JPH01502957A - スブチリシンアナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 スブリチシナナログ 発明の背景 本発明は新規類の熱安定性及びｐＨ安安定ススブチリシンアナログび該アナログ の製造方法に係る。特（こ、本発明番ま改良されたカルシウム結合能力を提供す る修飾されたカルシウム結合部位を有しており、場合によってζよスジチリシン 中に存在するへ５ｎ−Ｃ１ｙ配列のいずれかの残基が欠失及び／又は置換されて いるような類のスブチリシンアナログ（こ係る９本発明は更に、このようなスブ チリシンを含有する洗剤組成物、並びにこのようなスブチリシン及び組成物の洗 浄用としての使用に係る。

スブチリシンなる用語は各種の〕〈チレス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種Ｇこより産生 される細胞外アルカリセリンプロテアーゼの群を表す、これらの酵素はＢａｃｉ ｌｌｕｓセリンプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシン又は細菌アルカリ プロテアーゼとも呼称される。

Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシン分子は２７４個の残基（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｅ ｂｅｎｉｆｏｒｓｉｓにより産生されるＣａｒｌｓｂｅｒｇ型のスブチ１ノシン 及びＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｓｔｉｌｉｓＤＹ株により産生されるスブチリシ ンノ場合）、又は２７５個の残基（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ＋ａ　１ｏｌｉ　ｕｅ ｆａ−ｄμｌにより産生されるＢＰＮ’型のスブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ ｕｂｔ　ｉ　Ｉ　ｉｓのｍ遺伝子生成物、及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｓｅｎｔ ｅｒｉｃｕｓのスブチリシンの場合）のいずれかの単一ポリペプチド鎖から構成 される１本文中で異なるＢａｃｉｌｌｕｓ株からのスブチリシンのアミノ酸配列 を比較する場合、ＢＰＮ’スブチリシンの配列が標準として使用される１例えば 、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシン及びＢＰＮ’スブチリシンの間に最高の相同 度を与える配列の整列に基き、前者の活性部位のセリンはアミノ酸配列の２２０ 位に位置するにも拘わらすセリン２２１と呼称される。同一の基準に基づいて、 Ｃａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンのアミノ酸配列の２２０位はＢＰＮ’スブチリ シンの２２１位に「対応する」ということができる（例えばＮｅｄｋｏｖ他、Ｌ ｆｌ旦Ｓｉｙユｉピ」−Ｚ、　Ｐｈ　５ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、、　３６±、　１ ５３７−１５４０　（１９８３））。

ＢＰＮ’スブチリシンのＸｔｉｌ造［Ｗｒｉｇｈｔ他、Ｎａｔｕｒｅ、　２２１ ゜２３５　（１９６９）］によると、＾ｓｐコ２、Ｈｉ　ｓ　Ｇ　４及び５ｅｒ ２２盲を含むスブチリシンの触媒部位の形状は、残基＾ｓ　ｐ　ｌ°２、Ｈｉｓ ”及び５ｅｒＩＩｓを含む哺乳動物セリンプロテアーゼ（例えばキモトリプシン ）の活性部位の形状とほぼ同一である。一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓセリンプロテア ーゼと哺乳動物セリンプロテアーゼとは全体的に相異しているので、これらは２ つの無関係なタンパク質分解酵素の族であると言える。

Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシンの族において、完全なアミノ酸配列は５種のスブ チリシン、即ちＣａｒｌｓｂｅｒｇ［Ｓｍ１ｔｈ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、２４３．　２１８４−２１９１　（１９６８）コ、　ＢＰＮ’　［ Ｍａｒｋｌａｎｄ他、　Ｊ、−Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２４２．５１９８− ５２１１（１９６７）コ、吐値遺伝子生成物［５ｔａｈ！他、Ｊ、　Ｂａｅｔｅ ｒｉｏｌ、、　１５８．４１１−４１８　（１９８４）］、ＤＹ［Ｎｅｄｋｏｖ 他、前出文献］及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｅｕｓ［５ｖｅｎｄ −ｓｅｎ他、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１９６．２２０−２３２　（１９８ ６）］で得られる。

ＣａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンとＢＰＮ’スブチリシン（別称Ｎｏｖｏスブチ リシン）とは、８４個のアミノ酸及びＢＰＮ’の追加の１個の残基が異なる（Ｃ ｉｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンはＢＰＮ’スブチリシンの残基５６に対応するア ミノ酸を欠失している＞、　ＤＹスブチリシンは２７４個のアミノ酸を含んでお り、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンとは３２個のアミノ酸位置が異なり、ＢＰ Ｎ’とは８２個のアミノＢ置換及び１個の欠失が異なる（ＤＹスプチリシンはＢ ＰＮ’スブチリシンの残基５６に対応するアミノ酸残基を欠失している）、組状 遺伝子生成物のアミノ酸配列はＢＰＮ’スブチリシンのアミノ酸配列と８５％の 相同度を有する。このように、各種のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのスブチリシンの アミノ酸配列の間には広範な相同性があると思われる。この相同性は分子の所定 の領域、特に触媒メカニズム及び基質結合の役割を果たす領域で完全である。こ のような配列不変性の例は一次及び二次基質結合部位夫々５ｅｒ１２１１ｅｕ１ ２１に１ｙ１２１及びＴｙ　ｒ　Ｉ　６４、並びに反応性セリン（２２１）の周 囲の配列＾５ｎ２１＠−Ｇｌｙ２目−Ｔｈｒ２２°−５ｅｒ２２１−Ｍｅ１２２ ２−＾！ａ２２コである。

スブチリシン分子は独特の安定性を示す、スブチリシンは広いｐ）ｌ範囲にわた って完全に安定ではないが、尿素及びグアニジン溶液による変質に対して比較的 耐性であり、それらの酵素活性は８Ｍ尿素中でしばらく保持される。４未満のｐ Ｈを有する溶液中でスブチリシンは迅速且つ不可逆的にそのタンパク質分解活性 を失う。Ｇｏｕｎａｒｉｓ他、ε７エー辷。５」。ト」１ｄ廊エヨー、阻、　３ ７　（１９６５）は、スブチリシンの酸失活が御飯的電荷効果によらないことを 立証し、分子の内部疎水性部分におけるヒスチジン残基の陽子化のような分子中 の他の変化によるものであると推測している。

Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシンは水溶液中で温度及びｐＨに大幅に依存する速度 で不可逆的に失活する。ｐＨ値が４より低いか又は１１より高いと、失活速度は 非常に迅速であり、ｐＨが４．５〜１０．５では該速度は著しく緩慢ではあるが 、溶液のアルカリ度が増加するに従って増加する。この失活のメカニズムは十分 には解明されていないが、このｐｎ範囲の酵素不安定性の少なくとも一部には自 己消化が関与していることを示す証拠がある。一般に、どのようなｐＨ値であっ ても温度が高いほどスブチリシン失活速度は速い。

タンパク質の加水分解を必要とする工業的プロセスにおけるプロテアーゼの使用 は、操作条件下の酵素の不安定性により制限されている。従って、例えばタンパ ク質の染みを除去し易くするために洗濯用洗剤（例えばスイス国５ｅｈｎ−ｙｄ ｅｒ、　ＺＢｉｏ−３８）にトリプシンを導入する試みは、非常に制限された成 果しか得られず、これは確実に洗濯条件下の酵素不安定の結果であった。更に、 洗剤に適合性の細菌アルカリプロテアーゼが洗剤配合物中で使用されている。

多くの工業的プロセスはほとんどの酵素の安定性の範囲よりも高い温度で実施さ れるので、熱安定性の高いプロテアーゼは既に安定なプロテアーゼを必要とする 洗剤及び皮革脱毛のようなある種の産業分野で有利であるのみならず、例えば濃 縮スープの製造のための植物及び動物タンパク質の加水分解のようにタンパク質 を分解するために化学的手段を使用する産業でも有用であり得る。

熱失活は酵素の工業的使用を制限する最も重要な因子であり得るが、広いｐＨ範 囲にわたる効力の必要性及び変性剤の使用といった他の因子も工業的プロセスに おけるプロテアーゼの使用に関して不利な効果を及ぼし得る。従って、各種の産 業に必要な温度、ｐｉｔ、変性剤及び他の条件に関して改良された安定性を有す る類のプロテアーゼを得ることが望ましい。

過去数年間にわたって洗剤配合物には大きな変化があり、特にリン酸塩の代わり に別のビルグーが使用され、環境及び消費者の需要に見合うような液体洗濯用洗 剤が開発されている。このような変化は、従来の洗剤酵素にも変化の必要をもた らしている。より特定的には、液体洗濯用配合物中の保存安定性が高く、より広 いｐｉ及び温度範囲で安定性及び活性を有するタンパク質分解酵素を使用するこ とが望まれるようになった。

洗剤配合物中で有用な修飾されたスブチリシンを製造するーアプローチはヨーロ ッパ特許出願第１３０７５６号に開示されており、該文献は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　１１力ＵｊＪ聾工鱈ユμじ一咀。

７±ｉ　ｕｅｆａｅｉｅｎｓ）のスブチリシンのＴｙｒ−’、＾５ｐ３２、＾ｓ 、ｌｌｌ５．　Ｔ、、＋０４、Ｍ　ｅ　ｔ２２２、に１，１＠＠、■ｉｓ＠４、 ｃｔｙ＋１．ｐ）、ｅＩＩＩ、５ｅｒ３３、Ｓｅ　ｒ　！　ｔ　Ｉ、７．ｒ２＋ ？、に１ｕＩＩ＠及び／又は＾１ａ＋ｓｚ位置に突然変異を誘発すると、安定性 の変化、配座の変更、又は酵素の「処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉＢ）」の変化が生じ ることを立証している。特に、Ｍｅ　ｔ２２２が＾１ａ又はＣｙｓ（該突然変異 体は野生型よりも最適ｐＨ値が優れている）又はＳｅｒに突然変異すると、改良 された酸化安定性が得られると主張している　に１．ＩＩ＠を＾１ｍ、＾ｓｐ、 　Ｇｌｕ、　Ｐｈｅ、　Ｈｉｓ、　Ｌｙｓ、＾ｓｎ、＾ｒｇ又はＶｉｌで置換す ると、酵素の動力学的パラメーターが変化することが示唆されている。しかしな がら、このアプローチに開示された突然変異では、高温での安定性が野生型酵素 よりも大きいか又は野生型酵素よりも広いｐＨ範囲で安定性を有するアナログは 得られない。

