KR100188532B1

KR100188532B1 - 돌연변이 섭티리신 및 그를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR100188532B1
Application number: KR1019910700067A
Authority: KR
Inventors: 마크 엠. 주코스키; 린다 오. 나르히; 마이클 레비트
Original assignee: 스티븐 엠. 오드리; 암젠 인코포레이티드
Priority date: 1989-05-17
Filing date: 1990-04-23
Publication date: 1999-06-01
Also published as: CA2016211C; CA2016211A1; WO1990014420A1; AU5558090A; KR920701426A; EP0398539A1; JPH03505976A; ATE141324T1; GR3021010T3; AU618675B2; US5397705A; DE69028040T2; EP0398539B1; DK0398539T3; SG47797A1; ES2091224T3; HK1006857A1; DE69028040D1

Abstract

본 발명은 바실루스 섭티리스(Bacillus Subtilis)에서 섭리리신 동족체를 암호화하는 변이된 유전자를 형질 발현시킴으로써 자연 발생적인 바실루스(Bacillus) 섭티리신 보다 안정성이 증진되고 세정제 조성물내의 혼합물로서 적합하도록 제조한 섭티리신 동족체에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

돌연변이 섭티리신 및 그를 함유하는 조성물

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 섭티리신을 표준 세정제 제제형에 첨가할 때 찌든 빨래의 세탁 능력이 탁월하고 증진된 산화 안정성을 가지며 열 및 pH에 대하여 안정한 새로운 섭티리신 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

특히 본 발명은 증진된 칼슘 결합 능력을 제공하도록 칼슘 결합 부위를 변형한 일군의 섭티리신 동족체 및 섭티리신에 존재하는 Asn-Gly 시퀀스 잔기를 선택적으로 삭제 및/또는 치환하고 산화 안정성을 증진시키기 위해 하나 이상의 메티오닌 잔기를 변형한 섭티리신에 관한 것이다. 또한 본 발명은 그와 같은 섭티리신을 함유하는 세정제 조성물 및 세척 응용면에 있어서의 조성물과 그러한 섭티리신의 용도에 관한 것이다.

[발명의 배경]

본 발명에서 섭티리신이란 용어는 여러 종류의 바실리(Bacilli)에 의해 제조된 일군의 세포외 알칼리성 세린 프로테아제를 명명한 것이다. 또한 이들 효소를 바실루스(Bacillus) 세린 프로테아제, 바실루스 섭티리신 또는 세균 알칼리성 프로테아제라 칭한다.

바실루스 섭티리신 분자는 274개 잔기의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되거나[바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)에 의해 생성된 섭티리신형 칼스버그 및 바실루스 섭티리스(Bacillus Subtillis 균주 DY 에 의해 생성된 섭티리신에 해당됨] 또는 275개 잔기의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된다[바실루스 아밀로리퀘페이시언스(Bacillus amyliliquefaciens)에 의하여 생성된 섭티리신형 BPN1, 바실루스 섭티리스의 aprA 유전자 생성물 및 바실루스 메센테리쿠스(Bacillus mesentericus)의 섭티리신과 바실루스 섭티리스 변종 아밀로사카리티쿠스(Bacillus subtillis var amylosacchariticus)의 섭티리신에 해당됨].

여기에서 바실루스의 다른 균주로부터 생성된 섭티리신의 아미노산 시퀀스를 비교할 때, 섭티리신 BPN¹의 시퀀스를 표준으로 사용한다.

예를들면 섭티리신 칼스버그와 섭티리신 BPN¹사이에서 가장 높은 상동성을 보이는 시퀀스의 정렬를 근거로 하여, 전자의 활성 부위에 위치한 세린은 아미노산 시퀀스의 위치 220 에 존재하더라도 세린 221 로 칭한다. 같은 근거로, 섭티리신 칼스버그의 아미노산 시퀀스의 위치 220 은 섭티리신 BPN'의 위치 221에 상응한다라고 말할 수 있다. Nedkov 등의 Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1537 - 1540 (1983)문헌을 참조하라.

섭티리신 BPN1의 X-선 구조 [Wright 등의, Nature, 221, 235 (1969)참조] 는, Asp³², His⁶⁴및 Ser²²¹과 관련된 섭티리신 촉매 부위의 기하학적 구조가 Asp¹⁰², His⁵⁷및 Ser¹⁹⁵잔기들과 관련된 포유동물의 세린 프로테아제 (예를들면, 키모트립신)의 활성 부위의 기하학적 구조와 거의 동일하다는 것을 밝혔다. 그러나 바실루스 세린 프로테아제와 포유동물의 세린 프로테아제 사이의 전체적인 상이성은 이들이 서로 관련되지 않은 두 단백질 가수분해 효소군임을 나타낸다.

바실루스 섭티리신 군에 있어서 완전한 아미노산 시퀀스는 다음의 여섯 개의 섭티리신에 유효하다 : 칼스버그 [Smith 등의 J. Biol. Chem., 243. 2184-2191 (1968)] ; BPN1 [Markland 등의 J. Biol. Chem., 242, 5189-5211 (1967)] ; aprA 유전자 생성물 [Stahl 등의 J. Bacteriol ., 158, 411-418 (1984)] ; DY [Nedkov 등의 상기문헌] ; 바실루스 메센테리쿠스 [Svendsen등의 FEBS Letters, 196, 220-232 (1086)] 및 바실루스 섭티리스 변종 아밀로사카리티쿠스[Yoshimoto 등의 J. Biochem., 103,1060 - 1065 (1988)]. 섭티리신 칼스버그 및 섭티리신 BPN¹(때로는 섭티리신 노보라 칭함) 은 위치 84의 아미노산이 다르며 BPN'이 부가적인 잔기 하나를 더 갖는다는 점에서 다르다(섭티리신 칼스버그는 섭티리신 BPN1의 잔기 56에 상응하는 아미노산 잔기가 결핍되어 있음). 섭티리신 DY는 274개 아미노산을 포함하며 32 아미노산 위치에서 섭티리신 칼스버그와 다르고, 82 아미노산이 치환되고 하나가 삭제된 점에서 섭티리신 BPN¹과 다르다 (섭티리신 DY 는 섭티리신 BPN¹의 잔기 56에 상응하는 아미노산 잔기가 결핍되어 있다). aprA 유전자 생성물의 아미노산 시퀀스는 섭티리신 BPN¹의 아미노산 시퀀스와 85% 상동이다. 따라서 바실루스의 다른 균주들로부터의 섭티리신 아미노산 시퀀스 사이에는 광범위한 상동성이 있다. 이 상동성은 분자의 특정한 부위, 특히 촉매 메카니즘에서 역할을 담당하는 부분과 기질 결합 부분에서는 완전히 일치한다. 그와 같은 시퀀스 불변성의 예로서는 첫째 및 둘째 기질 결합 부위인 Ser¹²⁵- Leu¹²⁶- Gly¹²⁷- Giy¹²⁸및 Tyr¹⁰⁴각각과 반응 세린(221) 부근의 시퀀스인 Asn²¹⁸- Gly²¹⁹- Thr²⁰- Ser²²¹- Met²²²- Ala²²³이 있다.

섭티리신 분자는 독특한 안정성을 나타낸다. 그들은 넓은 pH 범위에 걸쳐 안정하지는 않지만 요소와 구아니딘 용액에 의한 변성에는 비교적 저항성을 지니며, 8 M 요소에서도 얼마동안 그 효소 활성을 유지한다. 4 이하의 pH를 가지는 용액하에서 섭티리신은 신속히 그리고 비가역적으로 그것의 단백질 가수분해 활성을 상실한다. Gounaris 등은 Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 35, 37 (1965) 문헌에서 섭티리신의 산 불활성화는 일반적인 전하효과에 기인하는 것이 아님을 기술하였고, 분자 내부의 소수성 부분에 존재하는 히스티딘 잔기의 양성자 첨가와 같은 분자내의 다른 변화에 기인하는 것으로 추측하였다. 바실루스 섭티리신은 온도와 pH 에 크게 의존하는 속도로 수용액상에서 비가역적으로 불활성화된다. pH 4 이하 또는 11 이상에서의 불활성화 속도는 매우 빠른 반면에 pH 4.5 내지 10.5 사이에서는 훨씬 느리지만 용액이 알칼리성이 될 수록 빨라진다. 이러한 불활성화 메카니즘은 완전히 알려지지는 않았으나 자가분해가 그 pH 범위에서 효소 불안정성에 적어도 부분적으로 영향을 미친다는 것을 보여주는 증거가 된다. 일반적으로 어떤 pH에서든지 온도가 높아질수록 섭티리신의 변성 속도도 빨라진다.

단백질 가수분해가 요구되는 산업공정에 있어서 프로테아제의 사용은 공정 조건하의 효소 불안정성에 의해 제약을 받는다. 예를들어, 단백질성 균주의 제거를 촉진시키기 위해 세탁용 세정제에 트립신을 포함시킨 것은(예를들면, 스위스 쉬나이더사의 바이오-38) 세탁조건하에서 효소 불안정성의 확실한 효과에 있어서 매우 한정된 성공이었다. 더욱이 세정제와 양립할 수 있는 세균 알칼리성 프로테아제가 세정제 제제형에 사용되어 왔다.

많은 산업 공정이 대다수의 효소가 안정성을 갖는 온도 이상에서 진행되므로 내열성 프로테아제는 세정제 및 가죽 디헤어링(dehairing)과 같은 내열성 프로테아제를 요하는 특정 산업에 매우 유용할 뿐만 아니라, 비누 농축액의 제조에 있어서 식물 및 동물 단백질의 가수분해와 같은 단백질 가수분해를 위해 화학적 방법을 사용하는 산업에도 유용할 것이다.

열에 의한 불활성화가 효소를 이용하는 산업을 제한하는 가장 주요한 요인이지만, 넓은 pH 범위에 걸쳐 효과적일 필요성과 변성제 및 산화제의 이용과 같은 다른 요인들이 산업 공정상 프로테아제의 사용과 관련하여 불리한 효과를 가져올 수도 있다. 따라서 온도, pH, 변성제와 산화제 및 다방면의 산업상 요구되는 그 밖의 조건들과 관련하여 증진된 안정성을 나타내는 프로테아제를 수득하는 것이 바람직하다.

과거 수년에 걸쳐 세정제 제제형에는 중요한 변화가 있었으며, 특히 인산염을 비누혼화제로 상호 대체하고 환경적 요구 및 소비자 요구를 충족시키기 위한 액체 세탁용 세정제의 개발이 있었다.

이러한 변화로 인해 재래식 효소 세정제를 변화시킬 필요성이 생겼다.

특히, 액체 세정제 제제형에서보다 큰 저장 안정성을 가질 뿐 아니라 다양한 세정제 제제형에서 넓은 pH 및 온도 범위에서도 안정성과 활성을 갖는 단백질 가수분해 효소를 사용하는 것이 바람직하게 되었다.

세정제 제제형에 유용한 변이된 섭티리신을 제조하기 위한 한 방법으로, 미국 특허 제 4,760,025호에서 바실루스 아밀로리퀘페이시언스의 섭티리신 내의 Asp³², Asn¹⁵⁵, Tyr¹⁰⁴, Met²²², Gly^166,His⁶⁴, Giy¹⁶⁹, Phe¹⁸⁹, Ser³³, Tyr²¹⁷및/또는 Gly¹⁵⁷위치가 변이된 섭티리신 돌연변이체가 변화된 안정성, 변화된 형태를 제공하였거나, 또는 효소의 공정상변화를 갖왔음을 확인하였다. 특히, Met²²²가 Ala 또는 Ser 으로 치환된 돌연변이체는 뚜렷하게 증진된 산화 안정성을 보이지만, 합성 펩티드 기질 즉 숙시닐 - 엘 - 알라닐 - 엘 - 알라닐 - 엘 - 프로릴 - 엘 - 페닐알라닐 - 피 - 니트로아닐리드(sAAPFpN)에 대한 효소의 고유 활성도는 변이되지 않은 효소와 비교할 때 감소하였다. Gly¹⁶⁶을 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Asn, Arg 또는 Val으로 치환하는 경우에는 요소의 반응 속도론적 매개 변수를 변화시킨다고 제안되었다.

그러나 이미 발표된 돌연변이체 중 어느 것도 야생형 효소보다 고온에서의 안정성과 넓은 pH 범위에 걸쳐 안정성을 갖는 동족체를 제공하지는 못하였다.

또 하나의 방법으로서, Thomas 등은 Nature, 318, 375-376(1985) 문헌에서 섭티리신 BPN' 의 Asp⁹⁹의 Asp를 Ser 으로 변화시킴으로써 섭티리신의 pH 의존도가 변화될 수 있다고 발표하였다. 이 변화는 활성 부위로부터 14 - 15 옹스트롬의 표면 전하를 변화시키는 것을 나타낸다. 그러나 Thomas 등은 하나의 비하전된 잔기가 다른 비하전된 잔기로 대체되는 경우와 같이 표면 전하에 변화가 없을 경우의 개선에 대한 사항은 전혀 제공하지 못하였다.

세 번째 방법으로서는, 계류중인 미국 특허 출원 제 819,241호 및 제 771,883호에 기술된 프로테아제에 존재하는 Asn - Gly 시퀀스를 삭제 및/또는 변이시킴으로써 특성을 밝힌 바실루스 세린 프로테아제 동족체에 관한 것이다.

