NO176844B - Enzymatisk aktive analoger av et Bacillus-subtilisin, nukleinsyre, vertscelle, fremgangsmåte for forbedring av varme- og pH-stabiliteten til et slikt subtilisin, samt vaskemiddelblanding som omfatter en slik analog - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt varmestabile og pH-stabile analoger av enzymet Bacillus-subtilisin, samt nukleinsyrer og vertsceller for fremstilling av slike analoger. Foreliggende oppfinnelse vedrører særlig analoger av Bacillus-subtilisin med en substitusjon for Asn<218>, samt nukleinsyrer og vertsceller for fremstilling av slike analoger.

Uttrykket subtilisin betegner en gruppe ekstracellulære alkaliske serinproteaser som produseres av forskjellige Bacillus-arter. Disse enzymene kalles også Bacillus-serinproteaser, Bacillus-subtilisiner eller bakterielle alkaliske proteaser.

Bacillus-subtilisin-molekylene består av en enkel polypeptidkjede med enten 274 rester (for subtilisin av type Carlsberg som produseres av Bacillus licheniformis,

og for subtilisinet som produseres av Bacillus stamme DY) eller 275 rester (for subtilisin av type BPN<1>, produsert av Bacillus amyloliquefaciens, og aprA-genproduktet fra

Bacillus subtilis). Når man sammenlignet aminosyresekvenser

i subtilisin fra forskjellige stammer av Bacillus, brukes sekvensen til subtilisin BPN' som en standard. Basert på

en oppstilling av sekvenser som gir den største grad av homologi mellom subtilisin Carlsberg og subtilisin BPN', henvises det f.eks. til serinet i det aktive sete til det førstnevne subtilisin som serin 221, selv om det befinner seg i posisjon 220 i aminosyresekvensen. På det samme grunnlag kan posisjon 220 i aminosyresekvensen til subtilisin Carlsberg sies å "tilsvare" posisjon 221 i subtilisin BPN'.

Se f.eks. Nedkov et al., Hoppe-Seyler<*>s Z. Physiol. Chem., 364, 1537-1540 (1983). ;Røntgenstrukturen til subtilisin BPN' [Wright et ;al., Nature, 221, 235 (1969)] avslørte at geometrien i det katalytiske sete til subtilisin, som omfatter Asp^, His^^ ;221 ;og Ser , er nesten identisk med geometrien i det aktive sete til serinproteaser fra pattedyr (f.eks. chymotrypsin) ;som omfatter restene Asp"*"^, His^ og Ser^"^. De samlede forskjeller mellom Bacillus-serinproteaser og pattedyr-serinproteaser indikerer imidlertid at disse er to ube-

slektede familier med proteolyttiske enzymer.

I familien med Bacillus-subtilisiner er fullstendige aminosyresekvenser tilgjengelige for fire subtilisiner: Carlsberg, [Smith et al., J. Biol. Chem., 243, 2184-2191

(1968)]; BPN<1> [Markland et al., J. Biol. Chem., 242, 5198-5211 (1967)]; aprA-genproduktet [Stahl et al.,

J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984)]; og DY [Nedkov et al., supra). Subtilisin Carlsberg og subtilisin BPN' (noen ganger henvist til som subtilisin Novo) avviker fra hverandre i 84 aminosyrer og en ytterligere rest i BPN' (subtilisin Carlsberg mangler en aminosyrerest som svarer til rest 56

i subtilisin BPN'), Smith et al., supra. Subtilisin DY er 274 aminosyrer langt og avviker fra subtilisin Carlsberg i 32 aminosyreposisjoner og fra subtilisin BPN<1> med 82 aminosyre-utbytninger og en fjerning (subtilisin DY mangler en aminosyrerest som svarer til rest 56 i subtilisin BPN<1>), Nedkov, et al., supra. Aminosyresekvensen til aprA-genproduktet er 85% homologt med aminosyresekvensen til subtilisin BPN', Stahl, et al., supra. Det synes således som om det er en utstrakt homologi mellom aminosyresekvenser til serinproteaser fra forskjellige stammer av Bacillus. Denne homologi er fullstendig i visse områder av molekylet og særlig i de områder som spiller en rolle i den katalytiske mekanisme og i substratbindingen. Eksempler på slike innbyrdes variasjoner i sekvens er de primære og sekundære

T. v,v, 125 T 126 127 ~, 128 substratbindmgsseter, hhv. Ser -Leu -Gly -Gly og Tyr 104, og sekvensen rundt det reaktive senn (221) ^ 218 219 220 0 221 Mq4_222 223

Asn -Gly -Thr -Ser -Met -Ala

Subtilisinmolekyler har noen unike stabilitets-egenskaper. De er ikke fullstendig stabile ved noen pH-verdi selv om de er forholdsvis resistente mot denaturering med urea og guanidinoppløsninger, og enzymaktivitet bi-beholdes en stund selv i en oppløsning av 8 M urea. I opp-løsninger ved en pH under 4 taper subtilisin hurtig og irreversibelt sin proteolyttiske aktivitet. Gounaris et al., Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 35, 37 (1965) viste at syredeaktiveringen av subtilisin ikke skyldes en generell ladningsvirkning, og antok at den skyldes andre endringer i molekylet, slik som protonering av histidinrester i de indre, hydrofobe deler av molekylet. I oppløsning ved pH over 5 gjennomgår Bacillus-serinproteaser gradvis irreversibel inaktivering ved en hastighet som øker med temperatur og pH. Mekanismene ved denne inaktivering er ikke fullt ut kjente, men det er tegn som tyder på at selvoppløsning i det minste delvis er ansvarlig for enzym-ustabilitet i dette pH-område.

Bruken av proteaser i industrielle prosesser som krever hydrolyse av proteiner, har vært begrenset på grunn av enzym-ustabilitet under driftsbetingelser. F.eks. inkorporering av trypsin i tøyvaskemidler (f.eks. "Bio-38") for å lette fjerning av proteinholdige flekker var således svært lite vellykket, noe som utvilsomt var et resultat av enzym-ustabilitet under vaskebetingelsene. Det var først rundt 19 60, etter innføringen av bruken av bakterielle alkaliske proteaser som er mer forenlige med vaskemidler, at proteaser ble vanlig brukt i vaskemiddelindustrien.

Av praktiske grunner utføres mange industrielle prosesser ved temperaturer som ligger over stabilitetsom-rådet til de fleste enzymer. Det er derfor rimelig å anta at svært varmestabile proteaser ikke bare vil være fordelaktige for visse industrier, slik som vaskemiddelproduksjon og avhåring av hud, som allerede krever stabile proteaser, men kan være nyttige innen industrier som bruker kjemiske midler for å hydrolysere proteiner, f.eks. hydrolyse av vegetabilske og animalske proteiner for produksjon av suppekonsentrater.

Det bør imidlertid påpekes at selv om varmeinaktiver-ing kan være den viktigste måte å inaktivere enzymer på,

kan andre faktorer enn varme, slik som ekstreme pH-verdier og ekstreme verdier for oxygeninnhold og denatureringsmidler, kan ha en avgjørende virkning på begrensning av bruken av proteaser i industrielle prosesser. Det er derfor ønskelig å oppnå proteaser som er kjennetegnet ved forbedret stabilitet under de driftsbetingelser som brukes i forskjellige industrier. Et slikt mål kan oppnås enten

gjennom forskning etter nye, mer stabile villtypeenzymer, eller gjennom stabilisering av proteaser som det allerede er kjent eksisterer.

Selv om de Bacillus-avledede, alkaliske proteaser er mer forenlige med vaskemiddelblandinger enn det de pancreatiske proteaser var, er de likevel ikke ideelle i alle henseender.

I løpet av de siste årene har det skjedd store endringer i vaskemiddelblandinger, særlig ved erstatningen av fosfater med alternative vaskemiddelbyggere, og i ut-viklingen av flytende tøyvaskemidler for å imøtekomme miljømessige og forbrukermessige krav. Disse endringer skaper et behov for endringer i tradisjonelle vaskemiddelenzymer. Nærmere bestemt er det blitt ønskelig å anvende proteolyttiske enzymer som gir større lagringsstabilitet i flytende tøyvaskemiddelblandinger, samt stabilitet og aktivitet i bredere pH- og temperaturområder.

