DK175576B1 - Subtilisinanaloger - Google Patents

Description

i DK 175576 B1

Der tilvejebringes ifølge den foreliggende opfindelse en hidtil ukendt klasse af termisk stabile og pH-stabile subtilisinanaloger og en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne analoger. I særdeleshed angår 5 den foreliggende opfindelse en klasse af subtilisinana-loger med et modificeret calciumbindingssted, der giver forbedret calciumbindingskapacitet og en deletion og/eller erstatning af den ene eller den anden enhed i Asn-Gly-sekvenser, tilstede i subtilisinen. Den fore-10 liggende opfindelse angår yderligere detergentkompositioner, der indeholder sådanne subtilisiner, og anvendelsen af sådanne subtilisiner og kompositioner til rengøringsformål.

Udtrykket subtilisin betegner en gruppe af ex-15 stracellulære, alkaliske serinproteaser, der produceres af forskellige Bacillus arter. Disse enzymer kaldes også Bacillus serinproteaser, Bacillus subtilisiner eller bakterielle, alkaliske proteaser.

Bacillus subtilisin-molekyler er sammensat af 20 en enkelt polypeptidkæde på enten 274 enheder (i subtilisintypen Carlsberg produceret af Bacillus lichenlformis og i subtilisinen, der produceres af Bacillus subtilis stammen DY) eller 275 enheder (i subti-“"‘'lisintypen BPN', der produceres af Bacillus amylolicrue-25 faciens, aprA-genproduktet fra Bacillus subtilis, og subtilisinen fra Bacillus mesentericus). Når man sammenligner aminosyresekvenser af substilisiner fra forskellige stammer af Bacillus, anvendes sekvensen af subtilisin BPN' som standard. Baseret på en opstilling 30 af sekvenser, der giver den højeste grad af homologi mellem subtilisin Carlsberg og subtilisin BPN', kaldes serinen ved det aktive sted på den førstnævnte, serin 221, på trods af at den er beliggende ved position 220 DK 175576 B1 2 1 aminosyresekvensen. På samme måde kan position 220 i aminosyresekvensen i subtilisin Carlsberg siges at "svare til" position 221 i subtilisin BPN'. Se f.eks.

Nedkov et al., Hoppe-Seyler1 s Z. Physiol. Cem., 364, 5 1537-1540 (1983).

Røntgenstrukturen af subtilisin BPN· [Wright, et al., Nature, 221, 235 (1969)] afslørede at geometrien af det katalytiske sted på subtillsinen, der Involverer Asp^2, His®4 og Ser22·1·, næsten er identisk med det ak-10 tive sted i pattedyrs serinproteaser (f.eks. chymo-trypsin), hvilket involverer enhederne Asp102, His57 og Ser1^5. Imidlertid indikerer de overordnede forskellig mellem Bacillus serinproteaser og pattedyrs serinproteaser at disse er to ikke beslægtede familier 15 af proteolytiske enzymer.

I Bacillus subtilisinernes familie er fem subti-lisiners komplette aminosyresekvenser tilgængelige:

Carlsberg, [Smith, et al., J. Blol. Chem., 243, 2184-2191 (1968)]; BPN' [Markland, et al., J. Blol. Chem., 20 242, 5198-5211 (1967)]; aprA-genets produkt [Stahl,

et al., J. Bacterlol., 158, 411-418 (1984)]; DY

[Nedkov, et al., supra] og Bacillus mesenterlcus [Svendsen, et al., PEBS Letters, 196, 220-232 (1986)]. Subtilisin Carlsberg og subtilisin BPN' (nogle gange kaldt subtilisin Novo) adskiller sig fra hinanden ved 84 aminosyrer og en yderligere enhed i BPN' (subtilisin Carlsberg mangler en aminosyreenhed svarende til enheden nr. 56 i subtilisin BPN'). Subtilisin DY består af 274 aminosyrer og adskiller sig fra subtilisin Carls-berg ved 32 aminosy repos it ioner og fra subtilisin BPN' ved 82 aminosyreerstatninger og en deletion (subtilisin DY mangler en aminosyreenhed svarende til enheden nr.

56 i subtilisin BPN'). Aminosyresekvensen i aprA gen- 3 DK 175576 B1 produktet har 85% homolog! med aminosyresekvensen i subtillsin BPN'. Således forekommer det, at der er en omfattende homologi mellem aminosyresekvenserne i subtilisiner fra forskellige Bacillus stammer. Denne 5 homologi er komplet i bestemte områder af molekylet og specielt i de, der spiller en rolle ved de katalytiske mekanismer og ved substratbinding. Eksempler på sådanne ikke varierende sekvenser er de primære og sekundære substratbindingssteder, Ser125-Leu12^-Gly127_Gly128 og 10 Tyr104 og sekvenserne omkring den reaktive serin (221), Asn218-Gly219-Thr220-Ser221-Met222-Ala223.

Subtilisinmolekylerne udviser enestående stabile egenskaber. På trods af at de ikke er fuldstændig stabile over et bredt pH-område, er subtilisiner rela-15 tivt modstandsdygtige overfor denaturering med urinstof- og guanidinopløsninger, og deres enzymatiske aktivitet bevares i nogen tid i 8 M urinstof. I opløsninger med en pH-værdi under 4 taber subtillsin hurtigt og irreversibelt sin proteolytiske aktivitet. Gounaris, et 20 al., Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberq, 35, 37 (1965) demonstrerede at subtilisins syredeaktivering ikke skyldes en sædvanlig ladningseffekt og mente, at det skyldtes andre ændringer i molekylet, som f.eks. protonoverførsel til histidinenheder i molekylets indre 25 hydrofobe dele. Bacillus subtilisiner inaktiveres irreversibelt i vandige opløsninger med en hastighed, der i stor udstrækning afhængig af temperatur og pH. ved pH-værdier under 4 eller over 11 er inaktiveringshastigheden meget stor, mens hastigheden ved pH-værdier 30 på mellem 4,5 og 10,5, omend den er meget mindre forøges idet opløsningen bliver mere alkalisk. Mekanismerne i denne inaktivering er ikke fuldstændig kendt, men der foreligger tegn på at selvdigestion er ansvarlig for 4 DK 175576 B1 i det mindste en del af enzyminstabiliteten i dette pH-interval. Sædvanligvis følges en højere temperatur af en hurtigere subtilisindeaktiverings-hastighed ved ethvert pH.

5 Anvendelsen af proteaser i industlelle proces ser, der kræver hydrolysering af proteiner, har været begrænset på grund af enzyminstabilitet under driftbetingelserne. således havde f.eks. tilsætningen af trypsin til vaskedetergenter (f.eks. Bio-38, Schnyder; 10 Schweiz), for at lette fjernelsen af proteinholdige pletter, en meget begrænset succes, hvilket uden tvivl var et resultat af enzymustabilitet under vaskebetingelserne. Yderligere er detergentkompatible bakterielle alkaliske proteaser blevet anvendt i detergent-15 formuleringer.

Idet mange industrielle processer udføres ved temperaturer, der er over stabilitetsintervallet for de fleste enzymer, vil meget termostabile proteaser ikke kun være fordelagtige for specielle industrier, som 20 f.eks. i detergenter og hudafhåringspræparater, hvor der i forvejen kræves stabile proteaser, men kan være anvendelige i industrier, der anvender kemiske fremgangsmåder til hydrolysering af proteiner, f.eks. hydrolysering af grøntsags- og dyreproteiner til produk-25 tionen af suppekoncentrater.

På trods af at termisk inaktivering sikkert er den vigtigste faktor ved begrænsningen af den industrielle anvendelse af enzymer, kan andre faktorer, som f.eks. behovet for effektivitet over brede pH-områder 30 og anvendelsen af denatureringsstoffer, også have en skadelig effekt med hensyn til anvendelsen af proteaser i industrielle processer. Det er derfor ønskeligt at opnå en klasse af proteaser, karakteriseret DK 175576 B1 5 ved forbedret stabilitet med hensyn til temperatur, pH, denatureringsstoffer og andre betingelser, der kræves indenfor forskellige industrier.

Over de sidste adskillige år er der sket en 5 kraftig forandring i detergentformuleringer, især ved erstatningen af phosphater med skiftende buildere-og ved udviklingen af flydende vaskedetergenter, for at Imødekomme miljø og forbrugerkrav. Disse ændringer skaber et behov for ændringer af traditionelle deter-10 gentenzymer. Især er det blevet ønskeligt at anvende proteolytiske enzymer, der besidder såvel større lagerstabilitet i flydende vaskemidler som stabilitet og aktivitet i bredere pH- og temperaturintervaller.

En fremgangsmåde til fremstilling af modificere-15 de subtilisiner, der er anvendelige i detergentformuleringer, er anført i EP-patentansøgning nr. 130.756, hvori mutationer i subtilisinen fra Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens) ved positionerne Tyr"1, Asp32, Asn155, Tyr104, Met222, Gly166, 20 His64, Gly169, Phe189, Ser33, Ser221, Tyr217, Glu156 og/eller Ala152 blev påvist at give ændret stabilitet, ændret form eller at give ændringer i enzymets egenskaber. Især hævdes en mutation af Met222 til Ala eller Cys (hvilken mutant også udviser et skarpere pH-optimum 25 end vildtypen) eller Ser resultere i forbedret oxidationsstabilitet. Det er blevet foreslået at substitutionen af Gly166 med Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Asn,

Arg eller Val ville ændre enzymets kinetiske paramete-re. Imidlertid gav ingen af de beskrevne mutationer 30 analoger med større stabilitet ved høje temperaturer eller stabilitet i et bredere pH-interval end vildtypeenzymet .

Ved en anden fremgangsmåde afslørede Thomas, et al. Nature, 318, 375-376 (1985) at subtilisins pH- 6 DK 175576 B1 afhængighed kan ændres ved at ændre en Asp til Ser i Asp"-Gly100 i subtillsin BPN' . Denne ændring repræsenterer en ændring af en overfladeladning 14-15 Ångstrøm fra det aktive sted. Imidlertid kunne Thomas, et al.

5 ikke give nogen indikation af forbedring, når der ikke blev lavet nogen ændring i overfladeladningen, som det er tilfælde, når en uladet enhed substitueres med en anden.

En tredie fremgangsmåde, der er beskrevet i den 10 samtidigt verserende US-patentansøgning S.N. 829.241, angår en klasse af Bacillus serinproteaseanaloger, karakteriseret ved deletion og/eller modifikationer af en hvilken som helst Asn-Gly-sekvens, der er tilstede i proteasen.

15 Leszczynski et al., Science (1986) 849-855 og J.

Cell Blochem Supple 10A (1986), Abstract E105 henviser begge til et andet, ikke-karakterisereret calciumbindings ted i subtilisin.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en 20 klasse af subtilisinanaloger, karakteriseret ved, at have forbedret pH-stabilitet og termisk stabilitet, hvorved der fås sådanne analoger, der specielt er anvendelige i såvel detergentformuleringer som til andre processer, der kræver stabile proteaser.

