KR960006120B1

KR960006120B1 - 섭티리신 동족체

Info

Publication number: KR960006120B1
Application number: KR1019880701638A
Authority: KR
Inventors: 엠. 주코스키 마크; 스태빈스키 이트쟈크; 레비트 마이클
Original assignee: 암젠 인코포레이티드; 로버트 디. 웨이스트
Priority date: 1987-04-10
Filing date: 1988-03-28
Publication date: 1996-05-09
Also published as: NO885484D0; WO1988008033A1; HK1007168A1; DK686788A; EP0309565A1; DE3853328T3; IL85953A; CA1316473C; AU1701688A; ATE119941T1; EP0309565A4; FI885719A0; DK175576B1; JPH01502957A; DK686788D0; KR890700668A; FI105695B; EP0309565B1; NO885484L; EP0309565B2

Abstract

내용 없음

Description

[발명의 명칭]

섭티리신 동족체

[발명의 상세한 설명]

[본 발명의 배경]

본 발명은 열 및 pH에 대하여 안정한 새로운 종류의 섭티리신 동족체에 관한 것이다. 특히 본 발명은 증진된 칼슘 결합 능력을 제공하도록 칼슘 결합부위를 변경한 일군의 섭티리신 동족체 및 섭티리신에 존재하는 Asn-Gly 시퀀스 잔기를 선택적으로 삭제 및/또는 치환한 섭티리신 동족체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 그와같은 섭티리신 동족체의 제조방법 및 그를 포함하는 세정제 조성물 및 세척작용에 있어서 섭티리신과 그 조성물의 용도에 관한 것이다.

여기에서 섭티리신이란 여러 종류의 바실루스에 의하여 생성된 일군의 세포의 알칼리성 세린 프로테아제를 지칭하는 것이다. 이들 효소는 바실루스(Bacillus) 세린 프로테아제, 바실루스 섭티리신 또는 세균성 알칼리 프로테아제라고도 불리어진다.

바실루스 섭티리신 분자는 274개 잔기의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되거나[바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)에 의하여 생성된 섭티리신형 칼스버그 및 바실루스 섭티리신(Bacillus subtilis) 균주 DY에 의하여 생성된 섭티리신에 해당됨] 또는 275개 잔기의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된다[바실루스 아말로리퀘페이시언스(Bacillus amyloliquefaciens)에 의하여 생성된 섭티리신형 BPN', 바실루스 섭티리스의

유전자 생성물 및 바실루스 메센테리쿠스(Bacillus mesentericus)의 섭티리신에 해당됨]. 본원에서, 바실루스의 다른 균주로부터 생성된 섭티리신의 아미노산 시퀀스를 비교할때, 섭티리신 BPN'의 시퀀스를 표준으로 사용한다. 예를들면 섭티리신 칼스버그와 섭티리신 BPN' 사이의 상동성에 가장 큰 차이를 나타내는 시퀀스의 배열을 기초로 하여, 전자의 활성부위의 세린이란 그것이 아미노산 시퀀스의 위치220에 존재하더라도 세린 221로 칭한다. 같은 원리로 섭티리신 칼스버그의 아미노산 시퀀스의 위치 220은 섭티리신 BPN'의 위치 221에 "상응하는"으로 나타낼 수 있다. Nedkov 등의

1537-1540(1983)문헌 참조.

섭티리신 BPN'의 X-선 구조[Wright 등의

, 235(1969) 참조]는 Asp32, His64 및 Ser221을 포함하는 섭티리신의 촉매부 위의 기하학적 구조가 잔기 Asp102, His57 및 Ser195를 포함하는 포유동물의 세린 프로테아제(예를들면 키모트립신)의 활성부위의 기하학적 구조와 거의 동일함을 나타냈다. 그러나 바실루스 세린 프로테아제와 포유동물의 세린 프로테아제 사이의 전체적인 상이성은 그들이 서로 관련되지 않은 두 단백질 분해 효소군임을 가리킨다.

바실루스 섭티리신군에 있어서 완전한 아미노산 시퀀스는 다섯개의 섭티리신에 유용하다 ;

칼스버그[Smith 등의

2184-2191(1968)참조]; BPN'[Markland 등의

, 5198-5211(1967)참조] ;

유전자 생성물[Stahl 등의

411-418(1984) 참조] : DY[Nedkov 등의 상기 문헌 참조] 및 바실루스 메센 테리쿠스[Svendsen, 등의

220-232(1986)참조]. 섭티리신 칼스버그 및 섭티리신 BPN'(때로는 섭티리신 노보로 명명됨)는 84개 아미노산이 다르며 BPN'가 부가적인 잔기 하나를 더 갖는다는 점에서 다르다(섭티리신 칼스버그는 섭티리신 BPN'의 잔기 56에 상응하는 아미노산 잔기가 부족함). 섭티리신 DY는 274개의 아미노산으로 구성되어 있고 32개 아미노산 위치가 섭티리신 칼스버그와 다르며 82개 아미노산이 치환되고 하나가 삭제원점에서 섭티리신 BPN'와 다르다(섭티리신 DY는 섭티리신 BPN'의 잔기 56에 상응하는 아미노산이 결핍되어 있다)

유전자 생성물의 아미노산 시퀀스는 섭티리신 BPN'의 아미노산 시퀀스와 85% 상동이다. 따라서 바실루스의 서로 다른 균주들로부터 생성된 섭티리신의 아미노산 시퀀스들 사이에는 폭넓은 상동성이 존재한다.

이 상동성은 분자의 특정부위 특히 촉매 메카니즘 역할을 하는 부위와 기질 결합부위에서는 완전히 일치한다. 그와같은 시퀀스 불변성의 예로서는 각각 첫째 및 둘째 기질 결합부위인 Ser¹²⁵-Leu^l26-Gly¹²⁷-Gly¹²⁸및 Tyr^l04와 활성 세린(221) 부근의 시퀀스인 Asn²¹⁸-Gly²¹⁹-Thr²²⁰-Ser²²¹-Met²²²-Ala²²³이 있다.

섭티리신 분자는 독특한 안정성을 나타낸다. 그들은 넓은 pH 법위에서는 안정하지 않지만 요소 및 구아니딘 용액에 의한 변성에는 비교적 저항성을 지니며 8M 요소하에서도 여러시간 그 효소 활성도를 유지한다. 4 이하의 pH를 가지는 용액하에서의 섭티리신은 빨리 그리고 비가역적으로 그의 단백질 분해 활성도를 잃는다.

Gounaris 등의

37(1965)의 문헌에서 섭티리신의 산 비활성화는 일반적인 전하 효과에 기인하는 것이 아니라 분자 내부의 소수성 부분의 히스티딘 잔기의 양성자 첨가와 같은 분자내의 다른 변화에 기인하는 것으로 추측하였다. 바실루스 섭티리신은 온도와 pH에 크게 의존하는 속도로 수용액에서 비가역적으로 비활성화 된다. pH 4 이하 또는 11 이상에서의 비활성화 속도는 매우 빠르며 pH 4.5 내지 10.5 사이에서는 훨씬 느리고 용액이 알칼리성이 될수록 빨라진다. 상기 비활성화 메카니즘은 완전히 알려지지는 않았으나 자가분해가 상기 pH 범위에서 효소 불안정성에 최소한 부분적으로는 영향을 미친다는 증거가 있다. 일반적으로 어떤 pH에서든지 온도가 높을수록 섭티리신 비활성화 속도로 빨라진다. 단백질 가수분해가 요구되는 산업공정에 있어서 프로테아제의 용도는 공정 조건하의 효소 불안정성에 따라 제한된다. 예를들면 단백질성 균주의 제거를 촉진시키기 위하여 세탁용 세정제에 트립신을 포함시키는 것(예를들면 스위스 시니디사의 바이오-38)은 세탁 조건하에서의 효소 불안정성의 결과가 확실한 매우 한정된 성공을 갖는다. 따라서 세정제와 양립할 수 있는 세균성 알칼리 프로테아제가 세정제 제제형(製劑形)에 사용되어 왔다.

많은 산업 공정이 대다수 효소의 안정성 범위 이상의 온도에서 진행되므로 높은 내열성 프로테아제는 이와같은 프로테아제가 요구되는 세정제 및 가죽 탈모와 같은 특정 산업에 유용할 뿐만 아니라 수프 농축액의 제조에 있어서의 야채 및 동물 단백질의 가수분해와 같은 단백질 가수분해를 위한 화학적 수단을 사용하는 산업에도 유용할 것이다.

열 비활성화가 효소의 산업적 이용을 제한하는데 가장 큰 요인이긴 하나, 넓은 pH 범위에서의 효과 및 변성제의 사용에 따른 효과와 같은 그 밖의 요인들도 산업 공정상 프로테아제의 용도와 관련하여 손해 효과를 가져올 수 있다. 따라서 온도, pH, 변성제 및 산업상 요구되는 다양한 그밖의 조건들과 관련하여 증진된 안정성을 가지는 프로테아제를 생산하는 것이 바람직하다.

과거 수년에 걸쳐 세정제 제제형에는 특히 인산염을 선택적 보조제로 대체한 점과 환경학적 요구 및 소비자 요구에 따른 액체 세탁용 세정제의 개발에 있어서 중요한 변화가 있었다.

이러한 변화는 통상적인 세정제 효소의 변화를 필요로 한다. 더욱 특별하게는 액체 세정제 제제형에서 보다 큰 저장 안정성을 가지며 넓은 pH 및 온도 범위에서 안정성과 활성도를 가지는 단백질 분해 효소를 사용하는 것이 바람직하게 된 점이다.

첫째 시도로서 세정제 제제형으로 유용한 변형된 섭티리신의 제조방법에 있어서, 유럽 특허 출원 제130, 756호는 바실루스 아미로리퀘페이시언스(비. 아밀로리퀘페이시언스)의 섭티리신내의 Tyr^-1, Asp³², Asn¹⁵⁵,Tyr^lo4, Met²²², Gly¹⁶⁶, His⁶⁴, Gly¹⁶⁹, Phe¹⁸⁹, Ser³³, Ser²²¹, Tyr²¹⁷, Glu^l56및/또는 Ala¹⁵²위치에서의 변이가 변화된 안정성, 변화된 구조 또는 효소의 "프로쎄싱"상 변화를 제공하는 것을 확인하였다.

