NO179679B - Subtilisinanalog, DNA-sekvens som koder for en analog av Bacillus-subtilisin, samt anvendelse av en subtilisinanalog i en vaskemiddelblanding - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny klasse varmestabile og pH-stabile subtilisinanaloger, og en DNA-sekvens som koder for en analog av Bacillus-subtilisin. Foreliggende oppfinnelse vedrører særlig en klasse subtilisinanaloger med et endret kalsiumbindingssted som gir forbedret kalsiumbindingskapasitet, og eventuelt en utelatelse og/eller utbytting av en av restene i Asn-Gly-sekvenser som er til stede i subtilisinet. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av slike subtilisiner i en vaskemiddelblanding.

Uttrykket subtilisin betegner en gruppe ekstracellulære alkaliske serinproteaser produsert av forskjellige arter av Bacillus. Disse enzymene henvises også til som Bacillus-serinproteaser, Bacillus-subtilisiner eller bakterielle alkaliske proteaser.

Bacillus-subtilisinmolekyler er sammensatt av en enkel polypeptidkjede med enten 274 rester (for subtilisin Carlsberg produsert av Bacillus licheniformis og for subtilisinet produsert av Bacillus subtilis stamme DY), eller 275 rester (for subtilisin type BPN' produsert av Bacillus amyloliquefaciens, aprA-genproduktet til Bacillus subtilis, og subtilisinet til Bacillus mesentericus). Når aminosyresekvensene til subtilisin fra forskjellige stammer av Bacillus sammen-lignes, anvendes sekvensen til subtilisin BPN<1> som en standard. Basert på en innstilling av sekvenser som gir den høyeste

grad av homologi mellom subtilisin Carlsberg og subtilisin BPN', henvises f.eks. serinet i det aktive sete til den førstnevnte til som serin 221, selv om det er lokalisert i posisjon 220 i aminosyresekvensen. På det samme grunnlag kan posisjon 220 i aminosyresekvensen til subtilisin Carlsberg sies å "svare" til posisjon 221 i subtilisin BPN<1.> Se f.eks. Nedkov et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364: 1537-1540 (1983).

Røntgen-strukturen til subtilisin BPN<1> [Wright, et

al., Nature, 221: 235 (1969)] avslørte at geometrien til det katalytiske sete i subtilisin, som omfatter Asp<32>, His^<4> og

221

Ser , er nesten identisk med geometrien til det aktive sete i pattedyrserinproteaser (f.eks. kymotrypsin), idet det om-32 57 195 fatter restene Asp , His og Ser . De samlede forskjeller mellom Bacillus-serinproteaser og pattedyrserinproteaser indikerer imidlertid at disse er to ubeslektede familier av proteolytiske enzymer.

I familien til Bacillus-subtilisiner er fullstendige aminosyresekvenser tilgjengelige for fem subtilisiner: Carlsberg, [Smith, et al., J. Biol. Chem., 243: 2184-2191

(1986)] ; BPN' [Markland, et al., J. Biol. Chem., 242: 5198-5211 (1967)]; AprA-genproduktet [Stahl, et al., J. Bacteriol., 158: 411-418 (1984)], DY [Nedkov, et al., supra] og Bacillus mesentericus [Svendsen, et al., FEBS Letters, 196, 220-232

(1986)]. Subtilisin Carlsberg og subtilisin BPN' (noen

ganger henvist til som subtilisin Novo) er forskjellige i 84 aminosyrer og en ytterligere rest i BPN<1> (subtilisin Carlsberg mangler en aminosyrerest som svarer til rest 56 i subtilisin BPN'). Subtilisin DY omfatter 274 aminosyrer og adskiller seg fra subtilisin Carlsberg i 32 aminosyreposi-sjoner, og fra subtilisin BPN' ved 82 aminosyreutbyttinger og en utelatelse (subtilisin DY mangler en aminosyrerest som svarer til rest 56 i subtilisin BPN'). Aminosyresekvensen til aprA-genproduktet er 85% homologt med aminosyresekvensen til subtilisin BPN'. Det synes således som om det er utstrakt homologi mellom aminosyresekvensene til subtilisiner fra forskjellige stammer av Bacillus. Denne homologi er fullstendig i visse områder av molekylet, og særlig i de områdene som spiller en rolle i den katalytiske mekanisme og i sub-stratbindingen. Eksempler på slike sekvensuforanderligheter er de primære og sekundære substratbindingssteder, henholds-. e 125 T 126 ^ 127 nl 128 m 104sekvensen vis Ser -Leu -Gly -Gly og Tyr , og sekvensen rundt det reaktive serin (221), Asn218-Gly219-Thr220,Ser221-„ ,.222 223

Met -Ala

Subtilisinmolekyler utviser enestående stabilitets-egenskaper. Selv om de ikke er fullstendig stabile over et bredt pH-område, er subtilisiner forholdsvis resistente overfor denaturering med urea- og guanidinoppløsninger, og deres enzymatiske aktivitet bibeholdes en viss tid i 8 M urea. I oppløsninger med en pH under 4 taper subtilisin hurtig og irreversibelt sin proteolytiske aktivitet. Gounaris, et al., Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 3_5, 37 (1965) viste at syredeaktiveringen av subtilisin ikke skyldes en generell ladningseffekt, og antok at den skyldes andre ladninger i molekylet, slik som protonering av histidinrester i de indre,, hydrofobe deler av molekylet. Bacillus-subtilisiner gjennom-går irreversibel inaktivering i vandige oppløsninger ved en hastighet som er stort sett avhengig av temperatur og pH. Ved pH-verdier under 4 eller over 11 er inaktiveringshastig-heten svært hurtig, mens hastigheten ved pH-er mellom 4,5

og 10,5 øker, selv om den er mye senere, etterhvert som opp-løsningen blir mer alkalisk. Mekanismene ved denne inaktivering er ikke fullt ut kjent, men det er tegn som tyder på at selvoppløsning er ansvarlig for i det minste en del av enzymustabiliteten i dette pH-område. Ved enhver pH-verdi gjelder det generelt at dess høyere temperaturen er, dess hurtigere er hastigheten for subtilisindeaktivering.

Anvendelsen av proteaser i industrielle prosesser som krever hydrolyse av proteiner har vært begrenset på grunn av enzymustabilitet under driftsbetingelser. Således hadde f.eks. inkorporeringen av trypsin i tøyvaskemidler (f.eks. Bio-38) for å lette fjerning av proteinholdige flekker, en svært begrenset suksess, noe som utvilsomt var et resultat av enzymustabilitet under vaskebetingelsene. I tillegg har bakterielle alkaliske proteaser som er forenlige med vaskemidler, blitt benyttet i vaskemiddelblandinger.

Ettersom mange industrielle prosesser utføres ved temperaturer som er over stabilitetsområdet til de fleste enzymer, vil .svært varmestabile proteaser ikke bare fordelaktige for visse industrier, slik som vaskemiddel og avhåring av hud, som allerede krever stabile proteaser, men kan være nyttige i industrier som bruker kjemiske midler for å hydrolysere proteiner, f.eks. hydrolyse av vegetabilske og animalske proteiner for fremstillingen av suppekonsentrater.

Selv om varmeinaktivering kan være den viktigste fak-tor når det gjelder å begrense den industrielle bruk av enzymer, kan også andre faktorer, slik som behov for effektivitet

over brede pH-områder og bruk av denatureringsmidler, også

ha en forringende effekt når det gjelder bruken av proteaser i industrielle prosesser. Det er derfor ønskelig å oppnå en klasse av proteaser som er kjennetegnet ved forbedret stabilitet med hensyn til temperatur, pH , denatureringsmidler og andre påkrevde betingelser i forskjellige industrier.

I løpet av de siste årene har det skjedd store end1-ringer i vaskemiddelsammensetninger, særlig ved erstatning av fosfater med alternative byggere, og i utviklingen av flytende tøyvaskemidler for å imøtekomme miljømessige krav og forbrukerkrav. Disse endringer skaper et behov for endringer i tradisjonelle vaskemiddelenzymer. Nærmere bestemt er det blitt ønskelig å anvende proteolytiske enzymer som har større lagringsstabilitet i flytende tøyvaskemidler, samt stabilitet og aktivitet i bredere områder for pH og temperatur .

En fremgangsmåte for fremstilling av endrede subtilisiner som kan anvendes i vaskemiddelblandinger, ble beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 130.756 hvor mutasjoner i subtilisinet til Bacillus amyloliquefaciens ( B. amyloliquefaciens)

_ -1 , 32 _ 155 _ 104 M ^222 166

i posisjonene Tyr , Asp , Asn , Tyr , Met , Gly ,

„. 64 _n 169 189 _ 33 _ 221 _ 217 _n 156 , -. , His , Gly , Phe , Ser , Ser , Tyr , Glu og/eller Ala 152 ble identifisert til å gi endret stabilitet, forandret konfigurasjon eller til at man fikk endringer i enzymets

222 "processing". Særlig ble det hevdet at en mutasjon av Met til Ala eller Cys (en mutant som også utviser et skarpere pH-optimum enn villtypen) eller Ser resulterte i forbedret oxydasjonsstabilitet. Det ble foreslått at substitusjon for

166

Gly med Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Asn, Arg eller Val ville forandre enzymets kinetiske parametere. Ingen av de beskrevne mutasjoner gir imidlertid analoger med større stabilitet ved høyere temperaturer eller stabilitet over et bredere pH-område enn villtypeenzymet.

Ved en annen fremgangsmåte beskrev Thomas, et al., Nature, 318, 375-376 (1985) at pH-avhengighet til subtilisin kan forandres ved å endre en Asp til Ser i Asp 99 -Gly100

i subtilisin BPN'. Denne endring representerer en forandring av en overflateladning 14 - 15 Ångstrøm fra det aktive sete

Thomas, et al. gir imidlertid ikke noen indikasjon på for-bedring når ingen endring i overflateladning gjøres, noe som er tilfellet når én uladet last settes inn i stedet for en annen.