25 Subtilisinanalogerne ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved at have en aminosyresekvens fra en naturligt forekommende Bacillus subtilisin, der er blevet modificeret ved at (1) en eller flere af aminosyrerne, der er til stede i et calciumbindingssted 30 repræsenteret af Asp41, Leu78, Asn78, Asn77, Ser78,

Ile78, Gly80, Val81, Thr2^8 og Tyr214 i det naturligt forekommende Bacillus subtilisin, er erstattet af en negativt ladet aminosyre; og (2) en eller flere af enh- 7 DK 175576 B1 ver Asn-Gly-sekvens i det naturligt forekommende Bacillus subtilisin er deleteret eller erstattet af en anden aminosyre, idet analogen har forbedret calciumbindingskapacitet med hensyn til naturligt forekommende 5 Bacillus subtilisin, og idet subtilisinanalogen ikke er subtilisin Carlsberg eller subtilisin DY.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer yderligere detergentkompositioner indeholdende den foreliggende opfindelses subtilisinanaloger og anvendelsen af 10 sådanne subtilisinanaloger og kompositioner til rengøringsformål .

Subtilisinanalogerne ifølge den foreliggende opfindelse udviser forbedret termisk stabilitet og pH-stabilitet, forbedret specifik aktivitet og bred 15 substratspecificitet, hvorved vaskeevnen af detergentformuleringer, der indeholder sådanne analoger, forbedres. Især giver den foreliggende opfindelses subtilisinanaloger . forbedret termostabilitet, forøget pH-stabilitet og højere specifik aktivitet, end der findes 20 i "vildtype" subtilisiner.

Yderligere angår den foreliggende opfindelse DNA sekvenser med kodoner, der koder for subtilisinanaloger som beskrevet ovenfor.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også 25 en fremgangsmåde til fremstilling af subtilisinanaloger, hvilken involverer en værtscelle med nucleinsyre, der koder for en subtilisinanalog som beskrevet oven- for. I en sådan celle kan den subtilisinanalogkodende nucleinsyre være kromosomal eller exstrakromosomal.

30 værtscellen udvælges fortrinsvis fra en stamme, der er mangelfuld med hensyn til udskilte proteaser, hvilket giver lettet isolering af analogerne ifølge den foreliggende opfindelse.

8 DK 175576 B1

Yderligere tilvejebringer den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til forbedring af den termiske stabilitet og pH-stabiliteten i subtilisiner, ved at modificere calciumbindingsstedet og/eller indføje 5 en aminosyre forskellig fra asparagin istedet for asparagin i en Asn-Gly sekvens, og især en asparaginen-hed i den position i subtilisinens aminosyresekvens, der svarer til position 218 i aminosyresekvensen som anført i tabel 1.

10 Fig. i illustrerer skematisk ringslutningen af

Asn-Gly-enheder, som f.eks. dem, der findes ved positionerne 218 og 219 i subtilisin som anført i tabel 1 til dannelse af anhydroaspartylglycin og skildrer også den base-katalyserede hydrolyse deraf;

15 Fig. 2 er et delvis restriktionskort af et aprA

gen indeholdende et EcoRI-KpnI-genfragment fra Bacillus subtilis (B. subtilis) stammen QB127 og omfatter et delvis restriktionskort af aprA-genet og flankerende sekvenser; 20 fig. 3 er et delvis restriktionskort af et plas- - mid pAMBll; fig. 4 er et flowskema, der illustrerer trinnene ved konstruktionen af pAMB113, et plasmid der styrer syntesen af [Ser]218-subtilisin fra B. subtilis værts- 25 celler; fig. 5 er et delvis restriktionskort af pAMB30 plasmid; fig. 6 illustrerer konstruktionen af ρΑΜΒΙΟβ; fig. 7 illustrerer konstruktionen af Ml3 mp!8 00 apr4.

Det skal bemærkes, at anvendelsen af udtrykket "subtilisin" henfører til en færdigt, udskilt form af enzymet, der mangler leadersekvenser, spaltet fra det DK 175576 B1 9 modne enzym før eller ved udskillelsen. Repræsentative subtilisiner, der kan modificeres i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, omfatter, men er ikke begrænset til naturligt forekomende, subtilisiner, 5 der repræsenteres af aminosyresekvensen i subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN', aprA genproduktet fra Bacillus subtilis, subtilisin DY og subtilisinen fra Bacillus mesentericus♦ Aminosyresekvensen for subtilisin Carlsberg er beskrevet af Smith, et al., J. Biol.

10 chem., 243, 2184-2191 (1968). Aminosyresekvensen for subtilisin BPN' er beskrevet af Markland, et al., J.

Biol. Chem., 242, 5198-5211 (1967). Aminosyresekvensen for subtilisin DY er beskrevet af Nedlov, et al., Hoppe-Seyler1 s Z. Physiol. Chem., 364, 1537-1540 15 (1983). Aminosyresekvensen for Bacillus mesentericus subtilisinen er beskrevet af Svedsen, et al., FEBS Letters, 196, 220-232 (1986). Aminosyresekvensen for aprA genproduktet fra Bacillus subtilis er beskrevet af Stahl, et al., J. Bacteriol,, 158, 411-418 (1984).

20 Aminosyresekvensen af sådanne subtilisiner er inkorporerede heri ved reference. Sådanne subtilisiner er karakteriseret ved at have calciumbindende steder, der er nødvendige for at stabilisere molekylet.

I overensstemmelse med den foreliggende opfin- 25 delse tilvejebringes der en klasse af subtilisinanalo- ger, der besidder forbedret calciumbindingskapacitet.

Calcium anvendes til at stabilisere subtilisin i pulver og flydende detergent, især ved anvendelser der kræver højere temperaturer. Den foreliggende opfindelse angår 30 modifikationen af subtilisinmolekylets calciumbindingssted for at forøge calciumbinding. Anvendt heri henfører udtrykket "modifikation af calciumbindingsstedet" til erstatning af en eller flere aminosyrer i et områ- 10 DK 175576 B1 de for et calciumbindingssted, der er tilstede i subti-lisinens aminosyresekvens, med en negativt ladet aminosyre, hvorved den resulterende subtilisinanalog bliver i stand til at få en yderligere negativ ladning. Man 5 har fundet at et calciumbindingssted i en subtilisin involverer de følger aminosyrer:

Asp41, Leu75, Asn78, Asn77, Ser7®, Ile7®, Gly80,

Val81, Thr208 og Tyr214 i forhold til aminosyresekven-sen, der er anført i tabel 1. Den foreliggende opfin-10 delse angår fortrinsvis erstatningen af en eller flere af de aminosyrer, der er til stede i calciumbindingsstedet, med en "negativt ladet" aminosyre som f.eks.

Asp og Glu og fortrinsvis Asp. Det bør bemærkes, at på trods af at Asp41 i calciumbindingsstedet er en 15 negativt ladet aminosyre, involverer en udførelsesform af den foreliggende opfindelse udskiftning af Asp41 til Glu41. De andre udførelsesformer angår udskiftninger forskellige fra udskiftning af Asp41.

En fortrukket udførelsesform af den foreliggende 20 opfindelse involverer en subtilisinanalog, hvori Asn78 omdannes til Asp78. En anden udførelsesform involverer udskiftningen af Ile7® med Asp7®. En foretrukket udførelsesform involverer en subtilisinanalog, hvori Asn77 er omdannet til Asp77. De mere foretrukne udførelses- 25 former af den foreliggende opfindelse involverer de ovenfor nævnte foretrukne modifikationer i calciumbindingsstedet, og substitutioner af Asn10® og Asn218 med Ser10® og Ser218, hvorved der elimineres to ustabile Asn-Gly sekvenser.

30 Udover calciumbindingsstederne, der er beskrevet ovenfor, kan subtilisiner have et eller flere yderligere calciumbindingssteder. Den foreliggende opfindelse omfatter modifikation af et eller flere af alle calciumbindingsstederne, der kan være til stede i sub- 11 DK 175576 B1 tilisinen. Antallet af calciumbindingssteder i enhver specifik subtilisin, der kan modificeres, afhænger af mange faktorer, f.eks. den specifikke subtilisin eller subtilisinanalogens bestemte anvendelse. Andre poten-5 tielle calciumbindingssteder, der kan være tilstede i subtilisiner, omfatter de følgende (1) Asp140 og Pro172; (2) Pro14 og Gin271; og (3) Pro172 og Glu195 eller Asp197. Det specifikke calciumbindingssted i hver molekyle afhænger af den bestemte subtilisin, 10 der skal modificeres. Som tidligere nævnt vil erstatningen af en eller flere af aminosyrerne i det ovennævnte potentielle calciumbindingssted resulterer i en subtilisin med forbedrede termiske egenskaber og pH-stabilitet. Repræsentative erstatninger omfatter 15 Asp140 med Glu14®, Pro172 med Asp172, Pro14 med Asp14,

Gin271 med Glu271, Glu197 med Asp197.

For yderligere at modificere calciumbindingsstedet i subtilisinmolekylet foretrækkes det at enhver Asn-Gly sekvens, der er tilstede i subtilisinen, dele-20 teres eller erstattes. Som tidligere afsløret i US-patentansøgning S.N. 819.241 er en bevaret sekvens, Asn-Gly, i positionerne 109-110 og specielt i positionerne 218-219 i Bacillus subtilisiner, blevet identificerede som faktoren, der er hovedansvarlig for pH-25 ustabiliteten af disse stoffer. For at eliminere dette ustabile element, Asn218-Gly219 fra subtilisinmolekylet, blev det afsløret enten af erstatte Asn218 med en hvilken som helst aminosyre forskellig fra asparagin og/eller udskifte Gly219 med en hvilken som helst 30 aminosyre forskellig fra glycin. På samme måde er modifikation af det ustabile Asn-Gly element i positionerne 109-110 beskrevet, at give stabilitet i de beskrevne analoger.

12 DK 175576 B1

Yderligere, har en foretrukket klasse af Bacillus subtilisinanaloger ifølge den foreliggende opfindelse, som tidligere anført, en aminosyresekvens, der, udover at omfatte en modifikation af et calcium->5 bindingssted, i steder der i Bacillus subtilisin indeholder en Asn-Gly-sekvens, ikke indeholder en Asn-Gly-sekvens i analogen, hvilken aminosyresekvens især indeholder færre Asn-Gly-sekvenser end i Bacillus subtilisinen. Helst indeholder en position svarende til 10 position 218 i aminosyresekvensen, som anført i tabel 1, ikke en asparaginylenhed, men i stedet en enhed af en anden aminosyre, fortrinsvis en aminosyre udvalgt blandt serin, valin, threonin, cystein, glutamin og isoleucin. I den grad erstatning af asparagin med be-15 stemte aminosyrer kan give anledning til forstyrrelse i konformation af det aktive sted, (f.eks. på grund af sterisk hindring, der kan indføres ved tilstedeværelsen af en aromatisk aminosyre, eller ændring i tertiær struktur, som f.eks. kan indføres ved tilstedeværelsen 20 af en prolinenhed) vil substitution med sådanne aminosyrer almindeligvis være mindre foretrukket. I den grad erstatning af asparagin med andre aminosyrer kan indføre en ladet gruppe (f.eks. asparaginsyre) i nærheden af det aktive sted, vil en sådan substitution på 25 samme måde være mindre foretrukket. Illustrerende for en nuværende foretrukket udførelsesform er en analog med et modificeret calciumbindingssted og en [Ser218] modifikation af Asn-Gly sekvensen i subtilisinen. Alternative udførelsesformer af analoger i betragtning 30 i forbindelse med opfindelsens, er dem med et modificeret calciumbindingssted, og hvori Asn109 i subtilisin BPN' eller i aprA genproduktet fortrinsvis er erstattet med serin, og hvor glycinenhederne i positionerne 110 DK 175576 B1 13 og/eller 219 er erstattet dem forskellige aminosyreen-heder. I andre subtilisiner er modifikation af et eller flere calciumbindingssteder og substitution af Asn62 eller Gly63 i subtilisinerne Carlsberg eller DY også 5 omfattet af den foreliggende opfindelse.