특히 Met²²²가 Ala 또는 Cys(또한 변이제는 천연의 것보다 더 뚜렷한 pH 최적을 나타낸다) 또는 Ser로 변성되는 것이 증진된 산화 안정성을 가져온다. 또한 Gly¹⁶⁶을 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Lys, Asn,Arg 또는 Val으로 대체하는 것이 효소의 역학적 변수를 변화시킨다고 제안하였다. 그러나 설명된 변성 가운데 어느것도 천연 효소보다 더 높은 온도 안정성과 넓은 pH 범위에서 안정성을 가지는 동족체를 제공하지 못하였다.

둘째 시도로서 Thomas 등의

318, 375-376(1985)문헌에서 섭티리신 BPN'의 Asp⁹⁹-Gly¹⁰⁰내의 Asp를 Ser로 변화시킴으로써 섭티리신의 pH 의존도가 변화될 수 있다고 제안하였다. 이 변화는 활성부위로부터 표면 전하 14-15옹스트롬을 변화시키는 것을 나타낸다. 그러나 Thomas 등은 이미 표면 전하가 생성된 경우의 증진은 지적하지 못하였으며, 이 경우 전하를 띠지 않는 잔기는 다른 것으로 대체하여야 한다.

셋째 시도로서 공동 계류중인 미국 특허 출원 제819,241호는 프로테아제에 존재하는 Asn-Gly 시퀀스를 삭제 및/또는 수정한 바실루스 세린 프로테아제 동족체에 관한 것이다.

[본 발명의 요약]

본 발명은 세정제 제제형 뿐만 아니라 안정된 프로테아제를 필요로 하는 다른 공정에 특히 유용한 pH 및 열에 대해 증진된 안정성을 가지는 일군의 섭티리신 동족체를 제공한다. 본 발명에 따른 섭티리신 동족체는 (1) 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 아미노산 시퀀스내에 존재하는 칼슘 결합부위의 하나 이상의 아미노산 잔기를 음전하를 띤 아미노산으로 치환하고 (2) 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 아미노산 시퀀스에 존재하는 Asn-Gly 잔기를 삭제하거나 치환함으로써 변형시킨 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 아미노산 시퀀스를 가진다. 또한 본 발명은 본 발명의 섭티리신 동족체를 포함하는 세정제 조성물을 제공하며, 세척 작용에 있어서의 섭티리신 동족체 밋 그의 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 섭티리신 동족체는 열 및 pH에 대하여 증진된 안정성을 나타내며, 증진된 고유 활성도 및 폭넓은 기질 특이성을 나타내므로 이와같은 동족체를 포함하는 세정제 제제형의 세정력도 증진된다. 특히 본발명의 섭티리신 동족체는 "천연적 형태"의 섭티리신보다 증진된 열 안정성, pH 안정성 및 고유 활성도를 나타낸다.

또한 본 발명은 상기 섭티리신 동족체를 암호화하는 코돈을 가지는 DNA 시퀀스에 관한 것이다.

본 발명은 상기 섭티리신 동족체를 암호화하는 핵산을 가지는 숙주 세포를 포함하는 섭티러신 동족체의제조방법을 제공한다. 상기 세포에 있어서, 섭티리신 동족체를 암호화하는 핵산은 염색체 또는 염색체외의 것일 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 동족체를 용이하게 분리하게 하는, 분비된 프로테아제가 결핍된 균주로부터 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명은 섭티리신 아미노산 시퀀스에 있어서 칼슘 결합부위를 변형하거나 표 1에 나타난 바와같은 아미노산의 위치 218에 상응하는 섭티리신 아미노산 시퀀스의 Asn-Gly 시퀀스 특히 아스파라긴 잔기를 다른 아미노산으로 치환함으로써 섭티리신의 열 및 pH에 내한 안정성을 중진시키는 방법을 제공한다.

[본 발명의 상세한 설명]

용어 "섭티리신(subtilisin)"은 분비되기 전이나 분비시 성숙한 효소로부터 분리되는 리더 시퀀스가 결핍된 형태로 분비되는 성숙한 형태의 효소를 가러킨다. 본 발명에 따라 변형될 수 있는 대표적인 섭티리신은 섭티리신 칼스버그, 섭티리신 BPN', 바실루스 섭티리신의

유전자 생성물, 섭티리신 DY 및 바실루스 메센테리쿠스의 아미노산 시퀀스로 대표되는 자연 발생적인 섭티리신을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니다. 섭티리신 칼스버그의 아미노산 시퀀스는

등의

2184-2191(1968)문헌에 기술되어 있다. 섭티리신 BPN'의 아미노산 시퀀스는 Markland 등의

5198-5211(1967)문헌에 기술되어 있다. 섭티리신 DY의 아미노산 시퀀스는 Nedlov 등의

1537-1540(1983)문헌에 기술되어 있다. 바실루스 메센테리쿠스의 섭티리신에 대한아미노산 시퀀스는 Sevden 등의

220-232(1986)문헌에 기술되어 있다. 바실루스 섭티리신의

유전자 생성물의 아미노산 시퀀스는 Stah1 등의

441-418(1984)문헌에 기술되어 있다. 이와같은 섭티리신의 아미노산 시퀀스를 모두 본 발명에 참고로 인용하였다. 이와같은 섭티리신은 분자를 안정하게 하는데 필요한 칼슘 결합부위를 가짐을 특징으로 한다.

본 발명은 칼슘과의 결합 능력이 증진된 섭티리신 동족체를 제공한다. 칼슘은 분말과 액체 세정제, 특히 보다 높은 온도를 요구하는 세척 작용시 섭티리신을 안정시키는데 사용된다. 본 발명은 칼슘과의 결합능력을 증진시키기 위하여 섭티리신 분자의 칼슘 결합부위를 변형하는 것에 관한 것이다. 여기서 사용되는 용어 "칼슘 결합부위의 변형"이란 음전하를 가지는 섭티리신 아미노산에 존재하는 칼슘 결합부위의 하나 이상의 아미노산을 치환함으로써 그 결과 생성되는 섭티리신 동족체가 부가적인 음전하를 갖도록 하는 것을 가리킨다. 섭티리신에 있어서 칼슘 결합부위로 밝혀진 아미노산은 다음과 같다: 표 1에 제시한 아미노산 시퀀스와 관련된 Asp⁴¹, Leu⁷⁵, Asn⁷⁶, Asn⁷⁷, Ser⁷⁸, Ile⁷⁹, Gly^8o, Va^18l, Thr²⁰⁸및 Tyr²¹⁴.

본 발명은 바람직하게는 칼슘 결합부위에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 "음전하를 가진" 아미노산으로 예를들면, Asp 및 Glu, 더욱 바람직하게는 Asp로 치환하는 것을 포함한다. 그러나 칼슘 결합부위의 Asp⁴¹이 음성 아미노산이지만 본 발명의 헝태는 Asp^4l을 Glu^4l로 치환하는 것을 포함한다. 다른 방법은Asp^4l을 다른 형태로 치환하는데 관한 것이다.

본 발명의 한 바람직한 형태는 Asn⁷⁶을 Asp⁷⁶으로 치환한 섭티리신 동족체를 포함한다. 다른 방법에서는Ile⁷⁹를 Asp⁷⁹로 치환한 것이 포함된다. 한 바람직한 방법에서는 Asn⁷⁷을 Asp⁷⁷로 치환한 섭티리신 동족체를 포함한다. 더욱 바람직한 본 발명의 방법은 칼슘 결합부위의 Asn^l09와 Asn²¹⁸을 Ser^l09와 Ser^2l8로 치환함으로써 불안정한 두 Asn-Gly 시퀀스를 제거하는 것이다.

상기 칼슘 결합부위 이외에, 섭티리신은 하나 이상의 부가적인 칼슘 결합부위를 가질 수도 있다. 본 발명의 청구범위는 섭티리신에 존재할 수 있는 하나 이상의 모든 칼슘 결합부위의 변형을 포함한다. 특별한 섭티리신에 있어서 즉, 섭티리신 동족체로서 특별히 적용되는 특이 섭티리신에 있어서 칼슘 결합부위의 수는 많은 요인에 의해 변형 될 수 있다. 섭티리신에 존재할 수 있는 다른 잠정적인 칼슘 결합부위로는 (1)Asp^14o와 Pro¹⁷²; (2) Pro¹⁴와 Gln²⁷¹및 (3) Pro¹⁷²와 Glu^l95또는 Asp¹⁹⁷이 있다.

각 분자에 존재하는 이 특수한 칼슘 결합부위는 변형된 특별한 섭티리신에 의존한다. 위에서 언급한 바와같이 상기 잠정적인 칼슘 결합부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환은 열 및 pH에 대해 증진된 안정성을 가지는 섭티리신을 제공한다. 대표적인 치환은 Asp^14o을 Glu^l40으로, Pro¹⁷²를 Asp¹⁷²로, Pro¹⁴를 Asp¹⁴로, Gln^27l을 Glu²⁷¹로, Glu^l97을 Asp¹⁹⁷로 치환하는 것이다.

섭티리신 분자의 칼슘 결합부위를 변형하는 것 이외에도 섭티리신에 존재하는 모든 Asn-Gly 시퀀스를 삭제하거나 치환하는 것이 바람직하다. 상기 미국 특허 출원 제819,241호는 바실루스 섭티리신의 위치109-110, 특히 218-219에 존재하는 보존적 시퀀스인 Asn-Gly이 이들의 pH에 내한 불안정성에 영향을 주는 중요한 요인임을 지적하였다. 불안정 요인인 Asn²¹⁸-Gly²¹⁹를 섭티리신 분자로부터 제거하기 위하여 Asn^2l8을 아스파라긴 이외의 다른 아미노산으로 바꾸거나 Gly^2l9를 글리신 이외에 다른 아미노산으로 바꾸었다. 다른 방법으로 위치 l09-110의 불안정 요소인 Asn-Gly를 변형함으로써 동족체에 안정성을 제공한다고 기술되어 있다.