En tredje fremgangsmåte beskrevet i US patentsøknad nr. 819.241 vedrører en klasse Bacillus-subtilisinprotease-analoger som er kjennetegnet ved utelatelse og/eller endringer i hvilken som helst Asn-Gly-sekvens som er til stede i proteasen.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en subtilisinanalog som er kjennetegnet ved at den har en aminosyresekvens til et naturlig forekommende Bacillus-subtilisin som er blitt endret ved at: (1) én eller flere av aminosyrene som er til stede i kalsiumbindingsstedet i det naturlig forekommende Bacillus-subtilisin representert ved Asp<41>, Leu<75>, Asn<76>, Asn77, Ser<78>, Ile<79>, Gly<80>, Val<81>, Thr20<8> og Tyr<214> er blitt erstattet av en negativt ladet aminosyre, og (2) én av eller begge aminosyrene i én eller flere Asn-Gly-sekvenser i det naturlig forekommende Bacillus-subtilisin er blitt utelatt eller byttet ut med en annen aminosyre,

idet analogen har forbedret kalsiumbindingskapasitet i forhold til det naturlig forekommende Bacillus-subtilisin.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre anvendelse av en effektiv mengde av en subtilisinanalog ifølge krav 1 i en vaskemiddelblanding.

Subtilisinanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse utviser forbedret varme- og pH-stabilitet, forøkt spesifikk aktivitet og bred substratspesifisitet, hvorved vaskeeffek-ten til vaskemiddelblandingene som inneholder slike analoger forbedres. Subtilisinanaloger ifølge foreliggende oppfinnelse gir særlig forbedret termostabilitet, forøkt pH-stabilitet og høyere spesifikk aktivitet enn det som man finner i "villtype"-subtilisiner.

I tillegg vedrører foreliggende oppfinnelse DNA-sekvens som koder for en analog av Bacillus-subtilisin, hvor Bacillus-subtilisinet har en aminosyresekvens som omfatter kalsiumbindingssted og en Asn-Gly-sekvens, kjennetegnet ved at (1) kodoner som koder for én eller flere av aminosyrene i kalsiumbindingsstedet, er utelatt eller byttet ut med kodoner som koder for en negativt ladet aminosyre, og (2) kodoner som koder for én eller flere av aminosyrene i Asn-Gly-sekvensen er utelatt eller byttet ut med kodoner som koder for en annen aminosyrerest.

Fremstillingen av subtilisinanalogene skjer ved hjelp av en vertscelle med nukleinsyre som koder for en subtilisinanalog som beskrevet ovenfor. I en slik celle kan nukleinsyren som koder for subtilisinanalogen, være kromosomal eller ekstrakromosomal. Vertscellen velges fortrinnsvis ut fra en stamme som mangler utskilte proteaser, noe som muliggjør lett isolering av analogene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser skjematisk ringslutningen av Asn-Gly-rester, slik som de som man finner i posisjonene 218 og 219

i subtilisin angitt i tabell 1, hvorved det dannes anhydro-aspartylglycin, og viser også basekatalysert hydrolyse derav.

Figur 2 er et partielt restriksjonskart av et aprA-gen som inneholder et EcoRI- Kpnl-genfragment fra Bacillus subtilis ( B. subtilis) stamme QB127, og omfatter et partielt restriksjonskart av aprA-genet og flankerende sekvenser. Figur 3 er et partielt restriksjonskart av et plasmid pAMBll. Figur 4 er et flytskjema som illustrerer trinn i oppbygningen av pAMBH3, et plasmid som styrer syntese av [Ser] 218-subtilisin fra Bj_ subtilis vertceller. Figur 5 er et partielt restriksjonskart av pAMB30-plasmid.

Figur 6 illustrerer oppbygningen av pAMBl06.

Figur 7 illustrerer oppbygningen av M13 mp_18 aprA.

Nærmere beskrivelse

Det bør legges merke til at uttrykket "subtilisin", slik det her er brukt, refererer til en fullt ferdig, utskilt form av enzymet som mangler ledersekvenser avspaltet fra det fullt ferdige enzym før eller ved utskillelsen. Represen-tanter for subtilisiner som kan endres i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, omfatter, men er ikke begrenset til, naturlig forekommende subtilisiner representert ved aminosyresekvensen til subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN', aprA-genproduket til Bacillus subtilis, subtilisin DY og subtilisinet til Bacillus mesentericus. Aminosyresekvensen for subtilisin Carlsberg er beskrevet av Smith, et al., J. Biol. Chem., 243, 2184-2191 (1968). Aminosyresekvensen for subtilisin BPN<1> er beskrevet av Markland, et al., J. Biol. Chem., 242, 5198-5211 (1967). Aminosyresekvensen for subtilisin DY er beskrevet av Nedkov, et al., Hoppe-Seyler<1>s Z. Physiol. Chem., 364, 1537-1540 (1983). Aminosyresekvensen

for subtilisinet til Bacillus mesentericus er beskrevet av Svendsen, et al., FEBS Letters, 196, 220-232 (1986). Aminosyresekvensen til aprA-genproduktet til Bacillus subtilis er beskrevet av Stahl, et al., J. Bacteriol-, 158, 411-418

(1984) . Aminosyresekvensen til slike subtilisiner er her innlemmet ved henvisning. Slike subtilisiner er kjennetegnet ved å ha kalsiumbindingssteder som er nødvendige for å stabilisere molekylet.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det til-veiebragt en klasse subtilisinanaloger som har forbedret evne når det gjelder å bindes til kalsium. Kalsium er blitt brukt til å stabilisere subtilisin i pulver- og flytende vaskemiddel, spesielt i anvendelser som krever høyere temperaturer. Foreliggende oppfinnelse vedrører endringen av kalsiumbindingsstedet i subtilisinmolekylet for å øke kalsiumbinding. Slik det her er brukt, henviser uttrykket "endring av kalsiumbindingsstedet" til utskifting av én eller flere aminosyrer i området til et kalsiumbindingssted som er til stede i aminosyresekvensen til subtilisin, med en negativt ladet aminosyre, hvorved den resulterende subtilisinanalog får mulighet til å ha en ytterligere negativ ladning. Det er blitt funnet at ett kalsiumbindingssted i et subtilisin omfatter de følgende aminosyrer: Asp , Leu , Asn , Asn , Ser , Ile<79>, Gly<80>, Val<81>, Thr<208>o<g> Tyr<214> i forhold til aminosyresekvensen angitt i tabell 1. Foreliggende oppfinnelse omfatter fortrinnsvis utskifting av én eller flere av aminosyrene som er til stede i kalsiumbindingsstedet, med en "negativt ladet" aminosyre, slik som Asp og Glu, og fortrinnsvis Asp. Det bør legges merke.til at selv om Asp41 i kalsiumbindingsstedet er en negativt ladet aminosyre, omfatter en ut-førelsesform av foreliggende oppfinnelse å endre Asp<41> til

41

Glu . de øvrige utførelsesformene vedrører andre endringer enn til Asp

En foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter en subtilisinanalog hvor Asn<76> er omdannet til Asp<76>. En annen utførelsesform omfatter at Ile79 er omdannet til Asp<79>. En foretrukket utførelsesform omfatter en subtilisinanalog hvor Asn<77> er omdannet til Asp<77>. De mer foretrukne ut-førelsesf ormer av foreliggende oppfinnelse omfatter de ovenfor foretrukne endringer i kalsiumbindingsstedet, og utbyttinger av Asn10<9> og Asn21<8> til Ser<109> og Ser<218>, hvorved to ustabile Asn-Gly-sekvenser er fjernet.

I tillegg til kalsiumbindingsstedene beskrevet oven-

for kan subtilisiner ha ett eller flere ytterligere kalsiumbindingssteder. Foreliggende oppfinnelses krav omfatter endring av ett eller flere av alle kalsiumbindingssteder som kan være til stede i subtilisinet. Antallet kalsiumbindingssteder i ethvert spesielt subtilisin som kan endres, avhenger av mange faktorer, dvs. det bestemte subtilisin, den særlige anvendelse for subtilisinanalogen. Andre eventuelle kalsiumbindingssteder som kan være til stede i subtilisiner, omfatter de følgende (1) Asp140 og Pro<172>, (2) Pro14 og Gin<2>71

og (3) Pro172 og Glu195 eller Asp<197>. I det bestemte kalsiumbindingssted som er til stede i hvert molekyl, avhenger av det spesielle subtilisin som skal endres. Som tidligere nevnt, vil utskiftingen av én eller flere av aminosyrene i de ovenfor nevnte eventuelle kalsiumbindingssteder resul-

tere i et subtilisin med forbedret varme- og pH-stabilitet. Typiske eksempler på utskiftinger omfatter Asp<140> med Glu<140,>

17? 17? 14 14 271 271 197 Prox' med Aspx , ProX4 med Asp , Gin 7± med Glu , Glu *

197

med Asp

I tillegg til å endre kalsiumbindingsstedene til et subtilisinmolekyl, er det foretrukket å utelate eller skifte ut enhver Asn-Gly-sekvens som er til stede i subtilisinet.

Som tidligere beskrevet i US patentsøknad nr. 819.241, er

en bevart sekvens, Asn-Gly, i posisjonene 109 - 110 og spesielt i posisjonene 218 - 219, i Baeillus-subtilisiner blitt identifisert som en hovedfaktor med ansvar for pH-ustabiliteten til disse stoffene. For å fjerne det ustabile element, Asn 12 8 -Gly 219, fra subtilisinmolekylet, ble det beskrevet enten å skifte Asn 218 med hvilken som helst annen aminosyre enn asparagin, og/eller endre Gly 219 til hvilken som helst annen aminosyre enn glycin. På lignende måte ble endring av det ustabile Asn-Gly-element i posisjonene 109 - 110 beskrevet å gi stabilitet til analogene som her er beskrevet.