別のアプローチによると、Ｔｈｏｍａｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、　３１８．３７５− ３７６　（１９８５）は、ＢＰＮ’スブチリシンの＾ｓｐ！！−に１．＋６０の ＾ｓｐをＳｅｒに置換することによりスプチリシンのｐＨ依存性を変更できるこ とを開示している。この変化は活性部位からの１４〜１５オングストロームの表 面電荷の変化を表す、しかしながらＴｈｏｍａｓ他は、ある非帯電残基を別の残 基で置換する場合のよう表面電荷が変化しないような場合の改良を示していない 。

同時係属中の米国特許出願第８１９２４１号に記載されている第３のアプローチ は、プロテアーゼ中に存在する＾５ｎ−１１：ｌｙ配列の欠失及び／又は修飾を 特徴とするＢｉｅｉｌ！ｕｓセリンプロテアーゼアナログの類に係る。

１１へｉ扛 本発明は、洗剤配合物及び安定なプロテアーゼを必要とする他のプロセスで特に 有用にするために、改良されたｐｉ及び熱安定性を有することを特徴とするスブ チリシンアナログの類を提供する０本発明のスブチリシンアナログは、（１）天 然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアミノ酸配列中に存在するカルシ ウム結合部位の１個以上のアミノ酸残基を負の電荷を有するアミノ酸で置換し、 （２）天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアミノ酸配列中に存在す る＾５ｎ−Ｇｌｙ配列のいずれかの残基を欠失又は置換させることにより修飾さ れた天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアミノ酸配列を有すること を特徴とする０本発明は更に、本発明のスブチリシンアナログを含む洗剤組成物 、並びにこのようなスブチリシンアナログ及び組成物の洗浄用としての使用に係 る。

本発明のスブチリシンアナログは改良された熱及びｐｔｌ安定性、高い比活性及 び広い基質特異性を示し、従ってこのようなアナログを含有する洗剤配合物の洗 浄性を増加させる。特に、本発明のスブチリシンアナログは「野生型」のスブチ リシンに見いだされるよりも改良された熱安定性、高いｐｉ安定性及び高い比活 性を有する。

更に、本発明は上記スブチリシンアナログをコードするコドンを有するＤＮＡ配 列にも係る。

本発明は更に、上記スブチリシンアナログをコードする核酸を有する宿主細胞を 含むスブチリシンアナログの製造方法も提供する。このような細胞において、ス ブチリシンアナログをコードする核酸は染色体又は染色体外であり得る。宿主細 胞は好ましくは本発明のアナログを容易に単離できるように、分泌されるプロテ アーゼを欠失する株から選択される。

更に、本発明はカルシウム結合部位を修飾し及び／又は＾ｓｎ−にＩｙ配列中の アスパラギン、特に第１表に示したアミノ酸配列の２１８位に対応するスブチリ シンのアミノ酸配列中の位置のアスパラギン残基をアスパラギン以外のアミノ酸 に置換することにより、スブチリシンの熱及びｐｎ安定性を改良するための方法 を提供する。

パ　の　ｔ・ 第１図はアンヒドロアスパルチルグリシンを形成するために、第１表に示すよう なスブチリシンの２１８及び２１９位に見いだされるような＾５ｎ−Ｇｌｙ残基 の環化、及びその塩基触媒による加水分解を示す概略図、第２図はＢａａ　ｉ　 Ｉ　Ｉυ５ｓｕｂｔｉ目ｓ（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）株ＱＢ１２７のＥｅｏＲ Ｉ〜石１道伝子フラグメントを含む用＾遺伝子の部分制限地図、及びｕＥ−へ遺 伝子とフランキング配列の部分制限地図、第３図はプラスミドｐＡＭＢ１１の部 分制限地図、第４図はＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ宿主細胞からの［Ｓｅｔ］２’　 ”−スブチリシンの合成を導くプラスミドであるｐＡＭＢ１１３の構築段階を示 すフローチャート、第５図はｐＡＭＢ３０プラスミドの部分制限地図、第６図は ｐＡＭＢ１０６の構築を示す説明図、第７図はＭ１３　吐１８　丑４の構築を示 す説明図である。

那■ 本文中において、「スブチリシン」なる用語は分泌以前又は分泌時に成熟酵素か ら切断されたリーダー配列を欠失する酵素の成熟分泌型を意味することに留意す べきである。

本発明に従って修飾され得るスブチリシンの非限定的な例は、Ｃａｒｌｓｂｅｒ ｇスプチリシン、ＢＰＮ’スブチリシン、Ｂａｃｉｌ、１ｕｓｓｕｂｔ　ｉ　Ｉ 　ｉｓのｍ遺伝子生成物、ＤＹスブチリシン並びにＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｓｅ ｎｔｅｒｉｃｕｓのスブチリシンのアミノ酸配列により代表される天然に産生ず るスブチリシンである。

Ｃａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンのアミノ酸配列はＳ＋ａｉｔｈ他、Ｊ、旧ｏｆ 。

ＣｈｅｌＩｌ、、　２４３．２１８４−２１９１　（１９６８）により記載され ている。

ＢＰＮ’スブチリシンのアミノ酸配列はＭａｒｋｌａｎｄ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２４２．５１９８−５２１１　（１９６７）により記載されてい る。

ＤＹスブチリシンのアミノ酸配列はＮｄｅｌｏｖ他、）Ｉｏ　ｅ−Ｓｅ　Ｉｅｒ −’ｓ　Ｚ、　Ｐ上５ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、、　３６４．１５３７−１５４０　 （１９８３）４．１ｍよす記載されている。　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｓｅｎｔ ｅｒｉｃｕｓのスブチリシンのアミノ酸配列は５ｖｅｄｓｅｎ他、ＦＥＢＳ　Ｌ ｅｔｔｅｒｓ、　１９６．２２０−２３２（１９８６）により記載されている。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓの剪りノエ遺伝子生成物のアミノ酸配列は ５ｔａｈｌ他、Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、。

１５８、４１１−４１８　（１９８４）により記載されている。このようなスブ チリシンのアミノ酸配列は参考として本発明の一部とする。このようなスブチリ シンは分子を安定化させるために必要なカルシウム結合部位を有することを特徴 とする。

本発明によると、カルシウムに結合する改良された能力を有する類のスブチリシ ンアナログが提供される。カルシウムは粉末及び液体洗剤中で、特に高温を必要 とする用途でスブチリシンを安定化させるために使用されている０本発明はカル シウム結合を増加させるためのスブチリシン分子のカルシウム結合部位の修飾に も係る０本文中においてｒカルシウム結合部位の修飾」なる用語は、形成される スブチリシンアナログに別の負の電荷を与えるように、スブチリシンのアミノ酸 配列中に存在するカルシウム結合部位の領域の１個以上のアミノ酸を負の電荷を 有するアミノ酸で置換することを意味する。スジチリシン中のある１つのカルシ ウム結合部位は、第１表に示すアミノ酸配列に関連して次のアミノ酸配列：八Ｓ ｐ４１、Ｌｅｕ”、＾ｓ　ｎ　？　Ｉ、八ｓｎ”、Ｓｅｔ”、１１ｅフツ、に１ ．ｓｏ、Ｖａｌ”、Ｔｈｒ”’及び７　ｙ　ｒ　２１４を含むことが認められて いる１本発明は好ましくは、カルシウム結合部位に存在するアミノ酸の１個以上 を、＾ｓｐ及びＧｌｕ、より好ましくは＾ｓｐのような「負の電荷を有する」ア ミノ酸で置換するものである。カルシウム結合部位の＾ｓｐ“１は負の電荷を有 するアミノ酸であるが、本発明の一態様は＾ｓ　ｐ　４１をＧｌｕ”に置換する ものであることに留意すべきである。その他の態様は＾ｓ　ｐ　４１以外ものへ の置換に係る。

本発明の一好適態様は＾ｓｎ’“が八ｓ　ｐ　？　Ｇに変換されたスブチリシン アナログを含む、別の態様はＩｌｅ”から＾ｓ　ｐ　？　Ｉへの変換を含む、− 好適Ｒ様は＾ｓ　ｎ　？　？が＾ｓｐγ７に変換されたスブチリジンアナログを 含む０本発明のより好適な態様は、カルシウム結合部位に上記好適な修飾を施し 、且つ＾ｓ　ｎ　ｌ　６１及び＾５０２ＩａをＳｅ、１０９及び５ｅｔ２１８に 置換し、２つの不安定な＾５ｎ−Ｇｌ、配列を除去する。

上記カルシウム結合部位に加えて、スブチリシンは１個以上の別のカルシウム結 合部位を含み得る６本発明の請求の範囲はスジチリシン中に存在し得る全カルシ ウム結合部位の１個以上の修飾を包含する。修飾され得る特定のスジチリシン中 のカルシウム結合部位の数は多くの因子、即ち特定のスブチリシン、スプチリシ ンアナログの特定用途に依存する。スジチリシン中に存在し得る他の重要なカル シウム結合部位としては、（１）＾５ｐ１４１１及びｐ　ｒ　ｏ　＋　７２、（ ２）Ｐｒｏ”及びＧ１ｎ２テ１、並びに（３）Ｐｒｏ＋′”及びに１ｕＩＩｓ又 は＾Ｓｐｌ！？が挙げられる。各分子中に存在する特定のカルシウム結合部位は 修飾すべき特定のスブチリシンに依存する。上述したように、上記可能なカルシ ウム結合部位におけるアミノ酸の１種以上を置換することにより、改良された熱 及びｐＨ安定性を有するスブチリシンが得られる。置換の例としては、＾５ｐＩ ４０をに１ｕ１４１１．　ｐｒＯ＋７２を＾ｓ　ｐ　＋　’　２、Ｐｒｏ＋４を ＾ｓ　ｐ　ｌ　４、に１ｎ２７１をＣｌｕ”’、　にｌ、＋＊ｔを＾ｓ　ｐ　ｌ 　％　？で置換する例が挙げられる。