Ved ett forsøk på å produsere modifiserte subtilisiner for bruk i vaskemiddelblandinger, slik som beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 130.756, er mutasjoner i subtilisinet fra Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens) i Tyr<-1>, Asp<32>, Asn<155>, Tyr<1>04, Met<222>, Gly166, His64, Gly169, Phe<1>89, Ser33, Ser221, Tyr217,

Glu^6 og/eller Ala''"52 fastslått å gi endret stabilitet, forandret konformasjon eller å ha endringer i "bearbeid-ingen" av enzymet. I denne sammenheng hevdes mutasjon av Met 222 til Ala, Cys (en mutant som også utviser et skarpere pH-optimum enn villtype) eller Ser å resultere i forbedret

166 oxydasjonsstabilitet. Substitusjon av Gly med Ala, Asp, Glu, Phe, Hys, Lys, Asn, Arg eller Val synes å endre de kinetiske parametere til enzymet. Ingen av mutasjonene er imidlertid beskrevet å gi analoger med større stabilitet ved høye temperaturer eller stabilitet over et bredere pH-område enn villtype-enzymet.

I den andre fremgangsmåte synes det som om pH-avhengighet hos subtilisin kan forandres, som beskrevet i Thomas et al., Nature, 318, 375-376 (1985), ved å endre

9 9 100

en Asp til Ser i Asp -Gly i subtilisin BPN'. Denne endring representerer en forandring av en overflateladning

14-15 Ångstrom fra det aktive sete. Fremgangsmåten til

s Thomas et al. gir imidlertid ikke en indikasjon på forbedring når det ikke gjøres noen endring i overflateladning, slik tilfellet er når en uladet rest substitueres med en annen.

3 Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer analoger av Bacillus-serinproteaseprodukter som er kjennetegnet ved forbedret pH- og varmestabilitet, noe som gjør dem særlig

anvendbare i vaskemiddelblandinger, samt i andre prosesser

5 som krever bruk av protease. Enzymatisk aktiv analog av et Bacillus-subtilisin, hvor Bacillus-subtilisinet har en aminosyresekvens som omfatter en Asn-Gly-sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at analogen har en

aminosyresekvens hvor restene i Asn-Gly-sekvensen er fjernet 3 eller er erstattet av en rest av en annen aminosyre.

Det bør legges merke til at uttrykket "subtilisin", slik det her er anvendt, brukes for å henvise til den fullt ferdige, utskilte form av enzymet som mangler leder-sekvenser avspaltet fra det ferdige enzym før eller under

<5> utskillelsen.

Analoger av et Bacillus-subtilisin ifølge foreliggende oppfinnelse som for tiden er foretrukket, har en aminosyresekvens hvor posisjoner omfattende en Asn-Gly-sekvens i Bacillus-subtilisinet, ikke omfatter en Asn-Gly-<5> sekvens i analogen, og særlig hvor det er færre Asn-Gly-sekvenser enn i Bacillus-subtilisinet. Aller helst omfatter en posisjon svarende til posisjon 218 i aminosyresekvensen angitt i tabell 1, ikke en asparaginyl-rest, men omfatter

heller en rest av en annen aminosyre, fortrinnsvis en

<5> aminosyre valgt blant serin, valin, threonin, cystein, glutamin og isoleucin. I den utstrekning erstatning av asparagin med visse aminosyrer kan gi opphav til inter-

ferens med konformasjonen i det aktive sete, (f.eks. på

grunn av sterisk hindring som kan bli innført gjennom nær-været av en aromatisk aminosyre eller endringer i tertiær-struktur, slik som kan introduseres gjennom tilstedeværelsen av et prolin) vil substitusjon med slike aminosyrer vanligvis være mindre foretrukket. I den utstrekning erstatning av asparagin med andre aminosyrer kan innføre en ladet gruppe (f.eks. asparaginsyre) i nærheten av det aktive sete, vil likeledes slik substitusjon være mindre foretrukket. Et eksempel på en for tiden foretrukket ut-førelsesform av en analog ifølge foreliggende oppfinnelse,

er en [Ser 218]-analog av aprA-genproduktet. Alternative utførelsesformer av analogene innenfor omfanget av oppfinn-ing .

eisen er de hvor Asn i subtilisin BPN<1> eller i aprA-genproduktet er erstattet fortrinnsvis av et serin, og hvor glycinrester i posisjonene 110 og/eller 219 er erstattet av andre aminosyrerester. I andre subtilisiner omfattes også' substitusjon av Asn i rest 62 eller Gly i rest 63 i subtilisinene Carlsberg eller DY i foreliggende oppfinnelse.

En nucleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse har kodoner som koder for en polypeptidanalog som beskrevet ovenfor.

En vertscelle ifølge foreliggende oppfinnelse som kan uttrykke en enzymatisk aktiv analog av et Bacillus-subtilisin, er kjennetegnet ved at den omfatter en nukleinsyre som koder for en analog av Bacillus-subtilisin med en aminosyresekvens hvor en rest i en posisjon svarende til posisjon 218 i aminosyresekvensen beskrevet i tabell 1, ikke omfatter en asparaginylrest. I en slik celle kan nukleinsyren som koder for subtilisinanalogen, være kromosomal eller ekstrakromosomal. Vertscellen er fortrinnsvis valgt fra en stamme med en mangel i utskilte proteaser, noe som muliggjør lettvint isolering av analoge forbindelser.

En vaskemiddelblanding ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en enzymatisk aktiv analog av et Bacillus-subtilisin med en aminosyresekvens som omfatter en Asn-Gly-sekvens, kjennetegnet ved at en av eller begge restene av Asn-Gly- sekvensen er fjernet.

En fremgangsmåte for forbedring av varme- og pH-stabilitet hos subtilisiner ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at en rest i Asn-Gly-sekvensen fjernes eller én eller begge restene i Asn-Gly-sekvensen erstattes med en annen aminosyre, og særlig bytte ut asparaginresten i posisjonen i aminosyresekvensen til subtilisinet som svarer til posisjon 218 i aminosyresekvensen angitt i tabell 1.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser skjematisk ringslutningen av Asn-Gly-rester, slik som de som finnes i posisjonene 218 og 219 i subtilisin angitt i tabell 1, hvorved det dannes anhydro-aspartylglycin, og viser også basekatalysert hydrolyse derav. Figur 2 er et partielt restriksjonskart for et aprA-gen som inneholder et EcoRI-Kp_nI-genfragment fra Bacillus subtilis (B. subtilis) stamme QB127 og omfatter et partielt restriksjonskart for aprA-genet og flankerende ~ sekvenser. Figur 3 er et partielt restriksjonskart for et plasmid pAMBll. Figur 4 er et flytskjema som viser trinnene i konstruksjon av pAMB113, et plasmid som styrer syntese av [Ser] 218-subtilisin fra B. subtilis vertceller. Figur 5 er et partielt restriksjonskart for plasmidet pAMB30.

Detaljert beskrivelse

Bacillus-serinproteaser gjennomgår irreversibel inaktivering i vandige oppløsninger ved en hastighet som i stor grad er avhengig av temperatur og pH. Ved pH-verdier under 4 eller over 11 er inaktiveringshastigheten svært hurtig, mens hastigheten ved pH-er mellom 4,5 og 10,5,

selv om den er mye saktere, øker etter hvert som løsningen blir mer alkalisk. Ved alle pH-verdier gjelder generelt at dess høyere temperatur, dess hurtigere hastighet for subtilisindeaktivering.

En bevart sekvens, Asn-Gly, i posisjonene 109-110

og særlig i posisjonene 218-219 i Bacillus-subtilisiner er her identifisert som en hovedfaktor som er ansvarlig for pH-ustabilitet i disse stoffer. Sekvensen Asn-Gly i proteiner og peptider gjennomgår lett ringslutning under forskjellige betingelser slik at det ringformede imid-anhydroaspartylglycinet dannes [Bornstein et al., Methods in Enzymol., 4_7, 132-145 (1977)], slik som vist i figur 1. Dette cykliske imid er følsomt for basekatalysert hydrolyse som på foretrukken måte gir en ikke-naturlig forekommende, (3-aspartylpeptidbinding. Dessuten kan det cykliske imid avledet fra Asn-Gly, tjene som et mål for spesifikk spalting av subtilisin. Faktisk har den spesifikke spalting av proteiner i Asn-Gly-bindinger med alkalisk hydroxylamin blitt vanlig praksis ved fremstillingen av proteinfragmenter for bruk ved sekvensbestemmelse av aminosyrer. [Bornstein et al., supra].

Dannelse av et cyklisk imid og/eller (3-aspartyl-glycylpeptid i Asn 218 -Gly i subtilisin kan forutsies å gi irreversibel inaktivering av enzymet. Denne forutsigelse er basert på nærheten mellom det ustabile Asn-Gly-element og et reaktivt serin som befinner seg i posisjon 221. En datamaskinanalyse av proteinstrukturer førte til den antagelse at omordning av Asn 218 -Gly 219 enten til anhydroaspartyl-glycyl eller til [3-aspartyl-glycyl resulterer i en forflyt-ning av sidekjeden i Ser <221> bort fra posisjonen som den må innta for at enzymet skal være aktivt.