I tillegg har, som tidligere nevnt, en foretrukket klasse av analoger av et Bacillus-subtilisin ifølge foreliggende oppfinnelse en aminosyresekvens hvor, i tillegg til en endring i et kalsiumbindingssted, posisjonene som omfatter en Asn-Gly-sekvens i Bacillus-subtilisinet ikke omfatter en Asn-Gly-sekvens i analogen, og særlig hvor det er færre Asn-Gly-sekvenser enn i Bacillus-subtilisinet. Helst omfatter en posisjon svarende til posisjon 218 i aminosyresekvensen angitt i tabell 1 ikke en asparaginylrest, men omfatter heller en rest av en annen aminosyre, fortrinnsvis en aminosyre valgt blant serin, valin, threonin, cystein, glutamin og isoleucin. I den utstrekning utskifting av asparagin med visse aminosyrer kan gi opphav til innvirkning på konfigura-sjonen i aktivt sted,(f.eks. på grunn av sterisk hindring som kan innføres ved tilstedeværelsen av en aromatisk aminosyre, eller endringer i tertiære strukturer som kan bli inn-ført ved tilstedeværelsen av et prolin), vil substitusjon med slike aminosyrer vanligvis være mindre foretrukket. I den utstrekning utskifting av asparagin med andre aminosyrer kan innføre en annen gruppe (f.eks. asparaginsyre) i nær-heten av det aktive sete, ville likeledes slik substitusjon være mindre foretrukket. Illustrerende for en for tiden foretrukket utførelsesform, er en analog med et endret kalsiumbindingssted og en (Ser 218)-endring i Asn-Gly-sekvensen til subtilisinet. Alternative utførelsesformer av analoger innenfor oppfinnelsens omfang er de som har et endret kalsium-109

bindingssted og hvor Asn subtilisin BPN<1> eller i aprA-

genproduktet er skiftet ut, fortrinnsvis med et serin, og hvor glycinrester i posisjonene 110 og/eller 219 er skiftet ut med andre aminosyrerester. I andre subtilisiner er også endring av et kalsiumbindingssted eller -steder, og utbytting for Asn i rest 62 eller Gly i rest 63 i subtilisiner Carlsberg eller DY omfattet av foreliggende oppfinnelse.

På grunn av deres evne til å utskille vesentlige mengder proteiner og ettersom de for tiden anvendes til å fremstille vaskemiddelproteaser, utgjør Bacillus-mikroorga-nismer en foretrukket vert for rekombinant produksjon av subtilisinanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse. Ettersom de fleste Bacillus utskiller alkaliske og nøytrale proteaser, er det foretrukket at mutasjoner innføres i genene til B^ subtilis for endogen alkalisk og nøytral protease slik at det muterte subtilisin kan fremstilles og utskilles ved hjelp av B^ subtilis i et medium som er fritt for andre proteaser. Det er således også tilveiebrakt mutantstammer av B. subtilis som er blokkert med hensyn til syntesen av endogene proteaser, men som beholder evnen til å syntetisere og utskille subtilisinanalogene som her er beskrevet.

Som beskrevet nærmere nedenunder, ble det funnet at pH- og varmestabilitet, og stabiliteten til vaskemiddelblandinger med subtilisinanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse, er betydelig bedre enn stabiliteten til subtilisinet som er villtypen aprA-genprodukt, og Carlsberg-subtilisinet.

En rsubtilisinanalog ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles i overensstemmelse med følgende fremgangsmåte : 1) Isolering av det typiske subtilisingen aprA fra B. subtilis. 2) Kloning av aprA-genet på en vektor som muliggjør ut-nyttelse av oligonukleotidsted-rettet mutagenese for å

skape ønskede endringer.

3) Stedrettet mutagenese og sekvensering av den resulterende DNA for å bekrefte tilstedeværelsen av den ønskede mutasjon. 4) Konstruksjon av en ekspresjonsvektor for å styre

syntesen av det muterte enzym i subtilis.

5) Konstruksjon av muterte stammer av subtilis som ikke syntetiserer subtilisin og nøytral protease. 6) Isolering av enzymet i det ekstracellulære dyrkningsmedium og rensing derav. 7) Utøvelse av fremgangsmåte for innføyelse av genet som koder for det forbedrede enzym, i kromosomet til en stamme av subtilis som på forhånd er blitt mutert for å blokkere syntese av endogene proteaser.

De spesifikke subtilisinanaloger er her angitt ved å vise den utskiftede eller utelatte aminosyre i hakeparan-teser. F.eks. henviser en [Ser 109]-subtilisin til et subtilisinmolekyl med et serin i aminosyreposisjon 109, og et [Ser 109 , Ser <218> ]-subtilisin henviser til et subtilisinmolekyl med et serin i aminosyreposisjonene 109 og 218.

Ifølge eksempel 1 isoleres aprA-genet som koder for subtilisin, fra genomet til B^_ subtilis. Ifølge eksempel 2 underkastes aprA-genet stedrettet mutagenese. Ifølge eksempel 3 konstrueres en ekspresjonsvektor som inneholder det muterte aprA-gen. Ifølge eksempel 4 fremstilles en [Ser 109]-subtilisinanalog. Eksempel 5 beskriver fremstillingen av en [Ser 109 , Ser 218]-subtilisinanalog. Eksempel 6 beskriver fremstilling av en [Asp 76 , Ser <1>0<9> , Ser <218> ]-subtilisinanalog. Ifølge eksempel 7 fremstilles en [Asp<7**>, Asp<77>, Ser109, Ser 218]-subtilisinanalog. Eksempel 8 beskriver fremstillingen av en [Asp <76> , Glu <79> , Ser 109 , Ser <218>]-subtilisinanalog. Ifølge eksempel 9 konstrueres to mutantstammer av B^ subtilis som ikke produserer noen påvisbare ekstracellulære proteaser. Eksempel 10 beskriver fremgangsmåter for integrering av et mutert aprA-gen i kromosomet til B_^_ subtilis. Ifølge eksempel 11 isoleres villtype- og mutant- aprA-subtilisiner og renses. Eksemplene 12 - 14 sammenligner varmestabiliteten til [Ser 218]-subtilisin med varmestabiliteten til villtype-aprA-produktet.

I tillegg til en subtilisinanalog ifølge foreliggende oppfinnelse kan vaskemiddelblandinger omfatte: (a) Minst ett overflateaktivt middel som kan være anionisk, ikke-ionisk eller amofært, eller en vannoppløse-lig såpe. Typisk anvendes et anionisk overflateaktivt middel (f.eks. et rettkjedet alkylarylsulfonat) i blanding med et ikke-ionisk (f.eks. en alkylfenylpolyglycolether) i mengde på henholdsvis 5 - 30 og 1 - 5 vekt% av vaskemiddelblandingen.

(b) En eller flere byggere, fortrinnsvis med en med-følgende sekvestreringsfunksjon. Natriumtripolyfosfat, nat-riumcitrat, natriumsilikat og zeolitter er eksempler på

slike forbindelser som vanligvis utgjør fra 10 til 70 vekt% av vaskemiddelblandingen. (c) Et blekemiddel, fortrinnsvis en peroxyforbindelse, slik som natriumperborat, typisk inkorporert i mengde på opp til 30 vekt% av blandingen. (d) Hjelpemidler, slik som carboxymethylcellulose, optiske lysgjøringsmidler og parfyme. Om ønsket tilsettes et pH-regulerende middel, hvorved det fåes en pH i tøyvaske-mediet i området fra 8,0 til 10,5.

Vaskemiddelblandingene inneholder en effektiv mengde

av én eller flere av subtilisinanalogene ifølge foreliggende oppfinnelse. Slik det her er brukt, refererer "effektiv mengde av en subtilisinanalog" til den mengde subtilisinanalog som er nødvendig for å oppnå den enzymatiske aktivitet som er nødvendig i den bestemte vaskemiddelblanding. Slike effektive mengder fastlegges lett av en person med vanlig dyktighet innen teknikken, og er basert på mange faktorer, slik som den bestemte subtilisinanalog som benyttes, ren-gjøringsanvendelsen, den bestemte sammensetning av vaskemiddelblandingen, hvorvidt det er påkrevet med en flytende eller tørr blanding og lignende.

Det partikulære subtilisinanalogpreparat tilsettes i en mengde beregnet til å gi en enzymaktivitet på minst 0,1 Anson-enhet (AU, se nedenunder), fortrinnsvis 0,5 - 2,5 AU pr. 100 g vaskemiddelblanding. Om påkrevet kan utligning til 100% opp-rettes med uorganisk fyllstoff, fortrinnsvis natriumsulfat.

Flytende vaskemiddelblandinger kan fremstilles fra enzymoppslemmingen, fortrinnsvis i ikke-vandige medier. Slike oppslemminger kan typisk bestå av en suspensjon av fint oppmalt subtilisinanalogkonsentrat i et flytende ikke-ionisk overflateaktivt middel, f.eks."Tergitol 15 S 9"eller en blanding av slike overflateaktive midler. Vanligvis vil opp-slemmingen også inneholde ett eller flere uorganiske fyll-stoffer, slik som fint oppmalt natriumklorid, eventuelt i blanding med et suspensjonsstabiliseringsmiddel, f.eks. dampet silika ("Aerosil 200"). "Tergitol" og "Aerosil" er varemerker.

En subtilisinanalog ifølge oppfinnelsen tilsettes i en mengde som er beregnet å gi en proteaseaktivitet på minst 0,1 AU, fortrinnsvis minst 0,5 - 2,5 AU, pr. 100 g flytende vaskemiddelblanding.

Vaskemiddelblandingene kan fremstilles på vanlig måte, f.eks. ved å blande sammen bestanddelene. Alternativt lages det en forblanding som så blandes med de gjenværende bestand-deler.

På grunn av de gode stabilitets- og aktivitetsegen-skaper som er beskrevet, kan subtilisinanalogene ifølge oppfinnelsen anvendes på alle områder hvor proteolytiske enzymer generelt brukes, de kan særlig anvendes til vaskemidler og rensemidler eller flekkefjernere, som et hårfjernings-middel ved garving, og også i matvareindustrien for fremstilling av proteinhydrolysater, og i serologien ved påvisning av ufullstendige antistoffer. Det er særlig fordelaktig for bruk innen matvareindustrien og i serologien at subtilisinanalogene ifølge oppfinnelsen har utmerket stabilitet i den faste eller oppløste form, slik at fysiologisk aksep-table mengder av kalsiumioner ikke vil være nødvendig for å stabilisere subtilisinanalogen i vandige oppløsninger, i motsetning til i oppløsninger av andre enzympreparater.