Takagi 등은 J. Biol. 초드. 263, 19592-19596 (1988)에 이소루이신 31을 루이신으로 변화시킨 것이 야생형 효소와 비교해 볼 때 섭티리신 활성도를 증가시킨다고 발표하였다.

[발명의 요약]

본 발명은 세정제 제제형 및 안정된 프로테아제를 필요로 하는 다른 공정에 특히 유용한 pH, 온도 및 산화에 대해 증진된 안정성을 가지는 일군의 섭티리신을 제공한다. 본 발명에 따른 섭티리신은 (1) 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 아미노산 시퀀스 내에 존재하는 칼슘 결합 부위의 아미노산 잔기 중 하나 또는 그 이상을 음전하 아미노산으로 치환하고, (2) 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 아미노산 시퀀스에 존재하는 Asn - Gly 시퀀스 잔기를 선택적으로 삭제하거나 치환하고 (3) 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 알라닌 또는 루이신)로 치환하고 (4) 3 개조 측매부위(Asp³², His⁶⁴, Ser²²¹)부근의 아미노산 잔기 중 하나 또는 그 이상을 다른 아미노산으로 치환함으로써 변이된 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 아미노산 시퀀스를 갖는다. 또한 본 발명은 본 발명의 섭티리신을 함유하는 세정제 조성물을 제공하며, 세척 응용면에 있어서의 섭티리신 및 그 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 섭티리신은 온도, pH 및 산화에 대하여 증진된 안정성을 나타내며, 증가된 고유 활성도 및 폭넓은 기질 특이성을 나타내므로 이와 같은 섭티리신을 함유하는 세정제 제제형의 세척력도 증진된다. 특히 본 발명의 섭티리신은 증진된 내열성, pH안정성 및 산화 안정성을 제공하며, 야생형의 섭티리신에서 발견되는 것보다 높은 고유 활성도를 나타낸다.

또한, 본 발명은 상기 섭티리신을 암호화하는 코돈을 갖는 DNA 시퀀스에 관한 것이다.

본 발명은 상기 섭티리신을 암호화하는 핵산을 갖는 숙주 세포를 포함하는 섭티리신의 제조방법도 제공한다. 상기 세포에 있어서, 섭티리신을 암호화하는 핵산은 염색체 또는 비염색체일 수 있다. 본 발명의 섭티리신을 용이하게 분리하기 위해서는 프로테아제 분비가 결핍된 균주로부터 숙주 세포를 선택하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 칼슘 결합 부위를 변이시키거나 및/또는 Asn - Gly 시퀀스의 아스파라진, 특히 표 1에 나타난 바와 같이 아미노산 위치 109 및 218에 상응하는 섭티리신 아미노산 시퀀스 위치의 아스파라진 잔기를 아스파라진 이외의 다른 아미노산으로 치환하고 표1에 나타낸 아미노산의 위치 124 및 222에 상응하는 섭티리신 아미노산 시퀀스를 메티오닌 이외의 아미노산으로 치환하며, 효소의 활성 부위 부근의 자연 발생적인 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 섭티리신의 열, pH 및 산화에 대한 안정성을 증진시키는 방법을 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 무수아스파틸 글리실을 형성하기 위하여 표1에 나타낸 바와 같이 섭티리신의 위치 218 및 219의 Asn - Gly 잔기를 고리화한 것과 염기 촉매를 사용한 가수 분해를 대략적으로 나타내고,

제2도는 aprA 유전자를 포함하는 바실루스 섭티리스 (비.섭티리스) 균주 QB127의 EcoRI - Kpnl 유전자 단편을 포함한 aprA 유전자의 부분 제한 지도이며, aprA 유전자와 측면 시퀀스의 부분 제한 지도를 포함하고,

제3도는 플라스미드 pAMB11의 부분 제한 지도이고; 제4도는 비.섭티리스 숙주 세포로부터 [Ser²¹⁸] - 섭티리신의 합성을 유도하는 플라스미드인 pAMB113 구성물의 구성 단계를 나타낸 순서도이고,

제5도는 플라스미드 pAMB30의 부분 제한 지도이고,

제6도는 pAMB106의 구성을 나타내고,

제7도는 M13mp19 aprA143의 구성을 나타내고,

제8도는 표백제에서의 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²]섭티리신의 안정성을 나타내고,

제9도 및 10도는 [ Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²]섭티리신의 세탁성능을 나타낸다.

여기에서 사용된 용어 섭티리스(subtillisin)은 분비되기 전이나 분비시 숙성한 효소로부터 분리되는 리더(leader) 시퀀스가 결핍된 효소의 분비 및 숙성한 형태를 가리킨다. 본 발명에 의해 변이될 수 있는 섭리티신은 섭티리신 칼스버그, 섭티리신 BPN¹, 바실루스 섭티리스의 aprA 유전자 생성물, 섭티리신 DY 및 바실루스 메센테리쿠스의 섭티리신 및 비. 섭티리스 변종 아밀로사카리티쿠스의 섭티리신 아미노산 시퀀스로 나타낸 자연 발생적인 섭티리신을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니다. 섭티리신 칼스버그의 아미노산 시퀀스는 Smith등의 J. Biol. Chem., 243, 2184-2191 (1968)에 기술되어 있다.

섭티리신 BPN1의 아미노산 시퀀스는 Markland 등의 J. Biol. Chem., 242, 5198-5211(1967)에 기술되어 있다. 섭티리신 DY의 아미노산 시퀀스는 Nedlov 등의 Hoppe - Seyler's Z.Physiol. Chem., 364 1537 - 1540 (1983)에 기술되어 있다. 바실루스 메센테리쿠스의 섭티리신에 대한 아미노산 시퀀스는 Svedsen 등의 FEBS Letters, 196, 220-232 (1986)에 기술되어 있다. 바실루스 섭티리스 변종 아밀 로사카리티쿠스의 섭티리신에 대한 아미노산 시퀀스는 Yoshimoto 등의 J. Biochem., 103, 1060 - 1065 (1988)에 기술되어 있다. 바실루스 섭티리스의 aprA 유전자 생성물의 아미노산 시퀀스는 Stahl 등의 J.Bacteriol ., 158, 411 - 418 (1984)에 기술되어 있다. 이와 같은 섭티리신의 아미노산 시퀀스를 모두 본 발명에 참고로 인용하였다. 이와 같은 섭티리신으로 분자를 안정하게 하는 데에 필요한 칼슘 결합 부위를 가짐을 특징으로 한다.

본 발명은 칼슘과의 결합 능력이 증가된 섭티리신을 제공한다.

칼슘은 분말 및 액체 세정제, 특히 보다 높은 온도를 요구하느느세정제 내에서 섭티리신을 안정하게 하는 데에 사용된다. 본 발명은 칼슘과의 결합 능력을 증가시키기 위하여 섭티리신 분자의 칼슘결합 부위를 변이시키는 것에 관한 것이다. 여기에서 사용하는 용어 칼슘 결합 부위의 변이란 섭티리신 아미노산 시퀀스 내에 존재하는 칼슘 결합 부위의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 음전하 아미노산으로 치환함으로써 그 결과 생성되는 섭티리신이 부가적인 음전하를 띠도록하는 것을 가리킨다. 섭티리신에 있어서 하나의 칼슘 결합 부위는 다음의 아미노산을 포함하는 것으로 밝혀졌다 : 표1에 나타난 아미노산 시퀀스와 관계가 있는 Gln², Asp⁴¹, Leu⁷⁵, Asn⁷⁶, Asn⁷⁷, Ser⁷⁸, lle⁷⁹, Gly⁸⁰, Va⁸¹, Thr²⁰⁸및 Tyr²¹⁴. 본 발명은 바람직하게는 칼슘 결합 부위에 존재하는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 음전하 아미노산으로, 예를 들면 Asp 및 Glu, 더욱 바람직하게는 Asp로 치환하는 것을 포함한다. 그러나 칼슘 결합 부위의 Asp⁴¹이 음전하 아미노산일지라도 본 발명의 형태는 Asp⁴¹을 Glu⁴¹로 치환하는 것을 주목해야 한다. 다른 방법들은 Asp⁴¹을 다른 아미노산으로 치환하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 한 바람직한 형태는 Asn⁷⁶을 Asp⁷⁶으로 치환시킨 섭티리신을 포함한다. 다른 실시형태에서는 11e⁷⁹의 Asp⁷⁹로의 치환을 포함한다. 또 다른 형태는 상기의 바람직한 칼슘 결합부위를 변이시키고 Asn¹⁰⁹및 Asn²¹⁸을 Ser¹⁰⁹및 Ser²¹⁸로 치환하는 식으로 두 개의 불안정한 Asn-Gly 시퀀스를 제거하는 것을 포함한다.

더욱 바람직한 본 발명의 형태는 칼슘 결합 부위와 Asn-GlY 시퀀스의 상기 바람직한 변이와 함께 메티오닌 222를 알라닌으로 변화시키는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 형태는 칼슘 결합 부위와 Asn-Glu 시퀀스 및 Met-222의 상기 바람직한 변이와 함께 아조카제인 기질 또는 sAAPFpN 기질에 대하여 섭티리신 특이성을 증가시키는 아미노산 변이들, 즉 메티오닌 124를 루이신 또는 알라닌으로 및/또는 이소루이신 31을 루이신으로 및/또는 세린 33을 트레오닌으로 및/또는 세린 62를 아스파라진으로 및/또는 세린 63을 글리신으로 및/또는 타이로신 217을 루이신으로 및/또는 아르기닌 247을 루이신 또는 메티오닌으로 치환하는 것을 포함한다.

상기 칼슘 결합 부위 외에도 섭티리신은 하나 또는 그 이상의 부가적인 칼슘 결합 부위를 가질 수 있다. 본 발명의 청구범위는 섭티리신에 존재할 수 있는 모든 칼슘 결합 부위 중 하나 또는 그 이상의 변이를 포함한다. 변이되는 모든 특정 섭티리신내 칼슘 결합 부위의 수는 여러 인자, 즉 섭티리신 동족체에 대해 특별히 적용되는 특이 섭티리신에 의존한다. 섭티리신에 존재할 수 있는 다른 잠정적인 칼슘 결합 부위는 다음을 포함한다. (1) Asp¹⁴⁰및 Pro¹⁷²; (2) Pro¹⁴및 Gln²⁷¹; 및 (3) Pro¹⁷²및 Glu¹⁹⁵또는 Asp¹⁹⁷. 각 분자에 존재하는 특이 칼슘 결합 부위는 변이되는 특이 섭티리신에 의존한다. 위에서 언급한 바와 같이, 상기 잠정적인 칼슘 결합 부위의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환하면 열 및 pH 대하여 증진된 안정성을 갖는 섭티리신을 제공할 것이다. 대표적인 치환에는 Asp¹⁴⁰을 Glu¹⁴⁰으로, Pro¹⁷²를 Asp¹⁷²로, Pro¹⁴를 Asp¹⁴로, Gln²⁷¹을 Glu²⁷¹로, Glu¹⁹⁷을 Asp¹⁹⁷로 치환하는 것이 있다.

섭티리신 분자의 칼슘 결합 부위를 변이시키는 것 이외에, 섭티리신에 존재하는 어떤 Asn - Gly 시퀀스를 삭제하거나 치환하는 것이 바람직하다. 상기 미국 특허 출원 제819,241호에서 바실루스 섭티리신의 위치 109 - 110과 특히 위치 218 - 219에 존재하는 보존된 시퀀스인 Asn - Gly 가 이들의 pH불안정성에 영향을 미치는 중요한 요인임을 확인하였다(제1도 참조). 불안정 요소인 Asn²¹⁸, Gly²¹⁹를 섭티리신 분자로부터 제거하기 위해서 Asn²¹⁸을 아스파라진 이외의 다른 아미노산으로 치환하거나 및/또는 Gly²¹⁹를 글리신 이외의 다른 아미노산으로 선택적으로 치환하였다. 같은 방법으로, 불안정 요소인 위치 109-110의 Asn - Gly를 변이시킴으로써 상기 출원서에 기술된 동족체에 안정성을 제공하는 것으로 기술되어 있다.

상기한 바와 같이 본 발명에 따른 바람직한 바실루스 섭티리신은 변이된 칼슘 결합 부위 이외에, 바실루스 섭티리신에 존재하는 Asn - Gly 시퀀스를 포함하는 위치는 그의 변이 섭티리신에 존재하는 Asn - Gly 시퀀스를 포함하지 않고, 특히 바실루스 섭티리신에서보다 더 적은 Asn - Gly 시퀀스를 포함함을 특징으로 하는 아미노산 시퀀스를 갖는다. 가장 바람직하게는, 표 1에 나타낸 아미노산 시퀀스의 위치 218에 상응하는 위치는 아스파라진 잔기를 포함하는 것이 아니라 그 밖의 다른 아미노산 잔기, 특히 세린, 발린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민 및 이소루이신 중에서 선택한 아미노산일 때 오히려 바람직하다. 아스파라진을 다른 특정한 아미노산으로 치환할 때 활성 부위의 형태에 간섭을 야기시킨다면(예를들면, 방향족 아미노산의 존재로 인해 야기될 수 있는 입체 장해 또는 프롤린의 존재로 야기될 수 있는 삼차구조의 변화), 그러한 아미노산으로의 치환은 대체로 바람직하지 못하다. 그밖에, 아스파라진을 다른 아미노산으로 치환함으로써 활성 부위 근처에 하전 잔기(예를들면, 아스파르트산)가 삽입된다면, 그러한 치환방법은 바람직하지 않을 수 있다. 현재 바람직한 형태는 변이한 칼슘 부위를 가지며 섭티리신의 Asn - Gly 시퀀스를 [Ser²¹⁸]를 변이시킨 섭티리신이다. 본 발명의 범위내에서 선택적인 형태의 섭티리신은 변이된 칼슘 결합 부위를 가지며 섭티리신 BPN¹의 Asn¹⁰⁹또는 aprA 유전자 생성물의 Asn¹⁰⁹가 치환된 것, 특히 세린으로 치환된 것과 위치 110 및/또는 219의 글리신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 다른 섭티리신에 있어서, 변이된 칼슘 결합 부위(들) 및 섭티리신 칼스버그 또는 DY 의 잔기 62를 Asn으로 치환하거나 잔기 63을 Gly로 치환한 섭티리신도 본 발명의 범위에 포함된다.