218 219 For å eliminere det ustabile element, Asn -Gly ,

218

fra subtilisinmolekylet, kan man enten erstatte Asn med hvilken som helst annen aminosyre eller asparagin, og/eller

219

endre Gly til hvilken som helst annen aminosyre enn glycin. På lignende måte forventes modifikasjon av det ustabile Asn-Gly-element i posisjonene 109-110 å gi fordeler for stabiliteten hos analoger ifølge oppfinnelsen.

219

Den observerte innbyrdes variasjon i Gly hos subtilisiner og hos subtilisin-lignende enzymer [f.eks. Cucumisin fra melonen Cucumis Melo L. Var Prince, Kaneda

et al., J. Biochem., 95, 825-829 (1984); og proteinase K,

en subtilisin-lignende serinprotease fra soppen Tritirachium album, Jany et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 366, 485-492

(1985)], og den antagelse at dersom Gly 219 var hvilken som helst annen rest enn glycin, ville dens sidekjede kunne virke inn på bindingen av et substrat til enzymet, gjør endringen av Asn 218 i stedet for Gly <219> for fjerning av den ustabile Asn 218 -Gly <219->sekvens svært foretrukket.

Basert på teoretiske betraktninger og på innsamling og analyse av data fra sekvensbestemmelse, ble asparagin i posisjon 218 erstattet med serin i den utførelsesform av foreliggende oppfinnelse som for tiden er foretrukket og som er beskrevet i de illustrerende eksempler nedenunder. Denne utvelgelse var basert delvis på den iakttagelse at aminosyresekvensen rundt det reaktive serin i cucumisin, et subtilisin-lignende enzym fra melonfrukt, har sekvensen Ser-Gly-Thr-Ser-Met (Kaneda et al., supra). Proteinase K har den samme sekvens rundt det aktive sete, se Jany et al., supra. Det bør imidlertid understrekes at utvelgelsen av serin som en erstatning for Asn 218 ikke utelukker at det samme mål, dvs. eliminering av det ustabile element Asn<218 >Gly <219> oppnås gjennom erstatning av asparagin i posisjon 218 med en annen aminosyre. Det er foretrukket at en uladet, alifatisk aminosyre, slik som valin, threonin, cystein,

218

glutamin eller isoleucin, erstatter Asn

På grunn av evnen til å utskille vesentlige mengder proteiner og fordi de for tiden brukes til å produsere vaskemiddelproteaser, utgjør Bacillus-mikroorganismer en foretrukket vert for rekombinant produksjon av [Ser 218]-subtilisinet ifølge foreliggende oppfinnelse. Fordi de fleste Bacillus-arter utskiller alkaliske og nøytrale proteaser, er det foretrukket at mutasjoner innføres i genene for endogene alkaliske og nøytrale proteaser hos B. subtilis slik at det muterte subtilisin kan produseres og utskilles av B. subtilis i et medium som er fritt for andre proteaser. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således også mutante stammer av B. subtilis som er blokkert når det gjelder syntesen av endogene proteaser, men som be-holder evnen til å syntetisere og utskille subtilisinanaloger, slik som [Ser 218]-subtilisin.

Som beskrevet nærmere nedenunder, ble det funnet at pH- og varmestabilitet, og stabiliteten i vaskemiddelblandinger, til [Ser 218]- aprA-genprodukt-subtilisin er mye større enn for villtype aprA-genprodukt-subtilisin.

Fremstillingen av en stabil subtilisinanalog ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter følgende fremgangsmåter: 1. Isolering av det representative subtilisin-gen aprA fra B. subtilis. 2. Kloning av aprA-genet på en vektor som tillater utnyttelse av oligonucleotid-sted-rettet mutagenese for å danne ønskede modifikasjoner. 3. Sted-rettet mutagenese og sekvensbestemmelse av den resulterende DNA for å bekrefte tilstedeværelsen av den ønskede mutasjon. 4. Konstruksjon av en ekspresjonsvektor for å styre syntesen av det muterte enzym i B. subtilis. 5. Konstruksjon av muterte B. subtilis-stammer som ikke syntetiserer subtilisin og nøytral protease. 6. Isolasjon av enzymet i det ekstracellulære dyrkningsmedium og rensing derav. 7. Bestemmelse av stabilitets- og aktivitets-kjennetegn hos det isolerte produkt. 8. Utøvelse av fremgangsmåter for innsetning av genet som koder for det forbedrede enzym, i kromosomet til en B. subtilis-stamme som tidligere er mutert for å blokkere syntese av endogene proteaser.

I eksempel 1 isoleres det aprA-gen som koder for subtilisin, fra B. subtilis-genomet. I eksempel 2 under-kastes aprA-genet sted-rettet mutagenese. I eksempel 3 konstrueres en ekspresjonsvektor som inneholder det muterte aprA-gen. I eksempel 4 konstrueres to mutante stammer av B. subtilis som ikke produserer noen påvisbare ekstracellulære proteaser. Eksempel 5 beskriver fremgangsmåter for integrering av et mutert aprA-gen i kromosomet til B. subtilis. I eksempel 6 isoleres og renses villtype- og mutante aprA-subtilisiner. Eksemplene 7-10 sammenligner varmestabiliteten til [Ser 218]-subtilisin med varmestabiliteten til villtype aprA-genprodukt og med varmestabiliteten til et kommersielt BPN<1->produkt.

Eksempel 1

B. subtilis stamme QB127 ( trpC2 leuA8 sacU 200)

[Lepesant et.al., Molec. Gen. Genet., 118, 135-160 (1982)]

ble erholdt fra Bacillus Genetic Stock Center ved Ohio State University, Columbus, Ohio. Denne stamme overproduserer ekstracellulært serin og metallproteaser, a-amylase og levansucrase sammenlignet med isogene sacU<+->stammer på grunn av den pleiotrope virkning av sacU 200-mutasjonen [Lepesant et al., i Schlessinger, D., red., Microbiology, 1976, American Society for Microbiology, Washington, D.C.,

s. 65 (1976) ]. Stamme QB127 ble derfor ansett for å være en egnet kilde for DNA for isolering av aprA-genet som koder for subtilisin.

Genom-DNA ble isolert fra celler av B. subtilis stamme QB127 ved hjelp av en publisert fremgangsmåte [Saito et al., Biochim. Biophys. Acta, 72^ 619-629 (1963)].

Renset kromosom-DNA bie fordøyd fullstendig med EcoRI-restriksjonsendonucleasen.

DNA-fragmenter ble adskilt på en agarosegel med lavt smeltepunkt ved hjelp av elektroforese, og fragmenter i området 4,4-8,0 kilobaser (kb) ble isolert ved hjelp av en standard DNA-isoleringsfremgangsmåte anbefalt av leveran-døren. Disse fragmentene ble ligert til pCFM93 6 deponert som nr. 53.413 ved American Type Culture Collection,

12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 13. januar 1986, et Escherichia coli (E. coli) "walkaway"-plasmid som opp-viser høyere kopiantall ved forhøyede temperaturer, og som gir kanamycinresistens.

Vektoren ble fordøyd med EcoRI og defosforylert med alkalisk fosfatase fra kalvetarm før ligering.

Ligeringsprodukter ble innført i E. coli C600 (tilgjengelig som A.T.C.C. 23724 fra American Type Culture

Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland), og kanamycin-resistente vertceller ble valgt ut etter inkuba-sjon over natten på L-agar supplert med 10 ug/ml kanamycin. Antall kopier av plasmid-DNA ble økt ved å inkubere vertceller ved 42°C i 4 timer. Kolonier ble deretter overført til nitrocellulosefiltere og bearbeidet ved hjelp av en publisert fremgangsmåte henvist til som kolonihybridisering [Grunstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 72. # 3961

(1975)] .

Det ble brukt en probe for å sortere ut kolonier som inneholdt subtilisingenet på pCFM936. Proben [syntetisert ved hjelp av den kjemiske fosfitt-metode til Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22., 1859-1862 (1981)] hadde nucleotid-selveksen

(1) 5' GCGCAATCTGTTCCTTATGGC 3'

som svarer til aminoenden i aprA-genproduktet (Wong et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 81, 1184-1188 (1984); Stahl et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984). Det ble brukt en hybridiseringstemperatur på 55°C, og 5 positive kolonier ble identifisert blant tilsammen 400. Plasmidet-DNA fra en av de positive koloniene ble betegnet pCFM936 apr2.

Plasmid pCFM936 apr2 ble oppløst med EcoRI alene,

med Hindlll alene og med EcoRI og Hindlll i kombinasjon. Størrelsene til EcoRI-fragmentene i subtilisingenet var i overensstemmelse med de som er beskrevet i Stahl et al., supra, men det ble oppdaget flere Hindlll-seter som ellers er ubeskrevet. Som beskrevet i eksempel 3, ble to av Hindlll-setene anvendt for genetiske manipuleringer av subtilisingenet .