Eksemplene nedenunder vil ytterligere tjene til å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

B. subtilis stamme QB127 ( trpC2 leuA8 sacU 200) Lepesant, et al., Molec. Gen. Genet., 118, 135-260 (1982)] ble erholdt fra Bacillus Genetic Stock Center ved Ohio State University, Columbus, Ohio. Denne stamme overproduserer ekstracellulære serin- og metallproteaser, a-amylase og levansucrase i forhold til isogene sacU<+->stammer på grunn av den pleiotrope effekt av sacU 2 00-mutasjonen [Lepesant,

et al., i Schlessinger, D., red., Microbiology, 1976, American Society for Microbiology, Washington, D.C., s. 65

(1976)]. Stamme QB127 er således en egnet DNA-kilde for isolering av apra-genet som koder for subtilisin.

Genom-DNA ble isolert fra celler av B^ subtilis stamme QB127 i overensstemmelse med fremgangsmåten til Saito, et

al., Biochim. Biophys. Acta. 12_, 619-629 (1963). Renset kromosom-DNA ble fullstendig oppløst med EcoRI restriksjons-endonukleasen.

De resulterende DNA-fragmenter ble oppløst på en agarosegel med lavt smeltepunkt ved hjelp av elektroforese og fragmenter i området 4,4 - 8,0 kilobaser (kb) ble isolert. Disse fragmentene ble ligert til pCFM936 (A.T.C.C. nr. 53413 fra American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland), et Escherichia coli ( E. coli) plasmid som fremviser høyere kopiantall ved forhøyede temperaturer og som gir kanamycinresistens. Vektoren ble oppløst med EcoRI og defosforylert med alkalisk fosfatase fra kalvetarm før ligering.

Ligeringsproduktene ble inført i E_;_ coli C600 (A.T.C.C. nr. 23724 fra American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) og etter inkubasjon over natten på L-agar supplert med 10 yg/ml kanamycin, ble kana-mycinresistente vertceller valgt ut. Antallet kopier av plasmid-DNA ble økt ved å inkubere de utvalgte vertceller ved 42°C i 4 timer. Kolonier ble så overført til nitrocellu-losefiltere og bearbeidet i overensstemmelse med en koloni-hybridiseringsfremgangsmåte beskrevet av Grunstein, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 72_, 3961 (1975).

Det ble brukt en oligonukleotidsøker for å sortere ut kolonier som huset subtilisingenet på pCFM936. Søkeren syntetisert ved hjelp av fosfittmetoden beskrevet av Beaucage,

et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862 (1981) hadde nukleo-tidsekvensen

5<1> GCGCAATCTGTTCCTTAGGC 3<1 >som svarer til aminoenden i aprA-genproduktet (Wong, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 81, 1184-1188 (1984); Stahl,

et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984). En hybridiserings-temperatur på 55°C ble anvendt og 5 positive kolonier ble identifisert blant totalt 400. Plasmid-DNA fra en av de positive kolonier ble betegnet pCFM936 ap_r2.

Plasmid pCFM936 apr2 ble oppløst med EcoRI alene, med Hindlll alene og med EcoRI og Hindlll i kombinasjon. Størr-elser til EcoRI-fragmenter i subtilisingenet samsvarte med de som er beskrevet i Stahl, et al., supra, men flere andre ubeskrevne Hindlll-steder ble oppdaget. Slik det her er beskrevet i eksempel 3, ble to av HindiII-stedene benyttet i de genetiske forandringer av subtilisingenet.

Det ble bestemt at et stort 6,5 kb EcoRI-fragment i

B. subtilis QB127 genom-DNA bar aprA-genet, dets regulatorsekvenser og ubeslektede^ flankerende sekvenser, ved å verifisere at restriksjonsenzym-oppløsninger samsvarte med resultatene rapportert av Stahl, et al., supra. Dette ble bekreftet ved DNA-sekvensering under anvendelse av dideoxy-kjedetermineringsmetoden beskrevet av Sanger, et al., J.

Mol. Biol., 143, 161-178 (1980). Et 3,0 kb EcoRI- kpnl-under-fragment av det 6,5 kb store EcoRI-fragment, som illustrert i figur 2, ble også funnet å inneholde aprA-genet, dets regulatorsekvenser og ubeslektede flankerende sekvenser. Selv om kpnl- EcoRI-fragmentet er rapportert å være 2,5 kb langt av Stahl, et al., og i tegnforklaringen til figur 1 der, avslører sammenligning mellom målestokken til figur 1 og den der skraverte tegning av fragmentet at, selv i Stahl, et al., er kpnl- EcoRI-fragmentet vesentlig større enn 2,5 kb.

En kloningsvektor for Bacillus-vertsystemer, plasmid pAMBll, ble konstruert på følgende måte. Plasmidet pTG402 (Northern Regional Research Laboratories, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, stamme nr. NRRL B-15264) ble partielt oppløst med Rsal-restriksjonsendu-nuklease. Fragmenter ble ligert til M13 mp!8 (tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland som katalog nr. 8227SA) som på forhånd var blitt oppløst med HincII. Ligeringsprodukter ble innført i E^ coli JM103 (tilgjengelig fra Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey som katalog nr. 27-1545-01) ved transformasjon i overensstemmelse med Mandel, et al., J. Mol. Biol., 53, 154, (1970). Bakteriofagplakker ble sprøytet med 0,5M catechol (fremstilt i destillert vann) for å påvise den funksjonelle ekspresjon av et xylE-gen utvunnet fra pTG402. xylE-qenet koder for catechol-2,3-dioxygenase og er anvendbart til påvisning av promoterer i flere forskjellige organismer [Zukowski,

et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), J30, 1101-1105 (1983)].

xylE-genet ble så overført som et 1,0 kb EcoRI-Pstl-fragment til E^ coli/ B. subtilis plasmid pHV33 (tilgjengelig fra American Type Culture Collection som A.T.C.C.

39217) [Primrose, et al., Plasmid, 6, 193-201 (1981)] erholdt f ra R. Dedonder (Institut Pasteur, Paris, Frankrike). pHV33-plasmidet var på forhånd blitt oppløst med EcoRI og PstI slik at det xylE-holdige fragment ville inaktivere et gen for ampicillinresistens når det ble ligert i dette område. Det resulterende plasmid, pAMB21, inneholder et funksjonelt xylE-gen i E_^_ coli vertcelle, men krever tilsetningen av en promoter for at xylE skal bli uttrykt i B^ subtilis vertceller. E^ coli-celler som huser pAMB21, er resistente overfor tetracyklin (15 yg/ml) og kloramfenieol (20 ug/ml), mens B^ subtiles-celler som huser pAMB21, er resistente bare overfor kloramfenieol (5 yg/ml).

t QOp-transkripsjonstermineringssekvensen til bakteriofag lambda ble overført fra plasmid pCFM936 (på et 400 base-par Pstl- BgllI-fragment) til det unike Pstl-sted i pAMB21.

Et syntetisk nukleotid med sekvensen 5' GATCTGCA 3' ble konstruert for å knytte Bglll-enden til t QQp-fragmentet til Pstl-stedet i vektoren pAMB21. Det resulterende plasmid ble betegnet pAMB22 og hadde identiske egenskaper med pAMB21, bortsett fra at en transkripsjonsterminator er innesluttet. pAMB22-plasmidet er anvendbart til påvisning av sterke promoterer som er funksjonelle i B^ subtilis.

Den 1,4 kb EcoRI- BgllI-fragment i DNA fra pAMB22 som inneholder xylE og tQOp> ble isolert fra en agarosegel med lavt smeltepunkt etter elektroforese av begrensede fragmenter. Det 1,4 kb store stykke av DNA ble ligert til plasmid

pBD64 (tilgjengelig fra Bacillus Genetic Stock Center,

nr. 1E22) som på forhånd var blitt oppløst med EcoRI og BamHI. Det resulterende 5,3 kb plasmid, pAMBll, inneholder polylinker-sekvensen til Ml3mpl8 ( EcoRI, Sstl, Xmal, Sma, BamHI og Xbal) oppstrøms for xylE-genet som etterfølges av t , som vist i figur 3. pAMBll-plasmidet er i stand til å replikere i B^ subtilis og bidrar med vertcelleresistens mot kloramfenichol (5yg/ml) og/eller kanamycin (5 yg/ml).

Som vist i figur." 4, ble det rensede EcoRI-Kp_nl-fragment som inneholder aprA, klonet på pAMBll, hvorved pAMBlll ble dannet. Ligeringsprodukter ble innført i B_^ subtilis MI112 ( arg-15 leuB thr5 recE4) (tilgjengelig fra Bacillus Genetic Stock Center som nr. 1A423) ved hjelp av protoplast-transformasjonsmetoden beskrevet av Chang, et al., Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979). B^_ subtilis MI112 uten plasmid-DNA er proteasedyktig (Prt<+->fenotype), men utskilte subtilisin mengder er heller lave. Kloramfenicholresistente (CM ) transformanter ble overført på L-agar-plater supplert med 1,5% (vekt/volum) skummet melk og 5 yg/ml kloramfenichol og så inkubert ved 37<1>C.

Etter inkubasjon ved 37°C i omtrent 16 timer, ga kolonier av MI112 som huset plasmid pAMBlll, en klar ring rundt hver koloni. Ringer ble dannet ved den proteolytiske virkning av subtilisin på kaseinbestanddelen i skummet melk-medium-supplementet. M1112 som huser pAMBll-vektoren alene, hadde ingen synlig ring etter 16 timers inkubasjon, selv om en svak ring til sist utvikles etter 40 timers inkubasjon ved 37°C. Celler som bærer pAMBlll ble klart skjeldnet fra celler som bærer pAMBll, ved en forskjell i ringstørrelse. Kloningen av aprA- genet i en fullstendig funksjonell form

førte således til produksjon og utskillelse av subtilisin i stor mengde ved hjelp av B_^_ subtilis.