본 발명에 따른 바람직한 바실루스 섭티리신의 동족체는 바실루스 섭티리신내에 Asn-Gly 시퀀스를 포함하는 칼슘 결합부위를 변형하여 Asn-Gly 시퀀스를 포함하지 않도록 하고, 특히 바실루스 섭티리신내에 보다 적은 Asn-Gly 시퀀스가 존재함을 특징으로 하는 아미노산 시퀀스를 가진다. 가장 바람직하게는 표 1에 제시한 아미노산 시퀀스의 위치 218에 상응하는 위치가 아스파라긴 잔기를 포함하지 않고 그 밖의 다른 잔기를 포함하되, 특히 세린, 발린, 트레오닌, 시스틴, 글루타민 및 이소로이신중에서 선택한 아미노산일때 바람직하다. 아스파라긴을 다른 특정한 아미노산으로 치환할때 활성부위의 구조와의 간섭이 야기된다면 그 효과는 오히려 덜 바람직할 수 있다(예를들면, 방향즉 아미노산의 존재하에 삽입할때 또는 프롤린의 존재하에서와 같은 3가 구조에서 삽입할때 입체 장애를 일으킬 수 있다). 아스파라긴을 다른 아미노산으로 치환하는 범위에서 하전된 기(예를들면 아스파르트산)를 활성부위에 근접하도록 삽입하는 것과 같은 치환은 대체로 덜 바람직하다. 현재 바람직한 형태는 변헝된 칼슘 결합부위 및 섭티리신의 Asn-Gly 시퀀스를 [Ser²¹⁸]로 변형한 형태를 가지는 동족체이다. 본 발명의 범위내에서 선택적인 형태의 동족체는 변형된 칼슘 결합부위를 가지되 섭티리신 BPN'의 Asn^l09또는

유전자 생성물의 Asn^lo9를 치환한 것, 특히 세린으로 치환한 것과 위치 110 및/또는 219의 글리신 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 것이다. 다른 섭티리신내에서 칼슘 결합부위의 변형 및 섭티리신 칼스버그 또는 DY의 잔기 62의 Asn, 또는 잔기 63의 Gly의 치환은 본 발명 범위에 포함된다.

바실루스 미생물은 층분한 양의 단백질을 분비하는 능력에 기인하고 세정제용 프로테아제를 생산하기 위하여 지속적으로 사용되므로 본 발명에 따른 섭티리신 동족체 재결합성 생산을 위한 바람직한 숙주이다. 대부분의 바실루스가 알칼리성 또는 중성의 프로테아제를 분비하기 때문에 변성된 섭티리신은 다른 프로테아제가 없는 배지에서 비.섭티리스에 의하여 생성되고 분비되므로 비.섭티리스의 내인성 알칼리 및 중성의 프로테아제 유전자에 의하여 변성이 유도되는 것이다. 따라서 본 발명은 내인성의 합성은 억제하나 섭티리신 동족체를 합성하고 분비할 수 있는 능력을 보유하는 비. 섭티리스의 변이체 균주를 제공한다.

하기에서 더 상세히 설명하는 바와같이 본 발명의 섭티리신 동족체의 pH 및 열에 대한 안정성 및 세정제 제제형의 안정성은 천연 형태의

유전자 생성물 섭티리신 및 칼스버그 섭티리신의 안정성보다 상당히 크다.

본 발명에 따른 섭티리신 동족체는 다음 방법으로 제조할 수 있다.

1) 비.섭티리스로부터 대표적인 섭티리신 유전자

를 분리하고; 2) 원하는 헝태가 되도록 올리고뉴클레오티드 특정부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)의 활용을 허용하는 벡터상에

유전자를 클로닝시키고; 3) 특정부위 돌연변이유발 후 원하는 돌연변이의 존재여부를 확인하기 위하여 생성된 DNA를 시퀀싱하고: 4) 비. 섭티리스내에서 변이된 효소의 합성을 유도하는 발현벡터를 구성하고; 5) 섭티리신 및 중성 프로테아제를 합성하지 않는 변이된 비.섭티리스 균주를 구성하고; 6) 세포외 성장 배지내의 효소를 분리한 후 정제하고; 7) 증진된 효소를 암호화하는 유전자를 미리 변이된 비.섭티리스 균주의 염색체내로 삽입시켜 내인성 프로테아제의 합성을 차단한다.

본원에서 사용한 바와같은 특수한 섭티리신 동족체는 괄호안의 아미노산이 삭제되거나 치환된 것으로 나타낸다. 예를들면,[Ser^l09]섭티리신은 아미노산 위치 109에 세린을 가지는 섭티리신 분자를 가리키며[Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸섭티리신은 아미노산 위치 109 및 218에 세린을 가지는 섭티리신 분자를 가리킨다.

실시예 1에 있어서, 섭티리신을 암호화하는

유전자는 비.섭티리스 게놈으로부터 분리한 것이다. 실시예 2에 있어서,

유전자는 특정부위 돌연변이유발에 종속된다. 실시예 3에 있어서는 변이된

유전자를 포함하는 발현 벡터가 구성된다. 실시예 4에 있어서는 [Ser¹⁰⁹]섭티리신 동족체가 생성된다. 실시예 5는 [Ser^lo9, Ser²¹⁸]섭티리신 동족체의 제조방법을 기술한 것이다. 실시예 6은 [Asp⁷⁶, Ser^l09, Ser²¹⁸]섭티리신 동족체의 제조방법을 기술한 것이다. 실시예 7은 [Asp⁷⁶, Asp⁷⁷, Ser^l09, Ser²¹⁸]섭티리신 동족체의 제조방법을 기술한 것이다. 실시예 8은 [Asp⁷⁶, glu⁷⁹, Ser^l09, Ser²¹⁸]섭티리신 동족체의 제조방법을 기술한것이다. 실시예 9에서는 검출할 수 없을 정도로 세포의 프로테아제를 생산하는 비.섭티리스의 두 변이체 균주를 구성한다. 실시예 10은 변이된

유전자를 비·섭티리스의 염색체로 삽입하는 방법을 기술한 것이다. 실시예 11은 천연

섭티리신과 변이된

섭티리신을 분러하고 정제하는 것이다. 실시예 12 내지 14에서는 [Ser²¹⁸]섭티리신과 천연

유전자 생성물의 열에 대한 안정성을 비교한 것이다.

본 발명의 세정제 조성물은 본 발명의 섭티리신 동족체와 함께 다음을 포함할 수 있다;

(a) 음이온성, 비이온성 또는 양쪽성 또는 수용성 수프일 수 있는 최소한 하나 이상의 계면활성제. 대표적으로는 음이온성 계면활성제(예를들면 선형 알킬아릴 술폰산염)와 비-이온성 계면활성제(예를들면 알킬페닐 폴리글리콜 에테르)를 세정제 조성물의 각각 5-30 및 1-5중량% 혼합하여 사용한다.

(b) 바람직하게 격리작용을 수반하는 하나 이상의 보조제, 트리폴리인산나트륨, 시트르산 나트륨, 규산나트륩 및 제올라이트는 그러한 화합물의 예이며, 보통 세정제 조성물의 10 내지 70중량%를 차지한다.

(c) 전형적으로 세정제 조성물의 30중량%에 달하는 양으로 포함된 과붕산나트륨과 같은 과산화 화합물이 바람직한 표백제.

(d) 카르복시메틸 셀룰로오스, 광학 광택제 및 향료와 같은 보조제. 만약 필요하다면 세탁용 조성물의 pH가 8.0 내지 10.5가 되도록 pH 조정제를 첨가한다.

본 세정제 조성물은 하나 이상의 본 발명의 섭티리신 동족체의 유효량을 포함한다. 본원에서 사용한 "섭티리신 동족체의 유효량"이란 특수한 세정제 조성물에서 필요한 효소 활성도를 얻는데 필요한 정도의 섭티리신 동족체를 의미한다. 이와같은 유효량은 해당 분야의 숙련된 기술자들에 의해 쉽게 확인될 수 있고, 이는 또한 사용한 특별한 섭티리신 동족체, 세척, 세정제 조성물의 특수한 조성, 요구되는 조성물이 액체인지 또는 분말인지 등의 요인을 근거로 하고 있다.

본 발명에 따른 특수한 섭티리신 동족체 제조법은 세정제 조성물 100g당 최소한 0.1앤손 유닛(AU, 이후참조), 바람직하게는 0. 5-2.5AU의 효소 활성도를 제공하도록 그 양을 계산하여 첨가한다. 필요하다면 무기 첨가제, 바람직하게는 황산나트륨을 첨가하여 100%로 채운다.

바람직하게는 비-수용액 배지 내의 효소 슬러리로부터 액체 세정제 조성물을 제조할 수 있다. 대표적으로 이와같은 슬러리는 액체 비-이온성 계면활성제, 예를들면 테르지톨(Tergito1) 15 에스 9 또는 이와같은 계면활성제의 혼합물내에서 미세하게 분쇄한 섭티리신 동족체 농축액으로 구성될 수 있다. 대개 슬러러는 미세하게 분쇄한 염화나트륨과 같은 하나 이상의 무기첨가제를, 선택적으로는 훈중시킨 실리카[에어로실(Aerosil) 200]와 같은 현탁액 안정화제와의 혼합물을 포함할 것이다. 테르지톨과 에어로실은 상표명이다.

본 발명의 섭티리신 동족체는 액체 세정제 조성물의 100g당 최소한 0.1AU 이상, 바람직하게는 0.2-2.5AU의 프로테아제 활성도를 제공하도록 계산된 양으로 첨가한다.

세정제 조성물은 주로 성분들을 함께 혼합하여 제조한다. 선택적으로는 예비 혼합물을 만든 후 남아있는 성분과 다시 혼합한다. 안정성 및 활성도 특성이 뛰어나므로 본 섭티리신 동족체는 단백질 분해 효소가 일반적으로 사용되는 모든 분야에 사용할 수 있다. 특히, 세정제, 얼룩 제거제, 가죽 탈모제 및 단백질 가수분해물의 제조가 필요한 식품 산업 및 불완전한 향체의 검출을 위한 혈청학에 사용할 수 있다. 특히 식품산업과 혈청학에 유용한데, 왜냐하며 다른 효소 제조시에 비하여, 수용액에서의 섭티리신 동족체를 안정화시키는데 생리학적으로 적합한 양의 칼슘이온이 필요치 않을 수 있으므로 본 섭티리신 동족체는 고체 또는 용해된 형태에서 뛰어난 안정성을 갖기 때문이다.