이미 언급한 바와 같이 본 발명에 따른 바람직한 바실루스 섭티리신은 또한 칼슘 결합 부위(들) 및 Asn - Gly 시퀀스를 변이시킨것 이외에, 섭티리신의 산화 안정성을 증진시키도록 위치 222의 Met잔기를 다른 아미노산으로, 바람직하게는 Ala로 치환한 아미노산 시퀀스를 갖는다. 본 발명의 범위 이내에서 섭티리신의 선택적인 형태는 아조카제인 및 합성 펩티드(예 : sAAPFpN) 같은 기질에 대한 효소의 고유 활성도를 증가시키도록 활성 부위 잔기들(Asp³², His⁶⁴및 Ser²²¹) 부근의 아미노산을 치환한 것이다. 그러한 변이는 특히 Met²²²가 Ala로 변이된 섭티리신에 중요한데 그 이유는 이미 언급한 바와 같이, Met²²²가 Ala로 변이된 섭티리신은 변이되지 않은 효소의 그것보다 sAAPFpN 기질에 대해 더 작은 고유 활성도를 갖는다.

Met²²²가 Ala로 치환된 모든 섭티리신의 고유 활성도는 다음과 같은 하나 또는 그 이상의 부가적인 치환을 도입함으로써 증가될 수 있다 : Met¹²⁴를 Leu으로, Met¹²⁴를 Ala로, lle³¹을 Leu으로, Ser³³을 Thr으로, Ser⁶²를 Asn으로, Ser⁶³을 Gly으로, Tyr²¹⁷을 Leu으로, Arg²⁴⁷을 Leu 또는 Met으로, 바실루스 미생물은 충분한 양의 단백질을 분비하는 그들의 능력 때문에 세정제용 프로테아제를 생산하기 위하여 널리 사용되므로, 본 발명에 따른 섭티리신 재조합체 생산을 위한 바람직한 숙주이다.

대부분의 바실리는 알칼리성과 중성의 프로테아제를 분비하기 때문에, 변이된 섭티리신이 다른 프로테아제가 없는 배지에서 비. 섭티리스에 의하여 생산되고 분비되도록 비. 섭티리스의 내생의 알칼리성과 중성의 프로테아제 유전자에 변이를 일으키는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명은 내생 프로테아제의 합성은 억제하나, 여기에 기술한 섭티리신은 합성하고 분비할 수 있는 능력을 보유하는 비. 섭티리스의 변이 균주를 제공한다.

이후로 더 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 섭티리신의 pH, 열 및 신화에 대한 안정성과 세정제 제제형에서의 안정성은 야생형의 aprA 유전자 생성물 섭티리신 및 칼스버스 섭티리신의 그것보다 상당히 큰 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 모든 섭티리신은 다음 방법으로 제조할 수 있다 ;

1) 비. 섭티리스로부터 대표적인 섭티리신 유전자 aprA를 분리하고 ;

2) 원하는 변이를 일으키도록 올리고뉴클레오티드 부위특이적 돌연변이를 사용할 수 있는 벡터상에 aprA 유전자를 클로닝시키고 ;

3) 부위특이적 돌연변이를 실시한 후 원하는 변이가 되었는지 확인하기 위하여 생성된 DNA를 시퀀싱하고 ;

4) 비. 섭티리스 내에서 변이된 효소의 합성을 유도하는 발현벡터를 구성시키고 ;

5) 섭티리신 및 중성 프로테아제를 합성하지 않는 변이된 비. 섭티리스 균주를 구성시키고 ;

6) 세포외 성장 배지에서 효소를 분리시킨 후 그것을 정제하고 ;

7) 개량된 효소를 암호화하는 유전자를 내생 프로테아제의 합성이 차단되도록 미리 변이시킨 비. 섭티리스 균주의 염색체내로 삽입시키는 과정을 실시한다.

여기에서 사용한 바와 같이, 특이 섭티리신은 치환된 아미노산을 괄호안에 나타내어 표시하였다. 예를 들면, [Ser¹⁰⁹] 섭티리신은 아미노산 위치 109에 세린을 갖는 섭티리신 분자를 가리키며, [Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] 섭티리신은 아미노산 위치 109 및 218에 세린을 갖는 섭티리신 분자를 가리킨다.

실시예 1에 있어서, 섭티리신을 암호화하는 aprA 유전자는 비. 섭티리스 게놈으로부터 분리한 것이다. 실시예 2에 있어서, aprA 유전자는 부위특이적 돌연변이가 실시된다. 실시예 3에서는, 변이된 aprA 유전자를 포함하는 발현 벡터를 구성한다. 실시예 4에서는, [Ser¹⁰⁹] 섭티리신을 생성한다. 실시예 5는 [Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] 섭티리신의 제조방법을 기술한 것이다. 실시예 6은 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] 섭티리신의 제조방법을 기술한 것이다. 실시예 7은 [AsP⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] 섭티리신의 제조방법을 기술한 것이다.

실시예 8은 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] 섭티리신의 제조방법을 기술한 것이다. 실시예 9에서는 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²]섭티리신 유전자를 부위특이적 돌연변이를 위해 박테리오파지 M13mp19에 전이시키는 것에 관하여 기술하고 있다. 실시예 10은[Leu³¹, Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸,Ala²²²] 섭티리신을 제조하는 방법을 기술한 것이다. 실시예 11은 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Leu¹²⁴, Ser²¹⁸, Ala²²²]를 섭티리신을 제조하는 방법을 기술한 것이다.

실시예 12에서는 검출이 불가능한 세포외 프로테아제를 생산하는 비. 섭티리스의 두 돌연변이 균주를 구성하는 방법을 기술한 것이다.

실시예 13은 비. 섭티리스의 염색체 내로 돌연변이된 aprA 유전자를 삽입하는 방법을 기술한 것이다. 실시예 14는 야생형 및 돌연변이체 aprA 섭티리신을 분리하고 정제하는 방법을 기술한 것이다. 실시예 15, 16, 17, 18 및 19는 안정성, 활성도 및 세척 성능을 고려한 본 발명의 섭티리신의 특징을 기술한 것이다. 본 발명의 섭티리신 이외에, 본 발명의 세정제 조성물은 다음을 포함할 수 있다:

(a) 음이온성, 비-이온성이나 양쪽성 또는 수용성 비누일 수 있는 최소한 하나 이상의 계면활성제. 대표적으로는 음이온성 계면활성제 (예를 들면, 선형 알킬 아릴 술포네이트)와 비-이온성 계면활성제(예를 들면, 알킬 페닐 폴리글리콜 에테르)를 세정제 조성물의 중량비로 각각 5 - 30 및 1-5% 혼합하여 사용한다.

(b) 바람직하게는 부수적 격리 기능(concomitant sequestering function)을 갖는 하나 또는 그 이상의 비누혼화제. 즉, 트리플 리인산나트륨, 시트르산나트륨, 규산나트륨 및 제올라이트 같은 화합물은 세정제 조성물의 중량비로 전체의 10 내지 70%를 차지한다.

(c) 전형적으로 구성물 중량비의 30%에 달하는 과붕산나트륨과 같은 과산화 화합물인 표백제.

(d) 카르복시메틸 셀룰로오스, 광학 광택제 및 향료와 같은 보조제. 필요하다면, 세탁용 배지의 pH가 7.0 내지 10.5가 되도록 pH 조절제를 첨가한다.

본 세정제 조성물은 본 발명의 섭티리신 중 하나 또는 그 이상의 유효량을 함유한다. 여기에서 사용하는 바와 같이 섭티리신의 유효량 이란 특정 세정제 조성물에서 필요로 하는 효소 활성도를 얻는 데 요구되는 섭티리신의 양을 의미한다. 이러한 유효량은 본 분야의 숙련된 기술을 갖춘 이들에 의해 쉽게 확인될 수 있고, 이는 또한 사용한 특별한 섭티리신, 세척의 응용, 세정제 조성물에 포함된 특수한 조성물, 요구되는 조성물이 액체인지 또는 분말인지 등의 요인을 근거로 하고 있다.

본 발명에 따른 특수한 섭티리신 동족체는 세정제 조성물 100g당 최소한 0.1 앤손 유닛 (이하 AU 라 함), 바람직하게는 0.5 - 2.5 AU의 효소 활성도를 제공하도록 그 양을 계산하여 첨가한다.

필요하다면 무기 충전제, 바람직하게는 황산나트륨을 첨가하여 100%로 맞춘다.

바람직하게는 비 - 수성 배지 내에서 효소 슬러리로부터 액체 세정제 조성물을 제조할 수 있다. 대표적으로, 이와 같은 슬러리는 액체 비 - 이온성 계면활성제, 예를 들면 테르지통 15 S 9 또는 이와 같은 계면활성제의 혼합물 내에 농축되어 있는 미세하게 분쇄된 섭티리신 현탁액으로 구성될 수 있다. 대개 슬러리는 미세하게 분쇄된 염화나트륨과 같은 하나 또는 그 이상의 무기 충전제 또는 훈증시킨 실리카(에어로실 200)와 같은 현탁액 안정화제와의 혼합물 중에서 하나를 포함할 것이다. 테르지톨과 에어로실은 상표명이다.

본 발명의 섭티리신은 액체 세정제 조성물 100g당 최소한 0.1 AU 이상, 바람직하게는 0.5 - 2.5 AU의 프로테아제 활성도를 제공하도록 계산된 양을 첨가한다.

세정제 조성물은 일반적인 방법, 즉 성분들을 함께 혼합하는 방법으로 제조한다. 선택적으로 예비 혼합물을 만들 후 남아 있는 성분과 다시 혼합한다. 본 발명에 따른 섭티리신은 이미 언급한 바와 같이 안정성 및 활성도가 뛰어나므로 단백질 가수분해 효소가 일반적으로 사용되는 모든 분야에 사용할 수 있다. 특히 세정제 및 청정제 또는 얼룩 제거제, 가죽 탈모제 및 단백질 가수분해제의 제조가 필요한 식품 산업 및 불완전한 항체의 검출을 위한 혈청학에 사용할 수 있다. 본 섭티리신은 특히 식품 산업과 혈청학에 유용한데, 이는 다른 효소 제조시에 비하여 수용액에서 섭티리신을 안정화하는 데에 생리학적으로 용인가능한 양의 칼슘 이온이 필요치 않은 고체 또는 용해된 상태에서 뛰어난 안정성을 갖기 때문이다.

다음 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하기 위한 것으로 본 발명을 다음의 특별한 실시예로 제한하려는 것은 아니다.

[실시예 1]

비. 섭티리스 균주 QB127 (trpC2 leuA8 SacU^h200) [Lepesant 등의, Molec. Gen. Gent., 118 135 - 160 (1982 참조]를 오하이오 콜럼부스 오하이오 주립대학의 바실루스 제네틱 스탁 센터(Genetic Stock Center)로부터 입수하였다. 이 균주는 동질유전자형 sacU+균주와 비교할 때 sacU+200 돌연변이의 다면발현 효과에 기인하여 과량의 세포외 세린 및 금속 프로테아제, α-아밀라제 및 레반수크라제를 생산한다 [ Lepesant 등의, in Schlessinger, D., ed., Microbiology, 1976, American Society Microbiology, Washington, D.C., P. 65 (1976)참조]. 따라서 균주 QB127은 섭티리신을 암호화하는 aprA 유전자를 분리하기 위한 DNA의 알맞은 재원이다.

Saito 등의 Biochem. Biophys. Acta 72, 619-629 (1963)의 방법에 따라 비. 섭티리스 균주 QB127의 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였다.

정제한 염색체 DNA 는 EcoRl 제한 엔도뉴클레아제로 완전히 절단하였다.

그 결과로 생성된 DNA 단편을 낮은 용융점을 갖는 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 해상하고 4.4 내지 8.0 킬로베이스 (kb) 범위의 단편을 분리하였다. 높은 온도에서 많은 복제 수를 나타내며 가나마이신에 내성을 보이는 대장균(E. coli)플라스미드인 pCFM936 (매릴랜드 로크빌 파크로운 드라이브 12301 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 A. T. C. C. 제 53,413호)에 이 단편들을 결합시켰다. 벡터는 EcoRl으로 절단하고, 결합시키기에 앞서 송아지 창자의 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시킨다.