Det ble bestemt at et stort 6,5 kb EcoRI-fragment

av B. subtilis QB127 genom-DNA bar aprA-genet, dets regulatorsekvenser og ubeslektede, flankerende sekvenser ved å verifisere at oppløsninger med restriksjonsenzym var i overensstemmelse med resultatene rapportert av Stahl et al., supra. Dette ble bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensbestemmelse

under anvendelse av dideoxy-kjedetermineringsmetoden [Sanger et al., J. Mol. Biol., 143, 161-178 (1980)]. Et 3,0 kg EcoRI- Kpnl-sub fragment av 6,5 kb E_coRI - fragmentet,

som illustrert i figur 2, ble også funnet å inneholde aprA-genet, dets regulatorsekvenser og ubeslektede, flankerende sekvenser. Selv om Kpnl- EcoRI-fragmentet er rapportert å være 2,5 kb i lengde i teksten til Stahl et al., og den der angitte tekst til figur 1, avslører sammenligning av skalaen til figur 1 og den skalatro avtegning av fragmentet at, selv i Stahl et al. er Kpnl- EcoRI-fragmentet vesentlig større enn 2,5 kb.

En kloningsvektor for Bacillus vertsystemer,

plasmid pAMBll, ble konstruert på følgende måte. Plasmidet pTG402 (Northern Regional Research Laboratories, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, stamme nummer NRRL B-15264) ble partielt oppløst med Rsal-restriksjonsendonucleasen. Fragmenter ble ligert til M13 mp!8 (tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, som katalognummer 8227SA) som tidligere var blitt oppløst med HincII. Ligeringsprodukter ble innført i E. coli JM103 (tilgjengelig fra Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey, som katalognummer 27-1545-01) ved transformasjon [Mandel et al., J. Mol. Biol., 5_3, 154

(1970)]. Bakteriofagplakker ble sprøytet med 0,5M catechol (fremstilt i destillert vann) for å påvise den funksjonelle ekspresjon av xylE-genet avledet fra pTG402. xylE-genet koder for catechol-2,3-dioxygenase og er nyttig for påvisning av promoterer i en rekke forskjellige organismer. Zukowski et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 8i0, 1101-1105

(1983) .

xylE-genet ble så overført som et 1,0 kb EcoRI-

til Pstl-fragment til E. coli/B. subtilis plasmid pHV33 (tilgjengelig fra American Type Culture Collection som A.T.C.C. 39217) [Primrose et al., Plasmid, 6, 193-201

(1981)] erholdt fra R. Dedonder (Instutut Pasteur, Paris, Frankrike). pHV33-plasmidet var tidligere blitt oppløst med EcoRI og Pstl slik at det xylE-holdige fragment ville inaktivere et gen for ampicillinresistens når det ble ligert i dette område. Det resulterende plasmid, pAMB21, inneholder et funksjonelt xylE-gen i E. coli vertceller, men krever tilsetning av en promoter for xylE for å bli uttrykt i B. subtilis-vertceller. E. coli-celler som inneholder pAMB21, er resistente overfor tetracyclin (15 ug/ml) og kloramfenicol (20 ug/ml), mens B. subtilis-celler som inneholder pAMB21, er resistente bare overfor kloramfenicol (5 ug/ml). t oop-transkripsjonstermineringssekvensen til bakteriofag lambda ble deretter overført fra plasmid pCFM936 (på et 400 basepar Pst.I- BglII-fragment) til det unike Pstl-sete i pAMB21. Et syntetisk nucleotid med sekvensen 5' GATCTGCA 3' ble konstruert for å knytte Bglll-enden i t oop-fragmentet til Pstl-setet i vektoren pAMB21. Det resulterende plasmid ble betegnet pAMB22 og hadde egenskaper som er identiske med pAMB21, bortsett fra at en transkrip-sjonsterminator var inkludert. pAMB22-plasmidet er nyttig for påvisning av sterke promoterer som er funksjonelle i B. subtilis.

Det 1,4 kb EcoRI- Bglll-fragment i DNA fra pAMB22 som inneholder xylE og toop, ble isolert fra en agarosegel med lavt smeltepunkt etter elektroforese av begrensede fragmenter. DNA-stykket med 1,4 kb ble ligert til pBD64 (tilgjengelig fra Bacillus Genetic Stock Center, nummer 1E22) som tidligere var blitt oppløst med EcoRI og BamHI. Det resulterende 5,3 kb plasmid, pAMBll, inneholder polylinkersekvensen Ml3m.pl8 ( EcoRI, Sstl, Xmal, Sma, BamHI og Xbal) oppstrøms fra xylE-genet som etterfølges av t oop, som vist i figur 3. pAMBll-plasmidet er i stand til å replikere i B. subtilis og gir vertcelleresistens mot kloramfenicol (5 ug/ml) og/eller kanamycin (5 ug/ml).

Som illustrert i figur 4, ble det rensede EcoRI-Kpnl-fragment som inneholder aprA, klonet inn i pAMBll, hvorved pAMBlll dannes. Ligeringsprodukter ble innført i B. subtilis MI112 ( arg-15 leuB thr5 recE4) (tilgjengelig fra Bacillus Genetic Stock Center som nr. 1A423) ved hjelp av protoplast-transformasjonsmetoden [Chang et al., Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979)]. B. subtilis MI112 uten plasmid-DNA er protease-dyktiggjort (Prt<+->fenotype), men utskilte subtilisinmengder er heller små. Kloramfenicol-resistente (Cm ) transformanter ble overført på L-agarplater supplert med 1,5% (vekt/volum) skummet melk og 5 ug/ml kloramfenicol, og deretter inkubert ved 37°C.

Etter inkubering over natten (omtrent 16 timer) produserte kolonier av MI112 som inneholder det nye rekom-binantplasmid (betegnet pAMBlll), en klar ring som omga hver koloni. Ringer ble dannet ved den proteolyttiske virkning av subtilisin på kaseinbestanddelen i mediumsupplementet av skummet melk. MI112 inneholdende pAMBll-vektoren alene, hadde ingen synlig ring etter 16 timer selv om en svak ring til slutt ble utviklet etter 40 timer ved 37°C. Celler som bærer pAMBlll, kan tydelig skjelnes fra celler som bærer pAMBll ved hjelp av en forskjell i ringstørrelse. Klon-ingen av aprA-genet i en fullstendig funksjonell form ble således påvist å ha ført til det høye nivå for produksjon og utskillelse av subtilisin ved hjelp av B. subtilis.

Eksempel 2

Som videre illustrert i figur 4, ble det 3,0 kb

store EcoRI- Kpnl-genomfragmentet, hvis isolering er beskrevet i eksempel 1, oppløst med Hindlll for å fremstille tre fragmenter: (1) et 1,1 kb EcoRI-HindiII-fragment som bærer genetiske regulatorsekvenser for aprA-genekspresjon, "pre-pro"-området til genet som kreves for ekstracellulær utførsel av subtilisin, og DNA-sekvensen som koder for de første 49 aminosyrene i fullt ferdig subtilisin; (2) et 1,1 kb Hindlll- Hindlll-fragment som bærer DNA-sekvenser som koder for aminosyrer 50-275 (carboxylende) i subtilisin sammen med en transkripsjonstermineringssekvens og 3' ikke-kodende sekvenser; og (3) et 0,8 kb HindIII- KpnI-fragment som inneholder 3<1> ikke-kodende sekvenser.

Fragmentet med 1,1 kb fragment flankert av Hindlll-seter, ble klonet til det eneste Hindlll-sete i bakteriofag M13 mp!8 for DNA-sekvens bestemmelsesformål og stedrettet mutagenese. En av rekombinantene, betegnet M13 mp_18 apr2,

ga enkjedet templat-DNA som kreves for stedrettet mutagenese

av aprA-genet.

Det kodende område i aprA-genet ble sekvensbestemt, og resultatene av sekvensen er gjengitt i tabell 1 nedenunder. Det bør legges merke til at den bestemte identitet av de første 5 kodoner i lederområdet kan tilskrives rapporten til Stahl et al., supra, og Wong et al., supra, vedrørende sekvensinformasjon for aprA-genet, og at det foreligger kodonsekvensforskjeller i forhold til Stahl et al., supra, i aminosyreposisjonene 84 og 85 som kan være resultatet av sekvensbestemmelsesfeil hos forfatterne av littera-turhenvisningen Stahl et al., eller som kan være resultatet av en forskjell i nucleotidsekvensene hos de anvendte stammer. Nærmere bestemt rapporterer Stahl et al., supra,

et kodon GTT (som koder for valin) i aminosyreposisjon 84, mens kodonet GTA (som også koder for valin) fremgår av tabell 1. Stahl et al., supra, rapporterer også et kodon AGC (som koder for serin) i aminosyreposisjon 85, i motsetning til kodonet GCG (som koder for alanin) i tabell 1.

