codierte Produktion wurden zwei Arten von Stämmen benutzt, und zwar der hior beschriebene, alkalophile Stamm Bacillus PBT125 und der B.iubtllls-Stamm DS12367, ein von B. aubtllls DB104 abgeleiteter, asporogener Stamm

(Kawamura et al., J. Bacterlol., 160/1984, S.442-444). Diese Stämme wurdon mit pBHB-MXL-abgeloiteten Plasmidentransformiert. Die Baclllus-Stämmo PBT125 und B. subtilis DS12367, dio koine Protoasocodioronden Plasmide haben, wurdonals Kontrollstämmo benutzt.

Für dio Produktion mit Stämmen, dio chromosomal intogrierto Protease-Mutantongone enthalten, wurdon dio hior

beschriebenen Baclllus-PEP-Stämme benutzt. Die Bacillus-Stämme POT 108 und PBT110, die die Wildtyp-Protoasegoneenthalten, wurden als Kontrollstämmo benutzt. PBT108 ist ein Stamm, der zwoi getronnt voneinander auf dem Chromosomplazierte Wildtyp-Gene enthält (siehe EP-A-0284126). In bezug auf PBT110 sioho Beispiel 2 A.

Zwocks Überprüfung der Aktivität des ursprünglichen Promotors des PB92-Proteasogons in 'J. subtilis wurde din Zusammensetzung pBHB-MXLR hergestellt, boi der die Orientierung des Proteasogens im Hinblick auf den Hpa Il-Promotor

(Zyprian et al., DNA 5/1986, S. 219-225) umgekehrt war, so daß die Expression dos Protoasegens nur durch den ursprünglichen

Promotor gerichtet war. Die Produktionen erfolgten in öOOml-Schüttelgefäßen, die 100ml Proteaseproduktionsmedium enthielten. Im Falle der Nutzung von alkalophilen Baclllus-Stämmen wurden die Kulturen nach Beimpfung 40 Stunden bei 37 ⁰C in einem Produktionsmedium der in U.S. Patent Nr. Re. 30,602 beschriebenen Art inkubiert. Im Falle von plasmidhaltigen Stämmen wurde Neomycin (20Mg/ml) zugesetzt. Im Falle der Nutzung von B. subtllls-DS 12367-Stämmen wurde ein vergleichbares Medium mit 12,5g/l Holooxtrakt (Difco),

0,97g/l CaCI, · 6H₂0,2,25g/l MgCI₂ · 6HA 20mg/l MnSO₄ · 4H,0,1 mg/l CoCI₂ · 6H₁0,0,5g/l Citrat,0,5ml Antischaummittel 5693,6Ma.-% Maltose, 0,2M Phosphatpuffer (pH6,8) angewendet. Im Falle von plasmidhaltigon

Stämmen wurde Neomycin (20pg/ml) zugesetzt. Kulturen, die B. subtllls-Stämme enthielten, wurdon 65 Stunden boi 37°C inkubiert. In allen Fällen wurden die Schüttelgefäßo mit

0,1 ml diner Kultur aus tryptischer Sojabrühe beimpft, die 20um/ml Neomycin enthielt, in dem der relevante Stamm enthaltenwar, der 24 Stunden bei 37 ⁹C inkubiert worden war.

Die Proteaseaktivität wurde mit Hilfe von Dimethylcasoin als Substrat untersucht, und zwar auf die von Un et al., J. Biol. Chem.,

244/1969, S. 789-773 beschriebene Art und Weise. Die spezifischen Aktivitäten der Proteose-Mutanten (EP-A-0328229) wurdengenutzt, um die Produktion, gemessen in mg, zu bestimmen.