결합 생성물은 대장균 C600 (매릴랜드 로크빌 파크로운 드라이브 12301 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 A. T. C. C. 제 23724호)내로 삽입시킨 후, 10㎍/ml의 가나마아신을 보충한 L-한천 상에서 밤새 배양하여 가나마이신-내성 숙주 세포를 선택하였다. 선택한 숙주 세포를 42℃에서 4시간 동안 배양하여 플라스미드 DNA를 증식시켰다.

콜로니를 니트로셀룰로오스 필터로 옮긴 후, Grunstein 등의 Proc. Natl. ACAD. Sci. (USA), 72, 3961 (1975) 의 방법에 따라 콜로니 혼성화를 실시하였다.

pCFM936 상의 섭티리신 유전자를 함유하는 콜로니를 스크린하기 위하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하였다. Beaucage 등의 Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862 (1981) 문헌에 기술된 아인산염 방법에 의하여 합성된 프로브는 다음 뉴클레오티드 시퀀스를 가졌으며

[51 GCGCAATCTGTTCCTTATGGC 3¹]

이는 aprA 유전자 생성물의 아미노-말단에 상응하는 것이다 [Wong 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1184-1188 (1984) ; Stahl등의, J. Bacteriol., 158, 411-418(1984)]. 혼성화 온도로는 55℃를 택하였고, 총 400개 중에서 양성 콜로니는 5개로 확인되었다.

양성 콜로니 중 하나로부터 얻은 플라스미드 DNA를 pCFM936 apr2로 명명하였다.

플라스미드 pCFM936 apr2를 EcoR1 만으로, Hindlll 만으로 및 EcoR1과 Hindlll를 혼합한 것으로 각각 절단하였다. 형성된 섭티리신 유전자의 Ecorl 단편의 크기는 Stahl 등의 상기문헌에 기술된 바와 같으나, 그와는 달리 기술되지 않은 몇 개의 Hindlll 부위가 발견되었다. 실시예 3에 기술한 바와 같이 Hindlll 의 두 부위를 섭티리신 유전자의 유전자 조작에 활용하였다.

비. 섭티리스 QB127 게놈 DNA의 큰 6.5 kb EcoRl 단편은 Stahl 등의 상기문헌에 보고된 결과에 따른 제한 효소 절단을 입증함으로써 aprA 유전자, 그것의 조절 시퀀스 및 비관련 측면 시퀀스를 수반한다는 것이 밝혀졌다. 이것은 Sanger 등의 J. Mol. Biol., 143, 161-178 (1980)에 기술된 디데옥시 사슬 종결 방법을 이용하여 DNA를 시퀀싱함으로써 입증되었다. 제2도에 나타난 바와 같이, 6.5 kb EcoRl 단편의 3.0 kb EcoRl 내지 Kpnl 소단편도 aprA 유전자, 그것의 조절 시퀀스 및 비관련 측면 시퀀스를 포함하는 것으로 밝혀졌다.

Kpnl-EcoRl 단편은 Stahl 등의 문헌과 제1도에 관련하여 2.5 kb의 길이를 갖는 것으로 보고되고 있으나, 제1도의 규모와 그것의 단편의 규모에 대한 기술내용을 비교하였을 때는 Stahl 등의 문헌에서도 Kpnl -EcoRl 단편이 실제로는 2.5 kb 이상으로 밝혀졌다.

바실루스 숙주 체계에 대한 클로닝 벡터인 플라스미드 pAMB11을 다음과 같이 구성하였다. 플라스미드 pTG402 (미국 일리노이 페오리아 소재 미국 농무성 노던 리저널 리서치 라보라토리스 균주 제 NRRL B - 15264호)를 Rsal 제한 엔도뉴클레아제로 부분 절단하였다.

단편들은 Hincll 로 미리 절단한 M13mp18 (미국 메릴랜드 게터스버그 소재 베데스다 리서치 라보라토리스 목록 번호 제 8227SA 호)에 결합시켰다. 결합 생성물을 Mandel 등의 J. Mol. Biol., 53, 154, (1970)의 방법에 따라 형질전환시킴으로써 E.coli JM103 (뉴 저지 피스카타웨이 소재 파마시아 인코포레이티드에서 입수할 수 있는 목록 번호 제 27-1545-01호)내로 삽입시켰다. 박테리오파지 플라크를 pTG402로부터 유도된 xylE 유전자의 기능적인 형질발현을 검출하기 위하여 0.5M 카테콜 (증류수로 제조)로 분무하였다. xylE 유전자는 카테콜 2.3-디옥시게나제를 암호화하며 다양한 유기체 내의 촉진 유전자를 검출하는 데에 유용하다[Zukowski 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80 1101-1105 (1983) 참조].

그후 xylE 유전자를 1.0 kb의 EcoRl 내지 Pstl 단편으로서 알.데돈더(프랑스 파리 소재 파스퇴르 연구소)로부터 입수한 E.coli/비. 섭티리스 플라스미드 pHV33 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 A. T. C. C. 제 39217호) [Primrose 등의, Plasmid, 6, 193-201(1981)]에 전이시켰다.

pHV33 플라스미드는 이 부위에 결합시킬 때 xylE를 포함하는 단편이 암피실린 내성 유전자를 불활성화시키도록 EcoRl 및 Pstl 으로 미리 절단하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드인 pAMB21은 E.coli 숙주 세포내에서는 기능적인 xylE 유전자를 포함하지만, 비. 섭티리스 숙주 세포내에서는 발현되는 xylE 에 대한 촉진 유전자의 첨가를 필요로 한다. pAMB21을 내포하는 E. coli 세포는 테트라사이클린(15㎍/ml)과 클로람페니콜(20 ㎍/ml)에 내성을 갖는 반면에 pAMB21을 내포하는 비. 섭티리스 세포는 클로람페니콜(5 ㎍/ml)에 대해서만 내성을 갖는다.

박테리오파지 람다의 toop 전사 종결 시퀀스를 플라스미드 pAM936 (400 염기쌍의 Pst l 내지 Bgl ll 단편)으로부터 pAMB21의 특정한 Pstl 부위로 전이시켰다. 5¹GATCTGCA 3¹시퀀스를 가진 합성 뉴클레오티드를 벡터 pAMB21의 Pst1 부위에서 toop단편의 Bhl ll말단과 결합시키기 위해 구성하였다. 그 결과 생성되는 플라스미드를 pAMB22라 명명하였으며, 그것은 전사 종결 유전자를 포함하는 것을 제외하고는 pAMB21과 동일한 특성을 가졌다. pAMB22 플라스미드는 비. 섭티리스 내에서 작용하는 강한 촉진 유전자를 검출하는 데에 유용하다.

xylE 와 toop를 포함하는 pAMB22로부터의 DNA의 1.4 kb의 EcoRl 내지 Bgl ll단편은 제한 단편들을 전기영동한 후 낮은 용융점을 갖는 아가로스 겔로부터 분리하였다. 1.4kb의 DNA를 EcoRl 및 BamHl으로 미리 절단한 플라스미드 pBD64(QKTLFFNTM 제네틱 스탁센터 번호 제1E22호로부터 입수함)에 결합시켰다. 그 결과 생성되는 5.3 kb의 플라스미드인 pAMB11은 제3도에서와 같이 toop¹가 뒤따르는 xylE 유전자의 상류에 M13mp18의 폴리링커 시퀀스 (EcoRl, Sstl, Xmal, Sma, BamHl 및 Xbal)를 포함한다. pAMB11 플라스미드는 비.섭티리스 내에서 복제가 가능하고, 숙주 세포에 클로람 페니콜(5㎍/ml) 및/또는 가나마이신(5㎍/ml)내성을 부여한다.

제4도에 나타낸 바와 같이, pAMB111을 형성하기 위하여 aprA를 포함하는 정제된 EcoRl 내지 Kpnl 단편을 pAMB11상에 클로닝하였다. 결합 생성물은 CHang 등의 Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979)에 기술된 원형질체 형질전환 방법에 따라 비. 섭티리스 Ml112 (arg-15 leuB thr5 recE4) (바실루스 제네틱 스탁 센터 번호 제 1A423호로부터 입수함)에 삽입시켰다. 플라스미드 DNA를 수반하지 않는 비. 섭티리스 Ml112는 프로테아제는 생산하지만 (Prt⁺표현형) 섭티리신 분비 수준은 오히려 낮다. 클로람페니콜-내성(Cmr)형질전환체를 1.5%(w/v)의 탈지유 및 5㎍/ml의 클로람페니콜이 보충된 L-한천 플레이트 상에 전이시킨 후 37℃에서 배양하였다.

37℃에서 약 16시간 동안 배양한 후, 플라스미드 pAMB111을 함유하는 Ml112콜로니는 각 콜로니 주변에 투명한 운륜(halo)이 생겼다. 운륜은 탈지유 배지 보충물의 카제인 성분 상에서 섭티리신이 단백질 가수분해 작용을 함으로써 생성된 것이다. pAMB11 벡터만을 내포하는 Ml112는 16시간 배양 후에도 운륜을 볼 수 없으나, 37℃로 40시간 배양한 후에는 점차 약간의 운륜이 생성되었다.

pAMB111을 수반하는 세포는 운륜의 크기에 따라 pAMB11을 수반하는 세포와 분명히 구별된다. 따라서 완전한 기능적인 형태로의 aprA 유전자의 클로닝은 비. 섭티리스에 의한 섭티리신의 생산 및 분비를 높은 수준으로 유도한다.

[실시예 2]

제4도에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 기술한 것처럼 분리한 3.0 kb의 EcoRl 내지 Kpnl 게놈 단편을 Hindll 로 절단하여 세단편을 생성시켰다:

(1) aprA 유전자의 발현을 위하여 유전자 조절 시퀀스, 즉 섭티리신을 세포 바깥으로 배출하기 위해 필요한 유전자의 프리-프로(pre-pro) 부위 및 숙성한 섭티리신의 처음 49개 아미노산을 암호화 하는 DNA 시퀀스를 수반하는 1.1 kb의 EcoRl 내지 Hindll 단편 ;

(2) 전사 종결 유전자의 시퀀스 및 31 비 - 암호화 시퀀스와 함께 섭티리신의 아미노산 50 내지 275 (카르복시-말단)를 암호화하는 DNA 시퀀스를 수반하는 1.1 kb의 Hindlll 내지 Hindlll 단편 ; 및

(3) 3¹비-암호화 시퀀스를 포함하는 0.8 kb의 Hindlll 내지 Kpnl 단편.

Hindlll 부위의 측면에 놓이는 1.1 kb 단편은 DNA 시퀀싱 및 부위 특이적 돌연변이를 위하여 박테리오파지 M13mp18의 단일 Hindlll 부위에서 클로닝시켰다. 재조합체 가운데 M13mp18 apr2로 명명된 것은 aprA 유전자의 부위특이적 돌연변이에 필요한 단일 가닥의 주형 DNA를 제공하였다.

aprA 유전자의 암호화 부위를 시퀀싱하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 리더 부위의 처음 다섯 코돈을 구체적으로 확인한 것은 aprA 유잔자에 대한 시퀀스 정보를 나타낸 Stahl 등의 상기 문헌과 Wong 등의 상기 문헌의 보고서 덕택이었으며 아미노산 위치 84 및 85에는 Stahl 등의 상기 문헌의 내용과는 다른 코돈 시퀀스가 존재한다.

구체적으로 Stahl 등은 상기 문헌에서 아미노산 위치 84가 코돈 GTT(발린을 암호화)인 것으로 보고하고 있으나, 표1에는 코돈 GTA(이 또한 발린을 암호화)로 나타나 있다. 또한 Stahl등의 상기문헌에서 아미노산 위치 85가 코돈 AGC (세린을 암호화)인 것으로 보고 한 데 비해 표1에는 코돈 GCG (알라닌을 암호화)로 나타나 있다.

박테리오파지 M13mp18 apr2는, 전사 종결 유전자 시퀀스 및 31 비-암호화 시퀀스와 함께 aprA - 섭티리신의 아미노산 50 내지 275 (카르복시 말단)를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스를 수반하는 비. 섭티리스 QB127 게놈 DNA의 1.1 kb Hindll 내지 Hindll 단편을 박테리오파지 M13mp18의 특정한 Hindll 부위 내에 삽입함으로써 구성하였다.

3비-암호화 시퀀스를 제거하기 위하여, 전사 종결 유전자 시퀀스 바로 다음에 Kpnl 제한 엔도뉴클레아제 부위를 부위특이적 돌연변이에 의하여 삽입시켰다.

부위특이적 돌연변이는 Norrander 등의 Gene, 26, 101 - 106 (1983)에 기술된 방법에 따라 실시하였다. M13mp18 apr2로부터의 단일 - 가닥 DNA는 Beaucage등의 Tetragedron Letters, 22, 1859 - 1862 (1981)에 기술된 아인산염 방법으로 합성한 프라이머,

5TCCTGAGGTACCGGCGCATTC 3

으로 어닐링시켰다. 상기 프라이머는 타민(T)이 구아닌(G)으로, 또다른 티민(T)이 아데닌(A)으로 변화되어 그 결과 이 부분에 Kpnl 부위(밑줄친 부분)가 생기게 되는 두 지점(별표로 표시)을 제외하고는 이 부위에서 상기 뉴클레오티드와 상동이다.

