DE69028040T2 - Mehrfach mutierte Subtilisine - Google Patents

Mehrfach mutierte Subtilisine

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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Klasse von thermostabilen und pH-stabilen Subtilisin-Analogen mit verbesserter Oxidationsstabilität und überlegener Leistung bei der Reinigung von verschmutzten Geweben, wenn sie zu einer Standard-Waschmittelformulierung zugegeben werden, und ein Verfahren zur Herstellung solcher Analoge. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Klasse von Subtilisin-Analogen mit einer modifizierten Calciumbindungsstelle, die verbesserte Calciumbindungsfähigkeit liefert, und einer Deletion und/oder einem Ersatz eines Restes von Asn-Gly-Sequenzen, die im Subtilisin vorhanden sind, und einer Modifikation eines oder mehrerer Methionin-Reste, um die Oxidationsstabilität zu verbessern. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Waschmittelzusammensetzungen, die solche Subtilisine enthalten.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Der Ausdruck Subtilisin bezeichnet eine Gruppe von extrazellulären alkalischen Serinproteasen, die von verschiedenen Spezies von Bacilli produziert werden. Diese Enzyme werden auch als Bacillus-Serinproteasen, Bacillus-Subtilisine oder bakterielle alkalische Proteasen bezeichnet.
  • Bacillus-Subtilisinmoleküle bestehen aus einer einzelnen Polypeptidkette mit entweder 274 Resten (für Subtilisin Typ Carlsberg, produziert von Bacillus licheniformis, und für das Subtilisin, das von dem Bacillus subtilis-Stamm DY produziert wird) oder 275 Resten (für Subtilisin Typ BPN', produziert von Bacillus amyloliquefaciens, das aprA-Genprodukt von Bacillus subtilis und das Subtilisin von Bacillus mesentericus und das Subtilisin von Bacillus subtilis var.amylosacchariticus). Wenn man die Aminosäuresequenzen von Subtilisin aus verschiedenen Stättimen von Bacillus hierin vergleicht, wird die Sequenz von Subtilisin BPN' als ein Standard verwendet. Zum Beispiel wird, auf der Basis einer Ausrichtung der Sequenzen, die den höchsten Grad an Hornologie zwischen Subtilisin Carlsberg und Subtilisin BPN' ergibt, das Serin an der aktiven Stelle des ersteren als Serin 221 bezeichnet, selbst wenn es an Position 220 der Aminosäuresequenz angeordnet ist. Auf derselben Grundlage kann gesagt werden, daß die Position 220 der Aminosäuresequenz von Subtilisin carlsberg der Position 221 von Subtilisin BPN' "entspricht". Siehe z.B. Nedkov et al., Hoppe- Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1537-1540 (1983).
  • Die Röntgenstruktur von Subtilisin BPN' [Wright, et al., Nature, 221, 235 (1969)] zeigte, daß die Geometrie der katalytischen Stelle von Subtilisin, die Asp³², His&sup6;&sup4; und Ser²²¹ umfaßt, nahezu identisch ist mit derjenigen der aktiven Stelle von Säuger-Serinproteasen (z.B. Chymotrypsin), die die Reste Asp¹&sup0;², His&sup5;&sup7; und Ser¹&sup9;&sup5; umfaßt. Die Unterschiede insgesamt zwischen Bacillus-Serinproteasen und Säuger-Serinproteasen weisen darauf hin, daß diese zwei nicht-verwandte Familien proteolytischer Enzyme sind.
  • In der Familie von Bacillus-Subtilisinen sind vollständige Aminosäuresequenzen für sechs Subtilisine verfügbar: Carlsberg, [Smith, et al., J. Biol. Chem., 243, 2184-2191 (1968)]; BPN' [Markland, et al., J. Biol. Chem., 242, 5198- 5211 (1967)]; das aprA-Genprodukt [Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984)]; DY [Nedkov et al., aaO.]; Bacillus mesentericus [Svendsen, et al., FEBS Letters, 196, 220-232 (1986), und Bacillus subtilis var. amylosacchariticus [Yoshimoto, et al., J. Biochem., 103, 1060-1065 (1988)]. Subtilisin Carlsberg und Subtilisin BPN' (manchmal als Subtilisin Novo bezeichnet) unterscheiden sich um 84 Aminosäuren und einen zusätzlichen Rest in BPN' [Subtilisin Carlsberg fehlt ein Aminosäurerest, der Resyt 56 von Subtilisin BPN' entspricht). Subtilisin BPN' durch den Ersatz von 82 Aminosäuren und eine Deletion (Subtilisin DY fehlt ein Aminosäurerets, der Rest 56 von Subtilisin BPN' entspricht). Die Aminosäuresequenz des aprA-Genproduktes ist zu 85% homolog zur Aminosäuresequenz von Subtilisin BPN'. Es scheint somit, daß eine extensive Homologie zwischen Aminosäuresequenzen von Subtilisinen aus verschiedenen Stämmen von Bacillus besteht. Diese Homologie ist vollständig in bestimmten Regionen des Moleküls und insbesonder in denjenigen, die eine Rolle im katalytischen Mechanismus und in der Substratbindung speilen. Beispiele für solche Sequenz-Invarianzen sind die primären und sekundären Substratbindungsstellen, Ser¹²&sup5;-Leu¹²&sup6;-Gly¹²&sup7;-Gly¹²&sup8; bzw. Tyr¹&sup0;&sup4;, und die Sequenz um das reaktive Serin (221), Asn²¹&sup8;-Gly²¹&sup9;Thr²²&sup0;-Ser²²¹- Met²²²-Ala²²³.
  • Subtilisinmoleküle zeigen einzigartige Stabilitätseigenschaften. Obgleich sie nicht vollständig stabil über einen breiten pH-Bereich sind, sind Subtilisine relativ resistent gegen Denaturierung durch Harnstoff- und Guanidin-Lösungen, und ihre enzymatische Aktivität wird für eine gewisse Zeit in 8 M Harnstoff beibehalten. In Lösungen mit einem pH unter 4 verliert Subtilisin schnell und irreversibel seine proteolytische Aktivität. Gounaris, et al., Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 35, 37 (1965), belegten, daß die Säure-Desaktivierung von Subtilisin nicht auf einem allgemeinen Ladungseffekt beruht, und spekulierten, daß sie auf anderen Veränderungen im Molekül beruht, wie etwa Protonierung von Histidinresten in den inneren, hydrophoben Teilen des Moleküls Bacillus-Subtilisine durchlaufen irreversible Inaktivierung in wäßrigen Lösungen mit einer Geschwindigkeit, die in großem Maße abhängig ist von der Temperatur und dem pH Bei pH-Werten unter 4 oder über 11 ist die Inaktivierungsgeschwindigkeit sehr schnell, während bei pHs von 4,5 und 10,5 die Geschwindigkeit, obgleich viel langsamer, ansteigt, wenn die Lösung alkalischer wird. Die Mechanismen dieser Inaktivierung sind nicht vollständig bekannt, aber es gibt Belege, die darauf hinweisen, daß Selbstverdauung wenigstens teilweise für die Enzyminstabilität in diesem pH-Bereich verantwortlich ist. Im allgemeinen gilt bei jedem pH-Wert: je höher die Temperatur, desto schneller die Geschwindigkeit der Subtilisin-Desaktivierung.
  • Die Verwendung von Proteasen in industriellen Verfahren, welche die Hydrolyse von Proteinen erfordern, ist aufgrund der Enzyminstabilität unter Betriebsbedingungen begrenzt gewesen. So hatte z.B. die Einbeziehung von Trypsin in Waschmittel (z.B. Bio-38, Schnyder; Schweiz), um die Entfernung proteinhaltiger Flecke zu erleichtern, einen sehr begrenzten Erfolg, der unzweifelhaft ein Ergebnis der Enzyminstabilität unter den Waschbedingungen war. Zusätzlich sind bakterielle alkalische Proteasen, die mit Waschmitteln kompatibel sind, in Waschmittel formulierungen eingesetzt worden.
  • Weil viele industrielle Verfahren bei Temperaturen durchgeführt werden, die oberhalb des Stabilitätsbereichs der meisten Enzyme liegen, werden hochthermostabile Proteasen nicht nur für bestimmte Industriezweige vorteilhaft sein, wie für Waschmittel und Fellenthaarung, die schon stabile Proteasen erfordem, sondern können auch in den Industriezweigen nützlich sein, die chemische Mittel verwenden, um Proteine zu hydrolysieren, z.B. Hydrolyse von pflanzlichen und tierischen Proteinen zur Herstellung von Suppenkonzentraten.
  • Obgleich die thermische Inaktivierung der wichtigste Faktor bei einer Beschränkung der industriellen Verwendung von Enzymen sein kann, können auch andere Faktoren, wie etwa die Anforderung der Wirksamkeit über breite pH-Bereiche und die Verwendung von Denaturierungsmitteln und Oxidationsmitteln, eine nachteilige Wirkung im Hinblick auf die Verwendung von Proteasen in industriellen Verfahren haben. Es ist daher wünschenswert, eine Klasse von Proteasen zu erhalten, die gekennzeichnet ist durch verbesserte Stabilität im Hinblick auf Temperatur, pH, Denaturierungsmittel und Oxidationsmittel und andere Bedingungen, die von verschiedenen Industriezweigen als Anforderung gestellt werden.
  • Über die vergangenen Jahre hat es wesentliche Veränderungen in Waschmittelformulierungen gegeben, insbesondere durch den Ersatz von Phosphaten durch alternative Builder und bei der Entwicklung von Flüssigwaschmitteln, um Umwelt- und Verbraucheranforderungen Rechnung zu tragen. Diese Veränderungen schaffen ein Bedürfnis nach Veränderungen bei den herkömmlichen Waschmittelenzymen. Genauer gesagt ist es wünschenswert geworden, proteolytische Enzyme einzusetzen, die größere Lagerstabilität in Flüssigwaschmittelformulierungen besitzen, sowie Stabilität und Aktivität in größeren Bereichen von pH und Temperatur in einer Vielzahl kommerzieller Waschmittelformulierungen.
  • Ein Ansatz, um modifizierte Subtilisine zu produzieren, die in Waschmittelformulierungen brauchbar sind, wurde in U.S.Patent No. 4,760,025 offenbart, in dem Mutationen im Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens (z.B. amyloliquefaciens) in den Positionen Asp³², Asn¹&sup5;&sup5;, Tyr¹&sup0;&sup4;, Met²²², Gly¹&sup6;&sup6;, His&sup6;&sup4;, Gly¹&sup6;&sup9;, Phe¹&sup5;&sup9;, Ser³³, Tyr²¹&sup7; und/oder Gly¹&sup5;&sup7; als eine veränderte Stabilität, geänderte Konformation liefernd oder als Veränderungen in der "Verarbeitung" des Enzyms aufweisend identifiziert wurden. Insbesondere führte eine Mutation von Met²²² zu Ala oder Ser behauptetermaßen zu verbesserter Oxidationsstabilität, aber die spezifische Aktivität des Enzyms gegenüber dem synthetischen Peptidsubstrat, Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L- phenylalanyl-p-nitroanilid (sAAPFpN) wurde im Vergleich mit dem nicht-mutierten Enzym herabgesetzt. Es wurde vorgeschlagen, daß die Substitution von Gly¹&sup6;&sup6; durch Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Asn, Arg oder Val die kinetischen Parameter des Enzyms verändern würde. Keine der offenbarten Mutationen liefert jedoch Analoge mit größerer Stabilität bei hohen Temperaturen oder Stabilität über einen breiteren pH-Bereich als das Wild- Typ-Enzym.