Stedrettet mutagenese ble utført ved hjelp av en standardmetode. Norrander et al., Gene, _26, 101-106

(1983). Enkjedet DNA fra M13 mp!8 apr2 ble hybridisert til den mutagene primer

(a) 5' GGCGCTTATAGCGGAAC 3'

som ble syntetisert ved hjelp av den kjemiske fosfitt-metode (Beaucage et al., supra). Den syntetiske primer var homolog med kodoner for aminosyrene 216-220 i subtilisin, bortsett fra en enkel baseendring i kodonet for aminosyre 218 (AGC i stedet for AAC). En slik endring gjorde det mulig for den mutagene reaksjon å erstatte et serinkodon i posisjon 218 i stedet for det opprinnelige asparaginkodon i denne posisjon.

Den syntetiske primer ble hybridisert til M13 mp!8 apr2 DNA ved 65°C før sakte avkjøling til værelsetemperatur (omtrent 22°C). Polymerisering fulgt i 2 timer ved 15°C i en reaksjonsblanding som besto av 12,5 ul hybridisert DNA-oppløsning, 2,5 ul 10 mM hver av dATP, dGTP, dCTP og dGTP, 2,0 ul 12 mM ATP, 0,1 ul Klenow DNA-polymerase, 0,1 ul T4 DNA-ligase og 13 ul sterilt destillert vann. Den resulterende dobbeltkjedede, kovalent lukkede, ringformede DNA ble innført i E. coli JM103 ved transfeksjon.

Bakteriofag-plakker ble deretter overført til"Gene Screen" hybridiseringsmembraner. Plakker som inneholdt DNA med den ønskede baseendring, ble identifisert ved hjelp av hybridisering til radioaktivt merket (7- 32P) syntetisk oligonucleotid (2) brukt til den ovenfor beskrevne reaksjon med mutagen primer. Hybridisering ble utført ved en be-grensende temperatur (52°C) slik at bare DNA som bærer Ser 218-mutasjonen, ville hybridisere til det syntetiske

218 oligonucleotid. Tilstedeværelsen av Ser -mutasjonen i aprA-genet på DNA fra en enkelt renset plakk, betegnet M13 mp_18 apr2 [Ser]<218>, ble bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensbestemmelse ved fremgangsmåten til Sanger et al., supra.

Eksempel 3

For å uttrykke [Ser 218]-subtilisin i B. subtilis, ble det konstruert en egnet plasmid-bærer ved å oppløse pAMBlll med Hindlll. Det 1,1 kb store segment som bærer mesteparten av aprA-genet, ble fjernet ved religering av Hindlll oppløsningsprodukter av pAMBlll ved en konsentrasjon på omtrent 1 ug/ml. Dette resulterte i dannelse av pAMBHO som illustrert i figur 4. pAMBllO-plasmidet bærer genetiske regulatorsekvenser for ekspresjon av subtilisingenet, "pre-pro"-området som kreves for utskillelse av subtilisin, og DNA-sekvensen som koder for det 3<1->ikke-kodende område i fullt ferdig subtilisin, og de første 49 aminosyrene i fullt ferdig subtilisin. Ettersom det mangler DNA som koder for aminosyrene 50-275, syntetiserer pAMBllO ikke subtilisin når det er innført i B. subtilis vertceller. Subtilisin syntetiseres bare etter innføring av det gjenværende av et subtilisingen, enten den naturlig forekommende DNA-sekvens eller en analog-kodende sekvens, slik som en sekvens som koder for [Ser 218]-subtilisin.

218 Dobbeltkjedet DNA fra M13 mp!8 apr2 [Ser] ble oppløst med Hindlll. Et 1,1 kb stort fragment som bærer

218

aprA-gensegmentet med Ser -mutasjonen, ble deretter ligert til pAMBllO som tidligere var blitt oppløst med Hindlll. Ligeringsprodukter ble innført i B. subtilis ved transformasjon som i eksempel 1 ovenfor. Ligering av det 1,1 kb store Hindlll i den korrekte orientering (som bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensbestemmelse ved metoden til Sanger et al., supra) for uttrykning av det muterte gen, resulterte i konstruksjonen av pAMBH3, et plasmid som styrte syntese og utskillelse av [Ser 218]-subtilisin fra B. subtilis vertceller.

Eksempel 4

Ettersom de fleste Bacillus-arter utskiller alkaliske og/eller nøytrale proteaser i det omgivende dyrkningsmedium, er det foretrukket at mutasjoner innføres i endogene alkaliske og nøytrale proteasegener hos B. subtilis for å blokkere syntesen derav slik at muterte subtilisingener kan gi muterte subtilisiner når de innføres i mutantcellen,

som deretter vil bli utskilt i et medium fritt for andre proteaser som det er sannsynlig vil virke inn på isolering av intakte subtilisinanaloger. To mutante B. subtilis stammer BZ24 og BZ25, som ikke produserer noen påvisbare ekstracellulære proteaser, ble konstruert på følgende måte.

Først ble en plasmidbærer som er i stand til å replikere i E. coli, men ikke i B. subtilis med mindre den er integrert i kromosomet til B. subtilis ved hjelp av homolog rekombinasjon, konstruert på følgende måte.

Plasmid pBD64 (Bacillus Genetic Stock Center, nummer 1E22) ble oppløst fullstendig med Hpall, hvorved man fikk tre fragmenter med størrelse 2,95 kb, 1,0 kb og 0,75 kb. Disse fragmentene ble deretter ligert som en blanding til plasmid pBR322 (A.T.C.C. nr. 37017) som tidligere var blitt oppløst med Clal. Ligeringsprodukter ble innført i E. coli C600 (tilgjengelig fra American Type Culture Collection som A.T.C.C. nr. 23724) ved transformasjon [Mandel et al.,

J. Mol. Biol., 52, 154 (1970)]. Utvelgelse ble gjort for celler som er resistente mot kloramfenicol (20 ug/ml) og ampicillin (50 ug/ml). Plasmid-DNA fra 12 transformanter ble fremstilt ved hjelp av en alkalisk ekstraksjonsfremgangsmåte [Birnboim et al., Nucleic Acids Res., 1_,

1513-1523 (1979)], deretter oppløst med Hindlll og EcoRI i kombinasjon for å verifisere tilstedeværelsen av ett eller flere fragmenter som er innført. Ett slikt plasmid,

betegnet pAMB30, ble funnet å bære de 1,0 og 0,75 kb store Hpall-fragmenter fra pBD64 i Clal-setet til pBR322. Disse fragmentene inneholder genet for kloramfenicolacetyl-transferase (eat) som er funksjonelt i E. coli og B. subtilis. Oppløsninger med Bglll og, separat, med Sau3A, bekreftet identiteten og orienteringen til cat-genet på pAMB30, slik som vist i figur 5.

Ettersom pAMB30 mangler en sekvens for replikasjons-opprinnelse som er funksjonell i B. subtilis, kan det ikke J replikere som et autonomt replikon i B. subtilis vertceller. På den annen side inneholder pAMB30 det pBR3 22-avledede replikasjonsopprinnelsessted som er funksjonelt i E. coli,

og plasmidet kan derfor formeres i E. coli vertceller. Plasmid pAMB30 er nyttig på minst 2 måter. For det første kan et fragment av DNA som inneholder et funksjonelt opprinn-elsessted for replikasjon i B. subtilis, påvises når det klones inn i pAMB30, slik at plasmidet autonomt vil replikere i den ekstrakromosomale tilstand. For det andre kan plasmid pAMB30 integreres i genomet i B. subtilis på et homologt sted mellom kromosom-DNA og DNA fra B. subtilis klonet inn i pAMB30. En slik hendelse er gjentatte ganger blitt påvist tidligere [Haldenwang et al., J. Bacteriol., 142, 90-98 (1980); Young, J. Gen. Microbiol., 129,

1497-1512 (1983)] ved å bruke plasmidbærere som ligner på, men ikke er identiske med, pAMB30.

Plasmid pAMB21 (beskrevet i eksempel 1) ble oppløst med EcoRI og Pstl for å isolere xylE-genet på et 1,0 kb fragment. Fragmentet ble ligert til pAMB30 som tidligere var blitt oppløst med EcoRI og Pstl. Ligeringsprodukter ble innført i E. coli C600 ved transformasjon. Utvelgelse ble gjort for kloramfenicol-resistente (20 ug/ml) vertceller som var følsomme for ampicillin (50 ug/ml) på grunn av innføringen av xylE-fragmentet fra pAMB21 i det struktur-elle gen for ampicillin-resistens hos pAMB30. Det resulterende plasmid pAMB30/21, har egenskaper som er identiske med pAMB30, men har i tillegg et funksjonelt xylE-gen.