På grund af deres evne til at udskille væsentlige mængder af proteiner, og fordi de for tiden anvendes til at producere detergentproteaser, repræsenterer Bacillus mikroorganismer en foretrukket vært for 10 rekombinantfremstilling af subtilisinanalogerne ifølge den foreliggende opfindelse. Fordi de fleste Bacilli udskiller alkaliske og neutrale proteaser foretrækkes det, at mutationer indføres i de endogene alkaliske og neutrale proteasegener af B. subtilis, således at de 15 muterede subtilisiner kan produceres og udskilles af B. subtilis i et medium, der er fri for andre proteaser. Således tilvejebringer den foreliggende opfindelse mutantstammer af B. subtilis, der er blokkeret med hensyn til syntesen af endogene proteaser, men bibehol-20 der evnen til at syntetisere og udskille subtilisinanalogerne, der er beskrevet heri.

Som beskrevet i detaljer herunder blev det fundet, at pH-stabiliteten og den termiske stabilitet og stabiliteten i detergentformuleringer af den 25 foreliggende opfindelses subtilisinanaloger var signifikant højere end den hos vildtype aprA genprodukt subtilisinen og Carlsberg subtilisinen.

En subtilisinanalog ifølge opfindelsen kan fremstilles i overensstemmelse med den følgende frem-30 gangsmåde; 1) Isolering af det repræsentative subtilisingen aprA fra subtilis; 2) kloning af aprA genet i en vektor, der tillader udnyttelsen af oligonucleotidmålrettet muta-genese til dannelse af de ønskede modifikationer; 14 DK 175576 B1 3) målrettet mutagenese og sekvenering af det resulterende DNA til bekræftelse af tilstedeværelsen af den ønskede mutation; 4) konstruktion af en expressionsvektor til 5 styring af syntesen af det muterede enzym i subtilis; 5) konstruktion af muterede B_;_ subtilis stammer, der ikke syntetiserer subtilisin og neutral protease; 6) isolering af enzymet i det exstracellulære 10 vækstmedium og dets oprensning; 7) udførelse af fremgangsmåder til insertion af genet, der koder for det forbedrede enzym i kromosomet • i en Ek subtilis stamme, i forvejen muteret for at blokkere syntesen af endogene proteaser.

15 Anvendt heri er de specifikke subtilisinanaloger anført ved angivelse af de erstattede eller deleterede aminosyrer i parenteser. F.eks. betyder en [Ser109] subtilisin et subtilisinmolekyle med en serin i amino-syreposition 109 og en [Ser189, Ser2*8] subtilisin be-20 tyder et subtilisinmolekyle med en serin i aminosyre-positionerne 109 og 218.

I eksempel 1 er aprA genet, der koder for subtilisin, isoleret fra subtilis genomet. I eksempel 2 er aprA genet udsat for målrettet mutagenese. I eksem-25 pel 3 konstrueres en ekspressionsvektor med det muterede aprA gen. I eksempel 4 fremstilles en [Ser189] sub-tilisinanalog. Eksempel 5 beskriver fremstillingen af en [Ser189, Ser 218] subtilisinanalog. Eksempel 6 beskriver fremstillingen af en [Asp76, Ser109, Ser210] 30 subtilisinanalog. I eksempel 7 fremstilles en [Asp76,

Asp77, Ser109, Ser218] subtilisinanalog. Eksempel 8 beskriver fremstillingen af en [Asp76, Glu79, Ser189,

Ser218] subtilisinanalog. I eksempel 9 konstrueres 15 DK 175576 B1 2 mutantstammer af subtilis,, der ikke producerer nogle målelige ekstracellulære proteaser. Eksempel 10 beskriver fremgangsmåder til integration af et muteret aprA gen i kromosomet i subtilis. I eksempel 11 iso-5 leres og oprenses vildtype og mutant aprA subtilisiner. Eksemplerne 12-14 sammenligner termostabiliteten af [Ser218] subtilisin med den fra vildtype aprA genproduktet .

Foruden en subtilisinanalog fra den forliggende 10 opfindelse kan detergentkompositioner i den foreliggende opfindelse indeholde: (a) Mindst ét overfladeaktivt stof, der kan være anionisk, ikke-ionisk, eller amphotert, eller en vandopløselig sæbe. Typisk anvendes et anionisk over- 15 fladeaktivt stof (f.eks. en lineær alkylarylsulfonat) blandet med et ikke-ionisk (f.eks. en alkylphenyl-polyglycolether) i mængder på henholdsvis 5-30 og 1-5 vægt% af detergentkompositionen.

(b) Et eller flere buildere, fortrinsvis med en 20 ledsagende afsondringssekvestreringsfunktion. Natrium- tripolyphosphat, natriumcitrat, natriumsilicat og zeoliter er eksempler på sådanne komponenter, sædvanligvis udgør de fra 10-70 vægt% af detergentkompositio-. . nen.

25 (c) Et blegemiddel, fortrinsvis en peroxyfor bindelse som f.eks. natriumperborat, typisk indeholdt i en mængde på op til 30 vægt% af kompositionen.

(d) Hjælpestoffer som f.eks. carboxymethyl-cellulose, optiske blegemidler og parfumer. Eventuelt 30 tilsættes et pH-indstillende stof for at give et pH i vaskemidlet, i området fra 8,0 til 10,5.

Detergentkompositionerne indeholder en effektiv mængde af en eller flere af subtilisinanalogerne ifølge 16 DK 175576 B1 den foreliggende opfindelse. Den heri anvendte "effektive mængde af en subtilisinanalog" henfører til den mængde af subtilisinanalog, der er nødvendig til at opnå den nødvendige enzymatiske aktivitet i den speci-5 fikke detergentkomposition. Sådanne effektive mængder konstateres let af fagmanden og er baseret på mange faktorer, som f.eks. den bestemte subtilisinanalog der anvendes, vaskeanvendelsen, detergentkompositionens specifikke sammensætning, om der kræves flydende eller 10 tør komposition og lignende.

Opfindelsens bestemte subtilisinanalogpræparat tilsættes i en mængde, der er udregnet til at give en enzymaktivitet på mindst 1,0 Anson-enheder (AU, nedenfor), fortrinsvis 0,5-2,5 AU per 100 g detergent-15 komposition. Der kan eventuelt afvej es til 100% ved hjælp af et uorganisk fyldstof, fortrinsvis natriumsulfat.

Flydende detergentkompositioner kan fremstilles ud fra enzymopslæmninger, fortrinsvis i ikke-vandige 20 medier. Typisk består sådanne opslæmninger af en suspension af fint formalet subtilisinanalogkoncentrat i ... et flydende ikke-ionisk overfladeaktivt stof, f.eks. Tergitol 15 S 9 eller en blanding af sådanne overfladeaktive stoffer. Sædvanligvis vil opslæmningen også 25 indeholde en eller flere uorganiske fyldstoffer, som f.eks. fint formalet natriumchlorid, eventuelt blandet med en suspensionsstabilisator, f.eks. silicarøg (Aerosil 200). Tergitol og Aerosil er varemærker.

En subtilisinanalog ifølge opfindelsen tilsættes 30 i en mængde beregnet til at give en proteaseaktivitet på mindst 0,1 AU, fortrinsvis 0,5-2,5 AU per 100 g flydende detergentkomposition.

Detergentkompositionen kan fremstilles ifølge den sædvanlige fremgangsmåde, f.eks. ved at sammenblan- DK 175576 B1 17 de komponenterne. Alternativt laves en forblanding, der bagefter blandes med de resterende ingredienser.

På grund af de gode stabilitets- og aktivitetsegenskaber, der er beskrevet, kan subtilisinanalogerne 5 ifølge den foreliggende opfindelse anvendes på alle områder, hvor proteolytiske enzymer sædvanligvis anvendes. I særdeleshed kan de anvendes som detergenter og skurepulvre eller pletfjernere, som et afhåringsmiddel ved garvning, og også i levnedsmidde-10 lindustrien til fremstilling af proteinhydrolysater og i serologien til påvisning af mangelfulde antistoffer.

Det er især fordelagtigt til anvendelsen i levnedsmiddelindustrien og i serologien, at subtilisinanalo-gerne ifølge den foreliggende opfindelse har fortrinlig 15 stabilitet i den faste eller opløste form, således at fysiologisk acceptable mængder af calciumioner ikke er nødvendige for at stabilisere subtllisinanalogen i vandige opløsninger, i modsætning andre enzympræparater.

De følgende eksempler vil tjene til yderligere 20 illustrering af opfindelsen på trods af, at det vil være underforstået, at opfindelsen ikke er begrænset til disse specifikke eksempler.

Eksempel 1 25 B_;_ subtilis stammen QB127 (trpC2 leuA8 sacU^200) [Lepesant, et al., Molec. Gen. Genet., 118, 135-160 (1982)] blev skaffet fra Bacillus Genetic Stock Center ved Ohio State University, Columbus, Ohio. Denne stamme overproducerer ekstracellulære serin og metalprotea-30 ser, a-amylase og levansucrase i forhold til isogene sacu* stammer på grund af den pleiotropiske effekt af sacU^200 mutationen [Lepesant, et al., in Schlessin-ger, D.,udg., Microbiology, 1976, American Society for 18 DK 175576 B1

Microbiology, Washington, D.C., s. 65 (1976)]. Således er stammen QB127 anvendelig som kilde til DNA til isolering af aprA genet, der koder for subtilisin.

Der blev isoleret genomisk DNA fra celler af B.

5 subtilis stammen QB127 i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Salto, et al., Biochem. Biophys.

Acta. 72, 619-629 (1963). Oprenset chromosomalt DNA

blev digesteret fuldstændig med EcoRI restriktions-endonucelase.

10 De resulterende DNA-fragmenter blev adskilt på en lavt-smeltende agarosegel ved hjælp af elektro-forese, og fragmenterne i 4,4-8,0 kilobase (kb) området blev isoleret. Disse fragmener blev ligeret ind i pCFM936 (A.T.C.C. nr. 53.413 fra American Type Culture 15 Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland), et Escherichia coli (E. coll) plasmid, der udviser højere kopital ved forhøjede temperaturer og giver kana-mycinresistens. Vektoren blev digesteret med EcoRI og dephosphoryleret med intestinalalkalisk kalvephosphata-"20 se før ligering.

Ligeringsprodukterne blev indført i EL_ coli C600 (A.T.C.C. nr. 23724 fra American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) og efter inkubering natten over på L-agar forsynet med 25 io yg/ml kanamycin, blev kanamycinresistente værtsceller selekteret. Plasmid DNA blev amplificeret ved inkubering af de selekterede værtsceller ved 42°C i 4 timer. Kolonierne blev derefter overført til nitrocellulosefiltre og behandlet i overensstemmelse med 30 en kolonihybridiseringsfremgangsmåde, der er beskrevet af Grunstein, et al., Proc. Natl. Acad. Scl. (USA), 72, 3961 (1975).

Der blev anvendt en oligonucleotidprobe til at screene efter kolonier, der indeholdt subtilisingenet DK 175576 B1 19 på pCFM936. Proben, der blev syntetiseret ifølge phosphitmetoden, der er beskrevet af Beaucage, et al.. Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862 (1981) havde nucleo-tidsekvensen 5 5' GCGCAATCTGTTCCTTATGGC 3' der svarer til den amino-terminale ende i aprA genproduktet (Wong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.-10 (USA), 81, 1184-1188 (1984); Stahl, et al.,

Bacteriol., 158, 411-418 (1984). Der blev anvendt en hybridiseringstemperatur på 55°C, og der blev identificeret fem positive kolonier af ialt 400. Plasmid DNA'et fra en af de positive kolonier fik benævnelsen pCFM936 15 apr2.