  • In einem anderen Ansatz offenbarten Thomas, et al, Nature, 318, 375-376 (1985), daß die pH-Abhängigkeit von Subtilisin verändert werden kann, indem ein Asp zu Ser in Asp&sup9;&sup9; von Subtilisin BPN' geändert wird. Diese Änderung stellt eine Veränderung einer Oberflächenladung 14-15 Angström von der aktiven Stelle entfernt dar. Thomas et al. liefern jedoch keinerlei Hinweis auf eine Verbesserung, wenn keine Veränderung in der Oberflächenladung vorgenommen wird, wie dies der Fall ist, wenn ein ungeladener Rest durch einen anderen ersetzt wird.
  • Ein dritter Ansatz, der in W087/04461 und W088/08033 beschrieben ist, betrifft eine Klasse von Bacillus-Serinprotease-Analogen, die gekennzeichnet sind durch Deletion und/oder Modifikationen aller Asn-Gly-Sequenzen, die in der Protease vorhanden sind.
  • Takagi et al., J. Biol. Chem. 263, 19592-19596 (1988) offenbaren, daß eine Änderung von Isoleucin 31 zu Leucin die Aktivität von Subtilisin im Vergleich mit dem Wild-Typ-Enzym erhöht.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Klasse von Subtilisin- Analogen zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie verbesserte pH- und Thermostabilität und Oxidationsstabilität aufweisen, was solche Analoge besonders nützlich in Waschmittelformulierungen sowie anderen Verfahren, die stabile Proteasen erfordern, macht. Die Subtilisin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Aminosäuresequenz eines natürlich auftretenden Bacillus Subtilisins besitzen, die modifiziert worden ist. Die Erfindung stellt ein im wesentlichen reines [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin-Analog, fakultativ mit einer zusätzlichen Substitution, die ausgewählt ist aus [Leu³¹] und [Leu¹²&sup4;], zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Waschmittelzusammensetzungen zur Verfügung, die die Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung umfassen, und die Verwendung solcher Subtilisin-Analoge und zusammensetzungen in Reinigungsanwendungen.
  • Die Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung zeigen verbesserte thermische, pH-Stabilität und Oxidationsstabilität, erhöhte spezifische Aktivität und breite Substratspezifität, wodurch die Waschkraft von Waschmittelformulierungen erhöht wird, die solche Analoge enthalten. Insbesondere stellen die Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung verbesserte Thermostabilität, erhöhte pH-Stabilität, erhöhte Oxidationsstabilität und höhere spezifische Aktivität bereit, als in "Wild-Typ"-Subtilisinen anzutreffen ist.
  • Hierin offenbart ist ein Verfahren zur Herstellung von Subtilisin-Analogen, das eine Wirtszelle umfaßt, mit einer Nucleinsäure, die ein Subtilisin-Analog codiert, wie oben beschrieben. In solch einer Zelle kann die Nucleinsäure, die das Subtilisin-Analog codiert, chromosomal oder extrachromosomal sein. Die Wirtszelle ist bevorzugt ausgewählt aus einem bezüglich sekretierten Proteasen defizienten Stamm, was eine leichte Isolierung der Analoge der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 veranschaulicht schematisch die Zyklisierung von Asn- Gly-Resten, wie denjenigen, die an den Positionen 218 und 219 von Subtilisin anzutreffen sind, wie angegeben in Tabelle 1, um Anhydroaspartylglycin zu bilden, und zeigt auch die basenkatalysierte Hydrolyse davon;
  • Fig. 2 ist eine partielle Restriktionskarte eines das aprA-Gen enthaltenden EcoRI-KpnI-Genfragments vom Bacillus subtilis (B. subtilis)-Stamm QB127 und schließt eine partielle Restriktionskarte des aprA-Gens und der flankierenden Sequenzen ein;
  • Fig. 3 ist eine partielle Restriktionskarte eines Plasmids pAMB11;
  • Fig. 4 ist ein Flußdiagramm, das die Stufen bei der Konstruktion von pAMB113 veranschaulicht, einem Plasmid, das die Synthese von [Ser]²¹&sup8;-Subtilisin aus B. Subtilis-Wirtszellen steuert;
  • Fig. 5 ist eine partielle Restriktionskarte von pAMB30-Plasmid;
  • Fig. 6 veranschaulicht die Konstruktion von pAMB106;
  • Fig. 7 veranschaulicht die Konstruktion von M13mp19 aprA143.
  • Fig. 8 zeigt die Stabilität von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]- Subtilisin in Bleichlauge.
  • Die Figuren 9 und 10 zeigen die Waschleistung von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Der Begriff "Subtilisin", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine reife, sekretierte Form des Enzyms, der Leader- Sequenzen fehlen, die vom reifen Enzym vor oder bei der Sekretion abgespalten worden sind. Subtilisine, die gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert sein können, schließen natürlich auftretende Subtilisine ein, die repräsentiert werden durch die Aminosäuresequenz von Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN', dem aprA-Genprodukt vom Bacillus subtilis, Subtilisin DY und dem Subtilisin von Bacillus mesentericus und dem Subtilisin von B. subtilis var. amylosacchariticus, sind aber nicht hierauf beschränkt. Die Aminosäuresequenz für Subtilisin Carlsberg ist beschrieben von Smith, et al., J. Biol. Chem., 243, 2184-2191 (1968). Die Aminosäuresequenz für Subtilisin BPN' ist beschrieben von Markland, et al., J. Biol. Chem., 242, 5198-5211 (1967). Die Aminosäuresequenz für Subtilisin DY ist beschrieben von Nedlov, et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1537-1540 (1983). Die Aminosäuresequenz für das Subtilisin von Bacillus mesentericus ist beschrieben von Svedsen, et al., FEBS Letters, 196, 220-232 (1986). Die Aminosäuresequenz für das Subtilisin von Bacillus subtilis var. amylosacchariticus ist beschrieben von Yoshimoto, et al., J. Biochern., 103, 1060-1065 (1988). Die Aminosäuresequenz des aprA- Genproduktes von Bacillus subtilis ist beschrieben von Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984). Die Aminsäuresequenzen solcher Subtilisine sind hierin durch Bezugnahme miteinbezogen. Solche Subtilisine sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Calciumbindungsstellen aufweisen, die notwendig sind, um das Molekül zu stabilisieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Klasse von Subtilisin-Analogen zur Verfügung gestellt, die eine verbesserte Fähigkeit besitzt, an Calcium zu binden. Calcium ist verwendet worden, um Subtilisin in Pulvern und Flüssigwaschmittel zu stabilisieren, insbesondere in Anwendungen, die höhere Temperaturen erfordern. Die vorliegende Erfindung betrifft die Modifikation der Calciumbindungsstelle des Subtilisinmoleküls, um die Calciumbindung zu erhöhen. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Modifikation der Calciumbindungsstelle" den Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren in der Region einer Calciumbindungsstelle, die in der Aminosäuresequenz von Subtilisin vorhanden ist, durch eine negativ geladene Aminosäure, wodurch ermöglicht wird, daß das resultierende Subtilisin-Analog eine zusätzliche negative Ladung aufweist. Es ist festgestellt worden, daß eine Calciumbindungsstelle in einem Subtilisin die folgenden Aminosäuren umfaßt: Gln2, Asp&sup4;¹, Leu&sup7;&sup5;, Asn&sup7;&sup6;, Asn&sup7;&sup7;, Ser&sup7;&sup8;, Ile&sup7;&sup9;, Gly&sup8;&sup0;, Val&sup8;¹, Thr²&sup0;&sup8; und Tyr²¹&sup4;, relativ zur Aminosäuresequenz, die in Tabelle 1 angegeben ist.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Subtilisin-Analog, in dem Asn&sup7;&sup6; umgewandelt ist zu Asp&sup7;&sup6;, und Substitutionen von Asn¹&sup0;&sup9; und Asn²¹&sup8; zu Ser¹&sup0;&sup9; und Ser²¹&sup8;, wodurch zwei instabile Asn-Gly-Sequenzen eliminiert werden, in Kombination mit der Änderung von Methionin 222 zu Alanin. Eine andere bevorzugte Ausführungsform umfaßt die obigen bevorzugten Modifikationen der Calciumbindungsstelle und Asn-Gly-Sequenzen und Met-222 in Kombination mit Aminosäuremodifikationen, die die Spezifität von Subtilisin gegenüber einem Azocasein-Substrat oder einem sAAPFpN-Substrat erhöhen, d.h. Methionin 124 zu Leucin oder Alanin und/oder Isoleucin 31 zu Leucin.
  • Zusätzlich weist, wie zuvor gesagt, eine Klasse von Analogen eines Bacillus-Subtilisins gemäß der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz auf, in der, zusätzlich zu Modifikationen an der (den) Calciumbindungsstelle(n) und Asn-Gly-Sequenzen, ein Met-Rest an Position 222 ersetzt ist durch Ala, um die Oxidationsstabilität des Subtilisin-Analogs zu verbessern.
  • Die spezifische Aktivität eines Analogs, das die Substitution von Met²²² zu Ala umfaßt, kann durch Einbeziehung einer oder mehrerer der folgenden zusätzlichen Anderungen erhöht werden: Met¹²&sup4; zu Leu, Ile³¹ zu Leu.
  • Wegen ihrer Fähigkeit, beträchtliche Mengen an Proteinen zu sekretieren und weil sie gegenwärtig verwendet werden, um Waschmittel-Proteasen zu produzieren, repräsentieren Bacillus Mikroorganismen einen bevorzugten Wirt für die rekombinante Herstellung der Subtilisin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung. Weil die meisten Bacilli alkalische und neutrale Proteasen sekretieren, ist es bevorzugt, daß Mutationen in die Gene für endogene alkalische und neutrale Proteasen von B. subtilis eingeführt werden, so daß das mutierte Subtilisin durch B. subtilis in einem von anderen Proteasen freien Medium produziert und sekretiert werden kann. So stellt die vorliegende Erfindung auch mutante Stämme von B. subtilis zur Verfügung, die im Hinblick auf die Synthese von endogenen Proteasen blockiert sind, die aber die Fähigkeit beibehalten haben, die Subtilisin-Analoge, die hierin offenbart sind, zu synthetisieren und zu sekretieren.
  • Wie unten detaillierter beschrieben, wurde festgestellt, daß die pH und Thermostabilität und Oxidationsstabilität und die Stabilität in Waschmittelformulierungen der Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung signifikant höher ist als diejenige des Wildtyp-aprA-Genprodukt-Subtilisins und Carlsberg-Subtilisins.
  • Alle Subtilisin-Analoge gemäß der Erfindung können gemäß der folgenden Vorgehensweise hergestellt werden:
  • 1) Isolierung des repräsentativen Subtilisin-Gens aprA aus B. subtilis;
  • 2) Klonierung des aprA-Gens auf einem Vektor, der den Einsatz von ortsgerichteter Oligonucleotid-Mutagenese ermöglicht, um gewünschte Modifikationen zu schaffen;
  • 3) Ortsgerichtete Mutagenese und Sequenzierung der resultierenden DNA, um das Vorhandensein der gewünschten Mutation zu bestätigen;
  • 4) Konstruktion eines Expressionsvektors, um die Synthese des mutierten Enzyms in B. subtilis zu steuern;
  • 5) Konstruktion von mutierten B. subtilis-Stämmen, die Subtilisin und neutrale Protease nicht synthetisieren;
  • 6) Isolierung des Enzyms im extrazellulären Wachstumsmedium und seine Reinigung;
  • 7) Praktizieren von Verfahren zur Insertion des Gens, das für das verbesserte Enzym codiert, in das Chromosom eines B. subtilis-Stammes, der zuvor mutiert worden ist, um die Synthese von endogenen Proteasen zu blockieren.