スブチリシン分子のカルシウム結合部位の修飾に加えて、スジチリシン中に存在 するへ５ｎ−１１：Ｉｙ配列を欠失又は置換させることが好ましい、米国特許出 願第８１９２４１号に既に記載されているように、Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシ ンの１０９〜１１０位、特に２１８〜２１９位に維持された配列＾ｓｒ＋−Ｇｌ ｙは、これらの物質のｐＨ不安定性に関与する主要な因子であることが認められ ている。不安定な成分である＾５１２１１０１，２１″をスブチリシン分子から 除去するために、＾ｓ　ｎ　２１１をアスパラギン以外のアミノ酸で置換するか 及び／又はＣ１，２１％をグリシン以外のアミノ酸に変えることが開示されてい る。同様に、１０９〜１１０位の不安定な＾５ｎ−Ｃｌｙ成分を修飾することに よってもアナログに安定性を与えることができることが記載されている。

更に、上述したように、本発明のＢａｅｉｌｌｕｓスブチリシンのアナログの好 適類は、カルシウム結合部位の修飾に加えて、Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシン中 の＾５ｎ−Ｇｌｙ配列を含む位置でアナログがへ５ｏ−Ｃｌｙ配列を含まず、特 にＢｓ＋ｃｉｌｌｕｓスブチリシンよりもへ５ｎ−Ｃ１ｙ配列の数が少ないよう なアミノ酸配列を有する。最適には、第１表に示すアミノ酸配列中の２１８位に 対応する位置はアスパラギニル残基を含まず、別のアミノ酸、好ましくはセリン 、バリン、スレオニン、システィン、グルタミン及びイソロイシンから選択され たアミノ酸を含んでいる。（例えば芳香族アミノ酸の存在により導・入され得る 立体障害又はプロリンの存在により導入され得るような三次構造の変化により） アスパラギンを所定のアミノ酸に置換することにより活性部位配座に障害を生じ 得る程度まで、このようなアミノ酸で置換することは通常好適でない、同様に、 アスパラギンを他のアミノ酸で置換することにより帯電基（例えばアスパラギン 酸）が活性部位の近傍に導入され得る程度まで、このような置換は好ましくない ６本発明の好適な態様の例は修飾されたカルシウム結合部位を有しており且つス ブチリシンの＾５ｎ−Ｃ１ｙ配列が［５ｅｔ２１１１で修飾されたアナログであ る０本発明の企図の範囲内のアナログの別の態様は、修飾されたカルシウム結合 部位を有しており且つＢＰＮ’スブチリシン又は吐侍遺伝子生成物の＾ｓｎ１■ が好ましくはセリンにより置換されており、１１０及び／又は２１９位のグリシ ン残基が各種のアミノ酸残基で置換されているようなアナログである。他のスブ チリシンでは、カルシウム結合部位の修飾及びＣａｒｌｓｂｅｒｇ又はＤＹスプ チリシンの残基６２の＾ｓｎ又は残基６３のＧｌｙの置換も本発明に包含される 。

Ｂａｅｉｌｌｕｓ微生物は実質的量のタンパク質を分泌する能力があり、洗剤プ ロテアーゼを製造するために一般に使用されているので、本発明のスブチリシン アナログを組換により製造するための好適宿主である。はとんどのＢｉｅ　ｉ　 Ｉ　ｌｕｓはアルカリ性及び中性プロテアーゼを分泌するので、他のプロテアー ゼを含まない媒体中にＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓにより突然変異スブチリシンを産 生及び分泌できるようにＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの内因性アルカリ性及び中性プ ロテアーゼ遺伝子に突然変異を導入することが好ましい、従って、本発明は内因 性プロテアーゼの合成が妨げられ且つ本発明のスブチリシンアナログを合成及び 分泌する能力を維持するようなり、　５ｕｂｔ−辻国の突然変異株も提供する。

以下により詳細に記載するように、本発明のスブチリシンアルカリのｐｌ（及び 熱安定性並びに洗剤配合物における安定性は、野生型の吐依遺伝子生成物スブチ リシン及びＣａｒｌｓｂｅｒｇスプチリシンよりも著しくすぐれていることが発 見された。

本発明のスブチリシンアナログは次の手順に従って作成され得る。

１）Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓから代表的なスブチリシン遺伝子阻吐の単離。

２）所望の修飾を形成するようにオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を 利用できるようなベクター上でｍ遺伝子をクローニング。

３）部位特異的突然変異及び形成されたＤＮＡを配列決定し、所望の突然変異の 存在を確認。

４）Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓにおける突然変異酵素の合成を誘導するべく発現ベ クターを構築。

５）スブチリシン及び中性プロテアーゼを合成しない突然変異Ｂ、　５ｕｂｔｉ ｌｉｓ株の構築。

６）細胞外増殖培地における酵素の単離及びその精製。

７）予め内因性プロテアーゼの合成を妨げるように突然変異させたＢ、　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ株の染色体内に改良された酵素をコードする遺伝子を挿入するための 手順の実施。

本文中において、特定のスブチリシンアナログは置換又は欠失しているアミノ酸 を括弧内に表記することにより示される０例えば、［Ｓｅｒ’°９コスブチリシ ンはアミノ酸の１０９位にセリンを有するスブチリシン分子を表し、［ｓｅｒ＋ ６％。

Ｓｅ　ｒ　２１１　］スブチリシンはアミノ酸の１０９及び２１８位にセリンを 有するスブチリシン分子を表す。

実施例１では、スブチリシンをコードするｍ遺伝子をＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓゲ ノムから単離する。実施例２では、ｍ遺伝子に特定部位突然変異を誘発する。実 施例３では突然変異仕法遺伝子を含む発現ベクターを構築する。実施例４では［ Ｓｅ、１０１１スブチリシンアナログを作成する。実施例５は［５ｅｒ１０１． ５ｅｒ２＋１］スブチリシンアナログの作成について記載する。実施例６は［＾ ｓ　ｐ　Ｉ　Ｇ　、　Ｓｅ　ｒ　Ｉ　６９．　Ｓｅ　ｒ　２１１　］スブチリシ ンアナログの作成について記載する。実施例７では［＾ｓ　ｐ　？　＠。

＾Ｓｐ７？、　Ｓｅ、ｔｏ″　５　ｅ　ｒ　２１１　］スブチリシンアナログを 作成する。実施例８は［＾ｓｐ？ｇ、　Ｃ１ｕ７１．５ｅｒ＋６慢、　５ｅｒ２ 目］スブチリシンアナログの作成について記載する。実施例９では、検出可能な 細胞外プロテアーゼを産生しないＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの２種の突然変異株を 構築する。実施例１０は突然変異吐ｖ道伝子のＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの染色体 への組み込み手順を記載する。

実施例１１では、野生型及び突然変異組状スブチリシンを単離及び精製する。実 施例１２〜１４は［Ｓｅｒ””］スプチリシンの熱安定性を野生型組込遺伝子生 成物と比較する。

本発明のスブチリシンアナログ以外に、本発明の洗剤組成物は次の成分を含有し 得る。

（ａ）アニオン性、非イオン性、もしくは両性であり得る少なくとも１種の界面 活性剤、又は水溶性石鹸、典型的には、夫々洗剤組成物の５〜３０重量％のアニ オン性界面活性剤（例えば線状アルキルアリールスルホネート）及び１〜５重量 ％の非イオン性界面活性剤（例えばアルキルフェニルポリグリコールエーテル） の混合物が使用される。

（ｂ）好ましくは付随する金属イオン封鎖機能を有する１種以上のビルダー。こ のような化合物の例としてはトリポリリン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、 ケイ酸ナトリウム及びゼオライトが挙げられ、通常洗剤組成物の１０〜７０重量 ％を構成する。

（ｃ）漂白剤、好ましくは過ホウ酸ナトリウムのようなペルオキシ化合物であり 、典型的には組成物の３０重量％まで配合される。

（ｄ）カルボキシメチルセルロース、蛍光増白剤及び香料のような助剤、必要に 応じて、洗濯用媒体のｐＨを８．０〜１０．５にするためにｐＨ調整剤を添加す る。

洗剤組成物は本発明のスブチリシンアナログの１種以上を有効量含有している０ 本文中において、「スブチリシンアナログの有効量」とは特定の洗剤組成物中で 必要な酵素活性を得るために必要なスブチリシンアナログの量を表す。

このような有効量は当業者には容易に想到され、使用される特定のスブチリシン アナログ、洗浄用途、洗剤組成物の特定の組成、液体組成物と乾燥組成物のどち らが必要であるかなどの多くの因子に依存する。

本発明の粒状スブチリシンアナログ調製物は洗剤組成物１００２当たり少なくと も０．１＾ｎ５ｏｎ単位（＾Ｕ、下記参照）、好ましくは０．５〜２．５＾Ｕの 酵素活性を与えるように計算された量を添加される。必要に応じて無機充填剤、 好ましくは硫酸ナトリウムを加えることにより１００％にすることができる。

液体洗剤組成物は好ましくは非水性媒体中の酵素スラリーから調製され得る。典 型的には、このようなスラリーは液体非イオン性界面活性剤、例えばＴｅｒｇｉ ｔｏｌ　１５　Ｓ　９又はこのような界面活性剤の混合物中の微粉状スブチリシ ンナナログ濃１！物の懸濁液から構成され得る０通常、スラリーは更に、微粉状 塩化ナトリウムのような１種以上の無機充填剤を含有しており、該充填剤は場合 によっては例えばヒユームドシリカ（＾ｅｒｏｓｉｌ　２００）のような懸濁安 定剤との混合物として添加される。Ｔｅｒｇｉｔｏｌ及び＾ｅｒｏｓ　ｉ　Ｉは 商標である。