다음 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하기 위한 것으로 본 발명을 다음 실시예로 제한하는 것은 아니다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 무수아스파틸글리신을 형성하기 위하여 표 1에 나타난 바와같은 섭티리신의 위치 218 및 219의 Asn-Gly 잔기를 고리화하고 염기로 촉진시킨 그들의 가수분해를 나타내며 ;

제2도는

유전자를 함유하는 바실루스 섭티리신(비.섭티리스) 균주 QB127의

유전자 단편의 부분 제한지도이며

유전자와 측면 시퀀스의 부분 제한지도를 포함하고;

제 3도는 플라스미드 pAMBl1의 부분 제한지도이고;

제4도는 비.섭티리스 숙주 세포로부터의 [Ser]218-섭티리신의 합성을 유도하는 플라스미드인 pAMBl13의 구성 단계를 나타낸 순서도이고;

제 5도는 pAMB30 플라스미드의 부분 제한지도이고;

제 6 도는 pAMB106의 구셩을 나타내고;

제 7도는

의 구성을 나타낸다.

[실시예 1]

비.섭티리스 균주 QB127(

)를오 콜럼부스 오하이오 주립대학의 바실루스 제네틱스토크 센터로부터 구입하였다. 이 균주는

돌연변이[Lepesant 등의 in schlessinger, D., ed.,

, 1976, American Society for Microbiology, Washington, D. C., P. 65(1967) 참조]의 다면 발현 효과에 기인하여 동유전자형

균주에 비해 세포의 세린 및 급속 프로테아제, α-아밀라제 및 레반수크라제를 과잉 생산한다. 따라서 균주 QB127은 섭티리신을 암호화하는

유전자를 분리하기 위한 DNA의 안정원 원(sourse) 이다.

Saito 등의

619-629(1963)문헌의 방법에 따라 비.섭티리스 균주 QB127의 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 정제된 염색제 DNA는 엔도뉴클레아제인 제한 효소는

로 전달시킨다.

그 결과 생성되는 DNA 단편은 낮은 용융점을 가지는 아가로스 겔 상에서 전기영동함으로써 분해시키고 4.4 내지 8.0킬로베이스(kb) 범위의 단편을 분리하였다. 이 단편들을 높은 온도에서 많은 복제수를 나타내고 카나마이신에 저항성을 가지는 대장균 플라스미드인 pCFM936(메릴랜드 로크빌 파크로운 드라이브12301 아메리칸 타잎 컬쳐 콜렉션 ATCC 제53,413호)과 결합시켰다. 벡터를

로 절단하고, 결합시키기 전에 송아지 장의 알칼리성 인산효소로 탈인산화시켰다.

결합된 생성물을 대장균 C600(메릴랜드 로크빌 파크로운 드라이브 12301 아메리칸 타잎 컬쳐 콜렉션 ATCC 제23724호)으로 삽입시킨 후 10μg/ml의 카나마이신을 보충한 L-한천상에서 밤동안 배양한 후 카나마이신-저항성을 갖는 숙주 세포를 선택하였다. 선택한 숙주 세포를 42℃에서 4시간 동안 배양하여 플라스미드 DNA를 증폭하였다. 콜로니를 니트로셀룰로오스 필터로 옮긴 후 Grunstein 등의

3961(1975)문헌의 방법에 따라 콜로니를 혼성화하였다.

pCFM 936상의 섭티리신 유전자를 포함하는 콜로니를 선별하기 위하여 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. Beaucayge 등의

22, 1859-1862(1981)문헌에 기술된 아인산염 방법에 의하여 합성된 프로브는 다음 뉴클레오티드 시퀀스를 가졌으며

5' G C G C A A T C T G T T C C T T A T G G C 3'

이는

유전자 생성물의 아미노-말단에 상응하는 것이다(Wong 등의

81, 1184-1188(1984); Stah1 등의

411-418(1984) 참조). 혼성화 온도로는 55℃를 택하였고 총 400개 중에서 5개의 양성 콜로니가 확인되었다. 한 양성 콜로니로부터의 플라스미드 DNA를 pCFM936

로 명명하였다.

플라스미드 pCFM936

를 단독

와, 단독

을 결합시킨 것으로 절단시켰다. 섭티리신 유전자의

단편의 크기는 StahI 등의 상기 문헌에 기술된 바와 같으나 몇몇은 기술되지 않은

부위에서 발견되었다. 실시예 3에 기술한 바와같이

의 두 부위를 섭티리신 유전자의 유전자 증폭에 활용하였다.

비.섭티리스 QB127 게놈 DNA의 큰 6.5kb

단편은 제한효소 절단물이 StahI 등의 상기 문헌에 보고된 결과와 동일하다고 입증됨으로써,

유전자, 그의 조절 시퀀스 및 비관련 측면 시퀀스를 수반한다고 결정하였다. 이것은 Sanger 등의

161-178(1980) 문헌에 기술된 디데옥시 사슬종결 방법을 이용하는 DNA 시퀀싱에 의하여 입증되었다. 제2도에 기술한 바와같은 6.5kg

단편의 3.0kb

내지

소단편은

유전자, 조절 시퀀스 및 비관련 측면 시퀀스를 포함하는 것으로 밝혀졌다.

단편은 Stah1등의 문헌과 제1도에 따른 설명에 2.5kb의 길이를 갖는 것으로 보고되고 있으나, 제1도의 규모와 그 안의 단편의 규모에 대한 기술내용을 비교하여 보면 Stahl 등의 문헌에서도

단편이 실제로는 2.5kb 이상임을 드러내고 있다.

바실루스 숙주계에 내한 클로닝 벡터인 플라스미드 pAMB11은 다음과 같이 구성하였다. 플라스미드 pTG402(일리노이스 페오리아 유나이티드 스테이츠 디파트먼트오브 에그리컬쳐에 소재하는 노던 레져널 리서치 라브라토리스의 균주 제NRRL B-15264호)를 앤도뉴콜레아제 제한효소

으로 부분 절단하였다. 단편들을

로 미리 절단시킨

(메릴랜드 가이더스버그에 소재하는 베데스다 리서치 라보라토리스 카타로그 번호 제8227SA호를 구입함)과 결합하였다. 결합 생성물을 Mandel 등의,

154, (1970)문헌의 방법에 따라 형질전환시키기 위해 대장균 JMl03(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 인코포레이티드 카타로그 번호 제27-1545-01호)내에 삽입하였다. 박테리오파지 플라크는 pTG402로부터 유도된

유전자의 기능적 발현을 검출하기 위하여 0.5M 카테콜(증류수내에서 제조)과 함께 분무하였다.

유전자는 카테콜 2,3-디옥시게나제를 암호화하며 다양한 유기체내의 프로모터를 검출하는데 유용하다

그후

유전자를 프랑스 파리 인스티투트 파스테르(담당자; 알 데든더)로부터 구입한 대장균/비. 섭티리스 플라스미드 pHV33(아메리칸 타잎 컬쳐 콜렉션 ATCC 제39217호)[Primrose 등의

193-201(1981)참조]에 1.0kb

단편으로서 전이시켰다.

pHV33 플라스미드는 이와같은 부위에 결합시킬때

-함유 단편이 암피실린 내성에 대한 유전자를 비활성화시키도록

로 미리 절단시켰다. 그 결과 생성된 플라스미드 pAMB21은 내장균 숙주 세포내에 기능적인

유전자를 함유하나, 비. 섭티리스 숙주 세포내에서 발현되려면

에 대한 프로모터의 첨가가 필요하다. pAMB21을 함유하는 대장균 세포는 테트라시클린(15μg/ml)과 클로람페니콜(20μg/ml)에 내성을 갖는데 반하여 pAMB21을 함유하는 비.섭티리스 세포는 단지 클로람페니콜(5μg/ml)에 대해서만 내성을 갖는다.

박테리오파지 람다의

전사 종결 시퀀스를 플라스미드 pCFM936(400염기쌍의

단편상에서)으로부터 pAMB 21의 특정한

부위로 전이시켰다. 시퀀스 5′ GATCTGCA 3'를 갖는 합성 뉴클레오티드를 벡터 pAMB21의

부위에 대한

단편의

말단과 결합하도록 구성하였다. 그결과 생성되는 플라스미드를 pAMB22로 명명하고 전사 종결자를 포함하는 것을 제외하고는 pAMB21과 동일한 특성을 가졌다. pAMB22 플라스미드는 비.섭티리스 내에서 작용하는 강한 프로모터를 검출하는데 유용하다.

를 포함하는 pAMB22로부터의 1,4kb

DNA 단편은 낮은 용융점을 가지는 아가로스 겔 상에서 제한 단편들을 전기영동하여 분리하였다. 1.4kb의 DNA를

로 미리 절단시킨 플라스미드 pBD64(바실루스 제네틱 스토크 센터 제1E22호로부터 구입함)과 결합하였다. 그 결과 생성되는 5.3kb의 플라스미드인 pAMBll은 제3도에서와 같이

가 뒤따르는

유전자의 상류인 M13

의 폴리링커 시퀀스

을 포함한다. pAMBl1 플라스미드는 비.섭티리스 내에서 복제가 가능하며 클로람페니콜(5μg/mI) 및/또는 카나마이신(5μg/mI)에 저항하는 숙주 세포를 제공한다.

제4도에 나타난 바와같이,

를 함유하는 정제된

단편을 pAMBl11을 형성하기위하여 pAMBl1상에 클로닝하였다. 결합 생성물을 Chang 등의

111-l15(1979)문헌에 기술된 원형질체 형질전환 방법에 따라 비.섭티리스

(바실루스 제네틱 스토크 센터 제1A423호로부터 구입함)내로 삽입하있다. 플라스미드 DNA를 수반하지 않는 비.섭티리스 MI112는 프로테아제에 능숙하나(Prt+ 표현형)보다 낮은 섭티리신 분비 수준을 나타낸다. 클로람페니콜에 내성인(Cmr) 형질 전환체는 1.5%(w/v)의 탈지유 및 5μg/m1의 클로람페니콜이 보충된 L-한천 평판상에 이동시킨 후 37℃에서 배양하였다.

37℃에서 약 16시간 동안 배양한 후, 플라스미드 pAMB111을 함유하는 MI112 콜로니들은 각 콜로니를 둘러싸는 훈륜(halo)을 생성하였다. 훈륜은 탈지유 보충물의 카제인 성분상에서 섭티리신의 단백질 분해작용을 함으로써 생성된 것이다. pAMBl1 벡터만을 내포하는 MI112는 16시간 배양 후에도 가시적인 훈륜을 갖지는 않으나 37℃에서 40시간 배양한 후에는 결국 약간의 훈륜을 생성한다. pAMBl11을 운반하는 세포는 훈륜의 크기에 따라 pAMBl1을 운반하는 세포와 구별된다. 따라서 완전한 작용 형태의

유전자의 클로닝은 비.섭티리스에 의한 섭티리신의 생성 및 분비를 높은 수준으로 유도한다.