  • Wie hierin verwendet, werden die spezifischen Subtilisin-Analoge durch Darstellung der Ersatz-Aminosäure in Klammern angegeben. Zum Beispiel bezeichnet ein [Ser¹&sup0;&sup9;]-Subtilisin ein Subtilisinmolekül mit einem Serin in Aminosäureposition 109 und ein [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin bezeichnet ein Subtilisinmolekül mit einem Serin an den Aminosäurepositionen 109 und 218.
  • In Beispiel 1 wird das aprA-Gen, das Subtilisin codiert, aus dem B. subtilis-Genom isoliert. In Beispiel 2 wird das aprA- Gen ortsgerichteter Mutagenese unterzogen. In Beispiel 3 wird ein Expressionsvektor, der das mutierte aprA-Gen enthält, konstruiert. In Beispiel 4 wird ein [Ser¹&sup0;&sup9;]-Subtilisin-Analog hergestellt. Beispiel 5 beschreibt die Herstellung eines [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analogs. Beispiel 6 beschreibt die Herstellung eines [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup5;]-Subtilisin-Analogs. Beispiel 7 beschreibt die Herstellung eines [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup5;]-Subtilisin-Analogs.
  • In Beispiel 8 wird ein [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup5;, Ala²²²]-Subtilisin- Analog hergestellt. In Beispiel 9 wird das [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin-Analog in Bakteriophage M13mp19 zur Vorbereitung ortsgerichteter Mutagenese überführt. In Beispiel 10 wird ein [Leu³¹, Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin-Analog hergestellt. Beispiel 11 beschreibt die Herstellung eines [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Leu¹²&sup4;, Ser²¹&sup6;, Ala²²²]-Subtilisin-Analogs.
  • In Beispiel 12 werden zwei mutante Stämme von B. subtilis, die keine nachweisbaren extrazellulären Proteasen produzieren, konstruiert. Beispiel 13 beschreibt Verfahren zur Integration eines mutierten aprA-Gens in das Chromosom von B. subtilis. In Beispiel 14 werden Wild-Typ- und mutante aprA-Subtilisine isoliert und gereinigt. Die Beispiele 15, 16, 17, 18 und 19 beschreiben Eigenschaften der Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf Stabilität, Aktivität und Waschleistung.
  • Zusätzlich zu einem Subtilisin-Analog der vorliegenden Erfindung können Waschmittelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen:
  • (a) Wenigstens eine oberflächenaktive Substanz, die anionisch, nicht-ionisch oder amphoter sein kann, oder eine wasserlösliche Seife. Typischerweise wird ein anionisches Tensid (z.B. ein lineares Alkylarylsulfonat) in Vermischung mit einem nicht-ionischen (z.B. einem Alkylphenylpolyglykolether) in Mengen von 5-30 bzw. 1-5 Gew.-% der Waschmittelzusammensetzung verwendet.
  • (b) Einen oder mehrere Builder, die vorzugsweise gleichzeitig eine Maskierungs funktion besitzen. Natriumtripolyphosphat, Natriumcitrat, Natriumsilicat und Zeolithe sind Beispiele für solche Verbindungen, die üblicherweise von 10 bis 70 Gew.-% der Waschmittelzusammensetzung ausmachen.
  • (c) Ein Bleichmittel, vorzugsweise eine Peroxyverbindung, wie etwa Natriumperborat, das typischerweise in einer Menge von bis zu 30 Gew.-% der Zusammensetzung einbezogen wird.
  • (d) Hilfsstoffe, wie etwa Carboxymethylcellulose, optische Aufheller und Duftstoffe. Falls erforderlich, wird ein Mittel zur Einstellung des pH-Wertes zugegeben, um einen pH des Waschmediums im Bereich von 7,0 bis 10,5 zu ergeben.
  • Die Waschmittelzusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge eines oder mehrerer der Subtilisin-Analoge der vorliegenden Erfindung. Wie hierin verwendet, bezeichnet "wirksame Menge eines Subtilisin-Analogs" die Menge an Subtilisin-Analog, die erforderlich ist, um die enzymatische Aktivität zu erzielen, die in der spezifischen Waschmittelzusammensetzung erforderlich ist. Solche wirksamen Mengen werden ohne weiteres von einem Fachmann auf diesem Gebiet ermittelt und beruhen auf vielen Faktoren, wie etwa dem besonderen eingesetzten Subtilisin-Analog, der Reinigungsanwendung, der spezifischen Zusammensetzung der Waschmittelzusammensetzung, ob eine flüssige oder trockene Zusammensetzung erforderlich ist und dergleichen.
  • Die teilchenförmige Subtilisin-Analog-Zubereitung der Erfindung wird in einer Menge zugegeben, die so berechnet ist, daß sie eine Enzymaktivität von wenigstens 0,1 Anson-Einheiten (AU, siehe unten), vorzugsweise 0,5-2,5 AU pro 100 g Waschmittelzusammensetzung ergibt. Falls erforderlich, kann der Rest auf 100 % mit einem anorganischen Füllstoff, vorzugsweise Natriumsulfat, ergänzt werden.
  • Flüssigwaschmittelzusammensetzungen können aus Enzymaufschlämmungen, vorzugsweise in nicht-wäßrigen Medien, hergestellt werden. Typischerweise können solche Aufschlämmungen aus einer Suspension von fein vermahlenem Subtilisin-Analog-Konzentrat in einem flüssigen nicht-ionischen Tensid, z.B. Tergitol 15 S 9 oder einer Mischung solcher Tenside bestehen. Üblicherweise wird die Aufschlämmung auch einen oder mehrere anorganische Füllstoffe enthalten, wie etwa fein vermahlenes Natriumchlorid, fakultativ in Vermischung mit einem Suspensionsstabilisator, z.B. durch Flammenhydrolyse hergestellte Kieselsäure (Aerosil 200). Tergitol und Aerosil sind Warenzeichen.
  • Ein Subtilisin-Analog der Erfindung wird in einer Menge zugegeben, die so berechnet wird, daß sie eine Proteaseaktivität von wenigstens 0,1 AU, vorzugsweise 0,5-2,5 AU pro 100 g Flüssigwaschmittelzusammensetzung ergibt.
  • Die Waschmittelzusammensetzungen können in der üblichen Art und Weise hergestellt werden, z.B. durch Zusammenmischen der Bestandteile. Alternativ wird eine Vormischung hergestellt, die anschließend mit den restlichen Inhaltsstoffen vermischt wird.
  • Wegen der beschriebenen guten Stabilitäts- und Aktivitätseigenschaften können die Subtilisin-Analoge gemäß der Erfindung in allen Bereichen eingesetzt werden, in denen proteolytische Enzyme allgemein verwendet werden. Insbesondere können sie für Waschmittel und Reinigungsmittel oder Fleckentferner, als ein Enthaarungsmittel beim Gerben und auch in der Nahrungsmittelindustrie zur Herstellung von Proteinhydrolysaten und in der Serologie für den Nachweis unvollständiger Antikörper verwendet werden. Zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie und in der Serologie ist es besonders vorteilhaft, daß die Subtilisin-Analoge gemäß der Erfindung hervorragende Stabilität in der festen oder gelösten Form besitzen, so daß physiologisch annehmbare Mengen an Calcium-Ionen nicht erforderlich sein müssen, um das Subtilisin-Analog in wäßrigen Lösungen zu stabilisieren, im Gegensatz zu denjenigen anderer Enzymzubereitungen.
  • Die folgenden Beispiele werden weiter dazu dienen, die Erfindung zu veranschaulichen und zu zeigen, wie dieselbe umgesetzt werden kann. Die Beispiele 10, 11, 18 und 19 sind für die beanspruchte Erfindung besonders wichtig.
    • Beispiel 1
  • B. subtilis-Stamm QB127 (trpC2 leuA8 sacUh200) [Lepesant, et al., Molec. Gen. Genet., 118, 135-160 (1982)] wurde vom Bacillus Genetic Stock Center an der Ohio State University, Columbus, Ohio erhalten. Dieser Stamm zeigt eine Überproduktion an extrazellulären Serin- und Metallproteasen, α-Amylase und Levansucrase relativ zu isogenen sacU&spplus;-Stämmen, aufgrund des pleiotropen Effekts der sacUh200-Mutation [Lepesant, et al., in Schlessinger, D., ed., Microbiolooy, 1976, American Society for Microbiology, Washington, D.C., S. 65 (1976)]. Stamm QB127 ist somit eine geeignete DNA-Quelle zur Isolierung des aprAGens, das für Subtilisin codiert.
  • Genomische DNA wurde aus Zellen des B. subtilis-Stammes QB127 gemäß dem Verfahren von Saito, et al., Biochim. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963) isoliert. Gereinigte chromosomale DNA wurde mit der EcoRI-Restriktionsendonuclease vollständig verdaut.
  • Die resultierenden DNA-Fragmente wurden auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese aufgelöst und Fragmente im Bereich von 4,4 bis 8,0 Kilobasen (kb) wurden isoliert. Diese Fragmente wurden an pCFM936 (A.T.C.C. No. 53,413 von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) ligiert, einem Escherichia coli (E. coli)-Plasmid, das höhere Kopienzahlen bei erhöhten Temperaturen zeigt und das Kanamycin-Resistenz verleiht. Der Vektor wurde mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Kalbsdarm- Phosphatase vor der Ligation dephosphoryliert.
  • Die Ligationsprodukte wurden in E. coli C600 (A.T.C.C. No. 23724 von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) eingeführt, und im Anschluß an Inkubation über Nacht auf L-Agar, ergänzt mit 10 µg/ml Kanamycin, wurden Kanamycin-resistente Wirtszellen selektioniert. Plasmid-DNA wurde durch Inkubation der selektionierten Wirtszellen bei 42ºC für 4 Stunden amplifiziert. Kolonien wurden dann auf Nitrocellulosefilter übertragen und gemäß einem Kobniehybridisierungsverfahren weiterbehandelt, das beschrieben ist von Grunstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 72 3961 (1975).
  • Eine Oligonucleotid-Sonde wurde verwendet, um auf Kolonien zu screenen, die das Subtilisin-Gen auf pCFM936 enthielten. Die mit dem Phosphit-Verfahren, das von Beaucage, et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862 (1981), beschrieben ist, synthetisierte Sonde besaß die Nucleotidsequenz
  • 5' GCGCAATCTGTTCCTTATGGC 3',
  • die dem Aminoterminus des aprA-Genproduktes entspricht (Wong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1184-1188 (1984); Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984)). Eine Hybridisierungstemperatur von 55ºC wurde verwendet und 5 positive Kolonien aus einer Gesamtzahl von 400 identifiziert. Die Plasmid-DNA aus einer der positiven Kolonien wurde als pCFM936 apr2 bezeichnet.
  • Plasmid pCFM936 apr2 wurde mit EcoRI allein, mit HindIII allein und mit EcoRI und HindIII in Kombination verdaut. Die Größen der EcoRI-Fragmente des Subtilisin-Gens entsprachen denjenigen, die bei Stahl et al., aaO., beschrieben sind, aber mehrere an anderer Stelle noch nicht beschriebene HindIII- Stellen wurden entdeckt. Wie hierin in Beispiel 3 beschrieben, wurden zwei der HindIII-Stellen bei genetischen Manipulationen des Subtilisin-Gens genutzt.