本発明のスブチリシンアナログは、液体洗剤組成物１００ｇ当たり少なくとも０ ．１＾Ｕ、好ましくは０．５〜２．５＾Ｕのプロテアーゼ活性を与えるように計 算された量を添加される。

洗剤組成物は通常通りの方法で調製され得、例えば成分を相互に混合することに より調製され得る。あるいは予備混合物を形成してから、残りの成分と混合する 。

本文中に記載するような良好な安定性及び活性により、本発明のスブチリシンア ナログはタンパク質分解酵素が一般に使用される全分野で使用することができる 。特に、洗剤及びクレンザ−又は染み抜き剤として、なめし革の脱毛剤として、 更にはタンパク質加水分解物を製造する食品産業、並びに不完全抗体を検出する 血清学の分野で使用することができる１本発明のスブチリシンアナログは食品産 業及び血清学の分野で使用すると特に有利であり、他の酵素調製物とは対照的に 、水溶液中のスブチリシンアナログを安定化させるために生理学的に許容可能な 量のカルシウムイオンを必要としない固体又は溶解形態ですぐれた安定性を有す る。

以下の実施例は本発明を更に説明する目的であるが、本発明はこれらの具体的な 実施例に限定されないことが理解されよう。

寒ｍ ０ｈｉｏ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、　０ｈｉ ｏのＢａｃｉｌｌｕｓ（：ｅｎｅｔｉｅ　５ｔｏｃｋ　ＣｅｎｔｅｒからＢ、　 ５ｕｂｔｉｌｉｓａＱＢ１２７（口且Ｃ２Ｉｅｕ＾８５ａｃＵｈ２００）［Ｌｅ ｐｅｓａｎｔ他、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、υ」−・１３５−１ ６０　（１９８２）］を入手した。この株は、針！υｈ２００突然変異の多面的 効果により相同遺伝子の５ａｃＵ”株に比較して細胞外セレン及び金属プロテア ーゼ、α−アミラーゼ及びレバンスクラーゼを過剰に産生する［Ｌｅｐｅｓａｎ ｔ他、Ｓｃｈｌｅｓｓｉ−ｎｇｅｒ、　Ｄ、ｉ！Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　、　１ ９７８．＾ｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｅｉｅｔｙ　ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、ｐ、　６５　（１９７６）］、即ち、 株ＱＢ１２７はスブチリシンをコードする吐ｖ遺伝子を単離するために適当なＯ Ｎ＾ソースである。

Ｓｔ　ｉ　ｔｏ他、Ｂｉｏｅｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｅｔａ、　７２． ６１９−６２９　（１９６３）の手順に従ってＢ　、　５ｕｂｔ　ｉ　ｌ　ｉｓ ａ　ＱＢ１２７の細胞からゲノムＤＮ＾を単離した。精製した染色体ＤＮＡをＥ ｅｏＲｌ制限エンドヌクレアーゼで完全に消化した。

得られたＤＮＡフラグメントを電気泳動により低融点アガロースゲル上で分解さ せ、４．４〜８．０キロベース（ｋｂ）範囲のフラグメントを単離した。高温で より多くのコピー数を示し且つカナマイシン耐性を与える大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ ｉｅｈｉａｃｏｌｉ、　Ｅ、　Ｃｏ１１）プラスミドであるｐｃＦＭ９３６（＾ ｍｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ 　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄからの＾、Ｔ、Ｃ，ＣＮｏ、　５３，４１３）にこれらのフラ グメントを連結した。ベクターをＥｃｏＲＩで消化させ、連結前にウシ腸アルカ リホスファターゼで脱ホスホリル化した。

連結物をＥ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｅ−ｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ 、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄからの＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　 ２３７２４）に導入し、１０ＩＩｇ／ｌｌのカナマイシンを補充したし一寒天上 で一晩インキュベーション後、カナマイシン耐性宿主細胞を選択した１選択した 宿主細胞を４２℃で４時間インキュベートすることによりプラスミドＤＮＡを増 ｇした０次にコロニーをニトロセルロースフィルターに移し、Ｇｒｕｎｓｔｅｉ ｎ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｅｉ、ＬＩＳ＾、　７２゜３９６ １　（１９７５）に記載されているコロニーハイブリダイゼーション手順に従っ て処理した。

オリゴヌクレオチドプローブを使用してｐＣＦＭ９３６上にスブチリシン遺伝子 を生息させるコロニーをスクリーニングした。Ｂｅａｕｅａｇｅ他、Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２．１８５９−１８６２（１９８１）によ り記載されている亜リン酸塩法により合成したプローブは、ｍ遺伝子生成物のア ミノ末端に対応するヌクレオチド配列： ５°ｃｃｃｃ＾＾ＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＡＴＧにＣ３゜を有していた（Ｈｏｎｇ 他、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、Ａｅｔａ、　Ｓｃｉ、ＵＳ＾。

８１、１１８４−１１８８　＜１９８４）；　５ｔａｈｌ他、Ｊ、　Ｂａｅｔｅ ｒｉｏｌ、、　１５８゜４１１−４１８　（１９８４））、　５５℃のハイブリ ダイゼーション温度を使用し、合計４００個のコロニーから５個の陽性のコロニ ーを確認した。陽性のコロニーのうちの１個のコロニーの１ラスミドＤＮ＾をｐ ｃＦＭ９３６　ｕ■−２と命名した。

プラスミドｐｃＦＭ９３６凪２をｉ皇Ｒ１単独、［匝■単独、及び上部！とＢｉ ｎｄｌＩの組み合わせで消化した。スブチリシン遺伝子のＥｅｏＲｌフラグメン トの寸法は５ｔａｈ！他の前出の文献に記載されている寸法に合致していたが、 その他にも記載されていない数個のトド１部位が見出された。実施例３に記載す るように、駐ｎｄｌ１１部位の２個をスブチリシン遺伝子の遺伝子操作に使用し た。

制限酵素消化物が５ｔａｈｌ他の前出の文献に報告されているような結果に合致 することを確認することにより、Ｌｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＱＢ１２７ゲノムＤＮ＾ の６．５ｋｂの大きいＥｃｏＲｌフラグメントは仕組遺伝子、その調節配列及び 無関係なフランキング配列を有することが判明した。このことは、Ｓａｎｇｅｒ 他、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１４３．１６１−１７８　（１９８０）に より記載されているチェインターミネータ−法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　 ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）を使用するＤＮＡ配列決定により確認さ れた。　６．５ｋｂＥｅｏＲｌフラグメントの３．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲ１〜石１サ ブフラグメントも同様に、第２図に示すように７遺伝子、その調節配列及び無関 係なフランキング配列を含むことが確認された。　５ｔａｈｌ他の文献及び第１ 図の説明によると、石■〜ＥｅｏＲｌフラグメントは２．５ｋｂの長さを有する ことが報告されているが、第１図のスケールと同図中のフラグメントの段階的説 明とを比較すると、　５ｔａｈｌ他に文献おいてさえ石Ｔ　−ＥｃｏＲｌフラグ メントは実質的に２．５ｋｂよりも大きいことが明らかである。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主系のクローニングベクターであるプラスミドｐＡＭＢＩ＋ を次のように構築した。プラスミドｐＴＧ４０２（Ｎｏｒｔ−ｈｅｒｎ　Ｒｅｇ ｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｕｎｉｔｅｄ　 ５ｔａｔｅｓＤｅｐａｒｔｓ＋ｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｐｅ ｏｒｉａ、　Ｉｏｏｉｎｏｉｓ、株番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５２６４）をＲｓａ　 ｌ制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化した。予めＨｉｎｃＩ［で消化してお いたＭ１３　吐１８（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、　Ｃａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄからカタログ番号８ ２２７Ｓ＾とじて入手可能）にフラグメントを連結させた、　Ｍａｎｄｅｌ他、 Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　５３．１５４．　（１９７０）の手順に従って 形質転換することにより連結物をＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３（Ｐｈａｒ＊ａｃ ｉａ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｅａｔａｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙからカタ ログ番号２７−１５４５−０１として入手可能）に導入した。バクテリオファー ジプラークに０．５Ｈカテコール（蒸留水中で調製）を噴霧し、ｐＴＧ４０２か ら誘導される■土Ｅ遺伝子の機能的発現を検出した。■±Ｅ遺伝子はカテコール ２，３−ジオキシゲナーゼをコードし、各種の生物中でプロモーターを検出する ために有用である［Ｚｕｋｏｗｓｋｉ他、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　 Ｓｃｉ。

０盈υ−１μ、　１１０１−１１０５　（１９８３）］。

次に■±Ｅ遺伝子を、Ｒ，Ｄｅｄｏｎｄｅｒ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕ ｒ。

Ｐａｒｉｓ、　Ｆｒａｎｃｅ）から入手したＥ、　ｄＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓプ ラスミドｐＨＶ３３（＾ｍｅｒｉｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ！１ ｅｃＬｉｏｎから＾、Ｔ、Ｃ。

仁３９２１７として入手可能）［ｐｒｉｍｒｏｓｅ他、Ｐｌａｓｍｉｄ、　６． １９３−２０１　（１９８１）コに１．Ｏｋｂヒ且Ｒ１〜ｂ工■フラグメントと して移した。　ｐＨＶ３３プラスミドは予めい△ＲＩ及びＰｓｔｌで消化させて おき、！！ＬＬＥを含有するフラグメントがこの領域に連結した場合に遺伝子の アンピリジン耐性を失活させるようにした。得られたプラスミドｐＡＭＢ２１は Ｅ、　ｅｏｌｉ宿主細胞中に機能的ｘＬＬＥ遺伝子を含んでいるが、ｘＬＬＥを Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ宿主細胞中に発現させるためにプロモーターを加える必 要がある。　ｐＡＭＢ２１を生息させるＥ、　ｃｏｌｉ細胞はテトラサイクリン （１５ｕｙ／夏り及びクロラムフェニコール（２０１１ｇ／ｌｌ）に対して耐性 であり、ｐＡＭＢ２１を生息させるＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ細胞はクロラムフェ ニコール（Ｓｐｙ／ｚ１）のみに耐性である。