[실시예 2]

제4도에 나타난 바와같이, 실시예 1에서 기술한 3.0kb의

게놈 단편의 분리물을

절단하여 세 단편을 생성하였다:

(1)

유전자의 발현을 위하여 유전적 조절 시퀀스를 운반하는 1.lkb의

단편,섭티리신의 세포외 노출에 필요한 유전자의 "프리-프로"부위 및 성숙한 섭티리신의 첫번째 49개 아미노산을 암호화하는 DNA 시퀀스; (2) 전사 종결 시퀀스 및 3' 비-암호화 시퀀스를 수반하는 섭티리신의 아미노산 50 내지 275(카르복실-말단)를 암호화하는 DNA 시퀀스를 운반하는 1.1kb의

단편; 및 (3) 3' 비-암호학 시퀀스를 포함하는 0.8kb의

단편.

부위에 의하여 측면에 놓이는 1.1lkb 단편을 DNA 시퀸싱 및 특정부위 돌연변이 유발에 의한 박테리오파지

의 단일

부위에 클로닝하였다. 재조합체 가운데

로 명명된 것은

유전자의 특정부위 돌연변이 유발에 필요한 단일 가닥의 주형 DNA를 제공하였다.

리더 부위의 5개의 개시 코돈의 특이적 동질성은 Stahl 등의 상기 문헌 및 wong 등의 상기 문헌 보고에 기인하며,

유전자에 대한 시퀀스 정보의 특이적 동질성은 아미노산 위치 84 및 85에서 Stahl 등의 상기 문헌과 다른 코돈 시퀀스가 존재한다는 점이다. 특징적으로 Stah1 등의 아미노산 위치 84가 코돈 GTT(발린을 암호화한 코든)인 것으로 보고하고 있으나 표 1에는 코돈 GTA(이 또한 발린을 암호화한 코돈)로 나타나 있다. 또한 Stah1 등은 아미노산 위치 85가 코돈 AGC(세린을 암호화한 코돈)인 것으로 보고한데 반해 표 1에는 코돈 GCG(알라닌을 암호화한 코든)로 나타나 있다.

[표 1]

박테리오파지

는 박테리오파지

의 특정한

부위내에 전사 종결 시퀀스 및 3' 비-암호화 시퀀스를 수반하는

-섭티리신의 아미노산 50 내지 275(카르복실-말단)을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스를 비.섭티리스 QB127 게놈 DNA의 1.1kb

단편을 삽입함으로써 구성된다. 3' 비-암호화 시퀀스를 제거하기 위하여 엔도뉴클레아제인

제한 부위를 전사 종결 시퀀스가 뒤따르는 위치에서 특정부위 돌연변이 유발에 의하여 삽입시켰다.

특정부위 돌연변이 유발은 Norrander 등의

, 101-106(1983)문헌에 기술된 방법에 따라 유도되었다.

로부터의 단일-가닥 DNA를 다음 프라이머로 안닐링(annealing) 하였으며,

이는 Beaucage 등의

, 1859-1862(1981)문헌에 따른 아인산염 방법에 의하여 합성되었다. 상기 프라이머는 둘(별표로 나타냄)을 제외하고는 이 부분의 뉴클레오티드와 상동이며 티민(T)은 구아닌(G)으로 다른 티민(T)은 아데닌(A)으로 바뀌므로 이 부분에

부위(밑줄그은 부분)가 생긴다.

프라이머를 65℃에서

DNA에 안닐링시키고, 안닐링된 DNA를 약 22℃로 천천히 식힌 후12.5μl의 안닐링된 DNA 용액, 10mM의 dATA, dCTP 및 dGTP 각각 2.5μl, 12mM의 ATP 20μ1, 0.1μl의 클레녹스 DNA 중합효소, 0.1μ1의 T4 DNA 리가아제 및 13

1의 증류수로 구성되는 반응 혼합물 내에서 15℃로 2시간 동안 중합반응하였다. 그 결과 생성된 이중 가닥구조의 공유결합된 원형 DNA를 형질감염에 의해 대장균 JM103내로 도입하였다.

그후 박테리오파지 플라크를 Gene Screen^TM(메사추세츠 비버리 뉴 잉글랜드 뉴클리어) 혼성화 막으로 이동하였다. 원하는 염기 변화를 수반하는 DNA를 포함하는 플라크를 상기 돌연변이유발 프라이밍 반응에 사용되는 방사능 표지된(γ-³²p) 합성 올리고뉴클레오티드로 혼성화하여 확인하였다. 혼성화는 단지 DNA를 유발하는

만이 합성 올리고뉴클레오티드로 혼성화되도록 제한 온도인 65℃에서 진행하였다. M13

으로 명시된 정제된 단일 플라크로부터의 DNA상에

유전자의

변이체 하류가 존재하는 겻은 Sanger 등의 상기 문헌에 따른 방법과 제한효소 분석으로 밝혀냈다.

대부분의 3' 비-암호화 부위를 운반하는 1.1kb 단편은

로 절단하고, 절단 생성물을 500ng DNA/m1에서 결합시킨 후 결합 생성물을 대장균 JM103으로 형질감염에 의해 삽입함으로써 제거하였다. 바람직한 0.35kb 삭제가 이루어진 DNA를 포함하는 박데리오파지 플라크는 엔도뉴클레아제 제한효소 본석으로 확인하였다. 이와같은 플라크로부터의 박테리오파지를

(제7도)로 명명하였다. (

는 실시예 3에 기술된

유전자의 특정부위 돌연변이 유발을 위한 단일-가닥의 주형 DNA를 제공하였다.

[실시예 3]

비.섭티리스내의 변이된 섭티리신 유전자를 발현시키기 위하여 플라스미드 pAMBl06을 다음과 같이 변이된 유전자를 위한 운반체로서 구성하였다:

1) pAMBl11을

로 절단하였다.

대부분의

유전자를 운반하는 1.lkb 단편은 1μg/ml 농도에서 pAMBl11의 HindIII 절단 생성물을 재결합하여 삭제하였다. 이것은 제4도에 나타나는 바와같은 pAMBl10의 생성 결과이다. pAMB110 플라스미드는 섭티리신 유전자, 섭티리신의 분비를 위해 필요한 "프리-프로"부위 및 성숙한 섭티리신의 3'비-암호화 부위와 성숙한 섭티리신의 첫번깨 49개 아미노산을 암호화하는 DNA 시퀀스의 발현을 위한 유전적 조절 시퀀스를 운반한다.

2) 플라스미드 pAMBl10을 결합된 형태의

절단하였다. 이 과정은 6.2kb와 1.0kb의 두 크기의 DNA 단편을 생성한다. 1.0kb의 단편은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) mt-2(Zukowski 등의 상기 문헌 참조)의 TOL 플라스미드로부터 카테콜 2,3-디옥시게나제를 암호화하는 xylE 유전자를 운반한다.

3) 보다 큰 6.2kb의

단편을 Beaucage 등의 상기 문헌에 따른 아인산염 방법과 T4 DNA 리가제에 의하여 합성되는 단일 가닥으로 된 합성 올리고뉴콜레오티드 5' GATCTGCA 3'의 보조로자가 결합시켰다. 결합 생성물을 Change 등의 Mo1. Gen. Genet.

, 111-115(1979)문헌의 원형질체 형질전환 방법으로 비.섭티리스

(바실루스 제네틱 스토크 센터 제1A423호로부터 구입함)내로 삽입하였다.

콜로람페닐콜-내성(CmR) 콜로니를 플라스미드 성분에 대하여 선별하였다. 6.2kb 플라스미드는 pAMBl06을 엔도뉴클레아제 제한 효소 분석으로 확인하였다.

가 삭제된 것을 제외하고는 플라스미드 pAMBl10과 동일하다(제 6도).

섭티리신의 아미노산 50 내지 275를 암호화하는 DNA가 결핍되어 있으므로 pAMBl06은 비.섭티리스 숙주 세포내로 삽입될때 섭티리신을 합성하지 않는다. 섭티리신은 단지 섭티리신 유전자의 잔류물을 삽입한 후, 즉 천연 DNA 시퀀스 또는 동족체를 암호화하는 시퀀스를 삽입한 후에만 생성된다.

[실시예 4]

[세린 109] 섭티리신 동족체의 제조 방법

박테리오파지

로부터의 단일 가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 기술된 아인산염방법으로 합성된 프라이머에 안닐링하였다.

이 프라이머는 별표한 위치에서 염기 A가 G로 치환되어 Asn¹⁵⁹(코돈 AAC)가 Ser¹⁰⁹(코돈 AGC)로 변화되는 것을 제외하고는 aprA-섭티리신의 아미노산 106 내지 113에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동 이다.

이 프라이머를 65℃에서

DNA로 안닐링 한 후 안닐링된 DNA를 22℃까지 천천히 냉각시키고 실시예 2에서와 같이 중합, 결합 및 형질감염시켰다.

박테리오파지 플라크를 혼성화막으로 이동시킨 후 바람직한 염기 변화를 수반하는 DNA를 포함하는 플라크를 상기 돌연변이 유발 프라이밍 반응에 사용되는 방사능 표지된(γ-³²p) 합성 올리고뉴콜레오티드로 혼성화하여 확인하였다. 혼성화는 65℃에서 진행하였다. 한 양성 플라크는

[Ser¹⁰⁹]로 명명되는 박테리오파지를 포함하였다. 이 박테리오파지로부터의 이중가닥 DNA를 서로 결합된 형태의

와

으로 절단시킨 후

-섭티리신 유전자의 변이된 부분을 운반하는 750bp 단편을

으로 미리 절단시킨 후 pAMB106에 결합하였다. 결과적으로 생성되는 플라스미드 pAMB129를 [Ser¹⁰⁹]-섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 적합한 비.섭티리스 숙주 세포로 삽입할 수 있다.