Die Ergebnisse der Fermentationsversuche werden in der untenstehenden Tabelle 1 zusammenfassend dargestellt. Tabelle 1

Stamm	Relative Protease-	Mutation
	produktion
PBT110	100%	WT
PBT125	0%	-
PBT108	120%	WT
PEP111	100%	M216Q
PEP112	100%	M216S
PBT125pBHB-MXL	95-100%	WT
PBT125pBHB-MXLM216Q	95-100%	M216Q
PBT125pBHB-MXLM216S	95-100%	M216S
PBT125pBHB-MXLS160D	95-100%	S160D
PBT125pBHB-MXLN212D	95-100%	N212D
PEP211	120%	M216Q
PEP212	120%	M216S

Fortsetzung der Tabelle 1	Relative Protease-	Mutatio
Stamm	produktion
	0-1%	-
DS12367	4%	WT
DS12367 pBHB-MXLR	40%	WT
DS12367 pBHBMXL	40%	M216Q
DS12367pBHB-MXLM216O	40%	M216S
DS12367pBHB-MXLM216S	40%	S160 D
DS12367pBHB-MXLS160D	40%	N212D
DS12367 PBHB-MXLN212D

Sömtliche in diest,.· Patentbeschreibung genannten Veröffentlichungen (einschließlich Patentanmeldung) zeugen vom Niveau des Könnens der Fachleute auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht. Bei jeder Bezugnahme auf Veröffentlichungen in dieser Patentanmeldung ist davon auszugehen, daß auf jode einzelne Veröffentlichung speziell und einzeln Bezug genommen wurde.

Zwar Ist die Erfindung in einigen Einzelheiten zwecks besseren Verständnisses mit Hilfe von Abbildungen und Beispielen buscr rieben worden, doch wird für joden Fachmann mit dem üblichen Wissen erkennbar, daß viele Änderungen und Modifikationen vorgonommen worden können, ohne vom Geist oder dem Geltungsbereich der im Anhang befindlichen Patentansprüche abzuweichen.

Legende iu den Figuren Figur 1

1 Proteasegen

2 Bacillus novo-PB92-DNA

3 Plasmld-DNA

4 χ HPa 1-/BaI !Reinigung des großen Fragments

5 Llgation

β Transformalion iu B. subtilis DB104 7 Selektion: prof, Neo^R

Figur 2

1 temperaturempfindlicher ORI

2 χ Xba 1-/BgI H-Relnlgung der fragmenlhaltlgen Bacillus novo-DNA

3 χ Xba 1-/BgI Il-Relnlgung des den temperaturempfindllchen ORI enthaltenden DNA-Fragmenls

4 Llgation

5 Transformation ju B. tubtills DB104 β Selektion: Neo"

Figur 3

1 Homologe Rekombination

2 Proteasegon

3 temperaturempfindlicher ORI

Figur 4

1 Protoasogan

2 Illegitime Rekombination

3 chromosomale DNA, PBT125

4 chromosomale DNA, PBT126

FlgurS

1 Proteasegen

2 Ligation, Transformation zu E. coli JM101

Flgur8

1 Proteasegen

2 Llgation, Transformation iu E. coil JM101

Figur 9

1 Proteasegen

2 xBamHI-Religation

3 Transformation ju E. coli WK6

4 Selektion: Neo", amp"

Figur 10

1 Proteasegen

2 Reinigung des großen Fragmentes

3 Llgation

4 Transformation zu B. subtilis DB104

5 Selektion: prot'Neo"

Figur 11

1 Proteasegen

2 MutationM2I6Q

3 xBamHI-Religation

4 Transformation iu B. subtilis DB104

5 Selektion: prot¹ Neo"

Figur 12

1 temperelurempfJndlicherORI

2 SaI I-Religation

3 Transformation zu B. subtil!« DB104

4 Selektion: Neoⁿ

Figur 13

1 temperaturempflndlicher ORI

2 Proteasegen

3 Mutation M 2160.

4 Ugatlon

6 Transformation iu B.eubtllis DB104 6 Selektion: prot'Neo"

Figur 14

1 Integration

2 rhromosomaleDNAPBTIIO

3 chromosomale DNA

4 Proteasegen

6 Plasmid-DNA

β chromosomale DNA PBT110 M/Q

7 Out-Rekomblnation

8 chromosomale DNA PEP 111

Figur 15

1 chromosomale DNA PEP 111

2 illegitime Rekombination

3 temperaturempfindlicher ORI

4 chromosomale DNA PEP211

Claims

1. Verfahren zur Produktion von Proteasen, die sich in mindestens einer Aminosäure von der Wildtyp· Protease unterschieden, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Nutzung eines homologen, alkalophilen Baclllus-Stammes als Expressionswirt beinhaltet, wobei dieser Stamm keine Wildtyp-Protease produzieren kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionswirt ein proteasenegatver, alkalophiler Baclllus-Stamm aonutzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionswirt ein proteasenegativer Baclllus-Stamm genutzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Wildtyp-Proteasegen aus dem Genom doletiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem ein proteasenegativer Abkömmling der Bacillus novo-Spezies PB92 benutzt wird.