Eksempel 2

Som illustrert i figur 4, ble et 3,0 kb EcoRI- Kpnl-genomfragment, hvis isolering er beskrevet i eksempel 1, oppløst med Hindlll for å fremstille tre fragmenter: (1)

et 1,1 kb EcoRI- HindiII-fragment som bærer genetiske regula-

torsekvenser for aprA-genekspresjon, "pre-pro"-området til det gen som er påkrevet for ekstracellulær utførsel av subtilisin, og DNA-sekvensen som koder for de første 49 aminosyrer i det fullt ferdige subtilisin, (2) et 1,1 kb HindiII-HindIII-fragment som bærer DNA-sekvenser som koder for aminosyrene 50 - 275 (carboxylenden) til subtilisin sammen med en transkripsjonstermineringssekvens og 3<1->ikke-kodende sekvenser, og (3) et 0,8 kb HindiII- Kpnl-fragment som inneholder 3' ikke-kodende sekvenser.

1,1 kb-fragmentet flankert av Hindlll-steder ble klonet til det enkeltstående Hindlll-sted til bakteriofag M13 mp!8 for formålene med DNA-sekvensering og stedrettet mutagenese. En av rekombinantene, betegnet M13 mp_18 apr2, ga éntrådet templat-DNA som er påkrevet for stedrettet mutagenese av aprA-genet.

Det kodende område til aprA-genet ble sekvensert og resultatene av sekvenseringen er angitt i tabell 1 her. Det bør legges merke til at den spesifikke identitet til de første 5 kodoner i ledérområdet kan tilskrives rapporten til Stahl, et al., supra, og Wong, et al., supra, for sekvens-informasjon for aprA-genet, og at det foreligger kodonsekvens-forskjeller mellom Stahl, et al., supra, i aminosyreposi-sjonen 84 og 85. Nærmere bestemt rapporterer Stahl, et al., supra, et kodon GTT (som koder for valin) i aminosyreposisjon 84, mens kodonet GTA (som også koder for valin) fore-kommer i tabell 1. Stahl, et al., supra, rapporterer også

et kodon AGC (som koder for serin) i aminosyreposisjon 85,

i motsetning til kodonet GCG (som koder for alanin) i tabell.

1.

Bakteriofag M13 mp!8 apr2 ble konstruert ved å innføye et 1,1 kb HindiII-HindiII-fragment fra B^ subtilis QB127 genom-DNA som bærer nukleotidsekvenser som koder for aminosyrene 50 - 275 (carboxylende) til aprA-subtilisin sammen med en transkripsjonstermineringssekvens og 3' ikke-kodende sekvenser, i det unike Hindlll-sted til bakteriofag M13 mpl8. For å fjerne de 3' ikke-kodende sekvenser, ble et Kpnl-re-striksjonsendonukleasested innført ved stedrettet mutagenese i en posisjon like etter transkripsjonstermineringssekvensen.

Stedrettet mutagenese ble innført i overensstemmelse med en fremgangsmåte beskrevet av Norrander, et al., Gene, 26, 101-106 (1983). Éntrådet DNA fra M13 mp_18 apr2 ble hybridisert til en primer,

som var syntetisert ved hjelp av fosfittmetoden beskrevet av Beaucage, et al., Tetrahedron Letters, 22./ 1859-1862 (1981). Primeren var homolog med nukleotidene i dette område, bortsett fra to (merket med stjerner), hvor en thymin (T) var endret til guanin (G) og en annen thymin (T) var endret til adenin (A), hvorved det var skapt et Kpnl-sted (understreket) i dette område.

Primeren ble hybridisert til M13 mp!8 apr2-DNA ved 65°C og den hybridiserte DNA ble sakte avkjølt til omtrent 22°C og så polymerisert i 2 timer ved 15°C i en reaksjons-blanding som besto av 12,5 ul oppløsning av hybridisert DNA, 2,5 yl 10 mM hver av dATP, dCTP og dGTP, 2 0 yl 12 mM ATP,

0,1 yl Klenox DNA-polymerase, 0,1 yl T4-DNA-ligase og 13 yl sterilt destillert vann. Den resulterende dobbeltrådede, covalent lukkede ringformede DNA ble innført i E_;_ coli JM103

ved transfeksjon.

Bakteriofagplakker ble så overført til Gene Screen TM hybridiseringsmembraner. Plakker som inneholdt DNA med de ønskede baseendringer, ble identifisert ved hybridisering til det radioaktivt merkede (y- 32P) syntetisk oligonukleotid anvendt til den mutagene priming-reaksjon beskrevet ovenfor. Hybridisering ble utført ved en begrensende temperatur (65°C) for at bare DNA som bærer en Kpnl-mutasjon skulle hybridisere til det syntetiske oligonukleotid. Tilstedeværelsen av Kpnl-mutasjonen nedstrøms fra aprA-genet på DNA fra en enkel renset plakk, betegnet M13 mp!8 apr2 Kpnl, ble bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensering ved fremgangsmåten beskrevet av Sanger, et al., supra, og restriksjonsenzymanalyse.

Et 1,1 kb segment som bærer mesteparten av det 3' ikke-kodende område ble fjernet ved å oppløse M13 mp_18 apr2 Kpnl med Kpnl, religere oppløsningsprodukter ved en konsentrasjon på 500 ng DNA/ml, så innføre ligeringsproduktene i E^ coli JM103 ved transfeksjon, bakteriofagplakker som inneholdt DNA med den ønskede 0,35 kb utelatelse ble identifisert ved re-striks jonsendonukleaseanalyse . Bakteriofag fra en slik plakk ble betegnet Ml3 mp_18 apr4 (fig. 7) . M12 mp!8 apr4 ga éntrådet templat-DNA for stedrettet mutagenese av aprA-genet beskrevet nedenunder i eksempel 3.

Eksempel 3

For å uttrykke muterte subtilisingener B^ subtilis, ble plasmidet pAMBl0 6 konstruert som en bærer for det muterte gen på følgende måte: 1) pAMBlll ble oppløst med Hindlll. Et 1,1 kb segment som bærer mesteparten av aprA-genet, ble fjernet ved å religere Hindlll oppløsningsprodukter av pAMBlll ved en konsentrasjon på omtrent 1 yg/ml. Dette resulterte i dannelsen av pAMBllO som illustrert i figur 4. pAMBllO-plasmidet bærer genetiske regulatorsekvenser for ekspresjon av subtilisingenet, "pre-pro"-området som er påkrevet for utskillelse av subtilisin og DNA-sekvensen som koder for det 3' ikke-kodende område til fullt ferdig subtilisin og de første 49 aminosyrene i fullt ferdig subtilisin. 2) Plasmid pAMBllO ble oppløst med BamHI og Pstl i kombinasjon. Dette ga DNA-fragmenter med to størrelser, 6,2 kb og 1,0 kb. Fragmentet på 1,0 kb bærer xylE-genet som koder for catechol-2,3-dioxygenase, fra TOL-plasmidet til Pseudomonas putida mt-2 (Zukowski et al., supra). 3) Det største, 6,2 kb- BamHI- Pstl-fragment ble selv-ligert med hjelp av et éntrådet syntetisk oligonukleotid 5' GATCTGCA 3', som ble syntetisert ved hjelp av fosfittmetoden beskrevet av Beaucage et al., supra, og T4-DNA-ligase. Ligeringsprodukter ble innført i B^ subtilis MI112 ( arg-15 leuB thr5 recE4) (tilgjengelig fra Bacillus Genetic Stock Center som nr. lA423).ved protoplasttransformasjons-metoden beskrevet av Change et al., Mol. Gen. Genet. 168, 111-115 (1979).

Kloramfenicholresistente kolonier (Cm ) ble undersøkt med hensyn på plasmidinnhold. Det 6,2 kb store plasmid pAMB106 ble identifisert ved restriksjonsnedonukleaseana-lyse. Det er identisk med plasmid pAMBllO, bortsett fra at xylE er blitt fjernet (figur 6).

På grunn av at det mangler DNA som koder for aminosyrene 50 - 275 i aprA-subtilisin, syntetiserer pAMBl06 ikke subtilisin når det er innført i B_^ subtilis vertceller. Subtilisin syntetiseres bare etter innføyelse av det gjenværende av subtilisingenet, dvs. enten den naturlig forekommende DNA-sekvens eller en analogkodende sekvens.

Eksempel 4

Fremstilling av en [ Serin 10 9]- subtilisinanalog

Entrådet DNA fra bakteriofag M13mpl8 apr4 ble hybridisert til en primer,

som ble syntetisert ved hjelp av fosfittmetoden beskrevet av Beaucage et al., supra. Primeren var homolog med nukleotidene som omfatter kodoner for aminosyrene 106 - 113 i aprA-subtilisin, bortsett fra en baseendring (merket med en stjerne)

hvor en A var endret til en G for å muliggjøre overgangen

109 109

som ville endre Asn (kodon AAC) til Ser (kodon AGC).

Primeren ble hybridisert til M13mpl8 apr4-DNA ved 65°C og den hybridiserte DNA ble sakte avkjølt til omtrent 22°C

og så polymerisert, ligert og transfisert som beskrevet i eksempel 2.

Bakteriofag-plakker ble overført til hybridiseringsmembraner, så ble de som inneholdt DNA med den ønskede baseendring, identifisert ved hybridisering til et radioaktivt

32

merket (ot- P) oligonukleotid anvendt til den mutagene pri-mingsreaksjon beskrevet ovenfor. Hybridisering ble utført ved 65°C. En positiv plakk inneholdt bakteriofag betegnet som Ml3mpl8 apr4 [Ser 10 9]. Dobbeltrådet DNA fra denne bakteriofag ble oppløst med Hindlll og Kpnl i kombinasjon, så ble det 75 0 bp store fragment som bærer den muterte del av aprA-subtilisingenet, ligert til pAMB106 som på forhånd var blitt oppløst med Hindlll og Kpnl. Det resulterende plasmid, pAMB12 9, kan innføres i egnede B^ subtilis vertceller for syntese og utskillelse av [Ser 109]-subtilisin.