バクテリオファージλのｔａｏｐ転写終結配列を（４００塩基対Ｐｓｔ　Ｉ〜ｈ 土■フラグメント上の）プラスミドｐＣＦＭ９３６からｐＡＭＢ２１の非反復Ｐ ｓｔ１部位に移した。配列５’　Ｇ＾ＴＣＴＧＣ＾３゜を有する合成ヌクレオチ ドを構築し、ｔａａｐフラグメントの葎■末端をベクターｐＡＭＢ２１のｂ１１ 部位に結合させた。形成されたプラスミドをｐＡＭＢ２２と命名したが、このプ ラスミドは転写ターミネータ−を含んでいること除いてｐＡＭＢ２１と同一の特 性を有していた。ｐＡＭＢ２２プラスミドはＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中で機能的 な強力なプロモーターを検出するために有用である。

制限されたフラグメントの電気泳動後、１Ｅ及びｔ６６ｐを含むｐＡＭＢ２２か らのＤＮへの１．４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ〜ｈ土■フラグメントを低融点アガロース ゲルから単離した。予めＥｃｏＲｌ及びＢａｗｌ　Ｔで消化させておいたプラス ミドｐＢＤ６４（ＢａｃｉｌｌｕｓＧｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ から番号ＩＥ２２として入手可能）にＤＮＡの１．４ｋｂ片を連結させた。形成 された５、３ｋｂプラスミドｐＡＭＢ１１は、第３図に示すようにＵ±Ｅ遺伝子 の上流に８１３吐１８のポリリンカー配列（上部１．鉢工１、Ｘ＋ｍ工Ｉ、む工 、Ｂａｍ１ｌ　Ｉ及びＸｂａ工Ｉ）を含んでおり、下流にｔＬ！、ｔを含んでい る。ｐ＾ＭＢＩＩプラスミドはＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中で複製することが可能 であり、宿主細胞にクロラムフェニコール（ｈｙ／ｄ）及び／又はカナマイシン （ＳＬｌｆ／ｚ１）耐性を与える。

第４図に示すように、吐σを含む精製したＥｅｏＲｌ〜１リー１フラグメントを ｐＡＭＢ　Ｉ　＋にクローニングし、ｐＡＭＢ　Ｉ　Ｉ　＋を形成した。Ｃｈａ ｎｇ他、Ｍｏ１．Ｃｅｎ、　（：ｅｎｅｔ、、　１６８．１１１−１１５　（１ ９７９）により記載されている１０ドブラスト形質転換法により、連結物をＢ、 　ｓｕｂｔｉ１ｉｓＭ１１１２（１」−１５１ｅｕＢ口＋ｒ５　ｒｅｃＥ４）（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ＣｅｎｔｅｒからＮ０９１＾ ４２３として入手可能）に導入した。プラスミドＤＮ＾を含まないＢ、　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ旧１１２はプロテアーゼープロフィシエント（ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｐ ｒｏｆ　１ｅｉｅｎｔ）　（Ｐｒｔ’表現型）であるが、スブチリシンの分泌レ ベルはかなり低い、１．５％（ｗ／Ｖ）の脱脂粉乳及び５ｖｇ／ｘｉのタロラム フェニコールを補充したし一寒天培地にクロラムフェニコール耐性（Ｃｍ’）） ランスフォーマ−を移した後、３７℃でインキュベートした。

３７℃で約１６時間インキュベーション後、プラスミドｐＡＭＢ１１１を生息さ せる旧１１２のコロニーは各コロニーの周囲に明白なハローを形成した。ハロー は脱脂粉乳培地補充物のカゼイン成分上のスブチリシンのタンパク質分解作用に より形成された。ｐＡＮＢ１１ベクター単独を生息させる８１１１２では１６時 間インキュベーション後にハローは見られなかったが、３７℃で４０時間インキ ュベーション後には場合によっては薄いハロー形成された。ｐＡＭＢｌｌｌを担 持する細胞はハローの寸法の差によりｐＡＭＢｌｌを担持する細胞から明白に区 別された。このように完全に機能的な形態で吐仏遺伝子をクローニングすると、 Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓによる高レベルのスブチリシン産生及び分泌を実現する ことができた。

え１九に 第４図に示すように、実施例１に記載したように単離した３、Ｏｋｂ　ＥｃｏＲ Ｉ〜１工１ゲノムフラグメントをＨｉｎｄｌｌで消化し、３個のフラグメント、 即ち（１）組状遺伝子発現の遺伝子調節配列、スブチリシンの細胞外輸出に必要 な遺伝子の「プレプロＪ領域、及び成熟スプチリシンの最初の４９個のアミノ酸 をコードするＤＮＡ配列を担持する１、１ｋｂ　ＥｅｏＲＩ〜Ｈｉｎｄｌ［［フ ラグメント、（２）転写終結配列及び３°ノンコーディング配列と共にスブチリ シンの５０〜２７５（カルボキシ末端）のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を担 持する１、１ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［［〜Ｂｉｎｄｌｌフラグメント、並びに（３） ３’ノンコーディング配列を含む０．８ｋｂ　ｌｌ１ｎｄｌｌｌ　〜に１リエＩ フラグメントを作成した。

両側をＨｉｎｄ１１部位により切断した１、１ｋｂフラグメントをバクテリオフ ァージ８１３　吐１８の単−ＦＩｉｎｄｌｌ［部位にクローニングし、ＤＮＡ配 列決定及び部位特異的突然変異を誘発させた１組換体の１つである８１３　ｖＬ １８　旺シは、仕法遺伝子の部位特異的突然変異誘発に必要な一重鎖鋳型ＤＮＡ を提供した。

組状遺伝子のコーディング領域を配列決定し、配列の結果を以下の第１表に示す 、リーダー領域の最初の５個のコドンは組法遺伝子の配列情報に関する５ｔａｈ ｌ他の前出の文献及びＷｏｎｇ他の前出の文献に報告されており、アミノＲ８４ 位及び８５位では５ｔａｈｌ他の前出の文献とはコドン配列に相異があることに 留意すべきである。特に、５ｔａｈ　ｌ他の前出の文献は、アミノ酸８４位の（ バリンをコードする）コドン０１丁を報告しているが、第１表にはく同様にバリ ンをコードする）コドンＣＴ＾が見られる。同様に５ｔａｈｌ他の前出の文献は アミノ酸８５位に（セリンをコードする）コドン＾ＧＣを報告しているが、第１ 表には（アラニンをコードする）コドンＣＣＣが見られる。

！」ｊｌ Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　？’ｒｐ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ 　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＡｌａＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＧＣＡＡＡ　ＡＡＡ　Ｔ ＴＧ　’Ｉ’ＧＧ　ＡＴＣＡＧＣＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＧＣＧ墓１１」且） ユ １１１１■）ユ ＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＡ？’ＧＴＴＣＣＧＧＣＧＣ ＡＴＴＣＴＣ転写終結配列及び３′ノンコーディング配列と共に組状−スブチリ シンのアミノＢｓｏ〜２７５（カルボキシ末端）をコードするヌクレオチド配列 を担持するＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＱＢ１２７ゲノムＤＮ＾の１．１ｋｂ　Ｈ ｉｎｄｌＩ　〜Ｈｉｎｄｌ［［フラグメントをバクテリオファージＭ１３吐１８ の非反復Ｈｉｎｄｎ［部位に挿入することにより、バクテリオファージ８１３　 ｌ１１８　蛙ケを構築した。３′ノンコーディング配列を除去するために、む工 Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を部位特異的突然変異誘発により転写終結配列の 直後の位置に導入した。

部位特異的突然変異誘発はＮｏｒｒａｎｄｅｒ他、Ｇｅｎｅ、　２６．１０１− １０６　（１９８３）に記載されている手順に従って実施した０Ｍ１３吐１８リ エ２からの一重鎖ＤＮ＾を、Ｂｅａｕｃａｇｅ他、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅ ｔｔｅｒｓ　？、２．１８５９−１８６２　（１９８１）により記載されている 亜リン酸塩法により合成したプライマｍ：にアニールした。プライマーは２個（ アステリスクで示す）を除いてこの領域でヌクレオチドと相同であり、チミン（ Ｔ）がグアニン（Ｃ）に置換され、別のチミン（Ｔ）がアデニン（＾）に置換さ れ、こうしてこの領域にＩＩＪＬ−１部位（下線部）を形成している。

プライマー・を６５℃で旧３　吐１８　柱シＤＮ＾にアニールし、アニールした ＤＮＡを約２２℃まで徐冷した後、アニールしたＤＮ＾溶液１２．５，１、夫々 １０ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ及びｄＣＴＰ２．５．ｌ、１２ｍＭ＾ＴＰ２０ １１ｆ、　Ｋｌｅｎｏｘ　ＤＮ＾ポリメラーゼ０．１ｕ１、Ｔ４　ＤＮ＾リガー ゼ０．１．ｌ及び無菌蒸留水ｔ３ｐｌから構成される反応混合物中で１５℃で２ 時間重合した。形成された二重鎖の共有的閉環状ＤＮＡをトランスフェクション によりＥ、　ｅｏｌｉ　ＪＭ１０３に導入した。