5. Verfahren nach einem dor Ansprüche 1 bis 4, bei dom ein asporogener, alkalophiler Baclllus-Stamm genutzt wird,

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem ein asporogener Bacillus genutzt wird, aus dem das Wildtyp-Proteasegen mittels homologer oder illegitimer Rekombination deletiert worden ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die stark alkalische, mutierte Protease Plasmid-codiert ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die stark alkalische Wildtyp-Protease im wesentlichen die Aminosäuresequenz dor Protease der Bacillus novo-Spezies PB92 aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, Jaß das stark alkalische Wildtyp-Proteasegen aus dem Chromosom deletiert und mindestens eine Kopie eines mutierten, stark alkalischen Proteasegons in das Genom inseriert ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das stark alkalische Wildtyp-Proteasegen durch mindestens eine Kopie des stark alkalischen, mutierten Proteasegens ersetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Kopie des stark alkalischen, mutierten Proteasegens in das Genom inseriert und eine andere Kopie Plasmidcodiert ist.

12. Verfahren zur Gewinnung oines alkalophilen Bacillus-Stammes, mit vermindertem Niveau stark alkalischer, extrazellulären Protease, das folgende Schritte umfaßt:

- Isolierung eines Gens, einschließlich seiner 5'- und/oder 3'-nichtcodierenden Regionen, Codierung für eine stark alkalische Protease;

- Insertion des Gens in einen Klonierungsvektor;

- Deletion der Codierungsregion des Gens aus dem Klonierungsvektor;

- Transformation eines Bacillus-Stammes mit dem Klonierungsvektor;

- Vermehrung derTransformanten unter Bedingungen, bei denen die Replikationsfunktion des Vektors inaktiv ist;

- Selektion der Transformanten, bei denen die DNA-Sequenz verlorengegangen ist, die die alkalische Protease codiert.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der alkalophile Bacillus-Stamm ein Stamm der Bacillus novo-Spezies PB92 oder ein Abkömmling davon ist.

14. Ein alkalophiler Bacillus-Stamm, der gemäß Anspruch 12 gewonnen wird, transformiert mit einem Plasmidexpressionsvektor, der ein stark alkalisches, mutiertes Proteasegen enthält.

15. Bacillus-Stamm nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der alkalophile Bacillus-Stamm ein Abkömmling der Bacillus novo-Spezies PB92 ist, erhalten durch homologe oder illegitime Rekombination.

16. Eine stark alkalische Protease, die im wesentlichen frei von einer Kontamination durch stark alkalische Wildtyp-Protease ist, sich in mindestens einer Aminosäure von der Wi' Jtyp-Protease unterscheidet, die mit einem Bacillus-stamm produziert wurde, der mindestens eine Kopie eines mutierten Gens und keine Kopie des Wildtyp-Gens enthält, wodurch eine aktive Protease gebildet wird.

17. Eine stark alkalische Protease nach Anspruch 16, hergestellt mit Hilfe eines alkalophilen Bacillus-Stammes.

18. Eine stark alkalische Protease nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das mutierte Gen auf einem Plasmld und/oder in einem Genom zur Verfügung gestellt wird.

19. Eine Waschmittelzubereitung, die als Wirkstoff eine oder mehrere stark alkalische Proteasen nach einem der Ansprüche 16 bis 18 enthält.

20. Nutzung einer oder mehrerer stark alkalischer Proteasen nach einem der Ansprüche 16 bis 18 in einer Waschmittelzubereitung.

21. Nutzung einer oder mehrerer stark alkalischer Proteasemutanten nach einem der Ansprüche 16 bis 18 in einem Waschverfahren.