Eksempel 5

Fremstilling av en [ serin 109, serin 218]- subtilisinanalog

Bntrådet DNA fra Ml3mpl8 apr4 [Ser 10 9] ble syntetisert til en primer:

som var syntetisert ved hjelp av fosfittmetoden beskrevet av Beaucage et al., supra. Primeren var homolog med nukleotider som omfatter kodoner for aminosyrene 215 - 22 0 i aprA-subtilisin, bortsett fra en baseendring (merket med en stjerne) hvor en A var endret til en G for å muliggjøre overgangen

218 218

som ville endre Asn kodon AAC) til Ser (kodon AGC). Be-tingelsene for hybridisering, polymerisering, ligering, transfeksjon og identifikasjon av positive plakker var som beskrevet i eksempel 2. En enkel renset plakk inneholdt bakterio'

fag som Ml3mpl8 apr4 [Ser<109>, Ser<218>]. Dobbeltrådet DNA fra denne bakteriofag ble oppløst med Hindlll og Kpnl i kombinasjon, så ble 150 bp stort fragment som bærer de to mutasjonene, ligert til pAMBl06 som tidligere var blitt oppløst med Hindlll og Kpnl. Det resulterende plasmid, pAMBl30 kan innføres i B. subtilis vertceller for syntese og utskillelse av [Ser 109, Ser ]-subtilisin.

Eksempel 6

Fremstilling av en [ Asp 76, Ser 109, Ser 218]- subtilisinanalog

Éntrådet DNA fra Ml3mpl8 apr4 [Ser109y Ser<2>18] ble hybridisert til en primer:

*

som var syntetisert ved hjelp av fosfittmetoden beskrevet av Beaucage et al., supra. Primeren var homolog med nukleotidene som omfatter kodoner for aminosyrene 74 - 7 9 i aprA-subtilisin, bortsett fra en baseendring (merket med en stjerne) hvor en A var endret til en G for å muliggjøre overgangen

7 6 76

som endret Asn (kodon AAT) til Asp :(kodon GAT).

Primeren ble hybridisert til M13m<p>l8 [Ser 109 , Ser 218]-DNA ved 65°C og den hybridiserte DNA ble sakte avkjølt til omtrent 22°C og polymerisert, ligert og transfisert som beskrevet i eksempel 2.

Bakteriofagfplakker ble overført til hybridiseringsmembraner, og de som inneholdt DNA med den ønskede baseendring ble identifisert ved hybridisering som beskrevet i eksempel 2, bortsett fra at hybridisering ble utført ved 4 6°C. En positiv plakk inneholdt bakteriofag betegnet M13mpl8 apr4 [Asp<7>^, Ser<1>0<9>, Ser<218>]. Dobbeltrådet DNA fra bakteriofagen ble oppløst med Hindlll og Kpnl i kombinasjon, så ble et 750 bp stort fragment som bærer de tre mutasjonene til aprA-subtilisingenet, ligert til pAMBl06 som tidligere var blitt oppløst med Hindlll og Kpnl. Det resulterende plasmid, pAMB131, kan innføres i B^ subtilis vertceller for syntese og utskillelse av [Asp 76 , Ser <109> , Ser <218>]-subtilisin.

Eksempel 7

4---I-1- r* 76 „ 77 c 109 _ 218, ^ • •> • ■ Fremstilling av en LAsp , Asp , Ser , Ser J - subtilisin analog

Entrådet DNA fra Ml3mpl8 ap_r4 [Asp<76>, Ser109, Ser218] ble hybridisert til en primer:

<*>

som var syntetisert ved hjelp av fosfittmetoden beskrevet av Beaucage et al., supra. Primeren var homolog med nukleotidene som omfatter kodoner for aminosyrene 74 - 80 i [Asp<76>, Ser<109>, Ser 218]-subtilisin, bortsett fra to baseendringer (merket med stjerner) hvor en A var endret til en G og en C var endret

77

til en T for overgangene som endret Asn (kodon AAC) til Asp<77> (kodon GAT).

Primeren ble hybridisert til Ml3mpl8 apr4 [Asp 7 6, Ser<109>, Ser<218>]-DNA ved 65°C og den hybridiserte DNA ble sakte avkjølt ved omtrent 22°C og polymerisert, ligert og transfisert som beskrevet i eksempel 2.

Bakteriofagplakker ble overført til hybridiseringsmembraner og de som inneholdt DNA med de ønskede baseendringer, ble identifisert ved hybridisering som beskrevet i eksempel 2, bortsett fra at hybridisering ble utført ved 45°C. En positiv plakk inneholdt bakteriofag betegnet Ml3mpl8 apr4 [Asp<76>, Asp<77>, Ser<109>, Ser<218>]. Dobbeltrådet DNA fra denne bakteriofag ble oppløst med Hindlll og Kpnl i kombinasjon, så ble det 760 bp store fragment som bærer de fire mutasjonene til aprA-subtilisingenet, ligert til pAMB106 som på forhånd var blitt oppløst med Hindlll og Kpnl. Det resulterende plasmid, pAMBl32, kan innføres i B^ subtilis vertceller for syntese og utskillelse av [Asp 76 , Asp 77 , Ser 109 , Ser <21>8^subtilisin.

Eksempel 8

Fremstilling av en [ Asp <76> , Glu <79> , Ser 109 , Ser 218]- subtilisinanalog

Entrådet DNA fra Ml3mpl8 [Asp<76>, Ser<10>9, Ser<218>] ble hybridisert til en primer:

som var syntetisert ved hjelp av fosfittmetoden beskrevet av Beaucage et al., supra. Primeren var homolog med nukleo-tidet som omfatter partielle kodoner for aminosyrene 75 og 83 og hele kodonet for aminosyrene 76 - 82 i [Asp<76>, Ser<109>, Ser 218]-subtilisin, bortsett fra tre baseendringer (merket med stjerner) hvor en A var endret til en G, en C var endret

79

til en A og en C var endret til en A, som endret Ile (kodon ATC) til Glu<79> (kodon GAA).

Primeren ble hybridisert til Ml3mpl8 apr4 [Asp 7 6, Ser<109>, Ser<218>]-DNA ved 65°C og den hybridiserte DNA ble

sakte avkjølt til omtrent 2°C og ble polymerisert, ligert og transfisert som beskrevet i eksempel 2.

Bakteriofagplakker ble overført til hybridiseringsmembraner og de som inneholdt de ønskede baseendringer, ble identifisert ved hybridisering som beskrevet i eksempel 2, bortsett fra åt hybridiseringen" ble-utført ved 45°C...En positiv plakk inneholdt bakteriofag betgnet Ml3mpl8 apr4 [Asp 7 6 , Glu 79, Ser 109 , Ser 218]. Dobbeltrådet DNA fra denne bakteriofag ble oppløst med Hindlll og Kpnl i kombinasjon, så ble et 750 bp stort fragment som bærer de fire mutasjonene til aprA-subtilisingenet, ligert til pAMB106 som på forhånd var blitt oppløst med Hindlll og Kpnl. Det resulterende plasmid, pAMB133, kan innføres i B^ subtilis vertceller for syntese og utskillelse av. [Asp 76 , Glu , Ser 109 , Ser ]-subtilisin.

Eksempel 9

Ettersom de fleste Bacillus utskiller alkaliske og/ eller nøytrale proteaser i det omgivende vekstmedium, er det foretrukket at mutasjoner innføres gener for endogene alkaliske og nøytrale proteaser i B^ subtilis for å blokkere syntesen derav slik at muterte subtilisingener, når de inn-føres i mutantcellen, kan produsere muterte subtilisiner som så vil bli utskilt i et medium som er fritt for andre proteaser som sannsynligvis ville virke inn på isoleringen av intakte subtilisinanaloger. To mutante subtilis stammer BZ24 og BZ25 som ikke produserer noen påvisbare ekstracellulære proteaser, ble konstruert i overensstemmelse med den følgende fremgangsmåte:

Først ble en plasmidvektor som er i stand til å replikere

i E_^_ coli, men ikke i B^ subtilis med mindre den integrerer i kromosomet til B^ subtilis ved homolog rekombinasjon, konstruert på følgende måte. Plasmid pBD64 ( Bacillus Genetic Stock Center, nr. 1E22) ble oppløst fullstendig med Hpall for å fremstille tre fragmenter med størrelse 2,95 kb, 1,0 kb og 0,75 kb. Disse fragmentene ble så ligert som en blanding til plasmid pBR322 (A.T.C.C. 37017) som tidligere var blitt oppløst med Clal. Ligeringsproduktene ble innført i E. coli C600 (tilgjengelig fra American Type Culture Collection som A.T.C.C. 23724) ved transformasjon [Mandel, et al., J. Mol. Biol., 5_3, 154 (1970)]. Det ble selektert for celler som var resistente overfor kloramfenichol (20 yg/ml) og ampicillin (50 yg/ml). Plasmid-DNA fra 12 transformanter ble fremstilt ved hjelp av en fremgangsmåte med alkalisk ekstraksjon beskrevet av Birnboim, et al., Nucleic Acids Res., 1_, 1513-1523 (1979), så oppløst med Hindlll og EcoRI i kombinasjon for å verifisere tilstedeværelsen av innføyd(e) fragment (er). Ett slikt plasmid, betegnet pAMB30, ble funnet å bære de 1,0 og 0,75 kb store Hpall-fragmenter fra pBD64 i Clal-stedet til pBR322. Disse fragmentene inneholder klor-amf enicholacetyltransferasegenet ( eat) som er funksjonelt i E. coli og B^ subtilis. Oppløsningene med Bglll og, separat, med Sau3A bekreftet identiteten og orienteringen til cat-genet på pAMB3 0, som vist i figur 5.

Ettersom pAMB30 mangler en sekvens med oppstartings-sted for replikasjon som er funksjonell i B^ subtilis, kan det ikke replikere som et autonomt replikon i B_^_ subtilis vertceller. På den annen side inneholder pAMB30 det pBR322-avledede startsted for replikasjon som er funksjonelt i E. coli og plasmidet kan således formeres i E^ coli vertceller. Plasmid pAMB30 er nyttig på minst to måter. For det første kan et fragment av DNA som inneholder et funksjonelt startsted for replikasjon B^ subtilis, påvises når det klones på pAMB30 slik at plasmidet vil replikere autonomt i den ekstrakromosomale tilstand. For det andre kan plasmid pAMB3 0 integreres i genomet til B^ subtilis på et sted med homologi mellom kromosomet og den B^ subtilis-DNA som er klonet på pAMB30. Dette er blitt vist av Haldenwang, et al., J. Bacteriol., 142, 90-98 (1980) og Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983) som brukte lignende plasmidvektorer som, men ikke identisk med, pAMB30.