Plasmid pAMBllO som bærer aprA-genet hvor et område som koder for de siste 226 aminosyrer i fullt ferdig subtilisin, er fjernet, ble oppløst med EcoRI og Kpnl. Det 1,9 kb store fragment av B. subtilis DNA som inneholder genetiske regulatorsekvenser for aprA-genekspresjon, "pre-pro"-området, DNA-sekvensen som koder for de første 49 aminosyrene i fullt ferdig subtilisin, og 3' ikke-kodende sekvenser, ble ligert til pAMB30/21 som tidligere var blitt oppløst med EcoRI og Kpnl. Ligeringsprodukter ble innført i E. coli C600 ved transformasjon. Plasmid-DNA fra flere transformanter ble isolert ved hjelp av den alkaliske eks-tråksjonsfremgangsmåte til Birnboim et al., supra, og tilstedeværelsen av det innførte 1,9 kb fragment ble veri-fisert ved hjelp av flere restriksjonsendonucleaseoppløs-ninger. Ett slikt plasmid, betegnet pAMB301, ble beholdt for videre bruk.

B. subtilis stamme BGSC1A274 (Bacillus Genetic Stock Center) bærer en mutasjon i npr-stedet og er ute av stand til å produsere ekstracellulær nøytral protease. Plasmidet pAMB301 ble integrert i genomet til B. subtilis BGSC1A274 ved transformasjon av kompetente celler [Spizizen, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) , 44^, 1072-1078

(1958)]. Seleksjon ble gjort for kloramfenicol-resistente (5 ug/ml) vertceller som deretter ble overført ved hjelp av sterile tannstikkere til L-agar supplert med 1,5%

(vekt/volum) tørr skummet melk og (5 ug/ml) kloramfenicol. De cellene som ikke ga en klar ring rundt kolonien, manglet evnen til å produsere ekstracellulære nøytrale og serinproteaser på grunn av kombinasjonen av npr-mutasjonen sammen med den nyinnførte aprA-mutasjon. aprA-mutasjonen var en fjerning av de siste 226 aminosyrer i fullt ferdig subtilisin som skyldtes erstatningen av villtype aprA-genet med utgaven med en fjernelse båret på pAMB301. En slik stamme, betegnet BZ24, har Npr Apr Cm<r->fenotypen, og den produserer derfor ingen påvisbar ekstracellulær nøytral protease eller ekstracellulær alkalisk protease, og er resistent overfor kloramfenicol ved 5 ug/ml. Southern blotting [Southern, J. Mol. Biol., 9^8, 503-517 (1975)] ble brukt til å bekrefte fjerningen i aprA-genet på kromosomet til B. subtilis BZ24. Dyrking av B. subtilis BZ24 i anti-biotisk medium nr. 3 (Penassay Broth.) i fravær av anti-biotisk seleksjon i omtrent 32 generasjoner, førte til isoleringen av en derivatstamme av BZ24 hvor cat-genet som gir kloramfenicol-resistens til vertceller, var gått tapt på grunn av ustabiliteten i BZ24-kromosomet. Et slikt fenomen er tidligere blitt iakttatt i lignende forsøk [Stahl et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984)]. Et kloramfenicol-følsomt derivat av BZ24 ble betegnet BZ25.

B. subtilis BZ25 har Npr Apr~-fenotypen, og den produserer derfor ingen påvisbar ekstracellulær nøytral protease eller ekstracellulær alkalisk protease. Southern blotting ble brukt til å bekrefte fjernelsen i aprA-genet på kromosomet til B. subtilis BZ25.

Ettersom B. subtilis BZ25 ikke produserer noen påvisbar ekstracellulær nøytral protease eller subtilisin,

er den en nyttig vertstamme for innføring av plasmid-DNA, slik som pAMBll3, for produksjon av muterte subtilisiner som kan utskilles i det omgivende dyrkningsmedium som er fritt for andre proteaser.

B. subtilis BZ25 gir ingen påvisbare ekstracellulære proteaser når kultursupernatanter analyseres som beskrevet nedenunder. B. subtilis BZ25/pAMBll3, som er BZ25 som inneholder plasmid pAMBH3 (innført ved hjelp av protoplast-transformasjonsmetoden til Chang et al., supra) produserer vesentlige mengder av [Ser 218]-subtilisin når kultursupernatanter analyseres som beskrevet.

Eksempel 5

Integrering av [Ser <218>]-subtilisingenet i kromosomet til B. subtilis ble antatt å tilveiebringe en effektiv måte for å øke genetisk stabilitet til dette mutantgen.

Ved en slik fremgangsmåte unngås også behovet for kloramfenicol i fermenteringsmediet, noe som ellers trengs for anvendelse av selektivt trykk for å opprettholde plasmid-DNA

i den ekstrakromosomale tilstand. Derfor ble [Ser 218]-subtilisingenet sammen med dets genetiske regulatorsekvenser og flankerende DNA-homologer til B. subtilis-kromosomet, isolert fra en agarosegel med lavt smeltepunkt etter elektroforese av pAMBll3 som var blitt oppløst med EcoRI og Pstl i kombinasjon. Det 4,0 kb store EcoRI- PstI-fragment (illustrert i figur 4) ble deretter ligert til pAMB30 (illustrert i figur 5) som var blitt oppløst med EcoRI og Pstl i kombinasjon. Ligeringsprodukter ble innført i

E. coli HB101 (A.T.C.C. nr. 33694) ved transformasjon. Utvelgelse ble gjort for celler som var resistente overfor kloramfenicol (20 ug/ml). Plasmid-DNA fra fire transformanter som oppfylte kriteriene ovenfor, ble isolert ved hjelp av den alkaliske ekstraksjonsfremgangsmåte til Birnboim et al., supra, og deretter oppløst med EcoRI og Pstl i kombinasjon. Alle fire plasmider inneholdt det 4,0 kb store innskudd og den 5,6 kb gjenværende del av pAMB30.

Ett slikt plasmid, betegnet pAMB302, ble renset og oppbevart for videre bruk.

Gjentatte forsøk på å integrere plasmid pAMB302 i kromosomet til B. subtilis BZ25 ved hjelp av kompetanse-metoden [Spizizen, supra] var ikke vellykket. Dette kan skyldes at BZ25-cellene ikke ble kompetente ved hjelp av den anvendte metode. pAMB302 ble derfor innført i B. subtilis BZ25-celler ved hjelp av protoplast-transf orma - sjonsmetoden til Chang et al., supra. Dette antas å være den første påvisning av at protoplast-transformasjonsmetoden er vellykket når det gjelder å oppnå integrasjon av hetero-log DNA i Bacillus. Dette resultatet er særlig betydnings-fullt ved at forskningsstammer hvor integrasjon er blitt oppnådd, ble valgt på grunnlag av transformasjon ved kom-petanse-metoden. Stammer som kan være ute av stand til å bli kompetente, og særlig industrielle stammer som ikke ble utvalgt på grunnlag av transformasjon ved kompetanse-metoden, kan det være større sannsynlighet for at vil være ute av stand til å bli kompetente.

Utvelgelse var for kloramfenicol-resistente celler (5 ug/ml) som deretter ble overført med sterile tannstikkere til L-agar supplert med 1,5% (vekt/volum) skummet melk og 5 ug/ml kloramfenicol. Celler ble inkubert over natten ved 37°C. Klare ringer med forskjellige diametere ble iakttatt rundt Cm<r->koloniene. Dette indikerer at subtilisin ble fremstilt og utskilt ved hjelp av disse cellene. Et forsøk ble gjort på å isolere plasmid-DNA fra åtte av disse koloniene ved hjelp av den alkaliske ekstraksjonsmetode. Ikke noe plasmid-DNA ble påvist på agarosegeler som ble farvet med ethidiumbromid (1 ug/ml) for å visualisere DNA etter elektroforese. Fraværet av den ekstrakromosomale plasmid-DNA i Cm<r->cellene som produserte subtilisin, var en sterk indikasjon på at pAMB302 var blitt integrert i kromosomet til B. subtilis.

Flere kolonier som man fikk fra dette forsøk, ble isolert og betegnet BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 og BZ33. Hver stamme ble dyrket over natten ved 37°C med kraftig rysting i hjerne/herte-infusjonsmedium (BHI) supplert med 5 vag/ml kloramfenicol. Kultursupernatanter ble analysert med hensyn på subtilisinaktivitet. B. subtilis stammer BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 og BZ33 produserte alle subtilisin og utskilte det i det omgivende dyrkningsmedium, idet noen stammer produserte mer enn andre. Mengden av subtilisin som ble observert i dyrkningsvæsken, var direkte proporsjonal med størrelsen på ringen som ble observert på L-agarplatene med skummet melk. Ettersom mengdene av subtilisin utskilt av disse cellene var forskjellige, ble det postulert at enten ble flere kopier av pAMB302 integrert i kromosomet, eller at det hadde funnet sted en økning i kopiantallet for genet [Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983); Albertini et al., J. Bacteriol., 162, 1203-1211 (1985)].