Plasmid pCFM936 apr2 blev fordøjet med EcoRI alene, med Hind 111 alene og med en kombination af EcoRI og Hlndlll. Størrelserne af EcoRI fragmenterne fra subtilis ingenet stemte overens med dem, der er be-20 skrevet i Stahl, et al., supra, men der blev opdaget ·> adskillige andre ubeskrevne Hindlll steder. Som beskrevet heri i eksempel 3, blev to af Hlndlll stederne anvendt ved den genetiske manipulation af subtilisin-genet.

25 Det blev fastslået at et stort 6,5 kb EcoRI

fragment fra subtills QB127 genomisk DNA bar aprA genet, dets regulatoriske sekvenser og ikke beslægtede flankeringssekvenser ved bekræftelse af at re-striktionsenzymdigetionsprodukterne svarede til resul-30 taterne, der var rapporteret af Stahl, et al., supra.

Dette blev bekræftet ved DNA sekvensering ved at anvende dideoxykædedetermineringsmetoden, der er beskrevet af Sanger, et al., J. Mol. Blol., 143, 161-178 (1980).

20 DK 175576 B1

Et 3,0 kb EcoRI til Kpnl delfragment af det 6,5 kb store EcoRI fragment, som illusteret i fig. 2, blev også fundet at indeholde aprA genet, dets regulatoriske sekvenser og ikke beslægtede flankeringssekvenser.

5 På trods af at KpnI-EcoRI fragmentet rapporteres at være 2,5 kb lang af Stahl, et al., og i teksten til fig.

1 deri, afsløres sammenligning af målestokken i fig.

1 og den udmålte afbildning af fragmentet heri, at KpnI-EcoRI fragmentet, selv i Stahl, et al., er væsent-10 ligt større end 2,5 kb.

På følgende måde blev der konstrueret en kloningsvektor, plasmid pAMBll, til Bacillus værtssystemerne. Plasmidet pTG402 (Northern Regional Research Laboratories, United States Department af Agriculture, 15 Peoria, Illinois, stamme nr. NRRL B-15264) blev delvis digesteret med Rsal restriktionsendonuclease. Fragmenterne blev ligeret ind i Ml3 mpl8 (tilgængelig fra Bet-hesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland som katalog nr. 8227SA), der forinden var blevet 20 digesteret med HindII. Ligeringsprodukterne blev indført i EL_ coli JM103 (tilgængelig fra Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey som katalog nr. 27-1545-01) ved transformation i overensstemmelse med fremgangsmåden fra Mandel, et al., J. Mol. Biol., 53, 154, (1970).

25 Bacteriofageplaques blev oversprøjtet med 0,5M catechol (fremstillet i destilleret vand) for at påvise den funktionelle ekspression af et xylE gen stammende fra pTG402. xylE genet koder for catechol-2,3-dioxygenase og er anvendelig til måling af promotorer i mange 30 forskellige organismer [Zukowsky, et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. (USA), 80, 1101-1105 (1983)]- xylE genet blev derefter overført som et 1,0 kb EcoRI til PstI fragment til E^ coll/B. subtilis plasmi- 21 DK 175576 B1 det pHV33 (tilgængelig fra American Type Culture Collection som A.T.C.C. 39217) [Primrose, et al. Plasmid, 6, 193-201 (1981)] opnået fra R. Dedonder (Institut

Pasteur, Paris, Prance). pHV33 plasmidet var i for-5 vejen fordøjet med EcoRI og PstI således at det xylE-holdige fragment, når det blev ligeret ind i dette område, ville inaktivere et ampicillinresistensgen.

Det resulterende plasmid, pAMB2l, indeholder et funktionelt xylE gen i coli værtsceller men kræver til-10 sætningen af en promotor, for at xylE kan udtrykkes i B. subtilis værtsceller. E^_ coli celler indeholdende pAMB21 er tetracylinresistense (15 yg/ml) og chloramphenicol res is tente (20 pg/ml), mens B^ subtilis cellerne indeholdende pAMB21 kun er chloramphenicol-15 resistente (5 pg/ml).

Den toop transkriptionsterminerende sekvens i bacteriofage lambda blev transformerede fra plasmid pCFM936 (på et 400 basepar PstI til Bqlll fragment) til det enestående PstI sted på pAMB21. Der blev 20 fremstillet et syntetisk nucleotid med sekvensen, 5' GATCTGCA 3', til sammenbinding af Bqlll yderpunktet i tQOp fragmentet med PstI stedet i vektoren PAMB21.

Det resulterende plasmid fik benævnelsen pAMB22 og havde egenskaber, der var identiske med pAMB21 und-25 tagen inkluderingen af en transkriptionsterminator. pAMB22 plasmidet er anvendeligt til påvisning af stærke promotorer, der er funktionelle i subtilis.

Det 1,4 kb store EcoRI til Bqlll fragment af DNA fra pAMB22, der indeholder xylE og tQOp blev isoleret 30 fra en lavt-smeltende agarosegel efter elektroforese af restriktionsfragmenter. 1,4 kb stykket af DNA'et blev ligeret ind i plasmid pBD64 (tilgængelig fra Bacillus Gentic stock Center, nr. 1E22), der forinden 22 DK 175576 B1 var digesteret med BcoRI og BamHI♦ Det resultrende 5,3 kb plasmid, pAMBll indeholder polylinkersekvensen fra M13mpl8 (EcoRi, Sstl, Xmal, Sma, BamHI og Xbal) før xylE genet, der følges af tOQp, som vist i fig. 3.

5 pAMBll plasmidet er i stand til at replikere i B. subtilis og giver værtscellerne resistens overfor chloramphenicol (5 pg/ml) og/eller kanamycin (5 yg/ml).

Som illustreret i fig. 4 blev det oprensede EcoRI til Kpnl fragment med aprA klonet over på aAMBll 10 for at give pAMBlll. Ligeringsprodukterne blev indført i B^ subtil is MI112 (arg-15 leuB thr5 recE4) (tilgængelig fra Bacillus Genetic Stock Center som nr, 1A423) ved hjælp af protoplasttransformationsfrem-gangsmåden, der er beskrevet af Chang, et al.. Mol.

15 Gen. Genet., 168, 111-115 (1979). B^ subtills MI112 uden plasmid-DNA er proteasedannende (Prt+fænotype), men de udskilte niveauer af subtilisin er temmelig lave. chloramphenicol-resistente (Cmr) transformanter blev overført til L-agarplader med 1,5% (vægt/vol.) 20 skummetmælk og 5 pg/ml chloramphenicol og derefter inkuberet ved 37°C.

Efter inkuberlng ved 37°C i ca. 16 timer dannede kolonierne af MI112, indeholdende plasmidet pAMBlll, en klar ring omkring hver koloni. Ringene blev 25 dannet ved den proteolytiske indvirkning af subtilisin på caseinkomponenten i skummetmælksmediet. MI112 med pAMBll vektoren alene havde ikke nogen synlig ring efter 16 timers inkubering, omend der eventuelt fremkom en svag ring efter 40 timers inkubering ved 37°C.

30 Cellerne med pAMBlll kunne klart skelnes fra cellerne med pAMBll ved hjælp af forskelle i ringstørrelse. Kloningen af aprA genet i en fuldt funktionel form førte således til højt produktionsniveau og 23 DK 175576 B1 udskillelse af subtilisin fra subtilis.

Eksempel 2

Som illustreret i fig. 4 blev et 3,0 kb stort 5 EcoRI til Kpnl genomisk fragment, hvis isolering er beskrevet i eksempel l, digesteret med Hindlll for at danne tre fragmenter: (1) et 1,1 kb stort EcoRI til

Hindlll fragment med genetiske regulatoriske sekvenser for aprA genekspression, "for-pro"-område af genet, 10 der kræves til ekstracellulær udskillelse af subtilisin, og DNA sekvensen, der koder for de første 49 aminosyrer af modent subtilisin; (2) et 1,1 kb stort Hindlll til Hindlll fragment med DNA sekvenserne, der koder for aminosyrerne 50-275 (carboxyl-terminal ende) 15 i subtilisin sammen med en transkriptlonsterminerende sekvens og 3’ ikke-kodende sekvenser; og (3) et 0,8 kb stort Hindlll til Kpnl fragment indeholdende 3· ikke-kodende sekvenser.

Det i,i kb store fragment flankeret af Hindlll 20 stederne blev klonet ind i det eneste Hindlll sted i bakterifag Ml 3 mp!8 med henblik på DNA-sekvensering og målrettet mutagenese. En af rekombinanterne, med benævnelsen Ml3 mp!8 apr2, tilvejebragte en enkeltst renget templat-DNA, der kræves til målrettet muta-25 genese i aprA genet.

De kodende områder i aprA genet blev sekvenseret og resulterede i sekvensen, der er anført i tab. 1 heri. Det bør bemærkes, at den specifikke identitet af de initiale 5 kodoner i leaderområdet må tilskrives 30 den af Stahl, et al., supra, og Wong, et al., supra, beskrevne sekvensinformation for aprA genet, og at der eksisterer kodonsekvensforskelle fra Stahl, et al., supra, ved aminosyrepositionerne 84 og 85. Specifikt 24 DK 175576 B1 rapporterer Stahl, et al., supra, om et kodon GTT (der koder for valin) i aminosyreposition 84, mens kodonet GTA (der også koder for valin) forekommer i tabel l. Stahl, et al., supra, rapporterer også om 5 et kodon AGC (der koder for serin) i aminosyreposition 85 i modsætning til kodonet GCG (der koder for alanin) i tabel 1.

25 TABEL 1 -105 DK 175576 B1

Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala GTG AGA AGC AAA AAA TTG TGG ATC AGC TTG TTG TTT GCG

Leu Thr Leu Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala

TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCG TTC AGC AAC ATG TCT GCG

Gin Ala Ala Gly Lys Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val

CAG GCT GCC GGA AAA AGC AGT ACA G AA AAG AAA TAC ATT GTC

Gly Phe Lys Gin Thr Met Ser Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys

GGA TTT AAA CAG ACA ATG AGT GCC ATG AGT TCC GCC AAG AAA

Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly Lys Val Gin Lys Gin

AAG GAT GTT ATT TCT G AA AAA GGC GGA AAG GTT C AA AAG C AA

Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu Asp Glu Lys

TTT AAG TAT GTT AAC GCG GCC GCA GCA ACA TTG GAT G AA AAA

Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr Val

GCT GTA AAA G AA TTG AAA AAA GAT CCG AGC GTT GCA TAT GTG

-1 +1

Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gin Ser Val Pro

G AA G AA GAT CAT ATT GCA CAT G AA TAT GCG C AA TCT GTT CCT

10

Tyr Gly Ile Ser Gin Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gin

TAT GGC ATT TCT C AA ATT AAA GCG CCG GCT CTT CAC TCT C AA

20 30

Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser

GGC TAC ACA GGC TCT AAC GTA AAA GTA GCT GTT ATC GAC AGC

40

Gly Ile Asd Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly

GGA ATT GAC TCT TCT CAT CCT GAC TTA AAC GTC AGA GGC GGA

50 60

Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gin As? Gly GCA AGC TTC GTA CCT TCT G AA ACA AAC CCA TAC CAG GAC GGC 1

Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu

AGT TCT CAC GGT ACG CAT GTA GCC GGT ACG ATT GCC GCT CTT

26 TABEL 1 (fortsat) DK 175576 B1 60

Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser

AAT AAC TCA ATC GGT GTT CTG GGC GTA GCG CCA AGC GCA TCA

90 100

Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gin

TTA TAT GCA GTA AAA GTG CTT GAT TCA ACA GGA AGC GGC C AA

110

Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn

TAT AGC TGG ATT ATT AAC GGC ATT GAG TGG GCC ATT TCC AAC

120 130

Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly

AAT ATG GAT GTT ATC AAC ATG AGC CTT GGC GGA CCT ACT GGT

140

Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser

TCT ACA GCG CTG AAA ACA GTC GTT GAC AAA GCC GTT TCC AGC

150

Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser

GGT ATC GTC GTT GCT GCC GCA GCC GGÅ AAC GAA GGT TCA TCC

160 170

Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser

GGA AGC ACA AGC ACA GTC GGC TAC CCT GCA AAA TAT CCT TCT

180

Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gin Arg Ala

ACT ATT GCA GTA GGT GCG GTA AAC AGC AGC AAC CAA AGA GCT

190 200

Ser Phe Ser Ser Ala Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro

TCA TTC TCC AGC GCA GGT TCT GAG CTT GAT GTG ATG GCT CCT

210

Gly Val Ser Ile Gin Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly

GGC GTG TCC ATC CAA AGC ACA CTT CCT GGA GGC ACT TAC GGC

220

Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly

GCT TAT AAC GGA ACG TCC ATG GCG ACT CCT CAC GTT GCC GGA

230 240

Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn

GCA GCA GCG TTA ATT CTT TCT AAG CAC CCG ACT TGG ACA AAC

250

Ala Gin Val Arg Aso Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

GCG CAA GTC CGT GAT CGT TTA GAA AGC ACT GCA ACA TAT CTT

27 TABEL 1 (fortsat) DK 175576 B1 260 270

Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gin GGA AAC TCT TTC TAC TAT GGA AAA GGG TTA ATC AAC GT A C AA

275

Ala Ala Ala Gin OC

GCA GCT GCA CAA TAA TAGTAAAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCT TCTTTTTATTTGTCAGCATCCTGATGTTCCGGCGCATTCTC

28 DK 175576 B1

Bakteriofag Ml 3 mp!8 apr2 blev konstrueret ved indsætning af et 1,1 kb stort Hlndm til Hindlll fragment fra subtills QB127 genomisk DNA, der bar nu-cleotidsekvenser kodende for aminosyrerne 50-275 5 {carboxyl-terminal ende) i aprA-subtilisln sammen med en transkriptionsterminerende sekvens og 3' ikke-kodende sekvenser, i det enestående Hindlll sted i bakteriofag Ml3 mp!8. For at eliminere de 3' ikke-kodende sekvenser, blev der indført et Kpnl restriktionsendo-10 nucleasested, ved målrettet mutagenese i en position der følger umiddelbart efter den transkriptionsterminerende sekvens.

Målrettet mutagenese blev udført i overensstemmelse med fremgangsmåden, der er beskrevet af Norrander 15 et. al.. Gene, 26, 101-106 (1983). Enkeltstrenget DNA fra Ml3 mp!8 apr2 blev annealet med en primer, x x 5' TCCTGAGGTACCGGCGCATTC 3' 20 der var syntetiseret ved hjælp af phosphitfrerngangsmå-den, der er beskrevet af Beaucage et. al., Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 (1981). Primeren var homolog med nucleotidet i dette området undtagen i 2 positioner 25 (mærket med kryds), hvor en thymin (T) var udskiftet til guanin (G) og en anden thymin (T) var udskiftet med adenin (A), hvorved der dannedes et Kpnl sted (understreget) i dette område.

Primeren blev hybridiseret med Ml3 mp!8 apr2 DNA 30 ved 65°C og det hybridiserede DNA blev langsomt afkølet til omtrent 22°C og derefter polymeriseret i 2 timer ved 15°C i en reaktionsblanding, der bestod af 12,5 μΐ af annealet DNA opløsning, 2,5 pi 10 mM af henholds- 29 DK 175576 B1 vis dATP, dCTP og dGTP, 20 μΐ af 12 mM ATP, 0,1 μΐ Kle-now DNA polymerase, 0,1 μΐ T4 DNA ligase og 13 μΐ sterilt destilleret vand. Det resulterende dobbeltstrengende, kovalent lukkede, cirkulære DNA blev indført 5 i L coli JM103 ved transformering.

Bakteriofagplagues blev derefter overført til Gene Screen ™(New England Nuclear, Beverly, Massachusetts) hybridiseringsmembraner. Plaques der Indeholdt DNA med de ønskede baseændringer blev identificeret 10 ved hjælp af hybridisering med det radioaktivt mærkede (Y_32pj syntetiske nucleotid, der anvendes til den mutagene primerreaktion, der er beskrevet ovenfor. Hybridisering blev udført ved en restriktionstemperatur (65°C), for at kun DNA med en Kpnl mutation ville hy-15 bridisere med det syntetiske oligonucleotid. Tilstedeværelsen af Kpnl mutationen før aprA genet på DNA fra en enkelt, oprenset plaque, benævnet Ml 3 mpl8 apr2 Kpnl, blev bekræftet ved hjælp af DNA-sekvensering ifølge fremgangsmåden, der er beskrevet af Sanger et.

20 al., supra og restriktionsenzymanalyse.

Et 1,1 kb stort fragment med de fleste af de 3' ikke-kodende områder blev deleteret ved digestion af Ml3 mp!8 apr2 Kpnl med Kpnl, ligering af digetionsprodukterne ved en koncentration på 500 ng DNA/ml og 25 indføring af ligeringsprodukterne i EL coli JM103 ved transformering. Bakteriofagplaque indeholdende DNA med den ønskede 0,35 kb store deletion blev . identificeret ved restriktionsendonucleaseanalyse. Bakteriofag fra en sådan plaque blev benævnt Ml 3 mp!8 30 apr4 (fig. 7). M13 mpl8 apr4 tilvejebringer enkelt-strenget skabelon-DNA for målrettet mutagenese i aprA genet, der er beskrevet herefter i eksempel 3.

DK 175576 B1 30

Eksempel 3

For at udtrykke muterede subtilisingener i B. subtilis, blev plasmidet pAMB106 konstrueret som en bærer for det muterede gen på følgende måde: 5 1) pAMBI 11 blev digesteret med Hindlll. Et 1,1 kb stort fragment med det meste af aprA genet blev deleteret ved re-ligering af Hindlll digestionsprodukterne af pAMBI 11 ved en koncentration på ca. 1 yg/ml.

Dette resulterede i dannelsen af pAMBUO som illusteret 10 i fig. 4. pAMBUO plasmidet bærer genetisk regulerende sekvenser for ekspressionen af subtilisingenet, "for-pro" området, der kræves til udskillelse af subtilisin, og DNA sekvensen, der koder for det 3' ikke-kodende område i færdig subtilisin og de første 49 aminosyrer 15 i færdig subtilisin.

2) Plasmid pAMBUO blev digesteret med en blanding af BamHI og Pstl. Ditte producerede DNA-fragmenter af to størrelser, 6,2 kb og 1,0 kb. 1,0 kb fragmentet bar xylE genet, der koder for catechol-2,3-deoxygenase, 20 fra TOL-plasmidet i Pseudomonas putida mt-2 (Zukowski et. al., supra).

3) Det større 6,2 kb BamHI-Pstl fragment blev selvligeret ved hjælp af et enkeltstrenget syntetisk oligonucleotid, 5' GATCTGCA 3', hvilket var syntetise- 25 ret ved hjælp af phosphitfremgangsmåden, der er beskrevet af Beaucage et al., supra, og T4 DNA-ligase. Ligeringprodukterne blev indført i B^ subtilis MI112 (arg-15 leuB thr5 recE4) (tilgængelig fra Bacillus Gentic Stock Center som nr. 1A423) ved hjælp af proto-30 plasttransformationsfremgangsmåden, der er beskrevet af Change et. al., Mol. Gen. Genet. 168, 111-115 (1979).

Chloramphenicol-resistente (CmR) kolonier blev screenet for plasmidindhold. Det 6,2 kb store plasmid 31 DK 175576 B1 pAMB106 blev identificeret ved hjæp af restriktions-endonucleaseanalyse. Det er identisk med plasmid pAMBUO med undtagelse af at xylE er blevet slettet ved deletion (fig. 6).

5 Fordi ρΑΜΒΙΟδ mangler DNA, der koder for amino- syrerne 50-275 i aprA subtilisinen, syntetiserer det ikke subtilisin, når det indføres i B^ subitills værtceller. Subtilisin syntetiseres kun efter insertion af det resterende af subtilisingenet, f.eks. den naturlige 10 DNA-sekvens eller en analog-kodende sekvens.

Eksempel 4

Fremstilling af en [serin109]-subtilisinanalog.

Enkeltstrenget DNA fra bakteriofag Ml 3 mp!8 apr4 15 blev hybridiseret med en primer, x 5' TGG ATT ATT AGC GGC ATT GAG TGG 3' 106 107 108 109 110 111 112 113

20 TRP ILE ILE SER GLY ILE GLU TRP

der var syntetiseret ved hjælp af phosphitfremgangsmåden, der er beskrevet af Beaucage et. al., supra. Primeren var homolog med nucleotiderne, der indeholdt 25 kodonerne for aminosyrerne 106-113 i aprA-subtilisin med undtagelse af en baseændring (mærket med et kryds), hvor et A var udskiftet med et G for at give overgangen, der ville ændre Asn109 (kodon AAC) til Ser109 (kodon AGC).

30 Primeren blev annealet med M13mpl8 apr4-DNA

ved 65 °C og det annealede DNA blev langsomt afkølet til ca. 22"C og derefter polymeriseret, ligeret og transformeret som beskrevet i eksempel 2.

Bakteriofagplaques blev overført til hybridise-ringsmembraner, hvorefter de, der indeholdt DNA med 32 DK 175576 B1 den ønskede baseændring, blev identificeret ved hybri-disering med et radioaktivt mærket (a-82P)-oligonucleo-tid, der anvendes til den mutagene primings reaktions, der er beskrevet ovenfor. Hybridiseringen blev udført 5 ved 65°C. En positiv plague indeholdt bakteriofag med benævnelsen M13mpl8 apr4fSer109]« Dobbeltstrenget DNA fra bakteriofag blev digesteret med en blanding af Hindlll og Kpnl, hvorefter det 750 bp store fragment med den muterede del af aprA-subtilisingenet blev lige- 10 ret med pAMB106, der i forvejen var digesteret med Hindlll og Kpnl. Det resulterende plasmid, pAMB129, kan indføres i passende subtilis værtsceller til syntetisering og udskillelse af [Ser109]-subtilisin.

15 Eksempel 5

Fremstilling af en [serin 109, serin 218]-subtilisin-analog.