[실시예 5]

[세린 109, 세린 218] 섭티리신 동족체의 제조방법

M13mp18 apr4 [Ser¹⁰⁹]로부터의 단일 가닥으로 된 DNA를 Beuacage 등의 상기 문헌에 따른 아인산염방법으로 합성된 프라이머에 안닐링하였다 :

이 프라이머는 별표한 위치에서 A가 G로 치환됨으로써 Asn218(코돈 AAC)이 Ser218(코돈 AGC)로 전이되는 것을 제외하고는

-섭티리신의 아미노산 215 내지 220에 대한 코돈을 함유하는 뉴클레오티드와 상동이다. 아닐링, 중합, 결합, 형질감염 및 양성 플라크의 확인 조건은 모두 실시예 2에 기술한 바와 같다. 정제된 단일 플라크는

[Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]로 명명된 박톄리오파지를 포함한다., 이 박테리오파지로부터의 이중-가닥 DNA를 결합된 형태의

으로 절단한 후, 두 변이체를 운반하는 750bp 단편을

으로 미리 절단한 후 pAMB106에 결합하였다. 그 결과 생성되는 플라스미드인 pAMB130을 [Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]-섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 비.섭티리스 숙주 세포내로 삽입할수 있다.

[실시예 6]

[Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]섭티리신 동족체의 제조방법

[Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]로부터의 단일 가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 따른 아인산염 방법으로 합성된 프라이머에 안닐링하였다:

이 프라이머는 별표한 위치에서 염기 A가 G로 치환됨으로써 Asn⁷兪(코돈 AAT)가 Asp⁷⁶(코돈 GAT)로 전이되는 것을 제외하고는

-섭티리신의 아미노산 74 내지 79에 대한 코돈을 포함하는 뉴콜레오티드와 상동이다.

상동 프라이머를 65℃에서

[Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]DNA로 안닐링한 후, 안닐링된 DNA를 22℃에서 천천히 냉각시켜 실시예 2에 기술한 바와 같이 중합, 결합 및 형질감염시킨다.

박테리오파지 플라크를 혼성화 막으로 이동한 후 바람직한 염기 변화를 수반하는 DNA를 포함하는 플라크를 46℃에서의 혼성화는 제외하고 실시예 2에 기술한 방법으로 혼성화하여 확인하였다. 한 양성 플라크는

[Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²²⁸]로 명명되는 박테리오파지를 포함하였다. 박테리오파지로부터의 이중-가닥 DNA를 결합된 형태의

으로 절단한 후 aprA-섭티리신 유전자의 세 변이체를 운반하는 750bp 단편을

으로 미리 절단한 후 pAMB106에 결합하였다. 그 결과 생성되는 플라스미드인 pAMB131을[Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²²⁸]-섭티리신을 합성하고 분비하도록 비.섭티 리스 숙주 세포내로 삽입할 수 있다.

[실시예 7]

[Asp⁷⁶, Asp⁷⁷, Ser¹⁰⁹, Ser²²⁸]섭티리신 동족체의 제조방법

[Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²²⁸]로부터의 단일 가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 따른 아인산염 방법에 의하여 합성된 프라이머에 안닐링하였다:

이 프라이머는 별표한 위치에서 염기 A가 G로, C가 T로 치환됨으로써 Asn⁷⁷(코돈 AAC)가 Aps⁷⁷(코돈GAT)로 전이되는 것을 제외하고는 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]-섭티리신의 아미노산 74 내지 80에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동이다.

상기 프라이머를 65℃에서

[Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]DNA에 안닐링한 후 안닐링된 DNA를 22℃에서 천천히 냉각시켜 실시예 2에 기술한 바와같이 중합, 결합 및 형질감염시켰다.

박테리오파지 플라크를 혼성화 막으로 이동하고, 바람직한 염기 변화를 수반하는 DNA를 포함하는 플라크를 46℃에서의 혼성화는 제외하고 실시예 2에 기술한 방법에 따라 혼성화함으로써 확인하였다. 한 양성플라크는

[Asp⁷⁶, Asp⁷⁷, Ser¹⁰⁹, Ser²²⁸]로 명명되는 박테리오파지를 포함하였다. 이 박테리오파지로부터의 이중 가닥 DNA를 결합된 형태의

으로 절단한 후 aprA-섭티리신 유전자의 네 변이체를 운반하는 750bp 단편을 미리

으로 절단한 pAMBl06에 결합하였다. 그결과 생성되는 플라스미드인 pAMB132을[Asp⁷⁶, Asp⁷⁷, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]-섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 비.섭티리스 숙주 세포내로 삽입할 수 있다.

[실시예 8]

[Asp⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser¹⁰⁹, Ser²²⁸]섭티리신 동족체의 제조방법

[Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁹, Ser²²⁸]로부터의 단일 가닥 DNA를 Beaucage 등의 상기 문헌에 기술된 아인산염 방법에 의하여 합성된 프라이머에 안닐링하였다:

이 프라이머는 별표한 위치에서 염기 A가 G로, T가 A로 치환됨으로써 Ile⁷⁹(코돈 ATC)가 Glu⁷⁹(코돈GAA)로 전이되는 것을 제외하고는 [Asp⁷⁶, Ser^l09, Sre²¹⁸]-섭티리신의 아미노산 75 와 83의 부분적인 코돈 및 아미노산 76 내지 82의 전체적인 코돈을 포함하는 뉴클레오티드와 상동이다.

상기 프라이머를 65℃에서 M13 mp18 apr4[Asp⁷⁶, Ser^l09, Ser²¹⁸]DNA에 안닐링한 후 안닐링된 DNA를 약 22℃에서 천천히 냉각시켜 실시예 2에 기술한 바와같이 중합, 결합 및 형질감염시켰다.

박테리오파지 플라크를 혼성화 막으로 이동하고 46℃에서의 혼성화는 제외하고 실시예 2에서와 같이 혼성화하여 확인하였다. 한 양성 플라크는

[Asp⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser^l09, Ser²²⁸]로 명명되는 박테리오파지를 포함하였다. 이 박테리오파지로부터의 이중 가닥 DNA를 결합된 형태의

으로 절단하고

-섭티리신 유전자의 네 변이체를 운반하는 750bp 단편을 미리

으로 절단한 pAMB106에 결합하였다. 그 결과 생성되는 플라스미드인 pAMB133을[Asp⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser^l09, Ser²¹⁸]-섭티리신의 합성 및 분비를 위하여 비.섭티리스 숙주 세포내로 삽입할 수 있다.

[실시예 9]

대부분의 바실루스는 주위 성장 배지내로 알칼리성 및/또는 중성의 프로테아제를 분비하기 때문에 돌연변이 세포내로 삽입할 때 돌연변이 섭티리신 유전자가 천연의 섭티리딘 동족체의 분비를 방해하는 다른 프로테아제가 없는 배지내로 분비되도록 돌연변이 섭티리신을 생성할 수 있도록 하기 위하여 그들의 합성을 차단하는 비.섭티리슨의 내인성 알칼리성 및 중성 프로테아제 유전자로 돌연변이를 유동하는 것이 바람직하다. 검출할 수 없을 정도의 세포의 프로테아제를 생산하는 두개의 변이체 비. 섭티리스 균주 BZ24 및 BZ25를 다음 방법으로 구성하였다:

첫째, 대장균에서는 복제가 가능하나, 상동적 재조합에 의하여 비.섭티리스 염색체내로 삽입되지 않는한 비. 섭티리스에서는 복제가 불가능한 플라스미드 운반체를 다음과 같이 구성하였다. 플라스미드 pBD64(바실루스, 제네틱 스토크 센터 제1E22호)를

로 절단하여 2.95kb, 1.0kb 및 0.75kb 크기의 세 단편 제조를 완결하였다. 그 후

으로 미리 단편들을 혼합물로서 결합하였다. 결합 생성물을 형질전환 [Mande1 등의

., 53, 154(1970)참조]에 의하여 대장균 C600(아메리칸 타잎 컬쳐 콜렉션 A.T.C.C. 제23724호로부터 구입)으로 삽입하였다. 콜로람페니콜(20 μg/ml) 및 암피실린(50 μg/ml)내성인 세포를 선택하였다. 12개의 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 Birnboim 등의

7, l513-1523(1979) 문헌에 기술된 알칼리성 추출 방법으로 제조한 후 삽입된 단편을 확인하기 위하여 결합된 형태의

으로 절단하였다. 이와같은 플라스미드인 pAMB30은 pBR322의

부위에서 pBD64의 1.0 및 0.75kb

단편을 운반하는 것이 밝혀졌다. 이들 단편들은 대장균 및 비.섭티리스에서 작용하는 클로람페니콜 아세틸전이효소(

)유전자를 포함한다.

로 각각 절단하여 제5도에 나타나는 바와같이 pAMB30의

유전자의 동일성과 그의 배향을 확인하였다.

pAMB30은 비.섭티리스에서 작용하는 복제 시퀀스의 기원이 결핍되어 있으므로 비.섭티리스 숙주세포에서 자가 복제하는 것은 불가능하다. 반면, pAMB30은 대장균내에서 작용하는 pBR322-유래 복제 기원을 포함하므로 이 플라스미드는 대장균 숙주세포에서는 증식이 가능하다. 플라스미드는 적어도 두가지 방법으로 유용하게 사용될 수 있다. 첫째, 비.섭티리스 내에 기능상 복제 기원을 포함하는 DNA 단편은 플라스미드가 염색체외의 상태에서 자율적으로 복제되는 것처럼 pAMB30 상에 클로닝될 때 검출될 수 있다. 둘째, 플라스미드 pAMB30은 pAMB30상에 클로닝된 염색체와 비.섭티리스 pAMB30은 PAMB30상에 클로닝된 염색체와 비.섭티리스 DNA 사이의 상동 부위에서 비.섭티리스의 게놈내로 통합될 수 있다. 이것은 pAMB30과 유사하나 동일하지는 않은 플라스미드 운반제를 사용하는 Haldenwang 등의

142, 90-98(1980) 및 Young의

129, 1429-1512(1983) 문헌에 의하여 입증되었다.

플라스미드 pAMB21(실시예 1에 기술함)을

으로 절단하여 1.0kb 단편의 xy1E 유전자를분리하였다. 이 단편을 EorRI 및 PstI으로 미리 절단한 pAMB30에 결합하였다. 결합 생성물을 형질전환으로써 대장균 C600 내로 삽입하였다. pAMB3이 암피실린 내성을 갖도록 pAMB21의

단편을 구조 유전자내로 삽입하는데 기인하여 암피실린(50 μg/ml)에 민감한 클로람페니콜 내성(30 μg/ml)숙주세포를 선택하였다. 그 결과 생성된 플라스미드인 pAMB30/21은 pAMB30과 동일한 특성을 가졌으나

유전자의 특성을 갖지 않는다.