Eksempel 6

Villtype-subtilisin fra BZ25/pAMBlll og [Ser<218>]-subtilisin fra BZ25/pAMBll3 ble isolert og renset på følg-ende måte. Hver dyrkningsvæske ble sentrifugert ved 15.000 g i 30 minutter, og protein i den klare supernatant ble utfelt med (NH4)2S04 (350 g pr. liter). Utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering, og etter triturering med 75% aceton ble den filtrert og tørket under et vakuum.

For ytterligere å rense enzymet ble den tørkede ut-felling oppløst i vann, og oppløsningen ble filtrert og deretter dialysert mot 0,02M natriumfosfatbuffer ved pH 6,3. Den dialyserte oppløsningen ble sendt gjennom en kolonne (2,5 x 15 cm) med carboxymethylcellulose ved en hastighet på 2 ml pr. minutt. Etter vasking av kolonnen med 0,02M natriumfosfat (pH 6,3) ble enzymet eluert med den samme buffer inneholdende 0,15M NaCl. Toppfraksjoner ble slått sammen, og protein fra fraksjonene som inneholdt enzymet, idenfisiert ved hjelp av en fargeendring i en prøve av frak-sjonen blandet med succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-propyl-L-fenylalanyl-p-nitroanilid, ble utfelt ved tilsetning av 2,5 volumdeler aceton. Utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering og deretter oppløst i 0,005M calciumacetat (ca. 1 ml pr. 10 mg). Den resulterende oppløsning ble dialysert ved 4°C mot vann og deretter lyofilisert.

Eksempel 7

Ettersom foreliggende oppfinnelse vedrører stabilis-eringen av Bacillus-subtilisin, ble det utført en analyse av enzymstabilitet og kvantifisering derav.

De fleste enzymer utøver sin biologiske aktivitet, dvs. katalyse av kjemiske reaksjoner, bare innenfor et

snevert pH- og temperaturområde. Dessuten vil enzymet, selv under optimale betingelser, beholde sin aktivitet bare dersom polypeptidkjeden er foldet på en måte som danner den såkalte naturlige konformasjon. Den naturlige form av et enzym er

termodynamisk mer stabil enn den denaturerte eller ikke-foldede form ved et gjennomsnitt på 10-15 kilokalorier pr. mol. Opphevelse av foldingen av den naturlige struktur opptrer ofte når enzymet eksponeres mot ekstreme pH-verdier eller temperaturer, eller mot visse konsentrasjoner av kjemikalier, slik som vaskemidler, urea og organiske oppløs-ningsmidler. Fjerning av disse denatureringsmidler resulterer ofte i spontan nyfolding av peptidkjeden til den naturlige form og i gjenopprettelse av den opprinnelige enzymaktivitet.

Irreversibelt tap av enzymaktivitet kan oppstå på grunn av spalting av polypeptidkjeden eller på grunn av modifikasjon av visse aminosyresidekjeder, særlig dersom disse modifikasjonene endrer den naturlige arkitektur i enzymenes aktive sete. Eksempler på slike modifikasjoner omfatter deamideringen av asparaginyl- og glutaminyl-rester, oxydasjonen av methionylrester og den hydrolyttiske spaltning av cystein, hvorved det dannes en rest av thio-cystein og en av dehydroalanin. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et ytterligere eksempel i form av den irreversible inaktivering gjennom ringslutning av Asn-Gly-sekvenser.

Når enzympreparatet omfatter flere enzymatiske former som inaktiverer ved forskjellige hastigheter, og/eller når inaktiveringsprosessen opptrer gjennom en rekke mekanismer, er inaktiveringskinetikken komplisert. For de fleste enzympreparater ved et egnet pH- og temperaturområde følger imidlertid den termiske inaktivering kinetikk av første orden, dvs. at den gjenværende enzymaktivitet avtar som en funksjon av tiden langs en eksponensiell des-integrasjonskurve. Under disse forhold er halveringstiden ^Tl/2^ ^ or enzYmet uavhengig av den opprinnelige enzymkon-sentrasjon og kan beregnes som:

hvor A^ og A2 er enzymaktivitetene på tidspunktene hhv. t^ og t2.

Når alt annet er likt, er halveringstiden for et enzym i oppløsning vanligvis kortere ved høyere temperaturer.

For å sammenligne varmestabiliteten til [Ser 218]-aprA-genproduktet subtilisin med varmestabiliteten til villtype aprA-genprodukt subtilisin og subtilisin BPN', ble oppløsninger av disse enzymer (1 mg/ml) fremstilt i 0,1M natriumglycinatbuffer ved pH 10,0. Oppløsningene ble inkubert ved 52°C, og etter forskjellige tidsrom ble aliquoter (20 yl) tatt ut og blandet med 900 ul 0,2% casein-oppløsning i 0,1M tris-buffer ved pH 8,30. Som en kontroll ble substratoppløsningen (kasein) inkubert med 20 ul enzym-buffer. Hydrolysen av kasein ved værelsetemperatur ble bestemt etter 15 minutter med tilsetning av 200 ul 10% tri-kloreddiksyre. Hydrolysatet ble separert fra det utfelte protein ved sentrifugering, og den ultrafiolette (UV) absorp-

sjonskoeffisient ved 280 nm sammenlignet med kontrollen,

ble målt ved hjelp av et 8451A dioderad spektrofotometer. Substratkonsentrasjon var slik at enzymaktiviteter var direkte proporsjonale med UV-absorpsjonskoeffisientene ved 280 nm rapportert i tabell 2. I denne tabell representerer verdiene i parenteser prosentdeler av opprinnelige enzymaktiviteter. Den siste spalte i tabell 2 viser den beregnede halveringstid for de tre enzymene, og det kan ses at halveringstiden til det muterte [Ser 218] aprA-genprodukt er mer enn tre ganger lengre enn det naturlige aprA-genprodukt og subtilisin BPN<1> under de testede betingelser.

Eksempel

For bestemmelse av varmestabilitet til subtilisiner i nærvær av vaskemidler ble det flytende tøyvaskemiddel 'ERA Plus" brukt etter fortynning med vann (1:9) og fullstendig inaktivering av den opprinnelige proteaseaktivitet ved oppvarming til 65°C i 30 minutter. pH i den resulterende vaskemiddeloppløsning var 7,50. Ved å bruke kaseinanalyse og fremgangsmåten beskrevet i eksempel 7, ble stabilitetene til [Ser 218] aprA-genprodukt, villtype aprA-genprodukt og subtilisin BPN<1> testet i vaskemidlet ved 45°C. Resultatene er vist i tabell 3 hvor enzymaktivitetene er uttrykt som prosentdeler av opprinnelige enzymaktiviteter. Igjen var halveringstiden for subtilisinanalogen i størrelsesorden tre ganger større enn de naturlige produkter under test-betingelsene.

Resultatene i tabellen ovenfor viser at [Ser 218]-analogen av aprA-genproduktet utviser større stabilitet enn villtype aprA-genproduktet eller subtilisin BPN' i "ERA Plus" som, med en pH på 7,5, kan beskrives som et kationisk til nøytralt vaskemiddel og som sannsynligvis er blitt formulert for å være forenlig med innlemmelse av vaskemiddelenzymer. Disse resultatene sikrer imidlertid ikke at [Ser 218] aprA-genproduktet vil være forenlig med alle kommersielle vaskemiddelblandinger som for tiden finnes, f.eks. de som er blitt formulert for å brukes uten vaskemiddelenzymer. I de innledende forsøk med en 2% (vekt/volum) oppløsning av Tide® , som kan beskrives som et anionisk til nøytralt vaskemiddel med en pH som er høyere enn 8,5 og som ikke inneholder vaskemiddelenzymer i blandingen, utviste subtilisin BPN<1> større stabilitet enn villtype- og [Ser <218> ]- aprA-genproduktene. [Ser <218>]- aprA-genproduktet utviste imidlertid i den samme test større stabilitet enn villtype- aprA-genproduktet. Selv om de forskjellige relative virkninger av [Ser 218]- aprA-genprodutket og subtilisin BPN1

i "ERA Plus" og Tide<®> hittil ikke er blitt forklart, antyder forsøksresultatene at korrekt formulering av vaskemiddelblandinger er en forutsetning for optimal virkning av enzymer inkludert i slike blandinger. Det som tydelig er blitt demonstrert, er at [Ser <2>18]- aprA-genproduktet konse-kvent har egenskaper som er bedre enn egenskapene til villtype-aprA-genproduktet, og det antas at analoger av subtilisin Carlsberg og BPN' ifølge foreliggende oppfinnelse også vil ha større stabilitet enn det tilsvarende villtype-enzym.