Plasmid pAMB21 (beskrevet i eksempel 1) ble oppløst med EcoRI og Pstl for å isolere xylE-genet på et 1,0 kb fragment. Fragmentet ble ligert til pAMB30 som tidligere var blitt oppløst med EcoRI og Pstl. Ligeringsprodukter ble inn-ført i E^ coli C600 ved transformasjon. Det ble selektert for kloramfenicholresistente (20 yg/ml) vertceller som var føl-somme for ampicillin (50 yg/ml) på grunn av innføyelsen av xylE-fragmentet til pAMB21 i det strukturelle gen for ampicillinresistens i pAMB30. Det resulterende plasmid, pAMB30/21, har identiske egenskaper med pAMB30, men har i tillegg et funksjonelt xylE-gen.

Plasmid pAMBllO som bærer aprA-genet, hvorfra et område som koder for de siste 22 6 aminosyrene til fullt ferdig subtilisin, ble oppløst med EcoRI og Kpnl. Det 1,9 kb store fragment av B^ subtilis-DNA som inneholder genetiske regulatorsekvenser for aprA-genekspresjon, "pre-pro"-området, DNA-sekvensen som koder for de første 4 9 aminosyrene til fullt ferdig subtilisin og 3' ikke-kodende sekvenser, ble ligert til pAMB30/21 som tidligere var blitt oppløst med EcoRI og Kpnl. Ligeringsproduktet ble innført i E^ coli C600 ved transformasjon. Plasmid.DNA fra flere transformanter ble isolert ved hjelp av fremgangsmåten med alkalisk ekstraksjon til Birnboim, et al., supra, og tilstedeværelsen av det inn-føyde 1,9 kb fragment ble verifisert ved multiple restrik-sjonsendonukleaseoppløsninger. Ett slikt plasmid, betegnet pAMB301, ble beholdt for videre bruk.

B. subtilis stamme BGSC1A274 (Bacillus Genetic Stock Center) bærer en mutasjon i npr-stedet og er ute av stand til å produsere ekstracellulær nøytral protease. Plasmidet pAMB3 01 ble integrert i genomet til subtilis BGSC1A2 74 ved transformasjon av kompetente celler [Spizizen, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 44, 1072-1078 (1958)]. Det ble selektert for kloramfenicholresistente (5 yg/ml) vertceller som så ble overført ved hjelp av sterile tannpirkere til L-agar supplert med 1,5% (vekt/volum) pulverisert skummet melk og (5 yg/ml) kloramfenichol. De cellene som ikke produserte en klar ring rundt kolonien, manglet evnen til å produsere ekstracellulære nøytrale proteaser og serinproteaser på grunn av kombinasjonen av npr-mutasjonen sammen med den ny-innførte aprA-mutasjon. aprA-mutasjonen var en utelatelse av de siste 226 aminosyrene i fullt ferdig subtilisin på grunn av erstatningen av villtype- aprA-genet med versjonen med utelatelser som bæres på pAMB301. En slik stamme, betegnet BZ24, har npr Apr Cm<r->fenotype, og produserer således ingen påvisbar ekstracellulær nøytral protease eller ekstracellulær alkalisk protease, og er resistent overfor kloramfenichol ved 5 yg/ml. "Southern blotting"[Southern,

J. Mol. Biol., 98_, 503-517 (1975)] ble brukt til å bekrefte utelatelsen i aprA-genet på kromosomet til B^ subtilis BZ24. Dyrking av B^ subtilis BZ24 i antibiotisk medium nr. 3 (Penassay Broth, Difco, Detroit, Michigan) i fravær av antibiotisk utvelgelse i omtrent 32 generasjoner førte til isoleringen av en derivatstamme av BZ2 4 hvor cat-genet som gir kloramfenicholresistens til vertceller, var tapt på grunn av dens ustabilitet i BZ24-kromosomet. Et slikt fenomen er tidligere blitt observert av Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984). Et kloramfenicholsensitivt derivat av BZ24 ble betegnet BZ25. B^ subtilis BZ25 har Npr~ Apr~-feno-typen og produserer således ingen påvisbar ekstracellulær nøytral protease eller ekstracellulær alkalisk protease. "Southern blotting" ble brukt til å bekrefte utelatelsen i aprA-genet på kromosomet til B^ subtilis BZ25.

Ettersom B^ subtilis BZ25 ikke produserer noen påvisbar ekstracellulær nøytral protease eller subtilisin, er den en nyttig vertstamme for innføring av plasmid-DNA, slik som pAMBH3, for produksjonen av muterte subtilisiner som kan utskilles i det omgivende vekstdyrkningsmedium som er

fritt for andre proteaser.

B. subtilis BZ25 produserer ingen påvisbare ekstracellulære proteaser når kultursupernatanter analyseres som beskrevet nedenunder. B^ subtilis BZ25/pAMBll3, som er BZ25 som huser plasmid pAMBH3 (innført ved hjelp av protoplast-transformasjonsmetoden til Chang, et al., supra), produserer vesentlige mengder av [Ser 218]-subtilisin når kultursupernatanter analyseres som beskrevet.

Eksempel 10

Integrering av [Ser <218> ]-subtilisingenet i kromosomet til B^ subtilis var antatt å tilveiebringe en effektiv måte for å øke den genetiske stabilitet til dette mutantgenet.

En slik fremgangsmåte demper også behovet for kloramfenichol i fermenteringsmediet, noe som ellers trengs for anvendelse av selektivt trykk for å opprettholde plasmid-DNA

i den ekstrakromosomale tilstand. [Ser 218]-subtilisingenet sammen med dets genetiske regulatorsekvenser og flankerende DNA som er homolog med B^ subtilis-kromosornet, ble derfor isolert fra en agarosegel med lavt smeltepunkt etter elektroforese av pAMBll3 som var blitt oppløst med EcoRI og Pstl i kombinasjon. Det 4,0 kb store EcoRI- Pstl-fragment (illustrert i figur 4) ble så ligert til pAMB30 (illustrert i figur 5) som var blitt oppløst med EcoRI og Pstl i kombinasjon. Ligeringsprodukter ble innført i E_;_ coli HB101 (A.T.C.C. 33694) ved transformasjon. Det ble selektert for celler som er resistente overfor kloramfenichol (20 yg/ml). Plasmid-DNA fra fire transformanter som imøtekom de ovenfor nevnte kriterier ble isolert ved hjelp av fremgangsmåten med alkalisk ekstraksjon ifølge Birnboim, et al., supra, og så ble det oppløst med EcoRI og Pstl i kombinasjon. Alle fire plasmider inneholdt 4,0 kb-innføyelsen og den 5,6 kb gjenværende del av pAMB30. Et slikt plasmid, betegnet pAMB302, ble renset og bibeholdt for videre bruk.

Gjentatte forsøk for å integrere plasmid pAMB302 i kromosomet til B^ subtilis BZ25 ved hjelp av kompetansemetoden (Spizizen, supra) var ikke vellykket. Dette kan skyldes BZ25-cellenes manglende evne til å bli kompetente ved hjelp av den anvendte fremgangsmåte. pAMB302 ble derfor innført i B_;_ subtilis BZ25-celler ved hjelp av protoplast-transformasjonsmetoden til Shang, et al., supra. Dette re-sultatet er særlig betydningsfullt ved at forskningsstammer hvor integrering er blitt oppnådd ble valgt ut på grunnlag av transformasjon ved hjelp av kompetansemetoden. Stammer som kan være ute av stand til å bli kompetente, og særlig industrielle stammer som ikke ble utvalgt på grunnlag av transformasjon ved hjelp av kompetansemetoden, kan mer sann-synlig være ute av stand til å bli kompetente.

Det ble selektert med hensyn på kloramfenicholresistente celler (5 yg/ml) som så ble overført med sterile tannpirkere til L-agar supplert med 1,5% (vekt/volum) skummet melk og 5 yg/ml kloramfenichol. Celler ble inkubert over natten ved 37°C. Klare ringer med forskjellige diametere ble observert rundt cm 3-koloniene. Dette indikerer at subtilisin ble fremstilt og utskilt ved hjelp av disse cellene. Et for-søk ble gjort på å isolere plasmid-DNA fra 8 av disse koloniene ved hjelp av fremgangsmåten med alkalisk ekstraksjon. Det ble ikke påvist noe plasmid-DNA på agarosegeler som ble farget med ethidiumbromid (1 yg/ml) for å visualisere DNA etter elektroforese. Fraværet av ekstrakromosomal plasmid-DNA i Cm<r->cellene som produserte subtilisin var en sterk indikasjon på at pAMB302 var blitt integrert i kromosomet til B. subtilis.

Flere kolonier som man fikk fra dette forsøket, ble isolert og betegnet BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 og BZ33. Hver stamme ble dyrket over natten ved 37°C med kraftig rysting i hjerne-hjerte-infusjonsmedium (BHI) supplert med 5 yg/ml kloramfenichol. Kultursupernatanter ble analysert med hensyn på subtilisinaktivitet. B^ subtilis stammene BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 og BZ33 produserte alle subtilisin og utskilte det i det omgivende dyrkningsmedium, noen stammer produserte mer enn andre. Mengden av subtilisin observert i den flytende dyrkningsvæske var direkte proporsjonal med størrelsen på ringen observert på skummet melk/L-agar-plater. Ettersom mengder av subtilisin utskilt ved hjelp av disse cellene var forskjellige, var flere kopier av pAMB302 integrert i kromosomet, eller det hadde funnet sted en økning i antallet kopier av genet [Young, J. Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983), Albertini, et al., J. Bacteriol., 162, 1203-1211 (1985) ] .

Eksempel 11

Villtype-subtilisin fra BZ25/pAMBlll og [Asp<76>, Ser<109>, Ser 218]-subtilisinanalog fra BZ25/pAMB131 ble isolert og renset på følgende måte. Hver dyrkningsvæske ble sentrifu-gert ved 15.000 g i 30 minutter og protein i den klare super-natant ble utfelt med (NH4)2S04 (350 g pr. liter). Utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering, triturert med 75% aceton, filtrert og tørket under vakuum.