상기 프라이머를 65℃에서 M13mp18 apr2 DNA로 어닐링시키고 어닐링된 DNA는 약 22℃로 천천히 냉각시킨 후, 12.5μl의 어닐링된 DNA 용액. 10mM의 dATP, dGTP 각각 2.5μl, 12mM의 ATP 20μl, 0.1μl의 클레노우 DNA 중합효소, 0.1μl의 T4 DNA리가아제 및 13μl의 멸균한 증류수로 구성되는 반응 혼합물 내에서 15℃에서 2시간 동안 중합시켰다. 그 결과 생성된 이중-가닥의 공유적으로 밀폐된 원형의 DNA(covalently closed circular DNA)를 E. coli JM103내로 형질감염을 통해 삽입시켰다.

그 후 박테리오파지 플라크는 Gene Screen(미국 메사추세츠 비버리 소재 뉴 잉글랜드 뉴클레어에서 구입)혼성화 막으로 전이시켰다. 원하는 염기 변화를 수반하는 DNA를 포함하는 플라크는 상기 언급한 돌연변이 유발 프라이밍 반응에 사용된 방사성표지한(γ - 32P) 합성 올리고뉴클레오티드로 혼성화하여 확인하였다. 혼성화는 Kpn l 돌연변이체를 수반하는 DNA 만이 합성 올리고뉴클레오티드에 혼성화되도록 제한 온도인 65℃에서 실행하였다. M13mp18 apr2 kpn l이라 명명한 정제된 단일 플라크로부터의 DNA 상의 aprA 유전자 하류에 Kpn l 돌연변이체가 존재한다는 것은 Sanger 등의 상기문헌에 기술된 방법과 제한 효소 분석에 의한 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.

3비-암호화 부위의 대부분을 수반하는 1.1 kb단편은 M13mp18 apr2 Kpn l을 Kpn l 으로 절단하고, 그 절단 생성물을 500ng DNA/ml 에서 재결합시킨 후 형질감염을 통해 결합 생성물을 E. coli JM103 내로 삽입함으로써 제거하였다. 원하는 0.35kb를 삭제시킨 DNA를 포함하는 박테리오파지 플라크는 제한 엔도뉴클레아제 분석으로 확인하였다. 이와 같은 하나의 플라크로부터의 박테리오파지를 M13mp18 apr4로 명명하였다(제7도 참조). M13mp18 apr4는 이하에 기술하는 aprA 유전자의 부위특이적 돌연변이를 위한 단일 - 가닥의 주형 DNA를 제공하였다.

[실시예 3]

비. 섭티리스 내에서 돌연변이된 섭티리신 유전자를 발현시키기 위하여, 돌연변이 유전자에 대한 운반체로 플라스미드 pAMB106을 다음과 같이 구성하였다 :

1) pAMB 111을 Hindlll로 절단하였다. aprA유전자의 대부분을 수반하는 1.1 kb 단편을 약 1㎍/ml의 농도에서 pAMB111의 Hind lll 절단 생성물을 재결합시킴으로써 제거하였다. 이것은 제4도에 나타난 바와 같이 pAMB110의 생성을 초래하였다. pAMB110 플라스미드는 섭티리신 유전자의 발현을 위한 유전자 조절 시퀀스, 즉 섭티리신의 분비에 필요한 프리-프로 부위, 숙성한 섭티리신의 3비-암호화 부위를 암호화하는 DNA 시퀀스 및 숙성한 섭티리신의 처음 49개 아미노산을 암호화하는 DNA 시퀀스를 수반한다.

2) 플라스미드 pAMB110을 연합된 상태의 BamH l 및 Pst l으로 절단하였다. 이 과정은 6.2 kb 및 1.0 kb의 두 크기가 DNA단편을 생산한다. 1.0 kb의 단편은 슈도모나스 푸티다 mt - 2(Zukowski 등의, 상기문헌 참조)의 TOL 플라스미드로부터 카테콜 2, 3 - 디옥시게나제를 암호화하는 xylE 유전자를 수반한다.

3) 보다 큰 6.2 kb의 BmaHl - Pst l 단편은 Beaucage등의 상기 문헌에 기술된 아인산염 방법과 T4 DNA 리가아제에 의하여 합성한 단일 - 가닥 합성 올리고뉴클레오티드, 5GATCTGCA 3의 보조로 자기 결합(self-ligation)시켰다. 결합 생성물은 change 등의 Mol. Gen. Genet. 168, 111 - 115 (1979) 의 원형질체 형질전환 방법으로 비. 섭티리스 Ml 112 (arg-15 leuB thr5 recE4) (바실루스 제네틱 스탁 센터 번호 제 1A423 호로부터 입수함)내로 삽입하였다.

클로람페니콜 - 내성 (Cmr) 콜로니를 플라스미드 성분에 대하여 스크린하였다. 6.2 kb의 플라스미드 pAMB106은 제한 엔도뉴클레아제 분석으로 확인하였다. 그것은 xylE가 삭제된 것을 제외하고는 플라스미드 pAMB110과 동일하였다(제6도 참조).

aprA 섭티리신의 아미노산 50 내지 275를 암호화하는 DNA가 결핍되어 있으므로 pAMB106은 비. 섭티리스 숙주 세포내로 삽입될 때 섭티리신을 합성하지 않는다. 섭티리신은 단지 섭티리신 유전자의 잔류물, 즉 본래의 DNA 시퀀스 또는 섭티리신을 암호화하는 시퀀스를 삽입한 후에만 합성된다.

[실시예 4]

[세린] 섭티리신의 제조방법

박테리오파지 M13mp18 apr4로부터의 단일-가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 기술된 아인산염 방법으로 합성된 아래와 같은 프라이머로 어닐링하였다 :

이 프라이머는 하나의 염기 변화(별표로 표시), 즉 A가 G로 변화되어 그 결과 Asn¹⁰⁹(코돈 AAC)가 Ser¹⁰⁹(코돈 AGC)로 변화되는 것을 제외하고는 aprA-섭티리신의 아미노산 106 내지 113에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동이다.

이 프라이머를 65℃에서 M13mp18 apr4 DNA로 어닐링시킨 후 어닐링된 DNA를 22℃까지 천천히 냉각시키고 실시예 2에 기술한 바와 같이 중합, 결합 및 형질감염시켰다.

박테리오파지 플라크를 혼성화 막으로 전이시킨 후 바람직한 염기 변화를 수반하는 DNA를 포함하는 플라크를 상기 돌연변이 유발 프라이밍 반응에 사용된 방사성표지한 (α -³²p) 올리고뉴클레오티드에 혼성화하여 확인하였다. 혼성화는 65℃에서 실시하였다.

한 양성 플라크는 M13mp18 apr 4[ser¹⁰⁹]로 명명되는 박테리오파지를 포함하였다. 이 박테리오파지로부터의 이중 - 가닥 DNA를 연합된 상태의 Hindlll 및 Kpn l 으로 절단한 후, aprT - 섭티리신 유전자의 돌연변이 부분을 수반하는 750 bp 단편을 Hindlll 및 Jpnl 으로 미리 절단한 pAMB106에 결합시켰다. 결과적으로 생성된 플라스미드, pAMB129는 [Ser¹⁰⁹] - 섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 적합한 비. 섭티리스 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다.

[실시예 5]

[세린¹⁰⁹, 세린²¹⁸] 섭티리신의 제조방법

M13mp18 apr4 [Ser¹⁰⁹]로부터의 단일 - 가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 기술된 아인산염 방법으로 합성된 아래의 프라이머로 어닐링하였다 :

이 프라이머는 하나의 염기 변화(별표로 표시), 즉 A가 G로 변화됨으로써 Asn²¹⁸(코돈AAC) 이 Ser²¹⁸(코돈 AGC)로 변화되는 것을 제외하고는 aprA - 섭티리신의 아미노산 215 내지 220에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동이다. 어닐링, 중합, 결합, 형질감염 및 양성 플라크의 확인을 위한 조건은 모두 실시예 2에 기술한 바와 같다. 박테리오파지를 포함하는 정제된 단일 플라크를 M13mp18 apr4 [Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]로 명명하였다. 이 박테리오파지로부터의 이중 - 가닥 DNA를 연합된 상태의 Hindlll 및 Kpnl으로 절단한 후, 두 돌연변이체를 수반하는 750 bp 단편을 Hindll 및 Kpnl 으로 미리 절단한 pAMB106에 결합시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드인 pAMB130은 [Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] - 섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 비.섭티리스 숙주 세포에 삽입시킬 수 있다.

[실시예 6]

[Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] 섭티리신의 제조방법

M13mp18 apr4 [Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]로부터의 단일 - 가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 기술된 아인산염 방법으로 합성된 아래의 프라이머로 어닐링하였다 :

이 프라이머는 하나의 염기 변화(별표로 표시), 즉 A가 G로 변화됨으로써 Asn⁷⁶(코돈AAC)가 Asp⁷⁶(코돈 GAT)로 변화되는 것을 제외하고는 aprA - 섭티리신의 아미노산 74 내지 79에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동이다.

상기 프라이머를 65℃에서 M13mp18 [Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] DNA로 어닐링시킨 후, 어닐링된 DNA를 약 22℃로 천천히 냉각시켜 실시예 2에 기술한 바와 같이 중합, 결합 및 형질감염시킨다.

박테리오파지 플라크를 혼성화 막으로 전이시킨 후 원하는 염기 변화를 수반하는 DNA를 포함하는 플라크를 46℃에서 혼성화하는 것을 제외하고는 실시예2에 기술한 방법과 동일하게 혼성화하여 확인하였다. 한 양성 플라크는 M13mp18 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]로 명명되는 박테리오파지를 포함하였다. 박테리오파지로부터의 이중 - 가닥 DNA를 연합 상태의 Hindlll 및 Kpnl 으로 미리 절단한 후 aprA - 섭티리신 유전자의 세 돌연변이체를 수반하는 750bp 단편을 Hindlll 및 Kpnl 으로 미리 절단한 pAMB106 에 결합시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드인 pAMB131은 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] - 섭티리신을 합성하고 분비하도록 비. 섭티리신 숙주 세포에 삽입시킬 수 있다.

[실시예 7]

[Asp⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]섭티리신의 제조방법

M13mp18 apr4 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]로부터의 단일 - 가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 기술된 아인산염 방법에 의하여 합성된 아래의 프라이머로 어닐링하였다 :

이 프라이머는 세염기의 변화 (별표로 표시)위치에서 Ark G로, T가 A로, C 가 A로 변화됨으로써 lle⁷⁹(코돈 ATC)가 Glu⁷⁹(코돈 GAA)로 변화되는 것을 제외하고는 [Asp⁷⁶, Ser^109,Ser²¹⁸] - 섭티리신의 아미노산 76 내지 82에 대한 전체 코돈, 아미노산 76 내지 75 및 83에 대한 전체 코돈과 아미노산 75 및 83에 대한 부분 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동이다.

상기 프라이머를 65℃에서 M13mp18 apr4 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] DNA로 어닐링시킨 후 어닐링된 DNA를 약 22℃로 천천히 냉각시켜 실시예 2에 기술한 바와 같이 중합, 결합 및 형질감염시켰다.

박테리오파지 플라크를 혼성화 막으로 전이시키고, 원하는 염기 변화를 수반하는 것을 45℃에서의 혼성화를 제외하고는 실시예 2의 방법에 따라 혼성화함으로써 확인하였다. 박테리오파지를 포함하는 한 양성 플라크를 M13mp18 apr4 [Asp⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]로 명명하였다. 이 박테리오파지로부터의 이중 - 가닥 DNA를 연합된 형태의 Hindlll 및 Kpnl으로 절단한 후 aprA - 섭티리신 유전자의 네 돌연변이체를 수반하는 750bp 단편을 미리 Hindlll 및 Kpnl으로 절단한 후 pAMB106에 결합시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드인 pAMB133을 [Asp⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser²¹⁸] - 섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 비. 섭티리스 숙주 세포에 삽입시킬 수 있다.

[실시예 8]

[Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²,] 섭티리신의 제조방법

상기 프라이머는 별표한 두 염기 변화 위치에서 아데닌(A)은 구아닌(G)으로, 타민(T)은 시토신(C)으로 변화됨으로써 Met²²²(코돈 ATG)가 Ala²²²(코돈 GCG)로 변화되는 것을 제외하고는 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] - 섭티리신의 아미노산 219 내지 224에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동이다.

상기 프라이머를 65℃에서 M13mp18 apr4 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] DNA로 어닐링시킨 후 어닐링된 DNA를 약 22℃로 천천히 냉각시키고 실시예 2에서와 같이 중합, 결합 및 형질감염시켰다.

박테리오파지 플라크를 혼성화 막으로 전이시키고 58℃에서의 혼성화를 제외하고는 실시예 2에서와 같은 방법으로 혼성화하여 원하는 염기 변화를 포함한 것을 확인하였다. 한 양성 플라크는 M13mp18 apr4 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²]로 명명되는 박테리오파지를 함유하였다. 이 박테리오파지로부터의 이중 - 가닥 DNA를 연합 형태의 Hindlll 및 Kpnl으로 절단하고 aprA - 섭티리신 유전자의 네 돌연변이체를 수반하는 750bp 단편을 미리 Hindlll 및 Kpnl으로 절단한 pAMB106에 결합시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드인 pAMB143은 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] - 섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 비실루스 숙주 세포에 삽입시키고 증식시킬 수 있다.