  • Es wurde festgestellt, daß ein großes 6,5 kb langes EcoRI- Fragment von genomischer DNA von B. subtilis QB127 das aprA- Gen, seine regulatorischen Sequenzen und damit nicht zusammenhängende flankierende Sequenzen trug, indem verifiziert wurde, daß die Restriktionsenzymverdauungsprodukte mit den Ergebnissen übereinstimmten, die von Stahl, et al., aaO., berichtet worden waren. Dies wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung der Didesoxy-Kettenterminationsmethode bestätigt, die von Sanger, et al., J. Mol. Biol., 143, 161-178 (1980) beschrieben wurde. Es wurde auch festgestellt, daß ein 3,0 kb langes Eco-RI-Kpni-Subfragment des 6,5 kb langen EcoRI-Fragmentes, wie veranschaulicht in Fig. 2, das aprA-Gen, seine regulatorischen Sequenzen und damit nicht zusammenhängende flankierende Sequenzen enthielt. Obgleich von Stahl, et al., und in der Legende zu Fig. 1 darin, berichtet worden ist, daß das KpnI-Eco- RI-Fragment 2,5 kb lang sei, zeigt ein Vergleich des Maßstabs von Fig. 1 und der maßstabsgerechten Darstellung des Fragmentes darin, daß selbst bei Stahl, et al. das KpnI-EcoRI-Fragment beträchtlich größer als 2,5 kb ist.
  • Ein Klonierungsvektor für Bacillus-Wirtssysteme, Plasmid pAMB11, wurde wie folgt konstruiert. Das Plasmid pTG402 (Northern Regional Research Laboratories, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, Stammnummer NRRL B-15264) wurde mit der RsaI-Restriktionsendonuclease partiell verdaut. Fragmente wurden an M13 mp18 (erhältlich von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland als Katalognummer 8227SA), das zuvor mit HincII verdaut worden war, ligiert. Ligationsprodukte wurden in E. coli JM103 (erhältlich von Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey als Katalognummer 27- 1545-01) durch Transformation gemäß dem Verfahren von Mandel, et al., J Mol. Biol., 53, 154, (1970), eingeführt. Bakteriophagen-Plaques wurden mit 0,5M Catechol (hergestellt in destilliertem Wasser) besprüht, um die funktionale Expression eines xylE-Gens, abgeleitet aus pTG402, nachzuweisen. Das xylE-Gen codiert Catechol-2,3-Dioxygenase und ist nützlich für den Nachweis von Promotoren in einer Vielzahl von Organismen [Zukowski, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80, 1101-1105 (1983)].
  • Das xylE-Gen wurde dann als ein 1,0 kb langes EcoRI-PstI-Fragment in das E. coli/B. subtilis-Plasmid pHV33 überführt (erhältlich von American Type Culture Collection als A.T.C.C. 39217) [Primrose, et al., Plasmid, 6, 193-201 (1981)], erhalten von R. Dedonder (Institut Pasteur, Paris, Frankreich). Das pHV33-Plasmid war zuvor mit EcoRI und PstI verdaut worden, so daß das xylE-enthaltende Fragment, wenn in dieser Region ligiert, ein Gen für Ampicillin-Resistenz inaktivieren würde. Das resultierende Plasmid, pAMB21, enthält ein funktionales xvle-Gen in E. coli-Wirtszellen, erfordert aber die Hinzufügung eines Promotors für xyle, um in B. subtilis-Wirtszellen exprimiert werden zu können. E. coli-Zellen, die pAMB21 enthalten, sind resistent gegenüber Tetracyclin (15 µg/ml) und Chloramphenicol (20 µg/ml), während B. subtilis-Zellen, die pAMB21 enthalten, nur gegen Chloramphenicol (5 µg/ml) resistent sind.
  • Die toop-Transkriptionsterminationssequenz von Bakteriophage lambda wurde aus Plasmid pCFM936 (auf einem 400 Basenpaare langen PstI-BglII-Fragment) an die einzige PstI-Stelle von pAMB21 übertragen. Ein synthetisches Nucleotid mit derselben Sequenz, 5' GATCTGCA 3', wurde konstruiert, um die BglII-Extremität des toop- Fragments mit der PstI-Stelle des Vektors pAMB21 zu verknüpfen. Das resultierende Plasmid wurde mit pAMB22 bezeichnet und hatte zu pAMB21 identische Eigenschaften, mit der Ausnahme des Einschlusses eines Transkriptionsterminators. Das pAMB22-Plasmid ist nützlich zum Nachweis starker Promotoren, die in B. subtilis funktionell sind.
  • Das 1,4 kb lange EcoRI-BglII-Fragment von DNA aus pAMB22, das xylE und toop enthält, wurde aus einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt nach Elektrophorese restringierter Fragmente isoliert. Das 1,4 kb lange DNA-Stück wurde an Plasmid pBD64 (erhältlich vom Bacillus Genetic Stock Center, Nummer 1E22), das zuvor mit EcoRI und BamHI verdaut worden war, ligiert. Das resultierende 5,3 kb lange Plasmid, pAMB11, enthält die Polylinker-Sequenz von M13mp18 (EcoRI, SstI, XmaI, Sma, BamHI und XbaI) flußaufwärts des xylE-Gens, dem toop folgt, wie dargestellt in Figur 3. Das pAMB11-Plasmid ist in der Lage, in B. subtilis zu replizieren, und verleiht Wirtszellenresistenz gegen Chloramphenicol (5 µg/ml) und/oder Kanamycin (5 µg/ml).
  • Wie veranschaulicht in Fig. 4, wurde das gereinigte EcoRI KpnI-Fragment, das aprA enthielt, auf pAMB11 kloniert, um pAMB111 zu bilden. Ligationsprodukte wurden in B. subtilis MI112 (arg-15 leuB thr5 recE4) (erhältlich vom Bacillus Genetic Stock Center als No. 1A423) mit der Protoplastentransformationsmethode, die von Chang, et al., Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979) beschrieben ist, eingeführt. B. subtilis MI112 ohne Plasmid-DNA ist Protease-profizient (Prt+-pHänotyp), aber die sekretierten Mengen an Subtilisin sind ziemlich niedrig. Chlorampenicol-resistente (Cmr) Transformanten wurden auf L- Agar-Platten, supplementiert mit 1,5% (w/v) Magermilch und 5 µg/ml Chloramphenicol, überführt, anschließend bei 37ºC inkubiert.
  • Nach der Inkubation bei 37ºC für ungefähr sechzehn Stunden produzierten Kolonien von MI112, die Plasmid pAMB111 enthielten, einen klaren Hof, der jede Kolonie umgab. Höfe wurden durch die proteolytische Wirkung von Subtilisin auf die Casein-Komponente des Magermilch-Mediumsupplements gebildet. MI112, die den pAMB11-Vektor allein enthielten, zeigten nach 16 Std. Inkubation keinen sichtbaren Hof, obgleich sich nach 40 Std. Inkubation bei 37ºC letztendlich ein schwacher Hof entwickelte. Zellen, die pAMB111 trugen, unterschieden sich durch einen Unterschied in der Hofgröße deutlich von Zellen, die pAMB11 trugen. Die Klonierung des aprA-Gens in einer vollständig funktionellen Form führt somit zu einer Produktion und Sekretion von Subtilisin durch B. subtilis auf hohem Niveau.
    • Beispiel 2
  • Wie veranschaulicht in Fig. 4, wurde ein 3,0 kb langes genomisches EcoRI-KpnI-Fragment, dessen Isolierung in Beispiel 1 beschrieben ist, mit HindIII verdaut, um drei Fragmente zu liefern: (1) ein 1,1 kb langes EcoRI-HindIII-Fragment, das genetische regulatorische Sequenzen für die aprA-Genexpression, die "Prä-Pro"-Region des Gens, die für den Export von Subtilisin aus der Zelle erforderlich ist, und die DNA- Sequenz, die für die ersten 49 Aminosäuren von reifem Subtilisin codiert, trägt; (2) ein 1,1 kb langes HindIII-HindIII- Fragment, das DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuren 50 bis 275 (Carboxyl-Terminus) von Subtilisin zusammen mit einer Transkriptionsterminationssequenz und nicht-codierenden 3,-Sequenzen trägt; und (3) ein 0,8 kb langes HindIII-KpnI- Fragment, das nicht-codierende 3'-Sequenzen enthält.
  • Das 1,1 kb lange Fragment, das von HindII-Stellen flankiert ist, wurde an die einzelne HindIII-Stelle von Bakteriophage M13 mp18 zum Zwecke der DNA-Sequenzierung und ortsgerichteten Mutagenese kloniert. Einer der Rekombinanten, bezeichnet mit M13 mp18 apr2, liefert der einzelsträngige Matrizen-DNA, die für die ortsgerichtete Mutagenese des aprA-Gens erforderlich ist.
  • Die codierende Region des aprA-Gens wurde sequenziert und die Ergebnisse der Sequenz sind in Tabelle 1 hierin angegeben. Es sollte angemerkt werden, daß die spezifische Identität der 5 Anfangscodons der Leader-Region dem Bericht von Stahl, et al., aaO., und Wong, et al., aaO., über die Sequenz-Information für das aprA-Gen zuzuschreiben ist und daß Codonsequenzunterschiede von Stahl, et al., aaO., an den Aminosäurepositionen 84 und 85 bestehen. Genauer gesagt berichten Stahl, et al., aaO., über ein Codon GTT (das für Valin codiert) an Aminosäureposition 84, während in Tabelle 1 das Codon GTA (das auch für Valin codiert) erscheint. Stahl, et al., aaO., berichten auch über ein Codon AGC (das für Serin codiert) an Aminosäureposition 85 im Gegensatz zum Codon GCG (das für Alanin codiert) in Tabelle 1. Tabelle 1 Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung)
  • Bakteriophage M13 mp18 apr2 wurde konstruiert, indem ein 1,1 kb langes HindIII-HindIII-Fragment von genomischer DNA von B. subtilis QB127, das Nucleotidsequenzen trägt, die für die Aminosäuren 50 bis 275 (Carboxyl-Terminus) von aprA-Subtilisin codiert, zusammen mit einer Transkriptionsterminationssequenz und nicht-codierenden 3'-sequenzen, in die einzelne HindIII-Stelle von Bakteriophage M13 mp18 inseriert wurde. Um die nicht-codierenden 3'-Sequenzen zu eliminieren, wurde eine KpnI-Restriktionsendonucleasestelle durch ortsgerichtete Mutagenese an einer Position unmittelbar im Anschluß an die Transkriptionsterminationssequenz eingeführt.
  • Ortsgerichtete Mutagenese wurde gemäß einem Verfahren durchgeführt, das beschrieben ist von Norrander et. al., Gene, 26, 101-106 (1983). Einzelsträngige DNA aus M13 mp18 apr2 wurde an einen Primer aneliert,
  • 5' TCCTGA GT CCGGCGCATTC 3'
  • der mit der Phosphitmethode synthetisiert wurde, die beschrieben ist von Beaucage et. al., Tetrahedron Letters 22, 1859- 1862 (1981). Der Primer war zu den Nucleotiden in dieser Region homolog, mit Ausnahme von zweien (mit Sternchen markiert), wo ein Thymin (T) zu Guanin (G) geändert war und ein anderes Thymin (T) zu Adenin (A) geändert war, wodurch in dieser Region eine KpnI-Stelle (unterstrichen) geschaffen wurde.