次にバクテリオファージプラークをＧｅｎｅ　Ｓｃｒｅｅｎ（ＮｅｗＥｎｇｌａ ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓの登 録商標）ハイブリダイゼーション膜に移した。上記突然変異誘発反応に使用した 放射性物質で標議した（γ−３２Ｐ）合成オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ することにより、所望の塩基置換を有するＤＮＡを含むプラークを認識した。ハ イブリダイゼーションは、屈■突然変異を有するＤＮＡのみが合成オリゴヌクレ オチドにハイブリダイズするように、制限温度（６５℃）で実施した。単一の精 製プラークからのＤＮＡ上の組状遺伝子の下流の１リー１突然変異（８１３−１ ８ｕ■−２石１と命名）の存在は、５ａｎ１１ｅｒ他の前出の文献に記載されて いる手順によるＤＮＡ配列決定及び制限酵素分析により確認した。

８１３　吐１８　ａｐｒ２１リー１を１リエ！で消化し、消化物を５００ｎｙＤ Ｎ＾／ｗｌの濃度で再連結させ、次にトランスフェクションにより連結物をＥ、 　ｃｏｌｉ　ＪＮ１０３に導入することにより、３゛ノンコーデイング領域の大 部分を担持する１、１ｋｂセグメントを欠失させた。所望の０゜３５ｋｂ欠失を 有するＤＮＡを含むバクテリオファージプラークを制限エンドヌクレアーゼ分析 により認識した。このようなプラークからのバクテリオファージをＭ１３吐１８ 弘４（第７図）と命名した。Ｈ１３吐１８リエ４は実施例３に記載する組状遺伝 子の部位特異的突然変異誘発の一重鎖鋳型ＤＮＡを提供した。

え支ｉ支 Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中で突然変異スブチリシン遺伝子を発現させるために、 突然変異遺伝子のベクターとしてプラスミドｐＡＭＢ１０６を次のように構築し た。

１）ｐＡＭＢｌｌｌを１銹■で消化した。　ｐＡＭＢｌｌｌの１組■消化物を約 １ｐｙ／ｚｌの濃度で再連結させることによりｍ遺伝子の大部分を担持する１、 １ｋｂセグメントを欠失させた。こうして第４図に示すようにｐＡＭＢｌｌｏを 形成した。　ｐＡＭＢ１１０プラスミドはスブチリシン遺伝子の発現のための遺 伝子調節配列、スブチリシンの分泌に必要な「プレプロ」領域、並びに成熟スブ チリシンの３°ノンコーデイング領域及び成熟スブチリシンの最初の４９個のア ミノ酸をコードするＤＮＡ配列を担持している。

２）プラスミドｐＡＭＢＩＩＯをＢａｍＨｌ及びｂ工Ｉの組み合わせで消化した 。こうして６．２ｋｂ及び１．Ｏｋｂの２種類の寸法のＤＮＡフラグメントを作 成した。　１．ＯｋｂのフラグメントはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ匹■紅ａｔ−２ （Ｚｕｋｏｗｓｋｉ他の前出の文献）のＴＯＬプラスミドからのカテコール２， ３−ジオキシゲナーゼをコードするリリーＥ遺伝子を担持している。

３）より大きい６．２ｋｂ−Ｂａ＋ｎＨＩ　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメントを、Ｂｅ ａｕｃ−ａｇｅ他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩法により合成した一 重鎖合成オリゴヌクレオチド５’　ＧＡＴＣＴＧＣＡ　３°、及びＴ４　ＤＮＡ リガーゼにより自己連結させた。Ｃｈａｆｅ他、Ｍｏｌ。

Ｃｅｎ、　１１．ｅｎｅｔ、　１６８．１１１−１１５　（１９７９）により記 載されているプロトプラスト形質転換法により、連結物をＢ、　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ８１１１２（ニー１５１ｅｕＢ　ｔｈｒ５　ｒｅｃＥ４）（Ｂａｅｉｌｌｕｓ 　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒからＮｏ、　１＾４２３として入手 可能）に導入した。

クロラムフェニコール耐性（Ｃｎ’）コロニーのプラスミド含有量をスクリーニ ングした。　６．２ｋｂのプラスミドｐＡＭ８１０６は制限エンドヌクレアーゼ 分析により認識した。該プラスミドは！ＬＬＥを欠失している以外はプラスミド ｐＡＭＢＩＩＯと同一であった（第６図）。

ｐＡＭＢ１０６は仕組スブチリシンの５０〜２７５のアミノ酸をコードするＤＮ Ａを欠失しているので、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ宿主細胞に導入してもスブチリ シンを合成しない、スブチリシンはスブチリシン遺伝子の残部、即ち天然のＤＮ Ａ配列又はアナログをコードする配列のいずれかの挿入後のみに合成される。

Ｂｅａｕｃａｇｅ他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩法により合成した プライマー： ＴＲＰ　ＩＬＥ　ＩＬＥ　ＳＥＲにＬＹ　ＩＬＥ　ｌ；ＬＵ　ＴＲＰにバクテリ オファージＭ１３Ｉ！！１８月■−４からの一重鎖ＤＮＡをアニールした。プラ イマーは１個の塩基（アステリスクで示す）を除いて吐侍−スブチリシンの１０ ６〜１１３のアミノ酸のコドンを含むヌクレオチドと相同であり、＾ｓｎｔｏｗ （コドン＾＾Ｃ）を５ｅｔ１０″（コドン＾ＣＣ）に置換させるトランジション を可能にするように＾がＣに置換されていた。

プライマーを６５℃で８１３吐１８　月ト−４ＤＮＡにアニールし、アニールし たＤＮＡを約２２℃まで徐冷した後、実施例２に記載したように重合、連結及び トランスフェクトした。

バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーション膜に移し、上記突然変異 誘発反応に使用した放射性物質で標識した（α−３２Ｐ）オリゴヌクレオチドに ハイブリダイズすることにより、所望の塩基置換を有するＤＮＡを含むプラーク を認識した。ハイブリダイゼーションは６５℃で実施した。

１個の陽性のプラークはＮ１３吐１８　！Ｊど−４［Ｓｅｔ”すと呼称されるバ クテリオファージを含んでいた。このバクテリオファージからの二重鎖ＩＮＮ＾ をＢｉｎｄｌｌ及び石１の組み合わせで消化した後、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ及びＫＪＬ ！ＬＩで予め消化しておいたｐ＾ＭＢ１０６に、ｍ−スブチリシン遺伝子の突然 変異部分を担持する７５０ｂｐフラグメントを連結した。得られたプラスミドｐ ＡＭＢ１２９を適当なり、　５ｕｂｔｉｌｉｓ宿主細胞に導入し、［Ｓｅｔ”リ ースブチリシンを合成及び分泌することができる。

叉Ｌ１Σ セ１ン１０９　セ１ン２１８スブ　リシン　ナログのＢｅｕｈｃａＢｅ他の前出 の文献により記載されている亜リン酸塩法により合成したプライマー： ５’　ににＣＧＣＴ　ＴＡＴ　ＡＣＣにＧ＾　＾Ｃ３゜ＧＬＹ　ＡＬＡ　ＴＹＲ ＳＥＲにＬＹ　ＴＨＲにＮ１３吐１８　ａｐｒ４［Ｓｅｒ’°何からの一重鎖Ｄ ＮＡをアニールした。

プライマーは１個の塩基（アステリスクで示す）を除いてｍ−スブチリシンの２ １５〜２２０のアミノ酸のコドンを含むヌクレオチドと相同であり、＾ｓ　ｎ　 ２１１　（コドン＾＾Ｃ）を５ｅｒ２１ａ（コドン＾ＧＣ）に置換させるトラン ジションを可能にするように八がＣに置換されていた。アニーリング、重合、連 結、トランスフェクション及び陽性プラークの認識の条件は実施例２に記載した 通りである。１個の精製プラークは、８１３１１８　ｕト−４［Ｓｅｔ””、　 Ｓｅｔ””］と命名されるバクテリオファージを含んでいた。このバクテリオフ ァージからの二重鎖ＤＮＡをＨｉｎｄｌｌＪ及び石■の組み合わせで消化した後 、２つの突然変異部を有する７５０ｂｐフラグメントを予めＨｉｎｄｌ［ｌ及び Ｋｗｒで消化しておいたｐＡＭＢ１０６に連結した。得られたプラスミドｐＡＭ Ｂ１３０をＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ宿主細胞に導入し、［Ｓｅ、Ｉｔｓ。

Ｓｅｒ””］−スブチリシンを合成及び分泌することができる。

１１１［ ＾ｓ　７６　５ｅｒ１０９　５ｅｒ２１８スブ　リシンアナ口　のＢｅａｕｅａ ｇｅ他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩法により合成したプライマーニ ア４　７５　７６　７７　７８　７９ ＾ＬＡ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＡＳＮ　ＳＥＲＩＬＥにＮ１３吐１８丑４［Ｓｅｒ” ”、　Ｓｅｒ’目］からの一重鎖ＤＮＡをアニールした。プライマーは１個の塩 基（アステリスクで示す）を除いてｄ−スブチリシンの７４〜７９のアミノ酸の コドンを含むヌクレオチドと相同であり、八ｓ　ＩＩ　ｔ　＆　（コドン＾＾Ｔ ）をＡｓ　ｐ　？　Ｓ　（コドンＧＡＴ）に置換させるトランジションを可能に するように＾がＧに置換されていた。

プライマーを６５℃でＮ１３吐１８　［Ｓｅｒ’°ｓ、　Ｓｅｒ””］　ＤＮＡ にアニールし、アニールしたＤＮＡを約２２℃まで徐冷した後、実施例２に記載 したように重合、連結及びトランスフェクトした。

バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーション膜に移し、ハイブリダイ ゼーションを４６℃で実施した以外は実施例２に記載したようにハイブリダイズ することにより、所望の塩基置換されを有するＤＮＡを含むプラーク認識した。

１個の陽性のプラークはＭ１３＠Ｌ１８＆ＪＬ４［＾ｓｐ”、Ｓｅｔ’°９゜Ｓ ｅ　ｒ　２１　ｍ　］と呼称されるバクテリオファージを含んでいた。

このバクテリオファージからの二重ｇＤＮ＾をＨｉｎｄｌ［［及び１リエＩの組 み合わせにより消化した後、Ｈｉｎｄ　ｌ［ｌ及び石１で予め消化しておいたｐ ＡＭＢ１０６に、ｄ−スブチリシン遺伝子の３つの突然変異部を担持する７５０ ｂ、フラグメントを連結した。