For ytterligere å rense enzymet ble den tørkede ut-felling oppløst i vann og oppløsningen ble filtrert og så dialysert mot 0,02M natriumfosfatbuffer ved pH 6,3. Den dia-lyserte oppløsning ble sendt gjennom en kolonne (2,5 x 15

cm) med carboxymethylcellulose ved en hastighet på 2 ml pr. minutt. Etter vasking av kolonnen med 0,02M natriumfosfat (pH 6,3) ble enzymet eluert med den samme buffer inneholdende 0,15M NaCl. Toppfraksjoner ble slått sammen og protein fra fraksjonene inneholdende enzymet identifisert ved hjelp av en fargeendring i en prøve av fraksjonen blandet med succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-fenylalanyl-p-nitro-anilid, ble utfelt ved tilsetning av 2,5 volumdeler aceton. Utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering og så oppløst

i 0,005M kalsiumacetat (ca. 1 ml pr. 10 mg). Den resulterende oppløsning ble dialysert ved 4°C mot vann og så lyofilisert.

Eksempel 12

Ren subtilisin eller subtilisinanalog ble tilført en FPLC Superose 12 kolonne og materialet som eluerte som det intakte (ikke spaltede) protein ble slått sammen i 20 mM MES, 0,1 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6,3. Prøver av villtypesubtili-sin eller subtilisinanalog ifølge foreliggende oppfinnelse som skulle evalueres, ble inkubert i 10 minutter i den samme buffer, bufferen pluss 3% SDS eller 20 mM MES, 0,1 M NaCl, 5 mM CaC^ og 15 mM EDTA ved den angitte temperatur. Prøvene ble avkjølt til værelsetemperatur i 5 minutter og så analysert i 20 minutter ved værelsetemperatur (20°C) i Tris-HCl, pH 8,0 med 0,6% azokasein for å bestemme proteolytisk aktivitet. Den proteolytiske aktivitet av hver prøve uttrykkes som en prosent av den opprinnelige aktivitet av enten villtype eller analog, ved 20°C i 10 mM CaCl2, og er vist i tabell 2. ..... r* 76 _ 109 _ 218, Aktivitet av LAsp , Ser , Ser -- ]-subtilisinanalog ifølge eksempel 5

Eksempel 13

Intakte subtilisiner ble erholdt ved hjelp av FPLC på kolonnen med Superose 12. De intakte subtilisiner ble inkubert i 30 minutter ved værelsetemperatur (20°C) i 15 mM MES, 0,05 M NaCl, pH 6,3 inneholdende enten 4 mM CaCl2 eller 4 mM EDTA, og en variert mengde SDS. Den proteolytiske aktivitet til enzymet ble så bestemt ved hjelp av en 20-minutters inkubasjon i 0,6% azokasein i Tris-Cl, pH 8,0. Den proteolytiske aktivitet til hver evaluerte prøve er uttrykt i tabell 3 som en prosent av den opprinnelige aktivitet til prøven i 0% SDS og 10 mM Ca<2+>. Proteolytisk aktivitet av [ Asp 76 , Ser 109 , Ser 218]-subtilisinanaloger

Eksempel 14

Stabilitetene til [Asp 76 , Ser 109 , Ser ]-subtilisinana-r, 76 „, 79 _ 109 _ 218-, , .. , ... , log [Asp , Glu <79> , Ser , Ser <218>J-substilismanalog og subtilisin Carlsberg ble evaluert ved tre temperaturer (25°C, 37°C og 50°C) i to bufferoppløsninger (0,06M natriumfosfat, pH 9,0 eller 0,12M natriumglycinat, pH 11,0). Resultatene er uttrykt i tabell 4 som halveringstiden til enzymene under de angitte betingelser.

Selv om foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet ved hjelp av foretrukne utførelsesformer, skal det forståes at endringer og forbedringer vil oppstå for fagfolk innen teknikken. Det er således forventet at substitusjon av rester i andre kalsiumbindingssteder enn ved det bestemte kalsium som her er beskrevet, også kan forbedre stabilitet. Ytterligere forbedringer i stabilitet er forventet for slike sub-stitusjoner gjort i andre enzymer som har Asn-Gly-sekvensen og i andre proteiner som omfatter denne sekvensen. Dessuten er det forventet at en subtilisinanalog ifølge foreliggende oppfinnelse har bedre egenskaper enn villtype-subtilisiner i slike vaskemiddelblandinger som de som er beskrevet i f.eks. US patentskrifter nr. 3 732 170, 3 749 671 og 3 790 482.

Av praktiske grunner utføres videre mange industrielle prosesser ved temperaturer som er over stabilitetstemperatur-området til de fleste enzymer. Selv om vaskemiddelanvendel-

ser her er blitt fremhevet, antas det derfor at termostabile substilisinanaloger ifølge foreliggende oppfinnelse ikke bare er fordelaktig for visse industrier, slik som vaske-middelindustri, som allerede krever stabile subtilisiner,

men også kan være anvendbar i industrier hvor det anvendes kjemikalske midler til å hydrolysere proteiner, f.eks. hydro-

lyse av vegetabilske og animalske proteiner for fremstilling av suppekonsentrater.

Foreliggende oppfinnelse er derfor påtenkt å omfatte

alle slike endringer og forbedringer som faller innenfor om-

fanget av foreliggende oppfinnelse slik den er krevet.

Claims (23)

1. Subtilisinanalog, karakterisert ved at den har en aminosyresekvens til et naturlig forekommende Bacillus-subtilisin som er blitt endret ved at: (1) én eller flere av aminosyrene som er til stede i kalsiumbindingsstedet i det naturlig forekommende Bacillus-subtilisin representert ved Asp<41>, Leu75, Asn<76>, Asn77, Ser78, Ile<79>, Gly<80>, Val<81>, Thr<208> og Tyr21<4> er blitt erstattet av en negativt ladet aminosyre, og (2) én av eller begge aminosyrene i én eller flere Asn-Gly-sekvenser i det naturlig forekommende Bacillus-subtilisin er blitt utelatt eller byttet ut med en annen aminosyre, idet analogen har forbedret kalsiumbindingskapasitet i forhold til det naturlig forekommende Bacillus-subtilisin.

2. Subtilisinanalog ifølge krav 1, karakterisert ved at analogen er en analog av et naturlig forekommende Bacillus-subtilisin utvalgt fra gruppen bestående av subtilisin Carlsberg, subtilisin DY, subtilisin BPN', et aprA-subtilisin fra Bacillus subtilis og subtilisin fra Bacillus mesentericus.

3. Subtilisinanalog ifølge krav 1, karakterisert ved at den negativt ladede aminosyre er Asp eller Glu.

4. Subtilisinanalog ifølge krav 3, karakterisert ved at Asn<76> er byttet ut med Asp76.

5. Subtilisinanalog ifølge krav 3, karakterisert ved at Asn<77> er byttet ut med Asp77.

6. Subtilisinanalog ifølge krav 3, karakterisert ved at Ile<79> er byttet ut med Glu<79>.

7. Subtilisinanalog ifølge krav 3, karakterisert ved at Asn<76> er byttet ut med Asp76, og Asn<77> er byttet ut med Asp77.

8. Subtilisinanalog ifølge krav 3, karakterisert ved at Asn<76> er byttet ut med Asp76, og Ile<79> er byttet ut med Glu<79.>

9. Subtilisinanalog ifølge krav 1, karakterisert ved at en Asn-rest i Asn-Gly-sekvensen er byttet ut med en rest av en annen aminosyre.

10. Subtilisinanalog ifølge krav 9, karakterisert ved at en Asn-rest i Asn-Gly-sekvensen er byttet ut med en rest av en aminosyre fra gruppen bestående av Ser, Val, Thr, Cys, Glu og Ile.

11. Subtilisinanalog ifølge krav 10, karakterisert ved at Asn-resten i Asn-Gly-sekvensen er byttet ut med Ser.

12. Subtilisinanalog ifølge krav 11, karakterisert ved at en Asp-rest i posisjon 109 er byttet ut med Ser.

13. Subtilisinanalog ifølge krav 11, karakterisert ved at en Asn-rest i posisjon 218 er byttet ut med Ser.

14. Subtilisinanalog ifølge krav 11, karakterisert ved at en Asn-rest i posisjonene 109 og 218 er byttet ut med Ser.

15. Subtilisinanalog ifølge krav 14, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av [Asp76, Ser<1>09, Ser<218>]-subtilisin, [Asp<77>, Ser109, Ser21<8>]-subtilisin, [Glu<79>, Ser<109>, Ser<218>]-subtilisin, [Asp<76>, Asp<77>, Ser<1>0<9>, Ser<218>]-subtilisin og [Asp<76>, Glu<79>, Ser<109>, Ser218]-subtilisin.

16. Subtilisinanalog ifølge krav 1, karakterisert ved at Bacillus-subtilisin har en naturlig forekommende aminosyresekvens beskrevet i tabell 1.

17. Subtilisinanalog ifølge krav 16, karakterisert ved at ved den er [Asp<76>, Ser10<9>, Ser21<8>]-subtilisin.

18. Subtilisinanalog ifølge krav 16, karakterisert ved at den er [Asp<77>, Ser109, Ser<218>] -subtilisin.

19. Subtilisinanalog ifølge krav 16, karakterisert ved at den er [Glu<79>, Ser<109>, Ser<218>] -subtilisin.

20. Subtilisinanalog ifølge krav 16, karakterisert ved at den er [Asp<76>, Asp77, Ser10<9>, Ser<218>] -subtilisin.

21. Subtilisinanalog ifølge krav 16, karakterisert ved at den er Asp<76>, Glu<79>, Ser<109>, Ser<218>]-subtilisin.

22. DNA-sekvens som koder for en analog av Bacillus-subtilisin, hvor Bacillus-subtilisinet har en aminosyresekvens som omfatter kalsiumbindingssted og en Asn-Gly-sekvens, karakterisert ved at(l) kodoner som koder for én eller flere av aminosyrene i kalsiumbindingsstedet, er utelatt eller byttet ut med kodoner som koder for en negativt ladet aminosyre, og (2) kodoner som koder for én eller flere av aminosyrene i Asn-Gly-sekvensen er utelatt eller byttet ut med kodoner som koder for en annen aminosyrerest.

23. Anvendelse av en effektiv mengde av en subtilisinanalog ifølge krav 1 i en vaskemiddelblanding.