  • Der Primer wurde an M13 mp18 apr2-DNA bei 65ºC aneliert und die anelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und anschließend für 2 Std. bei 15ºC in einer Reaktionsmischung polymerisiert, die aus 12,5 µl anelierter DNA-Lösung, 2,5 µl von jeweils 10 mM dATP, dCTP und dGTP, 20 µl 12 mM ATP, 0,1 µl Klenow-DNA-Polymerase, 0,1 µl T4-DNA-Ligase und 13 µl sterilem destillierten Wasser bestand. Die resultierende doppelsträngige, kovalent geschlossene circuläre DNA wurde durch Transfektion in E. coli JM103 eingeführt.
  • Bakteriophagen-Plaques wurden anschließend auf Hybridisierungsmembranen Gene Screen (New England Nuclear, Beverly, Massachusetts) überführt. Plaques, die DNA mit den gewünschten Basenänderungen enthielten, wurden durch Hybridisierung an das radioaktiv markierte (γ-³²P) synthetische Oligonucleotid, das für die oben beschriebene mutagene Priming-Reaktion verwendet wurde, identifiziert. Die Hybridisierung wurde bei einer restriktiven Temperatur (65ºC) durchgeführt, damit nur DNA, die eine KpnI-Mutation trug, an das synthetische Oligonucleotid hybridisieren würde. Das Vorhandensein der KpnI-Mutation flußabwärts des aprA-Gens auf DNA von einer einzigen gereinigten Plaque, bezeichnet mit M13 mp18 apr2 KpnI, wurde durch DNA- Sequenzierung mit dem Verfahren, das von Sanger et. al., aaO. beschrieben ist, und Restriktionsenzymanalyse bestätigt.
  • Ein 1,1 kb langes Segment, das den Großteil der nicht-codierenden 3'-Region trägt, wurde deletiert, indem M13 mp18 apr2 KpnI mit KpnI verdaut wurde, die Verdauungsprodukte bei einer Konzentration von 500 ng DNA/ml erneut ligiert wurden, anschließend die Ligationsprodukte durch Transfektion in E. coli JM103 eingeführt wurden. Bakteriophagen-Plaques, die DNA mit der gewünschten 0,35 kb langen Deletion enthielten, wurden durch Restriktionsendonucleaseanalyse identifiziert. Die Bakteriophage aus einer solchen Plaque wurde mit M13 mp18 apr4 bezeichnet (Fig. 7). M13 mp18 apr4 liefert einzelsträngige Matrizen-DNA für ortsgerichtete Mutagenese des aprA-Gens, wie im weiteren beschrieben.
    • Beispiel 3
  • Um mutierte Subtilisin-Gene in B. subtilis zu exprimieren, wurde das Plasmid pAMB106 als ein Vehikel für das mutierte Gen wie folgt konstruiert:
  • 1) pAMB111 wurde mit HindIII verdaut. Ein 1,1 kb langes Segment, das den Großteil des aprA-Gens trägt, wurde durch erneute Ligation der HindIII-Verdauungsprodukte von pAMB111 bei einer Konzentration von ungefähr 1 µg/ml deletiert. Dies führte zur Bildung von pAMB110, wie in Fig. 4 veranschaulicht. Das pAMB110-Plasmid trägt genetische regulatorische Sequenzen zur Expression des Subtilisin-Gens, die "Prä-Pro"-Region, die für die Sekretion von Subtilisin erforderlich ist, und die DNA- Sequenz, die für die nicht-codierende 3'-Region von reifem Subtilisin und die ersten 49 Aminosäuren von reifem Subtilisin codiert.
  • 2) Plasmid pambib wurde mit BamHI und PstI in Kombination verdaut. Dies lieferte DNA-Fragmente in zwei Größen, 6,2 kb und 1,0 kb. Das 1,0 kb lange Fragment trägt das xylE-Gen, das für Catechol-2,3-Dioxygenase codiert, aus dem TOL-Plasmid von Pseudomonas putida mt-2 (Zukowski et. al., aaO.).
  • 3) Das größere, 6,2 kb lange BamHI-PstI-Fragment wurde mit Hilfe eines einzelsträngigen synthetischen Oligonucleotids, 5'GATCTGCA 3', das mit der Phosphitmethode synthetisiert wurde, die von Beaucage et. al., aaO., beschrieben ist, und T4- DNA-Ligase selbstligiert. Die Ligationsprodukte wurden in B. subtilis MI112 (arg-15 leuB thr5 recE4) (erhältlich vom Bacillus Genetic Stock Center als No. 1A423) mit der Protoplastentransformationsmethode, die beschrieben ist von Change et. al., Mol. Gen. Genet. 168, 111-115 (1979), eingeführt.
  • Chloramphenicol-resistente (CmR) Kolonien wurden auf Plasmidgehalt gescreent. Das 6,2 kb lange Plasmid pAMB106 wurde durch Restriktionsendonucleaseanalyse identifiziert. Es ist identisch mit Plasmid pAMB110, mit der Ausnahme, daß xylE deletiert worden ist (Fig. 6).
  • Weil ihm DNA fehlt, die für die Aminosäuren 50 bis 275 von aprA-Subtilisin codiert, synthetisiert pAMB106 kein Subtihsin, wenn es in B. subtilis-Wirtszellen eingeführt wird. Subtilisin wird nur nach Insertion des Restes des Subtilisin-Gens synthetisiert, d.h. entweder der nativen DNA-Sequenz oder einer ein Analog codierenden Sequenz.
    • Beispiel 4 Herstellung eines [Serin¹&sup0;&sup9;]-Subtilisin-Analogs
  • Einzelstrangige DNA aus Bakteriophage M13mp18 apr4 wurde an einen Primer
  • aneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et. al., aaO. beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, welche die Codons für die Aminosäuren 106 bis 113 von aprA-Subtilisin umfassen, mit Ausnahme einer Basenänderung (mit einem Sternchen markiert), wo ein A zu einem G geändert wurde, um den Übergang zu ermöglichen, der Asn¹&sup0;&sup9; (Codon AAC) in Ser¹&sup0;&sup9; (Codon AGC) verändern würde.
  • Der Primer wurde bei 65ºC an M13mp18 apr4-DNA aneliert und die anelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und anschließend polymerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen übertragen, anschließend wurden diejenigen, die DNA mit der gewünschten Basenänderung enthielten, durch Hybridisierung an ein radioaktiv markiertes (α&supmin;³²P) Oligonucleotid, das für die oben beschriebene mutagene Primingreaktion verwendet wurde, identifiziert. Die Hybridisierung wurde bei 65ºC durchgeführt. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, bezeichnet als M13mp18 apr4[Ser¹&sup0;&sup9;]. Doppelsträngige DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, anschließend wurde das 750 bp lange Fragment, das den mutierten Abschnitt des aprA-Subtilisin-Gens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB129, kann in Zellen eines geeigneten B. subtilis-Wirtes zur Synthese und Sekretion von [Ser¹&sup0;&sup9;]-Subtilisin eingeführt werden.
    • Beispiel 5 Herstellung eines [Serin¹&sup0;&sup9;, Serin²¹&sup8;]-Subtilisin-Analogs
  • Einzeisträngige DNA aus M13mp18 apr4[Ser¹&sup0;&sup9;] wurde an einen Primer:
  • aneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et. al., aaO. beschrieben ist. Der Primer war homolog zu Nucleotiden, welche die Codons für die Aminosäuren 215 bis 220 von aprA-Subtilisin umfassen, mit der Ausnahme einer Basenänderung (mit einem Sternchen markiert), wo ein A zu einem G geändert war, um den Übergang zu ermöglichen, der Asn²¹&sup8; (Codon AAC) zu Ser²¹&sup8; (Codon AGC) ändern würde. Die Bedingungen für die Anelierung, Polymerisation, Ligation, Transfektion und Identifizierung von positiven Plaques waren wie in Beispiel 2 beschrieben. Ein einziger gereinigter Plaque enthielt Bakteriophage, bezeichnet als M13mp18 apr4[Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;].
  • Doppelsträngige DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, anschließend wurde ein 750 bp langes Fragment, das die zwei Mutationen trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB130, kann zur Synthese und Sekretion von [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin in B. subtilis-Wirtszellen eingeführt werden.
    • Beispiel 6 Herstellung eines [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analogs
  • Einzeisträngige DNA aus M13mp18 apr4[Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] wurde an einen Primer:
  • aneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et. al., aaO. beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, welche die Codons für die Aminosäuren 74 bis 79 von aprA-Subtilisin umfassen, mit der Ausnahme einer Basenänderung (mit einem Sternchen markiert), wo ein A zu einem G geändert war, um den Übergang zu ermöglichen, der Asn&sup7;&sup6; (Codon AAT) zu Asp&sup7;&sup6; (Codon GAT) ändern würde.
  • Der Primer wurde an M13mp18 [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-DNA bei 65ºC aneliert und die anelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und polymerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen übertragen und diejenigen, die DNA mit der gewünschten Basenänderung enthielten, wurden durch Hybridisierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, identifiziert, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 46ºC durchgeführt wurde. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, bezeichnet als M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]. Doppelsträngige DNA aus der Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, anschließend wurde ein 750 bp langes Fragment, das die drei Mutationen des aprA-Subtilisingens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB131, kann zur Synthese und Sekretion von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin in B. subtilis-Wirtszellen eingeführt werden.
    • Beispiel 7 Herstellung eines [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin- Analogs
  • Einzelsträngige DNA aus M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] wurde an einen Primer:
  • aneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et al., aaO. beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, welche partielle Codons für die Aminosäuren 75 und 83 und vollständige Codons für die Aminosäuren 76 bis 82 von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin umfassen, mit der Ausnahme von drei Basenänderungen (durch Sternchen markiert), wo ein A zu einem G geändert war, ein T zu einem A geändert war und ein C zu einem A geändert war, was Ile&sup7;&sup9; (Codon ATC) zu Glu&sup7;&sup9; (Codon GAA) änderte.
  • Der Primer wurde an M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-DNA bei 650 aneliert und die anelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und wurde polymerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen übertragen und diejenigen, die die gewünschten Basenänderungen enthielten, wurden durch Hybridisierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 45ºC durchgeführt wurde, identifiziert. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, bezeichnet als M13mp18 adr4 [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]. Doppelsträngige DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, anschließend wurde ein 750 bp langes Fragment, das die vier Mutationen des aprA-Subtilisin-Gens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMBL33, kann zur Synthese und Sekretion von [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin in B. subtilis-Wirtszellen eingeführt werden.
    • Beispiel 8 Herstellung eines [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8; Ala²²²]-Subtilisin-Analogs
  • Einzelstängige DNA aus M13 mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] wurde an den Primer: aneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, das von Beaucage et. al., aaO. beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, welche Codons für die Aminosäuren 219 bis 224 von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;)-Subtilisin umfassen, mit der Ausnahme von zwei Basenänderungen (mit Sternchen markiert), wo ein Adenin (A) zu einem Guanin (G) geändert war und ein Thymin (T) zu einem Cytosin (C) geändert war, was die Met²²² (Codon ATG) zu Ala²²² (Codon GCG) änderte. Der Primer wurde an M13mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-DNA bei 65ºC aneliert und die anelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und wurde polmerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen übertragen und diejenigen, die gewünschte Basenänderungen enthielten, wurden durch Hybridisierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 58ºC durchgeführt wurde, identifiziert. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, bezeichnet als M13 mp18 apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]. Doppelstrangige DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit HindIII und KpnI in Kombination verdaut, anschließend wurde ein 750 bp langes DNA-Fragment, das die vier Mutationen des aprA-Subtilisin-Gens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB143, kann zur Synthese und Sekretion von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin in Bacillus-Wirtszellen eingeführt und vermehrt werden.