得られたプラスミドｐＡＭＢ１３１をＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ宿主細胞に導入し 、［＾ｓｐ）’、　Ｓｅｔ”’、　Ｓｅｒ””］−スブチリシンを合成及び分泌 することができる。

えＬ匠Ｌ ＾Ｓフロ　＾ＳＳフッＳｅ、１１＋１　５ｅ、２７８スブ　リシンアナ口　の１ 炙 Ｂｅａｕｃａｇｅ他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩法により合成した プライマーニ ア４　７５　７６　７７　７８　７９　８０ＡＬＡ　ＬＥＩＪ　ＡＳＰ　ＡＳＰ 　ＳＥＲＩＬＥ　ＧＬＹにＮ１３吐１８　旺カ［＾５ｐ）Ｉ　、　Ｓｅ　ｒ　ｌ 　６嘗　５ｅｒ２１１］がちの一重鎖ＤＮＡをアニールした。プライマーは２個 の塩基（アステリスクで示す）を除いて［Ａｓ　ｐ　ｔ　＆　、　Ｓｅ　ｒ　Ｉ 　Ｇ″　５　ｅ　ｒ　２１　ｍ　］−スブチリシンの７４〜８０のアミノ酸のコ ドンを含むヌクレオチドと相同であり、八ｓ　ｎ　？　？　（コドン＾＾Ｃ）を Ａｓ　ｐ　？　１　（コドンにＡＴ）に置換させるトランジションを可能にする ように＾がＧ、ＣがＴに置換されていた。

プライマーを６５℃でＭ１３Ｉ！ｉ１８　呼ヒ［＾５ｐ）−Ｓｅｒ”嘗。

Ｓｅｒ””］　ＤＮＡにアニールし、アニールしたＤＮＡを約２２℃まで徐冷し た後、実施例２に記載したように重合、連結及びトランスフェクトした。

バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーション膜に移し、ハイブリダイ ゼーションを４５℃で実施した以外は実施例２に記載したようにハイブリダイズ することにより、所望の塩基置換を有するＤＮＡを含むプラークを認識した。１ 個の陽性のプラークはＮ１３吐１８　ｕＥ−４［＾５ｐ）６．＾ｓｐフフ。

５ｅｒｌ＋１．５ｅｒ２１１］と呼称されるバクテリオファージを含んでいた。

このバクテリオファージからの二重ｇＤＮＡをＨｉｎｄｌ及びｍ■の組み合わせ により消化した後、Ｈｉｎｄｌ［及び’Ｊｕｌで予め消化しておいたｐＡＭＢ１ ０６に、ｄ−スブチリシン遺伝子の４つの突然変異部を担持する７５０ｂｐフラ グメントを連結した。得られたプラスミドｐＡＭＢ１３２をＢ、　５ｕｂｔｉｌ ｉｓ宿主細胞に導入し、［Ａｓ　ｐ　？−＾ｓｐフフ、　Ｓｅｒ”’、　５ｅｒ ２目］−スブチリシンを合成及び分泌することができる。

＾Ｓフロ　Ａｓ１！５ｅｒ１０嘗　Ｓｅｒ”目スブ　１シンアナログの１【 Ｂｅａｕｃａｇｅ他の前出の文献に記載されている亜リン酸塩法により合成した プライマーニ ア５７６　７７　７８　７９　８０　８１　８２　８３ＡＳＰ　ＡＳＮ　ＳＥＲ ［；ＬＵ　ＣＬＹ　ＶＡＬ　ＬＥＵにＭ１３！１」≧−１８リＬ４［＾ｓｐ”、 　Ｓｅｔ’°Ｉ、　Ｓｅｒ”魯コからの一重鎖ＤＮＡをアニールした。プライマ ーは３個の塩基（アステリスクで示す）を除いて［Ａｓ　ｐ？　＠　、　Ｓｅ　 ｔ　１６　ｍ　、　Ｓ　ｅ　ｒ　２目トスブチリシンの７５〜８３のアミノ酸の 一部のコドン及び７６〜８２のアミノ酸の全コドンを含むヌクレオチドと相同で あり、Ｉｌｅ”（コドン＾ＴＣ）をＣｌｕ”（コドンＧ＾＾）に置換させるトラ ンジションを可能にするように＾がＧ、Ｔが＾、Ｃが＾に置換されていた。

プライマーを６５℃でＭ１３ｗｚ１８　ｕＥ−４［Ａｓ　ｐ　？　＠　、　Ｓｅ 　ｒ　ｌ　Ｏ％。

Ｓｅｔ””］　ＤＮＡにアニールし、アニールしたＤＮＡを約２２℃まで徐冷し た後、実施例２に記載したように重合、連結及びトランスフェクトした。

バクテリオファージプラークをハイブリダイゼーション腹に移し、ハイブリダイ ゼーションを４５℃で実施した以外は実施例２に記載したようにハイブリダイズ することにより、所望の塩基置換を有するＤＮＡを含むプラークを認識した。１ 個の陽性のプラークはＭ１３吐１８　リニ４［＾ｓｐ”、　Ｇｌｕ）１゜５ｅｒ １０１．５ｅｒ２＋１］と呼称されるバクテリオファージを含んでいた。このバ クテリオファージからの二重ｆｉＤＮ八をＨｉｎｄｌ及び粒１の組み合わせによ り消化した後、Ｈｉｎｄｌｌ及び１リー１で予め消化しておいたｐ＾ＭＢ１０６ に、組状−スブチリシン遺伝子の４つの突然変異部を担持する７５０ｂｐフラグ メントを連結した。得られたプラスミドｐＡＭＢ１３３をＢ、　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ宿主細胞に導入し、［Ａｓｐｔ＆、　にｌｕ？！、　Ｓｅ、＋０９．５ｅｒ２ １Ｊ−スブチリシンを合成及び分泌することができる。

え１匠ｌ はとんどのＢｍａ　ｉ　ｌ　ｌ　ｉは周囲の増殖培地中にアルカリ性及び／又は 中性プロテアーゼを分泌するので、突然変異スブチリシン遺伝子が突然変異細胞 に導入されると突然変異スブチリシンを産生じ、完全なスブチリシンアナログの 単離を妨害し得る他のプロテアーゼを含まない培地中に該突然変異スブチリシン を分泌するように、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの内因性アルカリ性及び中性プロテ アーゼ遺伝子に突然変異を導入してその合成を阻止することが好ましい、検出可 能な細胞外プロテアーゼを産生じない２種類の突然変異Ｌ…ｔｉ−１ｉｓ株ＢＺ ２４及びＢＺ２５を次の手順に従って構築した。

まず、Ｅ、　ｃｏｌｉ中では複製することが可能であるが、Ｌｓｕｂｔｉｌｉｓ 中では相同組換によりＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中色体に組み込まない限り複製す ることができないプラスミドベクターを次のように構築した。プラスミドｐＢＤ ６４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅ−ｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｎ ｕｍｂｅｒｌＥ２２）をＬｐｐＩｌで完全に消化させ、夫々２．９５ｋｂ、１． Ｏｋｂ及び０．７５ｋｂの寸法の３つのフラグメントを作成した。これらのフラ グメントを次に、Ｃｌａ　ｌで予め消化しておいたプラスミドｐＢＲ３２２（＾ 、Ｔ、Ｃ，Ｃ，３７０１７）に混合物として連結した。連結物を形質転換により Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎがら＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ，２３７２４として入手可能）に導入し た［Ｍａｎｄｅｌ他、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

５３、１５４　（１９７０＞］、　りＤ　５　ム７　ｘ　：、、　＝７−ル（２ ｈｌＩ／ｉｔ’）及ヒ７ンビシリン（５ｈｙ＃ｉ’）に対して耐性の細胞を選択 した。

Ｂｉｒｎｂｏｉｍ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、７．１５１３− １５２３　（１９７９）に記載のアルカリ抽出手順により１２個の形質転換細胞 がらプラスミドＤＮＡを作成し、次にＨｉｎｄｌ［及びＥｃｏＲｌの組み合わせ で消化し、挿入したフラグメントの存在を確認した。

このような１個のプラスミドｐＡＭＢ３０はｐＢＲ３２２のりａ１部位にｐＢＤ ６４の１．０及び０．７５ｋｂの石■フラグメントを担持することが確認された 。これらのフラグメントはＥ、　ｅｏｌｉ及びＬｓｕｂｔｉｌｉｓ中で機能的な りロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（帆）遺伝子を含んでいる。

Ｉ■及びシュ３八で別々に消化した処、第５図に示すようにｐＡＭＢ３０上にり 工遺伝子の存在及び配向が確認された。

ｐＡＭＢ３０はＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中に機能的な複製配列の起源を欠いてい るので、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ宿主細胞中で自律的レプリコンとして複製する ことができない、他方、ｐＡＭＢ３０はＥ、　ｃｏｌｉ中にｐＢＲ３２２から誘 導される機能的な複製起源を含んでいるので、プラスミドはＥ、ｃｏｌｉ宿主細 胞中で増殖され得る。プラスミドｐＡＭＢ３０は少なくとも２つの点で有用であ る。まず第１に、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中に機能的複製起源を含むＤＮＡのフ ラグメントはｐＡＭＢ３０にクローニングすると検出され得、プラスミドは染色 体外状態で自律的に複製する。第２に、プラスミドｐＡＭＢ３０は染色体とｐＡ ＭＢ３０にクローニングしたＬｓｕｂｔ　ｉ　ｌ　１ｓＤＮ＾との間の相同部位 でＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓのゲノムに組み込まれ得る。このことは、ｐＡＭ８３ ０と同一ではないがこれに類似するプラスミドベクターを使用してＨａｌｄｅｎ ｗａｎｇ他、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１４２．９０−９８　（１９８０ ）及びＹｏｕｎｇ、　Ｊ、　（：ｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１２旦、　１４９７−１５１２　（１９８３）により 立証されている。