[실시예 9]

[ M13mp19 apr143의 제조방법]

플라스미드 pAMB143을 연합 형태의 EcoRl 및 Kpnl으로 절단하였다. [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] 섭티리신의 전체 유전자를 수반하는 1.8Kb의 DNA 단편은 전사와 번역의 개시 및 전사와 번역의 종결을 위해 필요한 그의 측면 시퀀스와 함께 EcoRl 및 Kpnl으로 절단한 박테리오파지 M13mp19(미국 매릴랜드 게터스버그 소재 베데스다리서치 라보라토리스 목록 제 8229SA 호를 이용할 수 있음)로 전이시켰다. 이러한 과정으로 얻어진 하나의 재조합 박테리오파지 DNA를 M13mp19 aprA143으로 명명하고, [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] - 섭티리신 유전자의 부위특이적 돌연변이를 위해 요구되는 단일 - 가닥의 주형 DNA를 제공하였다.

[실시예 10]

[Leu³¹, Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] 섭티리신의 제조방법

M13mp19 apr143으로부터의 단일 - 가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 기술된 아인산염 방법에 의하여 합성된 아래의 프라이머로 어닐링하였다 :

상기 프라이머는 별표로 표시된 두 개의 염기 변화, 즉 아데닌(A)은 티민(T)으로, 시토신(C)은 아데닌(A)으로 변화됨으로써 lle³¹(코돈 ATC)이 Leu³¹(코돈 TTA)로 변화되는 것을 제외하고는 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸,Ala²²²] - 섭티리신의 아미노산 28 내지 34에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동이다. 이 프라이머를 65℃에서 M13mp19 apr143 DNAFH 어닐링시키고, 어닐링된 DNA는 약 22℃로 천천히 냉각시켜서 실시예 2의 방법대로 중합, 결합 및 형질감염시켰다.

박테리오파지 플라크를 혼성화 막에 전이시키고 원하는 염기 변화를 함유한 플라크를 57℃에서 수행하는 혼성화를 제외하고는 실시예 2에서 기술한 대로 혼성화하여 확인하였다. 한 양성 플라크는 M13mp19 aprA144로 명명한 박테리아 파지를 함유하고, [Leu³¹, Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] - 섭티리신을 암호화하는 DNA를 수반한다. 이 박테리오파지로부터의 이중 - 가닥 DNA를 연합 형태의 EcoRl 및 Kpnl으로 절단한 후 aprA - 섭티리신 유전자의 다섯가지 돌연변이체를 수반하는 1.8 Kb의 DNA단편을 EcoRl 및 Kpnl으로 미리 절단한 pAMB106에 결합시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드인 pAMB144은 [Leu³¹, Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] - 섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 바실루스 숙주 세포에 삽입시키고 증식시킬 수 있다.

[실시예 11]

[ Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Leu¹²⁴, Ser²¹⁸, Ala²²²] - 섭티리신의 제조방법

M13mp19 apr143으로부터의 단일 - 가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 기술된 아인산염 방법에 의해 합성된 다음의 프라이머로 어닐링하였다 :

상기 프라이머는 별표로 표시된 두 개의 염기 변화, 즉 아데닌(A)은 티민(T)으로, 구아닌(G)은 아데닌(A)으로 변화되어 Met¹²⁴(코돈 ATG)가 Leu¹²⁴(코돈 TTA)로 변화되는 것을 제외하고는 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] - 섭티리신의 아미노산 121 내지 126의 전체 코돈 및 아미노산 120 내지 127의 부분 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동이다. 상기 프라이머를 65℃에서 M13mp19 apr143 DNA로 어닐링시키고, 어닐링된 DNA는 약 22℃로 천천히 냉각시켜서 실시예 2의 방법대로 중합, 결합 및 형질감염시켰다.

박테리오파지 플라크를 혼성화 막에 전이시키고 원하는 염기 변화를 함유한 플라크를 59℃에서 수행하는 혼성화를 제외하고는 실시예 2에서 기술한 대로 혼성화하여 확인하였다. 한 양성 플라크는 M13mp19 aprA145로 명명한 박테리오 파지를 함유하고, [Asp^76,Ser¹⁰⁹, Leu³¹, Ser²¹⁸, Ala²²²] - 섭티리신을 암호화하는 DNA를 운반한다. 이 박테리오파지로부터이중 - 가닥 DNA를 연합 형태의 EcoRl 및 Kpnl으로 절단한 후 aprA - 섭티리신 유전자의 다섯가지 돌연변이체를 운반하는 1.8 Kb의 DNA단편을 EcoRl 및 Kpnl으로 절단한 pAMB106에 결합시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드인 pAMB145는 [Asp⁷⁶,Ser¹⁰⁹, Leu¹²⁴, Ser²¹⁸, Ala²²²] - 섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 바실루스 숙주 세포에 삽입시키고 증식시킬 수 있다.

[실시예 12]

대부분의 바실리는 주변의 성장 배지로 알칼리성 및/또는 중성의 프로테아제를 분비하기 때문에 돌연변이 세포 내로 삽입할때는 돌연변이된 섭티리신 유전자가 주변의 섭티리신 동족체의 분리를 방해할 만한 다른 프로테아제가 없는 배지에 분비할 돌연변이된 섭티리신을 생산할 수 있도록 그들의 합성을 차단하기 위해 비. 섭티리스의 내생의 알칼리성 및 중성 프로테아제 유전자내로 돌연변이체를 삽입시키는 것이 바람직하다. 검출할 수 없을 정도의 세포외 프로테아제를 생산하는 두 개의 돌연변이체인 비. 섭티리스 균주BZ24 및 BZ25를 다음과 같은 방법으로 구성하였다.

첫째, E. coil 에서는 복제가 가능하나, 상동적 재조합에 의하여 비. 섭티리스 염색체 내로 도입되지 않는 한 비. 섭티리스에서는 복제가 불가능한 플라스미드 운반체를 다음과 같이 구성하였다.

플라스미드 pBD64(바실루스 제네틱 스탁 센터 번호 제 1E22 호)를 Hpall로 완전하게 절단하여 2.95 kb, 1.0 kb 및 0.75 kb 크기의 세단편을 제조하였다. 그 후 Clal으로 미리 절단한 플라스미드 pBR322(A. T. C. C. 제 37017호)에 이들 단편의 혼합물을 결합시켰다.

이 결합 생성물을 형질전환에 의하여 E. coli C600 (아메리칸 타입 컬쳐콜렉션 A. T. C. C. 제 23724호로부터 입수함) 내로 삽입시켰다 [Mandel 등의, J. Mol. Biol., 53, 154 (1970)]. 클로람페니콜(20μg/ml) 및 암피실린(50 μg/ml )에 내성을 갖는 세포를 선택하였다.

12개의 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 Birnboim 등의 Nucleic Acids Res., 7, 1513 - 1523 (1979)에 기술된 알칼리성 추출 방법으로 제조한 후 삽입된 단편의 존재를 확인하기 위하여 연합 형태의 Hindlll 및 Ecorl 으로 절단하였다. 이와 같이 pAMB30 이라 명명한 플라스미드는 pBR322의 Clal QDNL에서 pBD64의 1.0 및 0.75 kb Hpall 단편을 수반하는 것으로 밝혀졌다. 이들 단편은 E. coli 및 비. 섭티리스에서 기능성인 클로람페니콜 아세틸 전이효소(cat) 유전자를 포함한다. Bglll 및 Sau3A로 각각 절단하여 제5도에 나타나는 바와 같이 pAMB30 상의 cat 유전자의 동일성과 위치를 확인하였다.

pAMB30은 비. 섭티리스에서 기능성인 복제 시퀀스의 기원이 결핍되어 있으므로 비. 섭티리스 숙주 세포에서 자가복제자로서의 복제는 불가능하다. 반면, pAMB30은 E. coil 내에서 기능성인 복제의 pBR322에서 파생된 기원을 포함하므로 이 플라스미드는 E. coil 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 플라스미드 pAMB30은 적어도 두가지 방법으로 유용하게 사용될 수 있다. 첫째, 비. 섭티리스 내에서의 기능성 복제 기원을 포함하는 DNA 단편은 pAMB30 상에서 클로닝할 경우 플라스미드가 비염색체적 상태에서 자체적으로 복제되어 검출될 수 있다. 둘째, 플라스미드 pAMB30은 pAMB30으로 클로닝되는 염색체와 비. 섭티리스 DNA간의 상동 부분에서 비. 섭티리스의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 이것은 pAMB30과 유사하지만 동일하지는 않은 플라스미드 운반체를 사용하는 Haldenwang 등의 J. Bacteriol., 142, 90 - 98(1980) 및 Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1497 - 1512(1983) 문헌에 의하여 입증되었다.

플라스미드 pAMB21(실시예 1에 기술함)을 EcoRl 및 Pstl으로 절단하여 1.0 kb 단편의 xylE 유전자를 분리하였다. 이 단편을 EcoRl 및 Pstl 으로 미리 절단한 pAMB30에 결합시켰다. 결합 생성물은 E. COIL C600 내로 삽입하여 형질전환시켰다.

pAMB30의 암피실린 내성을 갖는 구조 유전자 내로 pAMB21의 xylE단편을 삽입시킴으로써 암피실린 (50μg/ml)에 민감한 클로람페니콜 내성(20μg/ml) 숙주 세포를 선택하였다. 그 결과 생성된 플라스미드인 pAMB30/21은 pAMB30과 동일한 특성을 가지지만 그 외에도 기능성인 xy1E 유전자를 갖게 된다.

숙성한 섭티리신의 후반부 226개의 아미노산을 암호화하는 부위가 삭제된 aprA 유전자를 수반하는 플라스미드 pAMB110을 EcoRl 및 Kpnl 으로 절단하였다. aprA 유전자의 발현을 위한 유전자 조절 시퀀스인 프리-프리 부위, 숙성한 섭티리신의 처음 49개의 아미노산을 암호화하는 DNA 시퀀스 및 3¹비 - 암호화 시퀀스를 포함하는 비. 섭티리스 DNA의 1.9 kb 단편을 EcoRl 및 Kpnl 으로 미리 절단한 pAMB30/21에 결합시켰다. 결합 생성물을 E. coli C600 내로 삽입하여 형질전화시켰다. 몇몇 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 Birnboim 등의 상기문헌에 따른 알칼리성 추출 방법으로 분리시킨 후 다중 제한 엔도뉴클레아제로 절단함으로써 삽입된 1.9 kb 단편의 존재를 입증하였다. 이러한 플라스미드를 pAMB301 이라 명명하고 이후에 사용하기 위하여 보관하였다.

비. 섭티리스 균주 BGSC1A274(바실루스 제네틱 스탁 센터)는 npr 위치에서 돌연변이를 수반하며, 세포외 중성 프로테아제는 생산하지 못한다. 플라스미드 pAMB301은 비. 섭티리스 BGSC1A274의 게놈에 삽입하여 감응 세포를 형질전환시켰다. [Spizizen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 44, 1072 - 1078 (1958)]. 1.5% (w/v)의 분말 탈지유와 5μg/ml)의 클로람페니콜로 보출한 L - 한천에 전이시킬 클로람페니콜 - 내성(5㎍/ml)숙주 세포를 멸균한 이쑤시개로 선택하였다.

콜로니 주변의 투명한 운륜을 생산하지 못한 세포들은 새롭게 삽입된 aprA 돌연변이와 npr 돌연변이로 인해 세포외 중성 및 세린 프로테아제를 생산하는 능력이 결핍되어 있다. 야생형 aprA 유전자를 pAMB301 상에 수반된 삭제 변형 헝태로 치환함으로써 aprA 돌연변이체는 숙성한 섭티리신의 후반부 226 개의 아미노산이 삭제된 것이다.

BZ24로 명명된 이러한 균주는 Npr^-Apr^-Cmr 표현형을 가지므로 검출 가능한 세포외 중성 프로테아제는 물론 세포외 알칼리성 프로테아제도 생산할 수 없으며 5μg/ml의 클로람페니콜에 대해서는 내성을 갖는다. 비 섭티리스 BZ24의 염색체상의 aprA 유전자 내에서의 삭제를 확인하기 위하여 서던 블로팅법[Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975)]을 사용하였다. 약 32세대에 대해 항생물질을 선택함이 없이 항생물질 배지 제3호(미국 미시간 디트로이트 소재 딥코에서 입수한 펜어세이 용액)내에서 비. 섭티리스 BZ24를 배양하여 숙주 세포상에서 클로람페니콜 내성을 제공하는 cat 유전자가 BZ24염색체에서 그것의 불안정성에 기인하여 상실된 BZ24 같은 유도체 균주를 분리해 내었다. 이러한 현상은 Stahl 등의 J. Bacteriol., 158, 411-418(1984)에서 이미 관찰된 바 있다. 클로람페니콜에 민감한 BZ24의 유도체를 BZ25라 명명하였다. 비. 섭티리스BZ25는 Npr^-Apr^-표현형을 가지며, 검출가능한 세포외 중성 프로테아제는 물론 세포외 알칼리성 프로테아제도 생산하지 않는다.

비. 섭티리스 BZ25의 염색체상의 aprA 유전자의 삭제를 확인하기 위하여 서던 블로팅법을 사용하였다.

비. 섭티리스 BZ25는 검출가능한 세포외 중성 프로테아제는 물론 섭티리신도 생산할 수 없으므로 다른 프로테아제가 없는 주위의 성장 배지로 분비될 수 있는 변이된 섭티리신을 생산하기 위하여 pAMB113과 같은 플라스미드 DNA를 삽입하는 데 있어서 상기 비. 섭티리스 BZ25는 유용한 숙주 균주이다.