    • Beispiel 9 Herstellung von M13 mp19 aprA143
  • Plasmid pAMB143 wurde mit EcoRI und KpnI in Kombination verdaut. Ein 1,8 kb langes DNA-Fragment, das das vollständige Gen für [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin trug, zusammen mit seinen flankierenden Sequenzen, die für die Initiation der Transkription und Translation und die Termination der Transkription und Translation erforderlich sind, wurde übertragen auf Bakteriophage M13mp19 (erhältlich von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD., als Katalog-Nr. 8229SA), die mit EcoRI und KpnI verdaut worden war. Eine der rekombinanten Bakteriophagen-DNAs, die sich aus diesem Verfahren ergaben, wurde als M13mp19 aprA143 bezeichnet und lieferte einzelsträngige Matrizen-DNA, die für die ortsgerichtete Mutagenese des [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin-Gens erforderlich ist.
    • Beispiel 10 Herstellung eines [Leu³¹, Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtiliin-Analogs
  • Einzelsträngige DNA aus M13 mp19 aprA143 wurde an den Primer:
  • aneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisisert wurde, das von Beaucage et al., aaO. beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, welche Codons für die Aminosäuren 28 bis 34 von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²)-Subtilisin umfassen, mit der Ausnahme von zwei Basenänderungen (mit Sternchen markiert), wo ein Adenin (A) zu Thymin (T) geändert war und ein Cytosin (C) zu Adenin (A) geändert war, was die Ile³¹ (Codon ATC) zu Leu³¹ (Codon TTA) änderte. Der Primer wurde an M13 mp19 aprA143-DNA bei 65ºC aneliert und die anelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und wurde polymerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen übertragen, und diejenigen, die gewünschte Basenänderungen enthielten, wurden durch Hybridisierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 57ºC durchgeführt wurde, identifiziert. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, bezeichnet als M13mp19, aprA144, und trug DNA, die für [Leu³¹, Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin codiert. Doppelstranglge DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit EcoRI und KpnI in Kombination verdaut, anschließend wurde ein 1,8 kb langes DNA-Fragment, das die fünf Mutationen des aprA- Subtilisin-Gens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit EcoRI und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB144, kann zur Synthese und Sekretion von [Leu³¹, Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin in Bacillus-Wirtszellen eingeführt und vermehrt werden.
    • Beispiel 11 Herstellung eines [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9; Leu¹²&sup4;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin-Analogs
  • Einzelsträngige DNA aus M13mp19 aprA143 wurde an den Primer:
  • aneliert, der mit dem Phosphitverfahren synthetisiert wurde, der von Beaucage et al., aaO. beschrieben ist. Der Primer war homolog zu den Nucleotiden, welche partielle Codons für die Aminosäuren 120 und 127 und vollständige Codons für die Amino säuren 121 bis 126 von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin umfassen, mit der Ausnahme von zwei Basenänderungen (mit Sternchen markiert), wo ein Adenin (A) zu Thymin (T) geändert war und ein Guanin (G) zu Adenin (A) geändert war, was die Met¹²&sup4; (Codon ATG) zu Leu¹²&sup4; (Codon TTA) änderte.
  • Der Primer wurde an M13mp19 aprA143-DNA bei 65ºC aneliert und die anelierte DNA wurde langsam auf ungefähr 22ºC abgekühlt und wurde polymerisiert, ligiert und transfiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Bakteriophagen-Plaques wurden auf Hybridisierungsmembranen übertragen und diejenigen, die gewünschte Basenänderungen enthielten, wurden durch Hybridisierung, wie beschrieben in Beispiel 2, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierung bei 59ºC durchgeführt wurde, identifiziert. Ein positiver Plaque enthielt Bakteriophage, bezeichnet als M13 mp19 aprA145, und trug DNA, die für [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Leu¹²&sup4;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin codierte. Doppelstrangige DNA aus dieser Bakteriophage wurde mit EcoRI und KpnI in Kombination verdaut, anschließend wurde ein 1,8 kb langes DNA-Fragment, das die fünf Mutationen des aprA- Subtilisin-Gens trug, an pAMB106 ligiert, das zuvor mit EcoRI und KpnI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid, pAMB145, kann zur Synthese und Sekretion von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Leu¹²&sup4;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin in Bacillus-Wirtszellen eingeführt und vermehrt werden.
    • Beispiel 12
  • Weil die meisten Bacilli alkalische und/oder neutrale Proteasen in das umgebende Wachstumsmedium sekretieren, ist es wünschenswert, das Mutationen in B. subtilis-Gene für endogene alkalische und neutrale Protease eingeführt werden, um ihre Synthese zu blockieren, so daß mutierte Subtilisin-Gene, wenn sie in die mutante Zelle eingeführt werden, mutierte Subtihsine produzieren können, die anschließend in ein Medium sekretiert werden, das frei von weiteren Proteasen ist, die wahrscheinlich die Isolierung von intakten Subtilisin-Analogen stören würden. Zwei mutante B. subtilis-Stämme BZ24 und BZ25, die keine nachweisbaren extrazellulären Proteasen produzieren, wurden gemäß dem folgenden Verfahren konstruiert:
  • Zunächst wurde ein Plasmidvehikel, das zur Replikation in E. coli in der Lage ist, aber nicht in B. subtilis, sofern es nicht in das B. subtilis-Chromosom durch homologe Rekombination integriert ist, wie folgt konstruiert. Plasmid pBD64 (Bacillus Genetic Stock Center, Number 1E22) -wurde mit HpaII vollständig verdaut, um drei Fragmente mit einer Größe von 2,95 kb, 1,0 kb und 0,75 kb zu produzieren. Diese Fragmente wurden anschließend als eine Mischung an Plasmid pBR322 (A.T.C.C. 37017) ligiert, das zuvor mit Clai verdaut worden war. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli C600 (erhältlich von der American Type Culture Collection als A.T.C.C. 23724) durch Transformation eingeführt [Mandel, et al., J. Mol. Biol., 53, 154 (1970)]. Die Selektion erfolgte auf Zellen, die gegen Chloramphenicol (20 µg/ml) und Ampicillin (50 µg/ml) resistent waren. Plasmid-DNA aus 12 Transformanten wurde mit einem alkalischen Extraktionsverfahren hergestellt, das von Birnboim, et al., Nucleic Acids Res., 1513-1523 (1979), beschrieben ist, anschließend mit HindIII und EcoRI in Kombination verdaut, um das Vorliegen des inserierten Fragments oder der inserierten Fragmente zu verifizieren Bei einem solchen Plasmid, bezeichnet als pAMB30, wurde festgestellt, daß es die 1,0 und 0,75 kb langen HpaII-Fragmente von pBD64 in der Clai- Stelle von pBR322 trug. Diese Fragmente enthalten das Chloramphenicol-Acetyltransferase(cat)-Gen, das in E. coli und B. subtilis funktionell ist. Verdauungen mit BglII und, getrennt, mit Sau3A bestätigten die Identität und Orientierung des cat- Gens auf pAMB30, wie dargestellt in Fig. 5.
  • Weil pAMB30 eine Sequenz für einen Replikationsursprung fehlt, der in B. subtilis funktionell ist, kann es in B. subtilis Wirtszellen nicht als ein autonomes Replicon replizieren. Andererseits enthält pAMB30 den von pBR322 abgeleiteten Replikationsursprung, der in E. coli funktionell ist, somit kann das Plasmid in E. coli-Wirtszellen vermehrt werden. Plasmid pAMB30 ist auf wenigstens zwei Arten nützlich. Erstens kann ein DNA-Fragment, das einen funktionellen Replikationsursprung in B. subtilis enthält, nachgewiesen werden, wenn es so auf pAMB30 kloniert wird, daß das Plasmid im extrachromosomalen Zustand autonom replizieren wird. Zweitens kann Plasmid pAMB30 sich in das Genom von B. subtilis an einer Homologiestelle zwischen dem Chromosom und der auf pAMB30 klonierten B. subtilis-DNA integrieren. Dies ist nachgewiesen worden von Haldenwang, et al., J. Bacteriol., 142, 90-98 (1980) und Young, J. Gen. Microbiol., 129. 1497-1512 (1983), unter Verwendung von Plasmidvehikeln, die ähnlich zu pAMB30 waren, aber nicht identisch.
  • Plasmid pAMB21 (beschrieben in Beispiel 1) wurde mit EcoRI und PstI verdaut, um das xylE-Gen auf einem 1,0 kb langen Fragment zu isolieren. Das Fragment wurde an pAMB30 ligiert, das zuvor mit EcoRI und PstI verdaut worden war. Die Ligationsprodukte wurden durch Transformation in E. coli C600 eingeführt. Die Selektion erfolgte auf Chloramphenicol-resistente (20 µg/ml) Wirtszellen, die wegen der Insertion des xylE-Fragments von pAMB21 in das Strukturgen für Ampicillin-Resistenz von pAMB30 gegen Ampicillin empfindlich waren (50 µg/ml). Das resultierende Plasmid, pAMB30/21, hat zu pAMB30 identische Eigenschaften, weist aber zusätzlich ein funktionelles xylE-Gen auf.
  • Plasmid pAMB110, welches das aprA-Gen trägt, von dem eine Region deletiert ist, die für die letzten 226 Aminosäuren von reifem Subtilisin codiert, wurde mit EcoRI und KpnI verdaut. Das 1,9 kb lange Fragment von B. subtilis-DNA, das genetische regulatorische Sequenzen für die aprA-Genexpression, die "Prä- Pro"-Region, die DNA-Sequenz, die für die ersten 49 Aminosäuren von reifem Subtilisin codiert, und nicht-codierende 3'- Sequenzen enthielt, wurde an pAMB30/21 ligiert, das zuvor mit EcoRI und KpnI verdaut worden war. Die Ligationsprodukte wurden durch Transformation in E. coli C600 eingeführt. Plasmid DNA aus mehreren Transformanten wurde mit dem alkalischen Extraktionsverfahren von Birnboim, et al., aaO., isoliert und das Vorliegen des inserierten 1,9 kb langen Fragments wurde durch mehrfache Restriktionsendonucleaseverdauungen verifiziert. Ein solches Plasmid, bezeichnet als pAMB301, wurde zur weiteren Verwendung zurückbehalten.
  • B. subtilis-Stamm BGSC1A274 (Bacillus Genetic Stock Center) trägt eine Mutation des npr-Locus und ist nicht zur Produktion extrazellulärer neutraler Protease in der Lage. Das Plasmid pAMB301 wurde in das Genom von B. subtilis BGSC1A274 durch Transformation kompetenter Zellen integriert . Die Selektion erfolgte auf Chloramphenicol-resistente (5 µg/ml) Wirtszellen, die anschließend mit sterilen Zahnstochern auf L-Agar überführt wurden, das mit 1,5% (w/v) Magermilchpulver und (5 µg/ml) Choramphenicol ergänzt war. Diejenigen Zellen, die keinen die Kolonie umgebenden klaren Hof erzeugten, waren wegen der Kombination der npr-Mutation zusammen mit der neu eingeführten aprA-Mutation defizient in der Fähigkeit, extrazelluläre neutrale und Serinproteasen zu produzieren. Die aprA-Mutation war eine Deletion der letzten 226 Aminosäuren von reifem Subtilisin wegen des Ersatzes des Wildtyp-aprA-Gens durch die deletierte Version, die in pAMB301 enthalten ist. Ein solcher Stamm, bezeichnet als BZ24, besitzt den Npr&supmin; Apr&supmin; Cmr-Phänotyp, somit produziert er weder nachweisbare extrazelluläre neutrale Protease noch extrazelluläre alkalische Protease und ist gegen Chloramphenicol bei 5 µg/ml resistent. Southern- Blotting [Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975)] wurde verwendet, um die Deletion im aprA-Gen auf dem Chromosom von B. subtilis BZ24 zu bestätigen. Kultivierung von B. subtilis BZ24 in Antibiotic Medium No. 3 (Penassay Broth, Difco, Detroit, Michigan) in der Abwesenheit von Antibiotika-Selektion für ungefähr 32 Generationen führte zur Isolierung eines denvativen Stammes von BZ24, in dem das cat-Gen, das den Wirtszellen Chloramphenicol-Resistenz verleiht, wegen seiner Instabilität im BZ24-Chromosom verlorengegangen war. Solch ein Phänomen ist bereits beobachtet worden von Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984). Ein Chloramphenicol-empfindliches Derivat von BZ24 wurde als BZ25 bezeichnet. B. subtilis BZ25 besitzt den Npr&supmin; Apr&supmin;-Phänotyp, somit produziert er weder nachweisbare extrazelluläre neutrale Protease noch extrazelluläre alkalische Protease. Southern-Blotting wurde verwendet, um die Deletion im aprA-Gen auf dem Chromosom von B. subtilis BZ25 zu bestätigen.