Eksempel 9

Ved å bruke succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-fenylalanyl-p-nitroanilid som substrat og økningshastig-heten for absorpsjonskoeffisient ved 405 nm på grunn av fri-givelse av p-nitroanilin [Del Mar et al., Anal. Biochem., 99, 316-320 (1979)] for å måle enzymaktivitet, ble varme-stabilitetene til [Ser 218] aprA, villtype- aprA og subtilisin BPN' i 0,1M natriumfosfatbuffer ved pH 7,5 bestemt på følgende måte.

Enzymoppløsninger med ca. 0,5 Anson-enheter pr. liter ble inkubert ved 40 og 50°C, og på forskjellige tids-punkter ble aliquoter (20 yl) tatt ut og fortynnet i 180 <y>l iskald 0,1M natriumfosfatbuffer ved pH 7,5. 10 yl av den således fortynnede prøve ble blandet med 8 90 <y>l 1 mM succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-fenylalanyl-p-nitro-anilid i 0,1M Tris-HCl, pH 8,2, og absorpsjonskoeffisientene ved 405 nm ble målt hvert 15. sekund i 5 minutter på et 8451A dioderad-spektrofotometer. Gjenværende enzymaktiviteter etter forskjellige inkubasjonstider ble uttrykt i tabell 4 og tabell 5 som prosentandeler av de tilsvarende opprinnelige aktiviteter. Fremgangsmåten ble deretter gjen-tatt i 0,1M natriumfosfatbuffer ved pH 9,0, og resultatene er gjengitt i tabellene 6 og 7.

Eksempel 10

For å teste pH-stabilitet for [Ser 218]-analogen, ble fremgangsmåten ifølge eksempel 7 utført ved pH 4,8 og værelsetemperatur, og resultatene er gjengitt i tabell 8.

Selv om foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet ved hjelp av foretrukne utførelsesformer, skal det forstås at modifikasjoner og forbedringer vil oppstå for fagfolk innen teknikken. F.eks. forekommer sekvensen Asn-Gly i andre punkter i subtilisiner, slik som i restene 109 og 110 i aprA-genproduktet og subtilisin BPN', og i restene 62 og 63 i subtilisin Carlsberg og i subtilisin DY. Det er derfor forventet at substitusjon av andre rester enn Asn og Gly på disse respektive steder også kan forbedre stabiliteten. Lignende forbedringer i stabilitet forventes for slike sub-stitusjoner gjort i andre enzymer som har Asn-Gly-sekvensen, og i andre proteiner som omfatter denne sekvens. Videre er det forventet at en subtilisin-analog ifølge foreliggende oppfinnelse har bedre egenskaper enn villtype-subtilisiner i vaskemiddelblandinger, slik som de som er beskrevet i f.eks. U.S. patentskrifter nr. 3.732.170, 3.749.671 og 3.790.482;

Av praktiske grunner utføres videre mange industrielle prosesser ved temperaturer som ligger over stabilitets-området til de fleste enzymer. Selv om vaskemiddel-anvendelser har blitt fremhevet, antas det derfor at termo-stabile proteaser ifølge foreliggende oppfinnelse ikke bare er fordelaktige for visse industrier, slik som vaskemiddel og avhåring av hud, som allerede krever stabile proteaser,

men også kan være anvendbare i industrier som bruker kjemiske midler for å hydrolysere proteiner, f.eks. hydrolyse av vegetabilske og animalske proteiner for fremstilling av suppekonsentrater.

Claims (24)

1. Enzymatisk aktiv analog av et Bacillus-subtilisin, hvor Bacillus-subtilisinet har en aminosyresekvens som omfatter en Asn-Gly-sekvens, karakterisert ved at analogen har en aminosyresekvens hvor restene i Asn-Gly-sekvensen er fjernet eller er erstattet av en rest av en annen aminosyre.

2. Analog ifølge krav 1, karakterisert ved at en asparaginylrest i Asn-Gly-sekvensen er erstattet med en rest av en annen aminosyre.

3. Analog ifølge krav 1, karakterisert ved at en asparaginylrest i Asn-Gly-sekvensen er erstattet med en rest av en aminosyre fra gruppen bestående av serin, valin, threonin, cystein, glutamin og isoleucin.

4. Analog ifølge krav 3, karakterisert ved at asparaginylresten i Asn-Gly-sekvensen er erstattet med serin.

5. Enzymatisk aktiv analog av et Bacillus-subtilisin, karakterisert ved at den enzymatisk aktive analog har en aminosyresekvens hvor en asparaginylrest som naturlig forekommer i en posisjon svarende til posisjon 218 i aminosyresekvensen beskrevet i tabell l#er erstattet med en rest av en annen aminosyre.

6. Analog ifølge krav 5, karakterisert ved at en asparaginylrest i posisjonen er erstattet med en rest av en aminosyre fra gruppen bestående av serin, valin, threonin, cystein, glutamin og isoleucin.

7. Analog ifølge krav 6, karakterisert ved at en serylrest har erstattet asparaginylresten.

8. Analog ifølge krav 5, karakterisert ved at analogen er en analog av et naturlig forekommende Bacillus-subtilisin i en stamme valgt fra gruppen bestående av subtilisin Carlsberg, subtilisin DY, subtilisin BPN' og aprA-genprodukt.

9. Analog ifølge krav 8, karakterisert ved at alle restene bortsett fra resten i posisjon 218 omfatter aminosyrerester som beskrevet i tabell 1.

10. Nucleinsyre som koder for en enzymatisk aktiv analog av Bacillus-subtilisin, hvor Bacillus-subtilisinet har en aminosyresekvens som omfatter en Asn-Gly-sekvens, karakterisert ved at kodoner som koder for en av eller begge restene av Asn-Gly-sekvensen, er fjernet eller er erstattet med kodoner som koder for en annen aminosyrerest.

11. Nucleinsyre ifølge krav 10, karakterisert ved at den koder for et polypeptid hvor en asparaginylrest i en posisjon svarende til posisjon 218 i aminosyresekvensen beskrevet i tabell 1, er erstattet med en rest av en annen aminosyre.

12. Nucleinsyre ifølge krav 11, karakterisert ved at den andre aminosyren er et medlem av gruppen bestående av serin, valin, threonin, cystein, glutamin og isoleucin.

13. Nucleinsyre ifølge krav 12, karakterisert ved at resten i posisjonen omfatter en serylrest.

14. Nucleinsyre ifølge krav 13, karakterisert ved at alle aminosyre-restene i' alle posisjonene i aminosyresekvensen til analogen, bortsett fra posisjon 218, omfatter aminosyrerester som beskrevet i tabell 1.

15. Vertscelle som kan uttrykke en enzymatisk aktiv analog av et Bacillus-subtilisin, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyre som koder for en analog av Bacillus-subtilisin med en aminosyresekvens hvor en rest i en posisjon svarende til posisjon 218 i aminosyresekvensen beskrevet i tabell 1, ikke omfatter en asparaginylrest.

16. Vertscelle ifølge krav 15, karakterisert ved at resten i posisjonen omfatter en rest av en aminosyre fra gruppen bestående av serin, valin, threonin, cystein, glutamin og isoleucin.

17. Vertscelle ifølge krav 16, karakterisert ved at resten i posisjonen omfatter en serylrest.

18. Vertscelle ifølge krav 17, karakterisert ved at alle rester i alle posisjoner bortsett fra 218, omfatter aminosyrerester beskrevet i tabell 1.

19. Vertscelle ifølge krav 18, karakterisert ved at vertcellen er mangel-full når det gjelder andre utskilte proteaser enn subtilisin.

20. Vertscelle ifølge krav 15, karakterisert ved at nucleinsyren er ekstrakromosomal.

21. Vertscelle ifølge krav 18, karakterisert ved at nucleinsyren er kromosomal.

22. Fremgangsmåte for forbedring av varme- og pH-stabiliteten til et enzymatisk aktivt Bacillus-subtilisin med en aminosyresekvens som omfatter en Asn-Gly-sekvens, karakterisert ved at en rest i Asn-Gly-sekvensen fjernes eller én eller begge restene i Asn-Gly-sekvensen erstattes med en annen aminosyre.

23. Vaskemiddelblanding som omfatter en enzymatisk aktiv analog av et Bacillus-subtilisin, hvor Bacillus-subtilisinet har en aminosyresekvens som omfatter en Asn-Gly-sekvens, karakterisert ved at en av eller begge restene i Asn-Gly-sekvensen er fjernet.

24. Enzymatisk aktiv analog av et Bacillus-subtilisin, karakterisert ved at den enzymatisk aktive analog har en aminosyresekvens med færre Asn-Gly-sekvenser enn det som er til stede i Bacillus-subtilisinet.