배양 상청액을 하기한 바와 같이 분석하여 보면, 비. 섭티리스 BZ25는 검출가능한 세포외 프로테아제를 생산하지 않는다. 플라스미드 pAMB113을 내포하는 BZ25 인 비. 섭티리스 BZ25/pAMB113(Chang 등의 상기문헌의 원형질체 형질전환 방법에 의해 삽입됨)은 상기와 같이 배양 상청액을 분석할 때 감지할 수 있을 정도의 [Ser218] - 섭티리신을 생산한다.

[실시예 13]

비. 섭티리스의 염색체 내로[Ser²¹⁸]- 섭티리신 유전자를 도입하는 것은 이러한 돌연변이 유전자의 유전적 안정성을 증가시키는 효율적인 방법을 제공한다고 믿어왔다. 이 방법은 또한 비염색체적 상태로 플라스미드 DNA를 유지하기 위하여 선택적인 압력을 적용하는 데 필요한 발효 배지내의 클로람페니콜의 필요를 경감시킨다. 따라서, 유전자 조절 시퀀스 및 비. 섭티리스 염색체와 상동인 측면 DNA를 수반하는 [Ser²¹⁸] -섭티리신 유전자를 혼합 상태의 EcoRl 및 Pstl으로 절단한 pAMB113을 전기영동한 후 낮은 용융점을 갖는 아가로스겔로부터 분리하였다. 4.0kb의 EcoRl 내지 Pstl 단편(제4도에 나타나 있음)을 연합 상태의 EcoRl 및 Pstl으로 절단한 pAMB30(제5도에 나타나 있음)에 결합시켰다. 결합 생성물을 E. coil HM101(A.T.C.C. 제 33694호)내로 삽입하여 형질전환시켰다.

클로람페니콜(20 ㎍/ml)에 내성을 갖는 세포를 선택하였다. 상기 표준에 일치하는 네가지 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 Birnboim 등의 상기 문헌에 따른 알칼리성 추출 방법으로 분리한 후 연합 상태의 EcoRl 및 Pstl으로 절단하였다. 네 가지의 모든 플라스미드는 pAMB30의 4.0 kb 삽입분 및 5.6 kb 잔여분을 포함하였다. pAMB302 라 명명된 이 플라스미드는 다음의 사용을 위하여 정제하여 보관하였다.

수용 능력 실험법(competence method)[Spizizen 등의, 상기 문헌 참조]을 사용하여 비. 섭티리스 BZ25의 염색체 내로 플라스미드 pAMB302를 삽입시키려는 반복된 시도의 결과는 성공적이지 못하였다.

이것은 사용한 방법이 BZ25 세포에 적합하지 않았기 때문이다. 따라서 pAMB302를 Chang 등의 상기 문헌에 따른 원형질체 형질전환 방법으로 비. 섭티리스 BZ25 세포 내로 삽입시켰다. 그 결과는 삽입된 연구 균주를 수용 능력 실험법에 의한 형질전환을 기초로 하여 선택한다는 점에서 특히 중요하다. 적합하지 않은 균주, 특히 수용 능력 실험법에 의한 형질전환을 기초로 하여 선택되지 않은 산업상의 균주는 더욱 적합하지 않을 듯하다.

클로람페니콜(5㎍/ml)에 내성인 세포들을 선택한 후 1.5(w/v)의 탈지유와 5㎍/ml의 클로람페니콜로 보충한 L-한천에 멸균한 이쑤시게로 전이시켰다. 세포는 37℃에서 밤새도록 배양하였다.

상이한 직경을 갖는 투명한 운륜이 Cm^r콜로니 주위에서 관찰되었다.

이는 섭티리신이 이들 세포에 의하여 생산되고 분비됨을 나타내는 것이다. 알칼리성 추출 방법으로 여덟 개의 이들 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 방법을 시도하였다. 전기영동후 DNA를 가시화하기 위하여 에티디움 브로마이드(1㎍/ml)로 착색한 아가로스 겔상에 플라스미드 DNA가 검출되지 않는다. 섭티리신을 생산한 Cm^r세포내의 비염색체적 플라스미드 DNA의 부재는 pAMB302가 비. 섭티리스의 염색체에 도입되었음을 강력히 시사하는 것이었다.

이 실험의 결과 생성된 몇몇 콜로니를 분리한 후 각각 BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 및 BZ33으로 명명하였다. 각 균주는 5㎍/ml)의 클로람페니콜을 보충한 뇌 심장 주입 배지(딥코에서 구입한 BHl 배지)에서 격렬히 진동시키며 37℃에서 밤새도록 배양하였다.

섭티리신 활성도를 분석하기 위하여 배양 상청액을 분석하였다.

비. 섭티리스 균주 BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 및 BZ33은 모두 섭티리신을 생산하여 주위의 성장 배지에 분비하였고 몇몇 균주는 다른 균주보다 더욱 많이 생산하였다. 액체 배양액내에서 관찰되는 섭티리신의 양은 탈지유를 함유한 L-한천 플레이트 상에서 관찰되는 운륜의 크기에 정비례하였다. 이들 세포에 의하여 분비되는 섭티리신의 양이 다르므로, pAMB302의 다수 복제물이 염색체 내로 통합되거나, 유전자 증폭[Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983) ; Albertini 등의, J. Bacteriol., 162, 1203-1211(1985) 참조]이 발생하였다.

[실시예 14]

야생형 섭티리신 및 돌연변이 섭티리신을 다음과 같이 분리하고 정제하였다. 각 배양액을 15,000g로 30분간 원심분리한 후, 맑은 상청액 속의 단백질을 (NH4)₂SO₄(600 g/l)로 침전시켰다.

원심분리를 통해 침전물을 모은 후 pH6.4의 20mM 2[N-모포리노]에 탄술폰산(MES)에 녹였다.30% 아세톤 용액을 제조하고, 30% 아세톤 상청액을 언심분리하여 모았다. 75% 아세톤 상청액을 제조하고, 30 - 75% 아세톤 펠릿을 여과하여 진공하에서 건조하였다.

효소를 더 정제하기 위하여 건조된 침전물을 물에 용해시킨 후, 이 용액을 pH 6.4의 5mM MES 완충용액에 대하여 투석하였다.

투석된 용액은 1분당 2ml의 속도로 S-세파로스 FF 컬럼(2.5 × 15cm)에 통과시켰다. 컬럼을 0.02M의 MES로 세척한 후, 동일 완충용액에 녹아있는 NaCl을 0.5 M NaCl 까지 선형 구배적으로 효소를 용리하였다. 피크 분획의 풀을 제조하고, 아조카제인과 혼합된 분획 시료의 색변화를 확인함으로써 효소를 포함한 분획으로부터 단백질을 4℃에서 pH6.3의 5mM MES에 대하여 투석하고 동결건조시켰다.

[실시예 15]

순수한 섭티리신을 파마시아 FPLC 수퍼로스 12컬럼에 적용하고, 본래의(분리되지 않는) 단백질로서 용리되는 물질을 pH 6.4의 20mM MES. 0.1M NaCl에서 풀을 제조하였다. 평가된 본 발명의 야생형 섭티리신 또는 돌연변이 섭티리신 시료를 동일한 완충용액, 완충용액 + 3% SDS 또는 20 mM MES, 0.1 M NaCl, 5mM CaCl₂및 15mM EDTA에서 정해진 온도로 10분간 항온시켰다. 시료를 5분간 실온으로 냉각시킨 후, 단백질 가수분해 활성도를 측정하기 위하여 0.6%의 아조카제인을 함유한 pH 8.0의 트리스 - HCl 내에서 실온(20℃)으로 하여 20분간 분석하였다. 각 표본의 단백질 가수분해 활성도는 20℃, 10mM NaCl₂에서 야생형 섭티리신 또는 돌연변이 섭티리신의 본래 활성도를 백분율로 나타냈으며 이는 표2에 나타나있다.

실시예 6의 [Asp, Ser, Ser] 섭티리신의 활성도

[실시예 16]

수퍼로스 12 컬럼 상에서 FPLC를 통해 완전한 섭티리신을 수득하였다. 이 섭티리신을 다양한 양의 SDS와 4mM CaCl또는 4mM EDTA를 선택적으로 포함하는 pH6.3의 15mM MES, 0.05M NaCl 내에서 실온(20℃)으로 하여 30분간 항온시켰다. 효소의 단백질 가수분해 활성도는 그 후 pH8.0의 트리스 - HCl 내의 0.6% 아조카제인 내에서 20분간 항온하여 측정하였다. 평가된 각 시료의 단백질 가수분해 활성도는 0% SDS 및 10mM Ca내에서 시료의 본래 활성도에 대한 백분율로 나타냈으며 그 결과는 표3에 나타난 바와 같다.

[실시예 17]

본 실험에서는 섭티리신만을 하기한 바와 같이 정제하였다.

각 배양액을 30분간 15,000g로 원심분리한 후 맑은 상청액속의 단백질을 (NH4)SO(리터당 600g)로 침전시켰다. 그 침전물을 원심분리를 통해 모으고, 75% 아세톤으로 분쇄하여 여과한 후 진공하에서 건조시켰다.

효소를 더 정제하기 위하여 건조된 침전물을 물에 용해시킨 후 용액을 여과하고, pH 6.3에서 0.02 M의 인산나트륨 완충용액에 대하여 투석하였다. 투석된 용액을 1분당 2ml 속도로 카르복시메틸 인산나트륨(pH6.3)으로 세척한 후, 효소를 0.15M의 NaCl을 함유하는 동일한 완충용액으로 용리하였다. 피크 부분의 분획을 모아 풀을 제조하고 이 분획을 숙시닐 - L - 알라닐 - L - 프로릴 - L - 페닐알라닐 - P - 니트로아닐리드(베가 바이오케이컬스에서 입수)와 혼합한 시료의 색 변화로써 확인되는 효소를 포함하는 분획으로부터 2.5배의 아세톤을 첨가함으로써 단백질을 침전시켰다. 그 침전물을 원심분리하여 모은 후 0.005M의 아세트산 칼슘(10m당 약 1ml)용해시켰다. 그 결과 생성된 용액을 물에 대하여 4℃에서 투석하고 동결건조시켰다.

[Asp, Ser, Ser] 섭티리신, [Asp, Glu, Ser, Ser]섭티리신 및 섭티리신 칼스버그의 안정성을 두 완충 용액(pH 9.0의 0.06 M 인산나트륨 또는 pH 11.0의 0.12M 글리신산나트륨)내에서 세온도(25℃, 37℃ 및 50℃)로 측정하였다. 그 결과는 특정 조건하에서의 효소의 반감기로서 표4에 나타나 있다.

[실시예 18]

[Asp, Ser, Ser, Ala] - 섭티리신의 특정화

[Asp, Ser, Ser, Ala] - 섭티리신을 실시예 14에 기술한 바와 같이 비. 섭티리스 BZ25/pAMB143 발효액으로부터 정제하였다. 열 안정성, 표백제 내에서의 안정성 및 이 섭티리신의 고유 활성도를 다음에 기술하는 바와 같이 시험하였다 :

Ⅰ. 열 안정성

[Asp, Ser, Ser, Ala] - 섭티리신 및 [Asp, Ser1Ser] - 섭티리신의 열 안정성 및 야생형 효소(AprA)의 열 안정성을 길포드 모델 리스폰스 11 분광 - 광도계의 열 프로그램으로 측정하였다.

pH 6.3의 20mM MES, 0.1 M NaCl 내의 정제된 프로테아제 시료를 다양한 농도의 Ca존재하에 25℃에서 95℃까지 가열하였다.

온도가 1분당 0.5℃씩 상승함에 따라 287nm 에서의 흡광도는 감소하였다. 융해용도(Tm)는 겹쳐지지 않은 상태와 겹쳐진 상태의 개체수가 동일한 때의 온도로 결정하며, 이는 겹쳐진 상태의 단백질에서 겹쳐지지 않은 단백질로의 전이 중간지점의 온도를 의미한다.

섭티리신에 있어서 열 변성은 비가역 반응이다 : 프로테아제 억제자의 부재시 본래의 효소는 겹쳐지지 않은 형태의 단백질을 분해하지만, 억제자의 존재시에는 단백질이 겹쳐지지 않은 형태로 침전한다.

따라서 Tm으로 상대적인 안정성을 비교해 볼 수 있다. 이러한 방법으로 측정한 융해온도를 하기하였다.

두 섭티리신의 융해온도는 측정된 모든 칼슘 농도에서 매우 유사하며, 전체적으로 AprA - 섭티리신의 융해온도보다 높다. 이 사실은 잔기 222에서의 Met을 Ala로 치환한 것이 증진된 안정성 및 76, 109와 218 위치에서의 치환으로 인한 증징된 칼슘 결합 친화력에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 가리키는 것이다.