Enkeltstrenget DNA fra M13mpl8 apr4[Ser109] blev hybridiseret med en primer: 20 x 5' GGC GCT TAT AGC GGA AC 3’ 215 216 217 218 219 220

GLY ALA TYR SER GLY THR

25 der var syntetiseret ved hjælp af phosphitfremgangsmåden, der er beskrevet af Beuacage et. al., supra. Pri-meren var homolog til nucleotiderne med kodonerne for aminosyrerne 215-220 i aprA-subtillsin med undtagelse 30 af et baseskift (mærket med et kryds), hvor en A var udskiftet med et G for at lave overgangen, der ville ændre Asn218 (kodon AAC) til Ser218 (kodon AGC). Betingelserne for annealing, polymerisering, transformering 33 DK 175576 B1 og identifikation af positive plagues var som beskrevet i eksempel 2. En enkelt, oprenset plague indeholdt bak-terofag med benævnelsen M13mpl8 apr4 [Ser109, Ser218]. Dobbetstrenget DNA fra denne bakteriofag blev digeste-5 ret med en blanding af Hindlll og Kpnl, hvorefter et 750 bp stort fragment med de to mutationer blev ligeret ind i ρΑΜΒίΟβ, der i forvejen var digesteret med • Hindlll og Kpnl. Det resulterende plasmid, pAMB130, kan indføres i B^ subtilis værtsceller til syntetisering og 10 udskillelse af [Ser109, Ser218]-subtilisin.

Eksempel 6

Fremstilling af en [Asp 76, Ser 109 Ser 218]-subtili-sinanalog.

15 Enkeltstrenget DNA fra Ml3mpl8 apr4 [Ser109,

Ser218j blev annealet til en primer: x 5' GCT CTT GAT AAC TCA ATC 3' 20 74 75 76 77 78 79

ALA LEU ASP ASN SER ILE

der var syntetiseret ved phosphitfremgangsmåden, der er beskrevet af Beaucage et. al., supra. Primeren var 25 homolog med nucleotiderne med kodonerne for aminosyrer- ne 74 til 79 i aprA-subtlllsin med undtagelse af en baseændring (mærket med et kryds), hvor et A var ændret til et G for at danne overgangen, der ville ændre Asn76 (kodon AAT) til Asp76 (kodon GAT).

30 Primeren blev annealet til M13mpl8 [Ser109,

Ser218]-DNA ved 65 °C, og det annealede DNA blev langsomt afkølet til omtrent 22 °C og polymeriseret, ligeret og transformeret som beskrevet i Eksempel 2.

Bakteriofagplaques blev overført til hybridise-. ringsmembraner, og de der indeholdt DNA med den ønskede DK 175576 B1 34 baseændring blev identificeret ved hybridisering som beskrevet i Eksempel 2, undtagen at hybridiseringen blev udført ved 46 °C. En positiv plague indeholdt bakteriofag med benævnelsen M13mpl8 apr4 [Asp76, 5 Ser1®®, Ser21®]. Dobbeltstrenget DNA fra bakteriofagen blev digesteret med en blanding af Hindlll og Kpnl, hvorefter et 750 bp stort fragment med de 3 mutationer i aprA-subtillsIngenet blev ligeret med pAMB106, der i forvejen var digesteret med Hindlll og Kpnl. Det 10 resulterende plasmid, pAMB131, kan indføres i B_^ subtilis værtceller til syntetisering og udskillelse af [Asp76, Ser109, Ser218]-subtilisin.

Eksempel 7 15 Fremstilling af en [Asp76, Asp77, Ser109, Ser218]-sub-tilisinanalog.

Enkeltstrenget DNA fra Ml3mpl8 apr4 [Asp76,

Ser1®9, Ser218] blev annealet til en primer:

20 XX

5’ GCT CTT GAT GAT TCA ATC CGT 3' 74 75 76 77 78 79 80 ALA LEU ASP ASP SER ILE GLY 1 2 3 4 5 der var syntetiseret ifølge phosphitfremgangsmåden, der er beskrevet af Beaucage et. al., supra. Primeren var homolog med nucleotiderne, der indeholdt kodonerne for aminosyrerne 74 til 80 i [Asp76, Ser109, 2

Ser218]-subtilisin med undtagelse af to baseændring 3 30(mærket med krydser), hvor et A var ændret til et G og en C var ændret til et T for at overgangerne, der 4 ændrede Asn77 (kodon AAC) til Asp77 (kodon GAT).

5

Primeren blev annealet til M13mpl8 apr4 [Asp76, Ser109, Ser218]-DNA ved 65 °C, og det annealede 35 DK 175576 B1 DNA blev langsomt afkølet til omtrent 22 eC og po-lymeriseret, ligeret og transformeret som beskrevet i Eksempel 2.

Bakteriofagplaques blev overført til hybridise-5 ringsmembraner, og de der indeholdt DNA med de ønskede baseændringer blev identificeret ved hybridisering som beskrevet i Eksempel 2, bortsæt fra at hybridiseringen blev udført ved 45 eC. En positiv plague indeholdt bak-terifag med benævnelsen Ml3mpl8 apr4 [Asp76, Asp77, 10 Ser189, Ser218]. Dobbeltstrenget DNA fra bakteriofagen blev digesteret med en blanding af Hindlll og Kpnl, hvorefter det 750 bp store fragment med de 4 mutationer i aprA-subtilisingenet blev ligeret med pAMB106, der i forvejen var digesteret med Hindlll og Kpnl. Det resul- 15 terende plasmid, pAMB132, kan indføres i B^ subtilis-værtceller til syntetisering og udskillelse af [Asp76,

Asp77, Ser109, Ser218]-subtilisin.

Eksempel 8 20 Fremstilling af en [Asp76, Glu79, Ser109, Ser218]-sub-tilisinanalog.

Enkeltstrenget DNA fra Ml3mpl8 apr4 [Asp76,

Ser189, Ser218] blev annealet til en primer: 25 xxx 5' T GAT AAC TCA GAA GGT GTT CTG G 3’ 75 76 77 78 79 80 81 82 83 ASP ASN SER GLU GLY VAL LEU 1 3er var syntetiseret ved hjælp af phosphitfremgangsmå-den, der er beskrevet af Beaucage et. al., supra. Pri-meren var homolog med nucleotiderne, indeholdende de delvise kodoner for aminosyrerne 75 og 83 og fuld- 36 DK 175576 B1 stændige kodoner for aminosyrerne 76 til 82 i [Asp76,

Ser109, Ser218]-subtilisin med undtagelse af tre baseændringer (mærket med krydser), hvor et A var ændret til et G et T var ændret til et A, og et C var æn-5 dret til A, hvilket ændrede Ile79 (kodon ATC) til Glu79 (codon GAA).

Primeren blev annealet til M13mpl8 apr4 [Asp76,

Ser189, Ser218]-DNA ved 65 °C, og det annealede DNA

blev langsomt afkølet til omtrent 22 "C og polymerise-10 ret, ligeret og transformeret som beskrevet i Eksempel 2.

Bakteriofagplaques blev overført til hybridise-ringsmembraner, og de, der indeholdt de ønskede baseændringer, blev identificeret ved hybridisering som bes-15 krevet i Eksempel 2, bortsæt fra at hybridiseringen blev udført ved 45 °C. En positiv plaque indeholdt bak-teriofag med benævnelsen M13mpl8 apr4 [Asp76, Glu79,

Ser109, Ser218]. Dobbeltstrenget DNA fra bakteriofagen blev digesteret med en blanding af Hindlll og Kpnl, 20 hvorefter et 750 bp stort fragment med de 4 mutationer i aprA-subtilisingenet blev ligeret til pAMBl06, der i forvejen var digesteret med Hindlll og Kpnl. Det resulterende plasmid, pAMB133, kan indføres i B_;_ subtllis-værtceller til syntetisering og udskillelse af [Asp76, 25 Glu79, Ser189, Ser218]-subtilisin.

Eksempel 9

Fordi de fleste Bacilli udskiller alkaliske og/eller neutrale proteaser til det omgivende medium, 30 foretrækkes det, at mutationerne indføres i endogene, alkaliske og neutrale proteasegener i B.subtilis for at blokere deres syntese, således at muterede subtili-singener, når de indføres i mutantcellen, kan producere 37 DK 175576 B1 muterede subtilisiner, der derefter vil blive udskilt i et medium fri for andre proteaser, der sandsynligvis vil interfere med isoleringen af intakte substilisina-naloger. To mutante B. subtilis stammer BZ24 og BZ25, 5 der ikke producerer målelige ekstracellulære proteaser, blev konstrueret i overensstemmelse med den følgende fremgangsmåde.

Først konstrueres en plasmidbærer, der kan re-plikeres i E.coli, men ikke i B_^ subtilis med mindre 10 den integreres i B_^ subtllis-kromosomet ved homolog rekombination, på følgende måde. Plasmid pBD64 (Bacillus Genetic Stock Center, nummer 1E22) blev digesteret fuldstændig med Hpall for at danne tre fragmenter på 2,95 kb, 1,0 kb og 0,75 kb. En blanding af disse frag-15 menter blev derefter ligeret ind i plasmid pBR322 (A.T.C.C. 37017), der i forvejen var digesteret med

Clal. Ligeringsprodukterne blev indført i E.coli C600 (tilgængelig fra American Type Culture Collection som A.T.C.C. 23724) ved transformation [Mandel, et al., 20 Mol. Biol,, 53, 154 (1979)]. Der blev selekteret efter chloramphenicolresistente celler (20 yg/ml) og ampicil-linresistente celler (50 yg/ml). Plasmid-DNA fra 12 transformanter blev fremstillet ved en alkalisk ek- w straktionsmetode, der er beskrevet af Birnboim, et al., 25 Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979) og derefter digesteret med en blanding af Hindlll og EcoRI for at bekræfte tilstedeværelsen af indført(e) fragment(er).

%-Et sådant plasmid, med benævnelsen pAMB30, blev fundet at bære 1,0 og 0,75 kb Hpall-fragmenterne fra pBD64 i 30 Clal-stedet i pBR322. Disse fragmenter indeholdt chlor-amphenicolacetyltransferase (cat)-genet, der er virksomt i E.coli og B^_ subtilis. Digestion med Bqlll og S au 3 A hver for sig bekræftede identiteten og orien- 38 DK 175576 B1 teringea af cat-genet i pAMB30, som illustreret i fig.

5.

Fordi pAMB30 mangler en replikationsorigonsek-vens, der er funktionel i B.subtilis, kan den ikke re-5 plikere som et autonomt replikon i Ek subtilis-værtceller. På den anden side indeholder pAMB30 det pBR322-afledte replikationsori, der er funktionelt i E.coll, således kan plasmidet propageres i E.coli-værtceller. Plasmid pAMB30 er nyttigt på mindst to 10 måder. Først kan et DNA-fragment, der indeholder et i B. subtil!s funktionelt replikationsori, påvises når det klones over i pABM30, således at plasmidet vil re-plikere autonomt i den extrakromosomale tilstand. For det andet kan plasmid pAMB30 integreres i genomet i 15 b^ subtllls på et sted med homolog! mellem kromosomet og subtilis-DNA, der er klonet ind i pAMB30. Dette er blevet demonstreret af Haldenwang, et al., J.

Bacteriol., 142, 90-98 (1980) og Young, J. Gen.

Microbiol., 129, 1497-1512 (1983) ved at anvende plas-20 mldbærer, svarende til, men ikke identisk med, pAMB30.

Plasmid pAMB21 (beskrevet i Eksempel 1) blev digesteret med BcoRI og Pstl for at isolere xylE genet på et 1,0 kb fragment. Fragmentet blev ligeret med pAMB30, der i forvejen var skåret med EcoRI og Pstl.

25 Ligeringsprodukterne blev indført i E.coli C600 ved transformation. Der blev udført selektion efter chlo-ramphenicolresistente (20 yg/ml) værtceller, der var ampicillinsensitivie (50 yg/ml) på grund af inser-tionen af xylE-fragmentet fra pAMB21 i det strukturelle 30 amplcillinresistensgen i pAMB30. Det resulterende plasmid pAMB30/21, havde egenskaber, der var identiske med pAMB30, men havde yderligere et funktionelt xylE gen.