성숙한 섭티리신의 후반부 226개 아미노산을 암호화하는 부위가 삭제된 aprA 유전자를 운반하는 플라스미드 pAMBl10을

으로 절단하였다.

유전자 발현을 의한 유전적 조절 시퀀스, "프리-프로"부위, 성숙한 섭티리신의 첫째 49개 아미노산을 암호화하는 DNA 시퀀스 및 3' 비-암포화 시퀀스를 포함하는 비.섭티리스의 1.9kb 단편을

으로 미리 절단하여 pAMB30/21에 결합하였다. 결합 생성물을 형질전환 방법으로 대장균 C600에 삽입하였다. 몇몇 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 Birnboim 등의 상기 문헌에 따른 알칼리성 추출 방법으로 분리한 후 다양한 엔도뉴클레아제 제한효소로 절단하여 삽입된 1.9kb 단편의 존제를 입증하였다. 이와같은 플라스미드 pAMB301을 다음 용도를 위하여 보관하였다.

비.섭티리스 균주 BGSClA274(바실루수 제네틱 스토크 센터)는 npr 유전자 위치에서 돌연변이를 수반하여 세포의 중성 프로테아제를 생성하지 못한다. 플라스미드 pAMB301을 감응 세포(competent cell)의 형질전환 방법으로 비.섭티리스 BGSClA274의 게놈내로 삽입하였다[Spizizen의

, 44, 1072-1078(1958)참조]. 1 5%(W/V)의 탈지유 분말 및 (5 μg/m1)의 클로람페니콜이 보충된 L-한천에 멸균한 이쑤시개로 이동시켜 콜로람페니콜-저항성 (5 μg/mI)숙주세포를 선택하였다. 콜로니를 둘러싸는 투명한 훈륜을' 생성하는데 실패한 세포들은 새롭게 유도되는

돌연변이를 수반하는

돌연변이의 결합에 기인하여 세포외의 중성 및 세린 프로테아제를 생성하는 능력이 결핍되어 있다. 천연

유전자가 pAMB301상에 운반되는 삭제 변형체로 치환되므로

돌연변이는 성숙한 섭티리신의 후반부226 아미노산이 삭제된다.

BZ24로 명시된 균주는 Npr-Apr-Cms11표현형을 가지며 검출 불가능할 정도의 세포의 중성 프로테아제 또는 세포의 알칼리성 프로테아제를 생성하며 5 μg/m1의 클로람페니콜에 대해 내성을 갖는다. 비.섭티리스 BZ24의 염색체상의

유전자내에서의 삭제를 확증하기 위하여 서던블로팅

을 사용하였다. 약 32개의 생성체에 대한 항생물질 선택이 결여된 항생물질 배지 제3도(미시간 디트로이트 딥코 펜어세이 브로스)에스 비 .섭티리스 BZ24의 배양은 BZ24 염색체내의 이들의 불안전성 때문에 숙주세포에 클로람페니콜 내성을 제공하는 cat 유전자의 손실로 BZ24의 유도체 균주의 분리를 유도한다. 이와같은 현상은 Stah1 등의

158, 4l1-418(1984) 문헌에서 이미 관찰된바 있다. 클로람페니콜에 민감한 BZ24의 유도체를 BZ25로 명명하였다. 비. 섭티리스 BZ25는 Npr-Apr- 표현형을 가지며, 검출 불가능할 정도의 세포의 중성 프로테아제 또는 세포외 알칼리성 프로테아제를 생성한다.

비. 섭티리스 BZ25의 염색체상의

유전자내의 삭제를 확인하기 위하여 서던 블로팅을 사용하였다. 비. 섭티리스 BZ25는 검출 불가능할 정도의 세포의 중성 프로테아제 또는 섭티리신의 생성하므로 다른 프로테아제가 없는 주위의 성장 배지로 분비될 수 있는 돌연변이 섭티리신 생성되로록 pAMA113과 같은 플라스미드 DNA를 삽입하는데 있어서 상기 비. 섭티리스 BZ25는 유용한 숙주 균주이다.

비.섭티리스 BZ25는 배양 상층액을 다음과 같이 분석할 때 검출 불가능할 정도의 세포의 프로테아제를생성한다.

플라스미드 pAMB113을 내포하는 BZ25인 비.섭티리스/pAMB113(Chang 등의 상기문헌의 원형질체 형질전환 방법에 의해 삽입됨)은 상기와 같이 배양 상층액을 분석할때 다소의 [Ser²¹⁸-섭티리신을 생성한다.

[실시예 10]

비. 섭티리스의 염색체내로 [Ser²¹⁸]-섭티리신 유전자를 삽입하는 것은 이 변이체 유전자의 유전적 안정성을 증가시키는 효율적인 방법을 제공한다고 믿어왔다. 이 방법은 또한 염색체 외에서 플라스미드 DNA를 보존하기 위하여 선택적인 압력을 적용하는데 필요한 발효 배지내의 클로람페니콜의 요구는 경감시킨다. 따라서, 비. 섭티리스 염색체에 대한 유전적 조절 시퀀스 및 측면 DNA 상동체를 수반하는 [Ser²⁸]-섭티리신 유전자를 결합된 pAMB113와

으로 수반하는

을 낮은 용융점을 갖는 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 분리하였다.

4.0kb

단편(제4도에 나타나 있음)을 결합된 형태의

으로 절단한 pAMB30(제5도에 나타나 있음)에 결합하였다. 결합 생성물을 형질전환에 의해 대장균 HBl01(A.T.C.C.제33694호)에 삽입하였다. 클로람페니콜(20 μg/ml)에 내성인 세포를 분리하였다. 상기 기준에 일치하는 네 변형체로부터의 플라스미드 DNA를 Birnboim 등의 상기 문헌에 따른 알칼리성 추출 방법으로 분리한 후 결합된

으로 절단하였다. 전체 네 플라스미드는 pAMB30의 4.0kb의 삽입부분 및 5 .6kb 잔존 부분을 포함하였다. pAMB302로 명시된 플라스미드는 다음에 사용하기 위하여 정제하여 보관하였다.

수용능력 방법[Spizizen의 상기 문헌 참조]에 의해 플라스미드 pAMB302를 비. 섭티리스 BZ25의 염색체내로 삽입하기 위해 반복한 시도는 성공적이지 못하였다. 이것은 사용한 방법이 BZ25 세포에 적합하지 않기 때문이다.

따라서 pAMB302를 Chang 등의 상기 문헌에 따른 원형질체 형질전환 방법으로 비.섭티리스 BZ25 세포에 삽입하였다. 그 결과는 지금까지 획든한 것을 집성한 연구 규주를 수용능력 방법에 의한 형질전환에 근거하여 선택한 점에서 특히 중요하다. 균주 가운데 적합하지 않은 것도 있는데 특히 수용능력 방법에 의한 형질전환에 근거하여 선택되지 않은 산업상의 균주는 더욱 적합하지 않다.

1.5%(W/V) 탈지유 및 5μg/mI의 콜로람페니콜로 보충된 L-한천에 멸균한 이쑤시개로 이동하여 클로람페니콜-내성(5 μg/mI)세포를 선택하였다. 세포를 37℃에서 밤동안 배양하였다. 다른 지름을 가지는 훈륜이 Cmr콜로니 주위에서 관찰되었다. 이는 이들 세포에 의하여 섭티리신이 생성되고 분비됨을 나타내는것이다. 알칼리성 추출 방법에 의해 이러한 콜로니 8개로부터 플라스미드 DNA의 분리를 시도하였다. 플라스미드 DNA는 전기영동 후 DNA를 가시화시키기 위해 에티디엄브로미드(1 μg/ml)로 착색한 아가로스 겔상에서 검출되지 않았다. 섭티리신을 생성하는 Cmr 세포내에서 염색체외의 플라스미드 DNA의 부재는 pAMB302의 비. 섭티리스의 염색체내로 삽입되었음을 강력히 시사하였다.

이 실험결과 생성된 몇몇 콜로니를 분리하여 BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 및 BZ33으로 명명하였다. 각각의 균주를 5 μg/m1 클로람페니콜이 보충된 뇌 심장침출액 배지(BHI, 딥코)내에서 격렬히 흔들면서 37℃에서 밤동안 배양하였다. 섭티리신 활성도를 분석하기 위하여 배양액 상층액을 분석하였다. 비. 섭티리스 균주 BZ28, BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 및 BZ33은 모두 섭티리신을 생성하였으며 주위의 성장 배지내로 분비하였고 몇몇 균주는 다른 균주보다 더욱 많이 생성하였다. 액체 배양액내에서 관찰되는 섭티리신의 양은 탈지유 L-한천 평판 상에서 관찰되는 훈륜의 크기에 정비례하였다.

이들 세포에 의하여 분비되는 섭티리신의 양이 다르므로, pAMB302의 다수의 복제물이 염색체내로 삽입되거나, 유전자 증폭[Young의

129, 1497-1512(1983); Albertini 등의

162, 1203-1211(1985) 참조]이 발생한다.

[실시예 11]

BZ25/pAMB11로부터의 천연 섭티리신 및 BZ25/pAM131로부터의 [Asp⁷⁶, Ser¹⁰⁸]-섭티리신 동족체를 분리한 후 다음과 같이 정제하였다. 각 배양 육즙을 15,000g로 30분간 원심분리한 후, 맑은 상층액 내의 단백질을 (NH₄)₂SO₄(350g/리터)으로 침전시켰다. 원심분리로 이 침전을 모은 후 75%의 아세톤으로 분쇄하고 여과하여 진공하에서 건조시켰다.

효소를 더 정제하기 위하여 건조된 침전물을 물에 용해시킨 후, 이 용액을 여과하고 pH 6.3의 0.02M 인산나트륨 완충용액에 대하여 투석하였다. 투석된 용액은 1분당 2m1의 속도로 2.5x15cm의 카르복실메틸 셀룰로오스 칼럼에 통과시켰다. 칼럼을 0.02M의 인산나트륨(pH 6.3)으로 세척한 후, 0.15M의 NaC1을 포함하는 동일한 완충용액으로 효소를 용리시켰다. 피크 분석을 모은 후, 숙시닐-L-알라닐-L-프로필-L-페닐알라닐-P-니트로아닐리드(배가 바이오케이컬스)와 혼합한 분획 시료의 색 변화로 확인되는 효소를 포함하는 분획으로부터의 단백질은 2.5부피의 아세톤을 첨가하여 침전시켰다. 원심분리로 침전을 모은후 0.005M의 아세트산 칼슘(약 1m1/l0mg)에 용해시켰다. 그 결과 생성되는 용액을 4℃에서 물에 대하여 투석하고 동결건조시켰다.