Ⅱ. 표백제 내에서의 안정성

위치 222에서 Met을 제거하는 목적은 산화에 대한 효소의 감수성을 감소시키기 위한 것이며, 표백제 내에서의 [Asp, Ser, Ser] - 섭티리신의 안정성 및 [Asp, Ser, Ser, Ala] - 섭티리신의 안정성을 비교하였다. 첫째 실험에 있어서, 두 섭티리신을 2% 클로록스, 2% 클로록스에 1% SDS를 가한 것, 또는 완충용 액만의 존재하에 pH7.5의 20mM 트리스 0.1M NaCl에서 50℃로 하여 항온시켰다. 2% 클로록스 표백제는 직물을 세탁하는 소비자가 주로 사용하는 양과 비교할 때 상당히 과량이란 사실을 주목해야 한다. 여러 시간에 걸쳐 분취량을 제거하고 잔존하는 프로테아제 활성도를 아조카제인 분석을 통해 측정하였다. 그 결과는 제8도에 나타나 있다. 두 섭티리신의 활성도는 완충용액만 존재할 때의 활성도 백분율로서 나타내며, 이는 실험 기간동안 내내 일정하다. [Asp, Ser, Ser, Ala]는 2% 표백제가 존재할 때 [Asp, Ser, Ser] 보다 큰 활성도를 보유하며, 두 섭티리신 모두 2% 클록스 및 1% SDS 존재시 50℃에서 급속히 활성도를 상실하는 것으로 나타난다. 이 실험 중 흥미있는 관찰 결과는 동일한 조건하에서 동량의 단백질을 사용하였을 때 [Asp, Ser, Ser]이 [Asp, Ser, Ser, Ala] 보다 훨씬 큰 활성도를 갖는다는 사실이다. 이 점에 대해서는 이후에 보다 상세히 기술하고자 한다.

또한 [Asp, Ser, SerAla] 및 [Asp, Ser, Ser]의 구조에 대한 표백제의 효과를 SDS - PAGE를 사용하여 분석하였다.

두 섭티리신을 2% 클로록스 또는 2% 클로록스에 1% SDS를 가한것의 존재하에 pH 7.5의 20mM 트리스, 0.1M NaCl, 1mM PMSF에서 50℃로 항온시켰다. 다른 시간대에서 30μl를 회수하여 1mM PMSF를 포함하는 4℃의 찬 시료 완충용액 15μㅣ 와 혼합하고 실험이 종료될 때까지 4℃에 보관하였다. 12.5% 폴리아크릴아미드를 용해시킨 겔 상에서 시료에 대해 SDS - PAGE를 실시하였다.

단백질은 쿠마지에 블루 염료(commassie bleu dye)로 착색시켜 가시화하였고, 본래의 겹쳐진 단백질(겔의 최상단 부분)과 본래의 겹쳐지지 않은 단백질(겔의 중간 부분) 및 단백질 가수분해 생성물(겔의 아래 부분)의 양을 레이저 농도계를 사용하여 측량하였다.

[Asp, Ser, Ser] 섭티리신의 경우, 2% 클로록스에서 1시간 경과한 후 단백질의 45%가 적당히 겹쳐진 채로 존재하며 표백제에서 2시간 경과한 후에는 단백질 전체가 겹쳐지지 않았고 많은 부분이 절단되었다. 섭티리신 [Asp, Ser, Ser, Ala]의 경우, 표백제에서 1시간 경과후 프로테아제의 56%가 여전히 겹쳐진 채로 남았으며 그 후 계속하여 2% 클로록스에서 50℃로 2시간 항온시킨 후에는 총 단백질의 20%가 본래대로 남아있었다. 2% 표백제, 1% SDS용액에서 두 섭티리신의 행동은 매우 유사했으며, 5분간 항온시킨 후에는 75%가 여전히 본래의 겹쳐진 채로 남았고, 15분간 항온시킨후에는 전체 단백질의 27%가 여전히 겹쳐진 채로 남았다.

[Asp, Ser, Ser, Ala]는 본 특이 분석을 위해 사용한 농도에서 혼합 형태의 변성제(표백제 및 SDS)에 대해 크게 증진된 안정성을 나타내지는 않지만 표백 변성에 대해 증가된 내성이 나타난다.

Ⅲ. 활성도

이상에 언급한 바와 같이, 섭티리신 [Asp, Ser, Ser, Ala]는 아조카제인에 대해 섭티리신 [Asp76, Ser109, Ser218]보다 낮은 고유 활성도를 가지며, [Asp, Ser, Ser, Ala] 의 경우 0.08 dA/(min-mg/ml)의 Vm치를 갖는 것에 비하여 [Asp, Ser, Ser, Ala]는 0.02dA/(min-mg/ml)의 Vm치를 갖는다. 이렇게 감소되는 활성도가 아조카제인의 경우에만 특이한 것인지 또는 [Asp, Ser, Ser, Ala] 섭티리신의 일반적 특성인지를 알아보기 위해 인공 펩티드인 숙시닐 Ala - Ala - Pro - Phe - 파라니트로아닐리드의 가수분해시 반응속도를 [Asp, Ser, Ser, Ala] 및 [Asp, Ser, Ser]에 대해 분석하였다. 섭티리신 [Asp, Ser, Ser]은 440 μM의 Km 및 7.9dA/(min-nmole)의 Vmax를 가지며 이 두 수치는 사전 분석에서 얻은 것과 일치한다. 기질에 대한 [Asp, Ser, Ser, Ala]의 Km은 1.4mM인 반면 Vmax는 1.1 dA/(min-nmole)이었다. 이는 기질 친화력이 3배 감소할 때 고유 활성도가 7배 감소함을 나타내는 것이다. 이 고유 활성도는 aprA - 섭티리신의 고유 활성도보다 4배 적다. 이러한 촉매 작용을 하는 Ser은 위치 221에 있으며, 이 사실은 위치 222의 치환이 단백질 가수분해 과정의 속도 제한 단계와 기질결합을 간섭한다는 것을 알 수 있다.

[실시예 19]

실시예 18에서 기술한 바와 같이 [Asp, Ser, Ser, Ala] - 섭티리신은 아조카제인에 대하여 [Asp, Ser, Ser] - 섭티리신보다 낮은 고유 활성도를 가지며, 합성 펩티드인 sAAPFpN 기질에 대해서도 낮은 고유 활성도를 갖는다. 이 결과는 Estell 등의 J. Niol Chem. 260, 6564-6570, 1986 문헌에서 관찰된 바와 같이 바실루스 아밀로리퀘페이시언스로부터의 BPN섭티리신의 Ala동족체 내에서의 활성도의 손실과 일치한다. 세정제 효소의 제작자 및 세정제의 제조업자가 프로테아제의 활성도를 측정하기 위해 주로 카제인 또는 아조카제인을 기질로 사용하므로 [Asp, Ser, Ser, Ala] 섭티리신은 더렵혀진 직물의 세척에 증진된 효과를 나타낼 것으로는 기대되지 않았다.

본 실시예에서 설명한 바와 같이 [Asp, Ser, Ser, Ala] - 섭티리신은 여러 조건하에서 오염된 직물로부터 얼룩을 제거하는 데에 일관성있게 증진된 성능을 보이는 예상치 못한 결과를 나타냈다.

제9도 및 제10도의 조건을 다음에 나타내었다 :

-전체 세척 조건, 10분 세척

- pH 약 7에서 인산염을 함유한 Fresh StartpH 약 9에서 인산염을 함유하지 않은 Fresh Start

- 27℃ 및 49℃의 세척 온도

- 150ppM의 물 경도

- 세가지 견본 직물 조각에 각각 두 얼룩 착색 : 면에 혈액/우유/잉크(BMI) 65% 데크론/35% 면 직물에 쵸콜렛 퍼지 푸딩(CFP)

- 대조 : Fresh Start에 1.5% Alcalse을 함유한 것

Fresh Start에 1.5% Termamyl을 함유한 것

- 프로테아제에 대한 아조카제인 단위/ml 및 아밀라아제에 대한 디니트 로살리신산 단위/ml를 기초로 해당량 활성도에서 효소를 검사함.

제10도에 대한 해설은 다음과 같다 :

노보 알칼라제 대조 활성도의 1/3 만큼의 [Asp, Ser, Ser, Ala] - 섭티리신 양을 사용할지라도 본 발명의 섭티리신은 표6에서와 같이 우수한 효과를 나타내었다.

143은 3 아조/L를 사용한 반면, 노보는 9 아조/L를 사용함

* 밸러스트는 오염된 직물의 견본외에 세탁기에 가하는 부가적인 오염물질을 말한다.

지금까지 본 발명을 바람직한 구체예로 기술하였으나 본 분야의 숙련된 이들에 의한 변형 및 개선이 가능할 것이다. 따라서 본 발명에서 기술한 구체적인 칼슘 결합 부위 이외에도 다른 칼슘 결합 부위에서의 잔기의 치환이 안정성을 증진시킬 수 있으리라 기대된다. 안정성의 부가적인 증진은 Asn - Gly 시퀀스를 갖는 다른 효소 및 이 시퀀스를 포함하는 다른 단백질에서의 치환으로써 얻어질 수 있으리라 기대된다. 그러한 치환에 대한 부가적인 고유 활성도의 증진은 활성 부위 아미노산 부근의 변이 아미노산을 단백질 내로 삽입시킬 때 다른 효소에서 만들어졌다. 각 단일 치환으로써 효소의 안정성, 칼슘 결합 또는 고유 활성도를 증진시킬 수 있는 반면에 한 효소내의 몇몇 조합의 변형은 상업적인 응용을 위한 효소를 제조하기 위해서 필요하다. 또한 각 아미노산 치환은 효소의 일차 구조를 변화시키고, 수소 결합 등과 같이 정전기 효과로 인해 주변 아미노산 잔기에 영향을 줄 수 있으며, 치환 조합이 항상 개선되고 증진된 효소를 생산하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 올바른 조합에 의해 우수한 성질을 가진 섭티리신을 제조할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 섭티리신은 본 발명에 참고로 인용한 미국 특허 제 3,732,170호 : 미국 특허 제 2,749,671호 및 미국 특허 제 3,790,482호에 나타난 세정제 제제형 내의 모든 야생형 섭티리신에 비하여 뛰어난 특성을 가진다.

무엇보다도 많은 산업 공정이 대부분의 효소가 안정한 온도 범위 이상에서 진행된다. 따라서 여기에서 강조되고 있는 세정제 응용에 있어서, 본 발명에 의한 섭티리신은 열에 대하여 안정한 섭티리신이 요구되는 세정제 산업과 같은 특정 산업 분야에 유용할 뿐 아니라, 동·식물 단백질의 가수분해와 같이 단백질을 가수분해하기 위한 화학적 수단으로서 산업분야에 또한 유용할 것으로 믿어진다.

따라서, 본 발명에서 청구하고자 하는 발명의 범위내에서 가능한 모든 변형 및 개선된 형태도 본 발명의 범위에 포함하고자 한다.

Claims

다음과 같이 변이시킨 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 아미노산 시퀀스를 함유하는, pH, 열 및 산화에 대하여 증진된 안정성을 가지며 증가된 고유 활성도를 가짐을 특징으로 하는 순수한 섭티리신으로서, (1) Asn⁷⁶과 lle⁷⁹중 하나 또는 둘다를 Asp 또는 Glu로 치환하고 ; (2) 위치 109 또는 218의 Asn 잔기를 Ser, 과 Thr 으로 이루어진 군에서 선택한 아미노산 잔기로 치환하고 ; (3) Met¹²⁴와 Met²²²중 하나 또는 둘다를 Ala 또는 Leu 로 치환하거나, 상기 Met 중 어느 것도 치환하지 않으며 ; (4) lle³¹을 Leu 으로 치환하되, 여기에서 변이 부위를 나타내는 번호는 하기 성숙한 바실루스 섭티리신 아미노산 시퀀스의 번호이다 :
제1항에 있어서, 상기 섭티리신은 섭티리신 칼스버그, 섭티리신 DY, 섭티리신 BPN¹, 바실루스 섭티리스의 aprA 섭티리신 및 바실루스 메센테리쿠스로부터의 섭티리신으로 이루어진 군에서 선택한 바실루스 섭티리신임을 특징으로 하는 섭티리신.
제1항에 있어서, Asn⁷⁶을 Asp⁷⁶으로 치환함을 특징으로 하는 섭티리신.
제1항에 있어서, llE⁷⁹를 Glu⁷⁹로 치환함을 특징으로 하는섭티리신.
제1항에 있어서, Asn⁷⁶을 Asp⁷⁶으로 치환하고 lle⁷⁹를 Glu⁷⁹로 치환함을 특징으로 하는 섭티리신.
제1항에 있어서, 위치 109의 Asn 잔기를 Ser으로 치환함을 특징으로 하는 섭티리신.
제1항에 있어서,위치 218의 Asn 잔기를 Ser으로 치환함을 특징으로 하는 섭티리신.
제1항에 있어서,위치 109 및 218의 Asn 잔기를 Ser 으로 치환함을 특징으로 하는 섭티리신.
제8항에 있어서, 상기 섭티리신은 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] 섭티리신, [Glu⁷⁹, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸] 섭티리신, [Asp⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] 섭티리신으로 이루어진 군에서 선택함을 특징으로 하는 섭티리신.
제1항에 있어서, Met²²²를 Ala로 치환함을 특징으로 하는 섭티리신.
제1항에 있어서, Met¹²⁴를 Leu 또는 Ala로 치환함을 특징으로 하는 섭티리신.
제1항에 있어서, 상기 섭티리신은 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala²²²] 섭티리신; [Leu³¹, Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸, Ala2^22]섭티리신 ; [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Leu¹²⁴, Ser²¹⁸, Ala²²²] 섭티리신 ; [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ala¹²⁴, Ser²¹⁸, Ala²²²]섭티리신으로 이루어진 군에서 선택함을 특징으로 하는 섭티리신.
세정제 제제형내에 제1항의 섭티리신의 유효량을 함유하는 조성물.