Plasmid pAMBUO, der bar ved deletion det slettede aprA-gen deleteret fra et område, der koder for DK 175576 B1 39 de sidste 226 aminosyrer af modent subtilisin, blev digesteret med EcoRI og Kpnl. Det 1,9 kb store fragment fra B> subtilis-DNA, med genetisk regulerende sekvenser for apr A genekspressionen, "pre-pro"-området, DNA-5 sekvensen, der koder for de første 49 aminosyrer af modent subtilisin og 3' ikke-kodende sekvenser, blev ligeret ind i pAMB30/21, der i forvejen var digesteret med EcoRI og Kpnl. Ligeringsprodukterne blev indført i E.coll C600 ved transformation. Plasmid-DNA fra adskil-10 lige transformanter blev isoleret ved hjælp af den alkaliske ekstraktionsmetode ifølge Birnboim, et al., supra, og tilstedeværelsen af det insatte 1,9 kb store fragment blev bekræftet ved hjælp af flere restrik-tionsendonucleasefordøjeiser. Et sådant plasmid, med 15 betegnelsen pAMB301, blev bibeholdt til yderligere anvendelse.

B. subtilis stammen BGSC1A274 (Bacillus Genetic Stock Center) bærer en mutation i npr stedet og er ude af stand til at producere extracellulær neutral 20 protease. Plasmidet pAMB301 blev integreret i genomet i subtilis BGSC1A274 ved transformation af kompetente celler [Spizizen, Proc. Natl. Acad. Scl. (USA), 44, 1072-1078 (1958)]. Der blev selekteret efter chloramphenicol-resistente (5 yg/ml) værtceller, der 25 derefter blev overført til L-agar tilsat 1,5% (vægt/vol.) skummetmælkspulver og (5 yg/ml) chloramphenicol ved hjælp af sterile tandstikkere. De celler, der ikke var i stand til at producere en klar ring omkring kolonien, var mangelfulde med hensyn til 30 at producere ekstracellulære, neutral proteaser og se-j rinproteaser p.g.a. kombinationen af npr-mutationen og den nyligt indførte aprA-mutation. aprA-mutationen var en deletion af de sidste 226 aminosyrer i modne 40 DK 175576 B1 subtilisin, p.g.a. erstatningen af vildtype aprA genet med den deleterede version, der bæres af pAMB30l.

En sådan stamme, med benævnelsen BZ24, har Npr- Apr~

Cmr fænotype, og producerer således hverken nogen måle-5 lig ekstracellulær, neutral protease eller extracel-lulær alkalisk protease og er resistent overfor chloramphenicol op til 5 pg/ml. Southern blot [Southern, J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975)} blev anvendt til at bekræfte deletionen i aprA genet i kromosomet i sub-10 tilis BZ24. Dyrkningen af subtilis BZ24 i antibiotisk medium nr. 3 (Penassay Broth, Difco, Detroit, Michigan) uden antibiotikaselektion i omtrent 32 generationer førte til isoleringen af en afledt stamme af BZ24, hvori cat genet, der giver chloramphenicolresi-15 stens i værtcellerne, var tabt p.g.a. dets ustabilitet i BZ24 kromosomet. Et sådant fænomen er tidligere observeret af Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984). En chloramphenicol-sensitiv organisme afledt af BZ24 blev betegnet BZ25. subtilis BZ25 har 20 fænotypen Npr- Apr-, og således producerer den hverken målelig ekstracellulær, neutral protease eller ekstracellulær, alkalisk protease. Southern blot blev anvendt til at bekræfte deletionen i aprA genet på kromosomet i B_j_ subtilis BZ25.

25 Fordi subtilis BZ25 hverken producerer måle lig, ekstracellulær neutral protease eller subtilisin, er den en anvendelig værtstamme til indføring af plas-mid-DNA, som f.eks. pAMB113, til produktionen af muterede subtilisiner, der kan udskilles i det omgivende 30 vækstmedium, fri for andre proteaser.

B. subtilis BZ25 producerer ingen målelige extracellulære proteaser, når kultursupernatanterne analyseres som beskrevet herunder. B_;_ subtilis 41 DK 175576 B1 BZ25/pAMBll3, hvilket er BZ25 med plasmidet pAMB113 (indført ved hjælp af protoplasttransformationsfremgangsmåden ifølge Chang, et al., supra) producerer væsentlige mængder af [Ser218]-subtilisin, når kultursu-5 pernatanterne analyseres som beskrevet.

Eksempel 10

Integretion af [Ser218]-subtilisingenet i kromosomet i B^ subtllis menes at tilvejebringe en effek-10 tiv måde til at forøge den genetiske stabilitet af dette mutantgen. En sådan fremgangsmåde dæmper også behovet for chloramphenicol i fermenteringsmediet, hvilket ellers er nødvendigt til frembringelse af selektivt pres, til bevarelse af plasmid-DNA i den extrachromo-15 somale form. Derfor blev [Ser218]-subtilisingenet isoleret sammen med dets genetisk regulerende sekvenser og flankerende dna homolog til B^ subtilis kromosomet fra en lavtsmeltende agarosegel efter elektroforese af pAMBH3, der var digesteret med en blanding af EcoRI og 20 PstI. Det 4,0 kb store EcoRI til PstI fragment (illusteret i fig. 4) blev derefter ligeret til pAMB30 (illusteret i fig. 5), der var digesteret med en blanding af EcoRI og PstI. Ligeringsprodukterne blev ind- . ført i Eh coli HB101 (A.T.C.C. 33694} ved transforma-25 tion. Der blev selekteret efter chloramphenicolresistente celler (20 pg/ml). Plasmid-DNA fra fire trans-formanter, der imødekom det ovennævnte kriterier, blev isoleret ved hjælp af den alkalisk ekstraktionsmetode ifølge Birnboim, et al., supra, og derefter digesteret .30 med en blanding af EcoRI og PstI. Alle fire plasmider indeholdt det 4,0 kb store insert og den 5,6 kb store resterende del af pAMB30. Et sådant plasmid, med benævnelsen pAMB302, blev oprenset og bevaret til yderligere anvendelse.

42 DK 175576 B1

Gentagne forsøg på at integrere plasmid pAMB302 i kromosomet i b^ subtilis BZ25 ved hjælp af kompetencefremgangsmåden [spizizen, supra] mislykkedes.

Dette kan skyldes BZ25 cellernes manglende evne til 5 at blive kompetente ved den anvendte fremgangsmåde.

Derfor blev pAMB302 indført i B^ subtills BZ25 celler ved hjælp af protoplasttransformatlonsfremgangsmåden ifølge Chang, et al., supra. Dette resultat er især si-« gnlfikant, idet der blev selekteret forskningsstammer, 10 hvori integretion var blevet opnået, på basis af transformation ved hjælp af kompetencefremgangsmåden. Stammer, der er ude af stand til at blive kompetente, og i særdeleshed industrielle stammer, der ikke blev selekteret på basis af transformation ved hjælp af 15 kompetencefremgangsmåden, kan være mere tilbøjelige til at være ude af stand til at blive kompetente.

Der blev selekteret efter chloramphenicol-resistente celler (5 yg/ml), der derefter ved hjælp af tandstikkere blev overført til L-agar tilsat 1,5% 20 (vægt/vol.) skummetmælk og 5 yg/ml chloramphenicol. Cellerne blev inkuberet natten over ved 37°C. Der blev observeret klare ringe med forskellige diametre omkring Cmr-kolonierne. Dette indikerede at subtilisin blev produceret og udskilt af disse celler. Der blev gjort 25 et forsøg på at isolere plasmid-DNA fra 8 af disse kolonier ved hjælp af den alkaliske ekstraktionsfremgangsmåde. Der blev ikke påvist noget plasmid-DNA på agarosegeler, der blev farvet med ethidiumbromid (1 yl/ml) for at synliggøre DNA efter elektroforese. Det 30 manglende extrakromosomale plasmi-DNA i Cmr-cellerne, der producerer subtilisin, var en stærk indikation af, at pAMB302 var blevet integreret i kromosomet i B. subtilis.

DK 175576 B1 43

Adskillige kolonier fra dette eksperiment blev isoleret og benævnt BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 og BZ33. Hver stamme blev dyrket natten over ved 37°C under kraftig omrøring i hjerne-hjerte infusionsmedium 5 (BHI, Difco) tilsat 5 pg/ml chloramphenicol. Kultur-supernatanterne blev testet for subtilisinaktivitet.

B. subtilis stammerne BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 og BZ33 producerede alle subtilisin og udskilte det i det omgivende vækstmedium, idet nogle stammer producerede 10 mer end andre. Mængden af subtilisin, der blev observeret i de flydende kulturmedier, var direkte propotio-nale med størrelsen af ringen, der blev observeret på skummetmælks L-agar plader. På grund af at disse cellers udskilte subtilisinmængder varierede, var der 15 integreret mange kopier af pAMB302 i chromosomet, eller der havde fundet en amplifikation sted [Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983); Albertini, et al., J. Bacterlol., 162, 1203-1211 (1985)]. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Eksempel 11 2

Vildtype-subtilisin fra BZ25/pAMBlll og [Asp76, 3

Ser109, Ser218]-subtilisinanalog fra BZ25/pAMB131 blev 4 isoleret og oprenset på følgende måde. Hvert kulturnæ 5 ringsmedium blev centrifugeret ved 15.000 g i 30 min., 6 og protein i den klare supernatant blev bundfældet med 7 (NH4)2S04 (350 g per liter). Bundfaldet blev opsamlet 8 ved hjælp af centrifugering, tritureret ved hjælp af 9 75% acetone, filtreret og tørret under vakuum.

10

Por at rense enzymet yderligere blev det tørrede 11 bundfald opløst i vand, og opløsningen blev filtreret og derefter dialyseret over for 0,02M natriumphosphat-puffer ved pH 6,3. Den dialyserede opløsning blev sendt igennem en kolonne (2,5 x 15 cm) af carboxymethylcellu- 44 DK 175576 B1 lose med en hastighed på 2 ml per min. Efter vaskning af kolonnen med 0,02M natriumphosphat (pH 6,3) blev enzymet elueret med den samme puffer, indeholdende 0,15M natriumchlorid. Topfraktionerne blev sammenblan-5 det og protein fraktionerne indeholdende enzymet, identificeret ved hjælp af et farveskift i en prøve af fraktionen blandet med succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid (Vega Biochemi-cals), blev udfældet ved tilsætning af 2,5 volumener 10 acetone. Bundfaldet blev opsamlet ved centrifugering og derefter opløst i 0,005M calciumacetat (ca. 1 ml per 10 mg). Den resulterende opløsning blev dialyseret ved 4eC overfor vand og derefter frysetørret.

15 Eksempel 12

Ren subtilisin eller subtilisinanalog blev anbragt på en PFLC Superose 12 kolonne, og materialet, der elueredes som det intakte (ikke spaltede) protein blev sammenblandet i 20 mM MES, 0,1 M NaCl, 10 mM 20 CaCl2, pH 6,3. Prøverne af vildtype subtilisin eller subtilisinanalog ifølge den foreliggende opfindelse, der skulle undersøges, blev inkuberet i 10 min. i den samme puffer, pufferen plus 3% SDS, eller 20 mM MES, 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl2 go 15 mM EDTA ved den anførte 25 temperatur. Prøverne blev afkølet til stuetemperatur i 5 min. og derefter testet i 20 min. ved stuetemperatur (20°C) i Tris-HCl, pH 8,0 med 0,6% azocasein for at måle den proteolytiske aktivitet. Den proteoly-tiske aktivitet i hver prøve er udtrykt som procent 30 af den oprindelige aktivitet af enten vildtype eller analog, ved 20°C i 10 mM CaCl2, og er anført i tabel 2.