  • Weil B. subtilis BZ25 weder nachweisbare extrazelluläre neutrale Protease noch Subtilisin produziert, ist er ein nützlicher Wirtsstamm für die Einführung von Plasmid-DNA, wie etwa pAMB113, zur Produktion mutierter Subtilisine, die in das umgebende Wachstumsmedium frei von weiteren Proteasen sekretiert werden können.
  • B. subtilis BZ25 produziert keine nachweisbaren extrazellulären Proteasen, wenn die Kulturüberstände untersucht werden, wie unten beschrieben. B. subtilis BZ25/pAMB113, der BZ25 ist, der Plasmid pAMB113 umfaßt (eingeführt mit dem Protoplastentransformationsverfahren von Chang, et al., aaO.), produziert nennenswerte Mengen von [Ser²¹&sup8;]-Subtilisin, wenn die Kulturüberstände untersucht werden, wie beschrieben.
    • Beispiel 13
  • Man glaubte, daß die Integration des [Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Gens in das Chromosom von B. subtilis einen effizienten Weg zur Verfügung stellt, um die genetische Stabilität dieses mutanten Gens zu erhöhen. Solch ein Ansatz befreit auch von der Notwendigkeit von Chloramphenicol im Fermentationsmedium, das ansonsten für das Auferlegen eines selektiven Druckes erforderlich ist, um Plasmid-DNA im extrachromosomalen Zustand zu halten. Daher wurde das [Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Gen, zusammen mit seinen genetischen regulatorischen Sequenzen und flankierender DNA, homolog zum B. subtilis-Chromosom, aus einem niedrig schmelzenden Agarosegel nach Elektrophorese von pAMB113, das mit EcoRI und PstI in Kombination verdaut worden war, isoliert. Das 4,0 kb lange EcoRI-PstI-Fragment (dargestellt in Fig. 4) wurde dann an pAMB30 ligiert (dargestellt in Fig 5), das mit EcoRI und PstI in Kombination verdaut worden war. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli HB101 (A.T.C.C. 33694) durch Transformation eingeführt. Die Selektion erfolgte auf Zellen, die gegen Chloramphenicol resistent waren (20 */µg/ml) Plasmid-DNA aus vier Transformanten, die die obigen Kriterien erfüllten, wurde mit dem alkalischen Extraktionsverfahren von Birnboim, et al., aaO., isoliert, anschließend mit EcoRI und PstI in Kombination verdaut. Alle vier Plasmide enthielten das 4,0 kb lange Insert und den 5,6 kb langen übrigbleibenden Abschnitt von pAMB30. Ein solches Plasmid, bezeichnet als pAMB302, wurde gereinigt und zur weiteren Verwendung zurückbehalten.
  • Wiederholte Versuche, Plasmid pAMB302 in das Chromosom von B. subtilis BZ25 mit der Kompetenz-Methode [Spizizen, aaO.] zu integrieren, waren erfolglos. Dies kann auf der Unfähigkeit von BZ25-Zellen beruhen, durch das eingesetzte Verfahren kompetent zu werden. Daher wurde pAMB302 in B. subtilis BZ25-Zellen mit dem Protoplastentransformationsverfahren von Chang et al., aaO., eingeführt. Dieses Ergebnis ist insbesondere insofern bedeutsam, als Forschungsstämme, in die Integration erreicht worden ist, auf der Basis der Transformation durch das Kompetenzverfahren ausgewählt wurden. Bei Stämmen, die nicht in der Lage sein könnten, kompetent zu werden, und insbesondere industrielle Stämme, die nicht auf der Basis der Transformation durch das Kompetenzverfahren ausgewählt wurden, könnte es wahrscheinlicher sein, daß sie nicht in der Lage sind, kompetent zu werden.
  • Die Selektion erfolgte auf Chloramphenicol-resistente Zellen (5 µg/ml), Zellen, die anschließend mit sterilen Zahnstochern auf L-Agar überführt wurden, das mit 1,5%, (w/v) Magermilch und 5 µg/ml Chloramphenicol suppiementiert war. Die Zellen wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Klare Höfe mit unterschiedlichen Durchmessern wurden um die Cmr-Kolonien herum beobachtet. Dies deutet darauf hin, daß Subtilisin von diesen Zellen produziert und sekretiert wurde. Ein Versuch wurde unternommen, um Plasmid-DNA aus acht von diesen Kolonien mit dem alkalischen Extraktionsverfahren zu isolieren. Auf Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid (1 µg/ml) angefärbt wurden, um DNA nach Elektrophorese sichtbar zu machen, wurde keine Plasmid-DNA nachgewiesen. Die Abwesenheit von extrachromosomaler Plasmid- DNA in den Cmr-Zellen, die Subtilisin produzierten, war ein starker Hinweis darauf, daß pAMB302 in das Chromosom von B. subtilis integriert worden war.
  • Mehrere Kolonien, die aus diesem Experiment stammten, wurden isoliert und bezeichnet als BZ28, BZ29, BZ30, BZ3L, BZ32 und BZ33. Jeder Stamm wurde über Nacht bei 37ºC unter heftigem Rütteln in Hirn-Herz-Infusionsmediurn (BHI, Difco), supplementiert mit 5 µg/ml Chloramphenicol, angezogen. Kulturüberstände wurden auf Subtilisin-Aktivität hin untersucht. Die B. subtilis-Stämme BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 und BZ33 produzierten alle Subtilisin und sekretierten es in das umgebende Wachstumsmedium, wobei einige Stämme mehr produzierten als andere. Die Menge an Subtilisin, die in der flüssigen Kulturbrühe beobachtet wurde, war direkt proportional zur Größe des Hofes, der auf Magermilch-L-Agar-Platten beobachtet worden war. Weil sich die von diesen Zellen sekretierten Mengen an Subtilisin unterschieden, waren Mehrfachkopien von pAMB302 in das Chromosom integriert oder hatte Genamplifikation stattgefunden [Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983); Albertini, et al., J. Bacteriol., 162, 1203-1211 (1985)].
    • Beispiel 14
  • Wildtyp-Subtilisin und Subtilisin-Analoge wurden wie folgt isoliert und gereinigt. Jede Kulturbrühe wurde bei 15.000 g für 30 Minuten zentrifugiert und Protein im klaren überstand wurde mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (600 g pro Liter) ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt, in 20 mM 2-[N- Morpholino]ethansulfonsäure (MES) pH 6,4 gelöst. Die Lösung wurde 30%ig in Aceton gemacht und der 30%ige Aceton-Überstand wurde durch Zentrifugation gesammelt. Der Überstand wurde dann 75%ig in Aceton gemacht und der 30-75%ige Aceton-Pellet wurde filtriert und unter Vakuum getrocknet.
  • Um das Enzym weiter zu reinigen, wurde der getrocknete Niederschlag in Wasser gelöst und die Lösung wurde gegen 5 mM MES- Puffer bei pH 6,4 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch eine Säule (2,5 x 15cm) aus 5-Sepharose FF mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute hindurchgegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 0,02M MES wurde das Enzym mit einem linearen NaCl-Gradienten in demselben Puffer, bis 0,5M NaCl, eluiert. Peakfraktionen wurden gepoolt und Protein aus den Fraktionen, die das Enzym enthielten, was erkannt wurde durch eine Farbänderung in einer mit Azocasein vermischten Probe der Fraktion, wurde bei 4ºC gegen 5 mM MES pH 6,3 dialysiert und anschließend lyophilisiert.
    • Beispiel 15
  • Reines Subtilisin oder Subtilisin-Analog wurde auf eine Säule aus Pharmacia FPLC Superose 12 aufgebracht, und das Material, das als das intakte (nicht gespaltene) Protein eluierte, wurde gepoolt, in 20 mM MES, 0,1 m NaCl, pH 6,4. Proben von Wildtyp- Subtilisin oder Subtilisin-Analog der vorliegenden Erfindung, die bewertet werden sollten, wurden für 10 Min. in demselben Puffer, dem Puffer plus 3% SDS oder 20 mM MES, 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl&sub2; und 15 mM EDTA bei der angegebenen Temperatur inkubiert. Die Proben wurden für 5 Min. auf Raumtemperatur abgekühlt und anschließend für 20 Min. bei Raumtemperatur (20ºC) in Tris-HCl, pH 8,0 mit 0,6% Azocasein getestet, um proteolytische Aktivität zu bestimmen. Die proteolytische Aktivität jeder Probe wird ausgedrückt als ein Prozentanteil der ursprünglichen Aktivität entweder vom Wildtyp oder Analog bei 20ºC in 10 mM CaCl&sub2;, und ist in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2
    • Beispiel 16
  • Intakte Subtilisine wurden durch FPLC auf der Superose 12-Säule erhalten. Die intakten Subtilisine wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur (20ºC) in 15 mM MES, 0,05 M NaCl, pH 6,3, das entweder 4 mM CaCl&sub2; oder 4 mM EDTA und eine variierte Menge SDS enthielt, inkubiert. Die proteolytische Aktivität des Enzyms wurde dann durch eine 20-minütige Inkubation in 0,6 Azocasein in Tris-Cl, pH8,0 bestimmt. Die proteolytische Aktivität jeder bewerteten Probe ist in Tabelle 3 als ein Prozentanteil der ursprünglichen Aktivität der Probe in 0% SDS und 10 mM Ca²&spplus; ausgedrückt. TABELLE 3
    • Beispiel 17
  • Für dieses Experiment wurden nur die Subtilisine wie unten beschrieben gereinigt.
  • Jede Kulturbrühe wurde bei 15.000 g für 30 Minuten zentrifugiert und Protein im klaren Überstand wurde mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (600 g pro Liter) ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt, mit 75%igem Aceton verrieben, filtriert und unter Vakuum getrocknet.
  • Um das Enzym weiter zu reinigen, wurde der getrocknete Niederschlag in Wasser gelöst und die Lösung wurde filtriert und anschließend gegen 0,02M Natriumphosphat-Puffer bei pH 6,3 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch eine Säule (2,5 x 15 cm) aus Carboxymethylcellulose mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute hindurchgegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 0,02M Natriumphosphat (pH 6,3) wurde das Enzym mit demselben Puffer, der 0,15M NaCl enthielt, eluiert. Peakfraktionen wurden gepoolt und Protein aus den Fraktionen, die das Enzym enthielten, was durch eine Farbänderung in einer mit Succinyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid (Vega Biochemicals) vermischten Probe der Fraktion erkannt wurde, wurde durch Zugabe von 2,5 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und anschließend in 0,005M Calciumacetat (etwa 1 ml pro 10 mg) gelöst. Die resultierende Lösung wurde bei 4ºC gegen Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert.