[실시예 12]

순수한 섭티리신 또는 섭티리신 동족체를 FPLC 세파로스 12칼럼에 가하고, 분리되지 않은 단백질 용리물질을 pH6.3의 20mM MED, 0.lmM CaCl2 내에 모았다. 평가된 본 발명의 천연 형태의 섭티리신 또는 섭티리신 동족체의 시료를 동일한 완충용액 +3% SDS, 또는 20mM MES, 0.lM NaCl, 5mM CaC12 및 15mM EDTA에서 지시된 온도로 10분간 배양하였다. 시료를 온도에서 5분간 냉각시킨 후 단백질 분해 활성도를 결정하기 위하여 0.6%의 아조카제인을 수반하는 pH 8.0의 트리스-HCl 내에서 실온으로 20분간 분석하였다. 각 시료의 단백질 분해 활성도는 20℃, 10mM CaC1₂에서 천연 형태 또는 동족체의 본래 활성도에 대한 퍼센트로 나타내었으며 이는 표 2에 나타나 있다.

[표 2]

천연 섭티리신의 단백질 분해 활성도

실시예 5의 [Asp⁷⁶, Ser^lo9, Ser²¹⁸]섭티리신 동족체의 활성도

[실시예 13]

세파로스 12 칼럼 상에서 FPLC에 의하여 본래의 섭티리신을 수득하였다. 이 섭티리신을 4mM CaCl₂또는 4mM EDTA 및 다양한 양의 SDS를 포함하는 pH 6.3의 15mM MES, 0.05M NaCl 내에서 실온(20℃)으로 30분간 배양하였다. 효소의 단백질 분해 활성도는 0.6% 아조카제인을 함유하는 pH 8.0의 트리스-C1 내에서 20분간 배양함으로써 측정하였다. 평가한 각 시료의 단백질 분해 활성도를 0% SDS 및 10mM Ca²⁺내에서 시료의 본래 활성도에 대한 퍼센트로 나타내었으며 그 결과는 표 3에 나타난 바와 같다.

[표 3]

천연 섭티리신의 단백질 분해 활성도

[Asp⁷⁶, Ser^lo9, Ser²¹⁸]섭티리신 동족체의 단백질 분해 활성도

[실시예 14]

[Asp⁷⁶, Ser^lo9, Ser²¹⁸]섭티리신 동족체, [Asp⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser¹⁰⁹, Ser²¹⁸]섭티리신 동족체 및 섭티리신 칼스버그의 안정성을 두 완충용액(pH 9의 0.06M 인산나트륨 또는 pH l1.0의 0.12M 소디움 글리시네이트)하의 세 온도(25℃, 37℃ 및 50℃)에서 측정하였다. 그 결과는 특정 조건하에서 효소의 반감기로 나타냈으며 표 4에 나타나 있다.

[표 4]

A. pH l1.0의 0.12M 소디움 글리시네이트 +0.2% SDS

B. pH 9.0의 0.06M 인산나트륨+0.2% SDS

C. pH l1.0의 0.12M 소디움 글리시네이트 +5mM EDTA

D. pH 9.0의 0.06M 인산나트륨+5mM EDTA

지금까지 본 발명을 바람직한 구체예로 기술하였으나 해당 분야의 숙련된 기술자들에 의한 수정 및 개선도 가능할 것이다. 따라서 본원에서 기술한 특징적인 칼슘 이외에도 칼슘 결합부위에서의 잔기의 치환이 안정성을 증진시킬 것이다. 안정성의 증진은 Asn-Gly 시퀀스를 가지는 다른 효소 및 이 시퀀스를 포함하는 다른 단백질의 치환으로 기대된다. 또한 본 발명에 따른 섭티리스 동족체는 본 발명에 참고로 인용한 미국특허 제3,732,170호: 미국 특허 제3,749,671호 및 미국 특허 제3,732,170호에 나타난 세정제 제제형 내의 천연 섭티리신에 대하여 뛰어난 특성을 가진다.

무엇보다도 많은 산업 공정은 대부분 효소의 안정성 온도 범위 이상에서 진행된다. 따라서 본원에서 강조되고 있는 세정제 적용에 있어서, 본 발명에 따른 열에 대하여 안정된 섭티리신 동족체는 이와같은 섭티리신이 요구되는 세정제 산업과 같은 특정 산업 분야에 유리할 뿐아니라, 예를들면 수프 농축액 생산을 위한 채소 또는 동물 단백질의 가수분해에 있어서 단백질 가수분해하는 화학 수단으로서 산업 분야에 있어서 유용한 것으로 믿어지고 있다.

따라서, 본 청구범위에 따르는 발명의 범위내에서 가능한 모두는 변형 및 개선도 본 발명의 범위에 포함하고자 한다.

Claims

(1) 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 칼슘결합부위에 존재하는, 표 1에 나타난 바와 같은 아미노산 Asp^4l, Leu⁷⁵, Asn⁷⁶, Asn⁷⁷, Ser⁷⁸, Ile⁷⁹, Gly⁸⁰, Va¹⁸¹, Thr^2o8및 Tyr²¹⁴중 하나 이상의 아미노산을 음전하를 가지는 아미노산으로 치환하고; (2) 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 하나 이상의 Asn-Gly 시퀀스를 삭제하거나 다른 아미노산으로 치환함으로써 변형되는 자연 발생적인 바실루스 섭티리신의 아미노산 시퀀스를 가짐을 특징으로 하는 십티리신 동족체.
제1항에 있어서, 상기 동족체는 섭티리신 칼스버그, 섭티리신 DY, 섭티리신 BPN', 바실루스 섭티리스의 [aprA] 섭티리신 및 바실루스 메센테리쿠스로부터의 섭티리신으로 구성된 그룹 중에서 선택한 자연발생적인 바실루스 섭티리신의 상기 변형된 아미노산 시퀀스를 가지는 동족체임을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제1항에 있어서, 음전하를 가지는 아미노산을 Asp 또는 Glu임을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제3항에 있어서, Asn⁷⁶이 Asp⁷⁶으로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제3항에 있어서, Asn⁷⁷이 Asp⁷⁷로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제3항에 있어서,Ile⁷⁹가 Glu⁷⁹로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제3항에 있어서, Asn⁷⁶이 Asp⁷⁶으로 치환되고 Asn⁷⁷이 Asp⁷⁷로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제3항에 있어서, Asn⁷⁶이 Asp⁷⁶으로 치환되고 Ile⁷⁹가 Glu⁷⁹로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제1항에 있어서, 상기 Asn-Gly 시퀀스 내의 Asn 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환됨을 특징으로 하는 성티리신 동족체.
제9항에 있어서, 상기 Asn-Gly 시퀀스 내의 Asn 잔기는 Ser, Val, Thr, Cys, Glu, Ile 중에서 선택된 아미노산 잔기로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제10항에 있어서, Asn-Gly 시퀀스 내의 Asn 잔기가 Ser로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제11항에 있어서, 위치 109의 Asn 잔기가 Ser로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제11항에 있어서, 위치 218의 Asn 잔기가 Ser로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제11항에 있어서, 위치 109 및 218의 Asn 잔기가 Ser로 치환됨을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제14항에 있어서, 섭티리신 동족체는 [Asp⁷⁶, Ser^lo9, Ser²¹⁰]섭티리신, [Asp⁷⁷, Ser^lo9, Ser²¹⁸]섭티리신, [Glu⁷⁹, Ser^l09, Ser^2l8]섭티리신, [Asp⁷⁶, Asp⁷⁷, Ser^l09, Ser^2l8]섭티리신 및 [Asp⁷⁶, Glu⁷⁹, Ser^l09, Ser^2l8]섭티리신으로 구성되는 그룹 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제1항에 있어서, 바실루스 섭티리신은 표 1에 나타난 바와 같은 자연 발생적인 아미노산 시퀀스를 가짐을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제16항에 있어서, 섭티리신 동족체가[Asp⁷⁶, Ser^lo9, Ser²¹⁸]섭티리신임을 특징으로하는 섭티리신 동족체.
제16항에 있어서, 섭티리신 동족체가 [Asp⁷⁷, Ser^l09, Ser²¹⁸]섭티리신임을 특징으로 하는 섭티리신동족체.
제16항에 있어서, 섭티리신 동족체가 [GIu⁷⁹, Ser^lo9, Ser²¹⁸]섭티리신임을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제16항에 있어서, 섭티리신 동족체가[Asp⁷⁶, Asp⁷⁷, Ser^l09, Ser²¹⁸]섭티리신임을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
제16항에 있어서, 섭티리신 동족체가 [Asp⁷⁶, GIu⁷⁹, Ser^lo9, Ser²¹⁸]섭티리신임을 특징으로 하는 섭티리신 동족체.
칼슘 결합부위 및 Asn-GIy 시퀀스를 포함하는 아미노산 퀀스를 가지는 바실루스 섭티리신의 동족체를 암호하는 시퀀스를 가지는 DNA에 있어서, (l) 칼슘 결합부위의 하나 이상의 아미노산을 암호하는 코돈을 삭제하거나 음전하를 가지는 아미노산을 암호하는 코돈으로 치환하고; (2) Asn-Gly 시퀀스내의 하나 이상의 아미노산을 암호하는 코돈을 삭제하거나 다른 아미노산 잔기를 암호하는 코돈으로 치환함을 특징으로 하는 바실루스 섭티리신 동족체를 암호하는 시퀀스를 가지는 DNA.
칼슘 결합부위의 아미노산 잔기를 음전하를 가지는 아미노산으로 치환하고 Asn-GIy 시퀀스내의 하나 이상의 아미노산을 치환하거나 삭제하는 과정으로 구성되는, 칼슘 결합부위를 가지는 바실루스 섭티리신의 열 및 pH에 대한 안정성을 증진시키는 방법.
세정제 제제형내에 제1항의 섭티리신 동즉체의 유효량을 포함하는 조성물.