DK 175576 B1 45 TABEL 2

Proteolytisk aktivitet af viltype-subtilisin.

5 Temperatur 0% SD5 3% SDS 0% SDS + 15 mM EDTA

20 100 8 100 35 100 0 62 50 95 0 37 10 70 14 0 14 100 0 0 0 15

Aktivitet af [Asp76, Ser109, ser218]-subtilisinanalog fra eksempel 5.

Temperatur 0% SDS 3% SDS 0% SDS + 15 mM EDTA

20 20 100 55 91 50 100 12 94 100 5 0 5 1 2 3 4 5 6

Eksempel 13 2

Der blev opnået intakte subtilisiner ved hjælp 3 af PPLC på superose 12 kolonnen. De intakte subtilisi 4 ner blev inkuberet i 30 min. ved stuetemperatur (20oC) 5 i 15 mM MES, 0,05 M Nacl, pH 6,3 med enten 4 mM CaCl2 6 eller 4 mM EDTA, og en varierende mængde SDS. Enzymets proteolytiske aktivitet blev derefter bestemt ved en 20 min's inkubering i 0,6% azocasein i Tris-Cl, pH 8,0.

Hver prøves målte, proteolytiske aktivet er anført i 46 DK 175576 B1 tabel 3 som procentvis angivelse af den oprindelige aktivitet af prøven i 0% SDS og 10 mM Ca2+.

TABEL 3 5

Proteolytisk aktivitet af vildtype-subtilisin.

% SDS 4 mM Ca2* 4 mM EDTA

10 0 100 94 0,1 100 76 0,25 100 45 0,50 76 13 0,75 63 3 15 1,0 60 0 2.0 29 0 3.0 17 0

Proteolytisk aktivitet af [Asp7**, Ser^·®^, Ser2^·®]- 20 subtilisinanalog.

% SDS 4 mM Ca2* 4 mM EDTA

0 100 95 25 0,1 100 95 0,25 100 86 0,50 100 81 0,75 96 79 1.0 96 78 30 2,0 86 69 3.0 71 65 DK 175576 B1 47

Eksempel 14

Stabiliteterne af [Asp76, Ser109, Ser218]-subti-llsinanalog, [Asp76, Glu79, Ser*®9, Ser2*8]-subtilisin-analog og subtilisin-Carlsberg blev målt ved tre tempe-5 raturer (25°C, 37°C og 50°C) i to pufferopløsninger (0,05M natriumphosphat, pH 9,0 eller 0,12 M natrium-glycinat, pH 11,0). Resultaterne er anført 1 tabel 4 som halveringstider for enzymerne under de specificerede betingelser.

DK 175576 B1 48 TABEL 4 A. I 0.12M natriumglycinat pH 11,0 + 0,2¾ SD5.

Subtilisin t| (2S*C) t|(37«C) t|(50»C) (Asp76, Ser*09, Ser2*8] analog 110 dage 3 5 7 2 timer 6?7 timer subtilisin Carlsberg 2 dage 8,4 timer 0.,53 timer (Asp76, Glu79, Ser109, Ser218] analog 154 dage 35,3 timer 7^8 timer B. I 0.Q6M natriumphosphat pH 9,0 + 0,2¾ SDS.

Subtilisin t| (2SaC) tj(37«C) t|(S0*C) (Asp76, Set109, Ser218] analog 79.,2 timer 16.,0 timer 0^52 timer subtilisin Carlsberg 17,3 timer 2,4 timer 0,18 timer (Asp76, Glu79, Ser109, Ser218] analog 86,3 timer 22,0 timer o,96 timer C. I 0.12M natriumglycinat pH 11,0 + 5 mM EDTA.

Subtilisin t} (25aC) t j, ( 37»C) t|( 509C) (Asp76, Ser109, Ser218) analog 28,7 timer 1,87 timer o,25 timer subtilisin Carlsberg 24 timer 1,71 timer 0,45 timer (Asp76, Glu79, Ser109, Ser218] analog 21,5 timer 1,42 timer 0,20 timer D. I 0.06M natriumphosphat pH 9,0 + 5 mM EDTA.

Subtilisin tj (25°C) t }(37»C) t^(50BC) (Asp76, Ser*09, Ser218] analog 27,4 timer 1,75 timer 0^23 timer subtilisin Carlsberg 26,3 timer 1,6 8 timer 0,3 2 timer (Asp76, Glu79, Ser*89, Ser2*8] analog 19,7 timer 1,36 timer 0^17 timer 49 DK 175576 B1

Mens den foreliggende opfindelse er beskrevet ved hjælp af foretrukne udførelsesformer, siger det sig selv, at modifikationer og forbedringer vil være indlysende for fagmanden. Således forventes det at substi-5 tution af enheder i calciumbindingssteder ud over ved det specifikke calcium, der er beskrevet heri, ligeledes vil forøge stabiliteten. Der forventes yderligere stabilitetsforbedringer for sådanne subtitutioner lavet i andre enzymer, der har Asn-Gly-sekvensen og i andre 10 proteiner med denne sekvens. Yderligere forventes det at subtilisinanalogen ifølge den foreliggende opfindelse besidder udmærkede egenskaber i forhold til vildty-pesubtilisiner ved detergenformuleringer, som f.eks. dem, der er beskrevet i f.eks. US-patent nr. 3.732.170; 15 US-patent nr. 3.749.671 og US-patent nr. 3.790.482, der alle er inkorporeret heri ved reference.

Af praktiske årsager udføres mange industrielle processer desuden ved temperaturer, der ligger over stabilitetsområdet for de fleste enzymer. Derfor, for-20 modes det, skønt der er lagt vægt på detergentanvendelserne heri, at termostabile subtilisin-analoger ifølge den foreliggende opfindelse ikke blot er fordelagtige for bestemte industrier, som f.eks. detergentindustrien, der allerede forlanger stabile subtilisiner, men 25 også kan være anvendelige i industrier, der anvender kemiske fremgangsmåder til hydrolysering af proteiner f.eks. hydrolysering af grøntsags- og dyreproteiner til .r £ fremstillingen af suppekoncentrater.

Derfor er det meningen, at den foreliggende op-30 findelse omfatter alle sådanne modifikationer og forbedringer, der ligger indenfor opfindelsens rammer.

Claims (22)

50 DK 175576 B1

1. Subtilisinanalog, kendetegnet ved, at den har en aminosyresekvens for en naturligt forekommende Bacillus subtilisin, der er modificeret ved 5 at; (1) en eller flere af aminosyrerne, der er til stede i et calciumbindingssted repræsenteret af Asp41, Leu75, Asn76, Asn77, Ser7®, Ile79, Gly80, Val81, Thr208 og Tyr214 i det naturligt forekommende Bacillus subtili- 10 sin, er erstattet af en negativt lade aminosyre; og (2) en eller flere af enhver Asn-Gly-sekvens i det naturligt forekommende Bacillus subtilisin er de-leteret eller erstattet af en anden aminosyre, idet analogen har forbedret calciumbindingskapacitet med 15 hensyn til naturligt forekommende Bacillus subtilisin, og idet subtilisinanalogen ikke er subtilisin Calsberg eller subtilisin DY.

2. Tyr214, kendetegnet ved, at man erstatter en aminosyreenhed i calciumbindingsstedet med en negativt ladet aminosyre og erstatter eller deleterer en eller flere af aminosyrerne i Asn-Gly-sekvensen.

2. Subtilisinanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analogen er en analog af en na- 20 turlig forekommende Bacillus subtilisin udvalgt blandt subtilisin Carlsberg, subtilisin DY, subtilisin BPN', eb aprA subtilisin fra Bacillus subtililis og subtilisin fra Bacillus mesentericus.

3. Subtilisinanalog ifølge krav 1 eller 2, 25 kendetegnet ved, at Asn76 er erstattet med Asp76.

4. Subtilisinanalog ifølge krav 3, kendetegnet ved, at Asn77 er erstattet med Asp77.

5. Subtilisinanalog ifølge krav 1 eller 2, 30 kendetegnet ved, at Ile79 er erstattet med Glu79.

6. Subtilisinanalog ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at Asn76 er erstattet med 51 DK 175576 B1 Asp76, og Asn77 er erstattet med Asp77.

7. Subtilisinanaloge ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at Asn76 er erstattet med Asp76, og Ile79 erstattet med Glu79.

8. Subtilisinanalog ifølge krav 1, kende tegnet ved, at en Asn enhed i Asn-Gly-sekvensen er erstattet af en enhed af en anden aminosyre.

9. Analogen ifølge krav 8, kendetegnet ved, at en Asn enhed i Asn-Gly-sekvensen er 10 erstattet med en aminosyreenhed valgt blandt Ser, Val, Thr, Cys, Glu og Ile.

10. Subtilisinanalog ifølge krav 9, kendetegnet ved, at Asn enheden i Asn-Gly-sekvensen er erstattet med Ser.

11. Subtilisinanalog ifølge krav 10, kende - tegnet ved, at en Asn enhed i position 109 er erstattet af Ser.

12. Subtilisinanalog ifølge krav 10, kendetegnet ved, at en Asn enhed i position 218 er 20 erstattet af Ser.

13. Subtilisinanalog ifølge krav 10, kendetegnet ved, at Asn enheder i positionerne 109 og 218 er erstattet af Ser.

14. Subtilisinanalog ifølge krav 13, kende- 25 tegnet ved, at den er udvalgt blandt [Asp76, Ser109, Ser218]-subtilisin, [Asp77, Ser109, Ser218] - subtilisin, [Glu79, Ser109, Ser218] -subtilisin, [Asp76, Asp77, Ser109 Ser218] -subtilisin og [Asp76, Glu79, Ser109, Ser218] subtilisin.

15 Ser109, Ser218]-subtilisin.

15. Subtilisinanalog ifølge krav 1, kende tegnet ved, at Bacillus subtilisinen har en naturligt forekommende aminosyresekvens, der er indeholdt i tabel 1. 52 DK 175576 B1

16. Subtilisinanalog ifølge krav 15, kende- t egnet ved, at subtilisinen er [Asp76, Ser109, Ser218] -subtilisin.

17. Subtilisinanalog ifølge krav 15, kende - 5 tegnet ved, at subtilisinen er [Asp77, Ser109, Ser218] -subtilisin.

18. Subtilisinanalog ifølge krav 15, kende - tegnet ved, at subtilisinen er [Glu79, Ser109, Ser210] -subtilisin.

19. Subtilisinanalog ifølge krav 15, kendetegnet ved, at subtilisinen er [Asp76, Asp77, Ser109, Ser218]-subtilisin.

20. Subtilisinanalog ifølge krav 15, kendetegnet ved, at subtilisinen er [Asp76, Glu79,

21. Fremgangsmåde til forbedring af termisk stabilitet og pH-stabilitet af en Bacillus subtilisin med et calciumbindingssted repræsenteret af Asp41, Leu75, Asn76, Asn77, Ser78, Ile79, Gly80, Val01, Thr208 og

22. Komposition, kendetegnet ved, at 25 den indeholder en effektiv mængde af subtilisinanalo- gen ifølge krav 1 i en detergentformulering.