  • Die Stabilitäten von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analog, [Asp&sup7;&sup6;, Glu&sup7;&sup9;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin-Analog und Subtilisin Carlsberg wurden bei drei Temperaturen (25ºC, 37ºC und 50ºC) in zwei Pufferlösungen (0,06M Natriumphosphat, pH 9,0 oder 0,12M Natriumglycinat, pH 11,0) bewertet. Die Ergebnisse sind
  • [TEXT FEHLT]
  • ten Bedingungen ausgedrückt. TABELLE 4
    • Beispiel 18 Charakterisierung von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin- Analog.
  • [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin wurde aus B. subtilis BZ25/pAMB143-Fermentationsbrühe gereinigt, wie beschrieben in Beispiel 14. Die Thermostabilität, Stabilität in Bleiche und spezifische Aktivität dieses Subtilisin-Analogs wurde wie unten beschrieben untersucht:
    • I. Thermostabilität.
  • Die Thermostabilität von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin und [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin und des Wildtyp-Enzyms (AprA) wurden unter Verwendung des thermischen Programms des Spektrophotometers Gilford Model Response II bestimmt. Proben von gereinigter Protease in 20 mM MES, 0,1 M NaCl pH 6,3 wurden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Ca²&spplus; von 25ºC bis 95ºC erhitzt. Die Temperatur wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,5ºC pro Minute erhöht, während die Abnahme der Absorbanz bei 287 nm verfolgt wurde. Die Schmelztemperatur (Tm) ist definiert als die Temperatur, bei der die Populationen der entfalteten und gefalteten Zustände gleich sind; mit anderen Worten die Temperatur, die auf halbem Wege beim Ubergang vom gefalteten zum entfalteten Protein eintritt. Hitzedenaturierung ist eine irreversible Reaktion für Subtilisin: in der Abwesenheit von Proteaseinhibitor verdaut das intakte Enzym die entfaltete Form, in der Gegenwart von Inhibitor fällt das Protein aus, wenn es sich entfaltet. Daher gibt die Tm uns einen relativen Vergleich der Stabilität. Die unter Verwendung dieser Technik bestimmten Schmelztemperaturen sind unten angegeben. TABELLE 5 Thermostabilität
  • ND = nicht bestimmt
  • Die Schmeiztemperaturen der 2 analogen Subtilisine sind bei allen untersuchten Calciumkonzentrationen sehr ähnlich und sind konsistent höher als diejenige des AprA-Subtilisins. Dies weist daraufhin, daß die Substitution von Ala für Met an Rest 222 die erhöhte Stabilität und höhere Calciumbindungsaffinität, die mit den Substitutionen an den Positionen 76, 109 und 218 erreicht wird, nicht negativ beeinflußte.
    • II. Stabilität in Bleiche
  • Da es der Zweck der Entfernung des Met an Position 222 war, die Empfindlichkeit des Enzyms gegenüber Oxidation zu senken, wurden die Stabilität von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin und [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin in Bleiche verglichen. Im ersten Experiment wurden die zwei Analoge bei 50ºC in 20 mM Tris 0,1 M NACl pH 7,5 in der Gegenwart von 2% Chlorox, 2% Chlorox plus 1% SDS oder Puffer allein inkubiert. Es sollte angemerkt werden, daß 2% Chlorox-Bleiche ein reichlicher überschuß ist, verglichen mit der normalerweise von einem Verbraucher für das Waschen von Stoffen verwendeten Menge. Aliquote wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und die verbliebene Proteaseaktivität wurde unter Verwendung des Azocasein- Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 8 dargestellt. Die Aktivität beider Analoge ist ausgedruckt als Prozentanteil der Aktivitat in der Gegenwart von Puffer allein, der während des gesamten Verlaufes des Experimentes konstant blieb. [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²] behielt mehr Aktivität als [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] in der Gegenwart von 2% Bleiche, während beide Analoge in der Gegenwart von 2% Chlorox und 1% SDS bei 50ºC schnell Aktivität zu verlieren schienen. Eine interessante Beobachtung während dieses Experimentes war die Tatsache, daß unter identischen Bedingungen, unter Verwendung derselben Mengen an Protein, [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] eine sehr viele höhere Aktivität besaß als [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]. Dies wird detaillierter unten diskutiert werden.
  • Die Wirkung von Bleiche auf die Struktur von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²] und [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;) wurde ebenfalls unter Verwendung von SDS-PAGE bestimmt. Beide Analoge wurden bei 50ºC in 20 mM Tris, 0,1 M NaCl, 1 mM PMSF, pH 7,5 in der Gegenwart von 2% Chlorox oder 2% Chlorox plus 1% SDS inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden 30 µl entnommen, mit 15 µl kaltem (4ºC) Probenpuffer, der 1 mM PMSF enthielt, vermischt und bei 4ºC aufbewahrt, bis das Experiment abgeschlossen war. Die Proben wurden anschließend SDS-PAGE auf 12,5%igen Polyacrylamid-Auflösungsgelen unterzogen. Das Protein wurde durch Anfärbung mit Coomassieblau-Farbstoff sichtbar gemacht und die Menge an intaktem, gefalteten Protein (am oberen Ende des Gels), intaktem, entfalteten Protein (in der Mitte des Gels) und proteolytischen Produkten (sogar noch weiter unten im Gel) wurden unter Verwendung von Laserdensitometrie quantifiziert. Für Analog [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] blieben nach 1 Std. in 2% Chlorox 45% des Proteins richtig gefaltet, während 2 Std. in Bleiche dazu führten, daß das gesamte Protein entfaltet und viel davon verdaut war. Für Analog [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²] waren nach 1 Std. in Bleiche 56% der Protease noch gefaltet und selbst nach einer 2stündigen Inkubation in 2% Chlorox bei 50ºC blieben 20% des gesamten Proteins intakt. In der Lösung mit 2% Bleiche und 1% SDS war das Verhalten beider Analoge sehr ähnlich, wobei 75% nach einer Sminütigen Inkubation noch intakt und gefaltet waren, was nach 15 Min. auf 27% noch gefaltetes Gesamtprotein sank. [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²] zeigte keine in großem Umfang gegenüber der Kombination von Denaturierungsmitteln (Bleiche und SDS) in den für diesen bestimmten Test verwendeten Konzentrationen erhöhte Stabilität, zeigte aber verstärkte Resistenz gegen Bleichedenaturierung.
    • III. Aktivität
  • Wie zuvor erwähnt, besitzt Analog [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²] eine niedrigere spezifische Aktivität gegenüber Azocasein als Analog [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;], mit einem ungefähren Vm von 0,02 dA/(min-mg/ml) gegenüber 0,08 dA/(min-mg/ml) für [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]. Um zu sehen, ob diese veringerte Aktivität für Azocasein spezifisch war oder ein allgemeines Merkmal des [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Analogs, wurden die Kinetiken der Hydrolyse des künstlichen Peptids Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-para-nitroanilid für [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²] und [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] analysiert. Analog [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] hatte eine Km von 440 µM und eine Vmax von 7,9 dA/(min-nmol); diese beiden Werte sind konsistent mit den in früheren Analysen erhaltenen. Die Km von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²] für das Substrat betrug 1,4 mM, während die Vmax 1,1 dA/(min-nmol) betrug. Dies stellt eine dreifache Abnahme in der Substrataffinität, gekoppelt mit einer siebenfachen Abnahme in der spezifischen Aktivität dar. Diese spezifische Aktivität ist 4mal niedriger als diejenige von aprA-Subtilisin. Das katalytische Ser liegt an Position 221 und es scheint, daß Substitutionen an Position 222 die Substratbindung sowie den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Proteolyse beeinflussen.
    • Beispiel 19
  • Wie zuvor in Beispiel 18 angegeben, besitzt [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²)-Subtilisin eine niedrigere spezifische Aktivität gegenüber Azocasein als [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-Subtilisin und besitzt auch eine niedrigere spezifische Aktivität gegenüber dem Substrat aus synthetischem Peptid sAAPFpN. Dieses Ergebnis ist konsistent mit dem Verlust an Aktivität im Ala²²²-Analog von BPN'-Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens, wie beobachtet von Estell et al J. Biol. Chem. 260, 6564-6570, 1986. Da Casein oder Azocasein üblicherweise von Herstellern von Waschmittelenzymen und Waschmittelformulatoren als ein Substrat verwendet wird, um die Aktivität von Proteasen zu bestimmen, wurde nicht erwartet, daß das [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin verbesserter Leistung in Waschstudien, die an verschmutzten Geweben durchgeführt wurden, zeigte.
  • Wie in diesem Beispiel veranschaulicht, lieferte das [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin-Analog das unerwartete Ergebnis konsistent verbesserter Leistung bei der Entfernung von Flekken aus verschmutzten Geweben unter verschiedenen Bedingungen. Die Bedingungen in den Figuren 9 und 10 waren wie folgt:
  • - Vollwaschbedingungen, 10minütiges Waschen
  • - Fresh Start mit Phosphat, pH ungefähr 7 Fresh Start ohne Phosphat, pH ungefähr 9
  • - 80º und 120º F Waschtemperatur
  • - 150 ppM Wasserhärte
  • - 2 Flecken, 3 Stoffproben jeweils: Blut/Milch/Tinte (BMI) auf Baumwolle Schokolade-Fudge-Pudding (CFP) auf einem Gewebe von 65% Dacron/35% Baumwolle
  • - Kontrollversuche: 1,5% Alcalse in Fresh Start
  • 1,5% Termamyl in Fresh Start
  • - Enzyme getestet bei äquivalenten Aktivitäten auf der Basis von Azocasein-Einheiten/ml für Protease und Dinitrosalicylsäure-Einheiten/ml für Amylase.
  • Die Legende für Figur 10 ist wie folgt:
  • Selbst wenn die Menge an [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin mit einem Drittel der Aktivität wie beim Kontrollversuch mit Novo Alcalase verwendet wurde, war das Analog der vorliegenden Erfindung noch überlegen in der Leistung nach Tabelle 6. TABELLE 6 Waschmaschinenbewertung von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin und Phosphat enthaltendem Fresh Start bei 100ºF
  • * Ballast bezeichnet zusätzliche verschmutzte Gewebe, die zur Waschmaschine zusätzlich zu den verschmutzten Gewebeproben zugegeben wurden.
  • Überdies werden aus praktischen Gründen viele industrielle Verfahren bei Temperaturen durchgeführt, die oberhalb des Stabilitätstemperaturbereiches der meisten Enzyme liegen Daher glaubt man, daß, oblgleich Waschmittelanwendungen hierin hervorgehoben worden sind, Subtilisin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur vorteilhaft für bestimmte Industriezweige sind, wie etwa die Waschmittelindustrie, die bereits stabile Subtilisine benötigen, sondern auch nützlich in Industriezweigen sein können, die chemische Mittel verwenden, um Proteine zu hydrolysieren, z.B. Hydrolyse von pflanzlichen und tierischen Proteinen.
  • Es ist daher beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung alle solche Modifikationen und Verbesserungen einschließt, wie sie innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung, wie sie beansprucht ist, liegen.

Claims (2)

1. Ein im wesentlichen reines [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;, Ala²²²]-Subtilisin-Analog, fakultativ mit einer zusätzlichen Substitution, die ausgewählt ist aus [Leu³¹] und [Leu¹²&sup4;].
2. Eine Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Subtilisin-Analogs nach Anspruch 1 in einer Waschmittelformulierung umfaßt.
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