プラスミドｐＡＭＢ２１　（実施例１に記載）をＥｅｏＲＩ及びＰｓｔｌで消化 し、１．Ｏｋｂフラグメント上のＸＬＬＥ遺伝子を単離した。

予めＥｅｏＲ■及びＰｓｔ　ｌで消化しておいたｐ＾ＭＢ３０にフラグメントを 連結した。連結物を形質転換によりＥ、　ｅｏｌｉ　Ｃ６００に導入した。　ｐ ＡＭＢ２１のＸＬＬＥフラグメントをｐＡＭＢ３０のアンピシリン耐性構造遺伝 子に挿入したためにアンピシリン（５ｈｇ／ｉ１）に怒受性であるクロラムフェ ニコール耐性（２０ｕｙ／ｌｊり宿主細胞を選択した。形成されたプラスミドｐ ＡＭＢ３０／２１はｐＡＭＢ３０と同一の特性を有しており、更に、機能的！！ ＬＬＥ遺伝子を有りでいる。

成熟スブチリシンの最後の２２６個のアミノ酸をコードする領域を欠失するｌｊ ｉ遺伝子を担持するプラスミドｐＨ８１１０をＥｃｏＲＩ及び石■で消化させた 。旺値遺伝子発現の遺伝子調節配列、「プレプロ」領域、成熟スブチリシンの最 初の４９個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列、並びに３°ノンコーディング配 列を含むＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＤＮへの１．９ｋｂフラグメントを、予め１ 且Ｒ１及び粒Ｉで消化したｐ＾ＭＢ３０／２１に連結した。

連結物を形質転換によりＥ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００に導入した。数個の形質転換 細胞からのプラスミドＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉ−他の前出の文献に記載のアルカ リ抽出手順により単離し、挿入した１、９ｋｂフラグメントの存在を多重制限エ ンドヌクレアーゼ消化により確認した。このような１つのプラスミドｐＡＭＢ３ ０１を後の使用のために残しておいた。

Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ株ＢにＳＣＩ＾２７４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　［；ｅｎｅ ｔｉｅ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ）は■工遺伝子座に突然変異部を担持しており 、細胞外中性プロテアーゼを産生ずることができない、コンピテント細胞の形質 転換によりプラスミドｐＡＭＢ３０１をＢ、　５ｕｂｔ土−１ｉｓ　ＢＧＳＣＩ ＾２７４のゲノムに組み込んだ［５ｐｉｚｉｚｅｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ、　４４．１０７２−１０７８　＜ １９５８）コ、クロラムフェニコール耐性（５νｙ／ｚ１）宿主細胞を選択し、 無菌楊枝により１．５％（、／Ｖ）の脱脂粉乳及び（ｈｙ／ｉｉ’）のクロラム フェニコールを補充したし一寒天に移した。これらの細胞はコロニーの周囲に明 白なハローを形成し得す、７然変異と新たに導入した７然変異との組み合わせに より細胞外中性及びセリンプロテアーゼを産生ずる能力を欠いていた。

組状突然変異部は野生型阻値遺伝子がｐＡＭＢ３０１に担持された欠失型で置換 されているので成熟スブチリシンの最後の２２６個のアミノ酸を欠失していた。

このような１つの株ＢＺ２４はＮｐｒ−Ａｐｒ−Ｃｍ’表現型を有しており、従 って、検出可能な細胞外中性プロテアーゼ及び細胞外アルカリ性プロテアーゼの いずれも産生せず、５ｐｇ／ｘｌのクロラムフェニコールに耐性である。サザン ブロツティング［５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｈｏｔ。

Ｂｉｏｌ、、　９８．５０３−５１７　（１９７５）コを使用してＢ、　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ　ＢＺ２４の染色体上の組状遺伝子の欠失を確認した。約３２世代の 抗生物質選択の不在下でＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＺ２４を抗生物質培地Ｎｏ 。

３（Ｐｅｎａｓｓａｙ　Ｂｒｏｔｈ、　Ｄｉｒｃｏ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉ ｃｈｉｇａｎ）で培養した処、ＢＺ２４染色体の不安定性により宿主細胞にクロ ラムフェニコール耐性を与える四遺伝子が欠失するようなりＺ２４の誘導株が単 離された。このような現象は５ｔａｈ　Ｉ他、ムーＢａｃｔｅｒｉｏ１．．１５ ８．４１１−４１８　（１９８４）により既に認められている。ＢＺ２４のクロ ラムフェニコール感受性誘導株をＢＺ２５と命名した。　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ　ＢＺ２５はＮｐｒ−Ａｐｒ−表現型を有するので、検出可能な細胞外中性プ ロテアーゼも細胞外アルカリ性１０テアーゼも産生じない、サザンブロッティン グを使用してＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＺ２５の染色体上のｍ遺伝子の欠失を 確認した。

Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＺ２５は検出可能な細胞外中性プロテアーゼ及びス ブチリシンのいずれも産生じないので、他のプロテアーゼを含まない周囲増殖培 地中に分泌され得る突然変異スブチリシンを産生ずるためにｐＡＭＢ１１３のよ うなプラスミドＤＮＡを導入するための有用な宿主細胞である。

Ｂ、　５ｕｂｔｉ！ｉｓ　ＢＺ２５は培養上滑を以下に記載するように試験する と、検出可能な細胞外プラスミドを産生じない。

（Ｃｈａｎｇ他の前出の文献に記載のプロトプラスト形質転換法により導入した ）プラスミドｐＡＭＢ１１３を生息させるＢＺ２５であるＢ、　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ　ＢＺ２５／ｐＡＭＢ１１３は、培養上滑を以下に記載するように試験すると 多少の量の［Ｓｅｔ”″］−スブチリシンを産生ずる。

えＩ九跨 ［Ｓｅｒ”’］−スブチリシン遺伝子のＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの染色体への組 み込みは、この突然変異遺伝子の遺伝子安定性を増加する有効な方法であると考 えられている。このようなアプローチは、それ以外の方法ではプラスミドＤＮＡ を染色体外状態で維持するために選択的圧力を加えることが必要な発酵培地にク ロラムフェニコールを使用する必要がない。従って、［Ｓｅ、２１１］−スブチ リシン遺伝子は、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ染色体と相同のその遺伝子調節配列及 びフランキングＤＮへと共に、予めＥｅｏＲＩ及びＰｓｔｌの組み合わせで消化 しておいた１５ＭＢ１１３の電気泳動後に低融点アガロースゲルから単離した。

次に、４．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ〜Ｐｓｔｌフラグメント（第４図）を予めＥｅｏ ＲＩ及びｂ工■の組み合わせで消化しておいたｐ＾ＭＢ３０　（第５図）に連結 した。連結物を形質転換によりＥ、　ｅｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ（＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ， ３３６９４）に導入した。クロラムフェニコール（２０１１ｇ／ｌｌ）に耐性の 細胞を選択した。上記基準を満たす４つの形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡ をＢｉｒｎｂｏｉ−他の前出の文献に記載されたアルカリ抽出手順により単離し た後、ＥｅｏＲＥ及びｂ工Ｉの組み合わせで消化した。４個のプラスミドはいず れもｐＡＭＢ３０の４．０ｋｂのインサート及び５．６ｋｂの残部を含んでいた 。このような１個のプラスミドｐＡＭＢ３０２を精製し、その後の使用に備えて 保持した。

コンピテント法［５ｐｉｚｉｚｅｎ、前出文献コによりＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓＢ Ｚ２５の染色体にプラスミドｐＡＭＢ３０２を組み込むように繰り返し試みたが 、成功しなかった。これは、使用した方法によりＢＺ２５細胞をコンピテントに することができながったためであると考えられる。従って、Ｃｈａｎｇ他の前出 の文献のプロトプラスト形質転換方法によりＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＺ２５ にｐＡＭＢ３０２を導入した。この結果は、組み込みが得られた試験株をコンビ テンス法による形質転換に基づいて選択したという点で特に意味がある。コンピ テントにすることができない株、特にコンビテンス法による形質転換に基づいて 選択されなかった一般市販株はコンピテントとなり得ない可能性が大きい。

クロラムフェニコール耐性（ＳＩＩｙ／ｉｆ）ｍ胞を選択し、次に１．５％（、 ／Ｖ）の脱脂粉乳及びｈｇ／ｚ１のクロラムフェニコールを補充したし一寒天に 無菌楊枝で移した。細胞を３７℃で一晩インキユベートした。異なる直径の鮮明 なハローがＣ１コロニーの周囲に観察された。これは、これらの細胞によりスブ チリシンが産生及び分泌されたことを意味する。アルカリ抽出法によりこれらの コロニーの８個からプラスミドＤＮＡを単離するように試みた。電気泳動後にＤ ＮＡを可視化するように臭化エチジウム（１ｕｙ＃／）で染色したアガロースゲ ル上にプラスミドＤＮＡは検出されなかった。スブチリシンを産生ずるＣｍ’細 胞中に染色体外プラスミドＤＮＡが不在であることは、ｐＡＭＢ３０２がＢ、　 ５ｕｂｔｉｌｉｓの染色体に組み込まれたことを表す有力な証拠である。

この実験からの数個のコロニーを単離し、ＢＺ２８、ＢＺ２９、ＢＺ３０．ＢＺ ３１、ＢＺ３２及ヒＢＺ３３　ト命名しｆ、：　、　５ｕｙ／ｙｌツクｏ　ラム フェニコールを補充した脳−心インフユージョン培地（ＢＨＩ。

Ｄｉｒｃｏ）中で激しく振蕩させながら各株を３７℃で一晩増殖させた。培養上 清のスブチリシン活性を試験した。Ｌｓｕｂｔ　ｉ　Ｉ　ｉｓ株ＢＺ２８、ＢＺ ２９、ＢＺ３０、ＢＺ３１、ＢＺ３；’及びＢＺ３３はいずれもスブチリシンを 産生じ、周囲の増殖培地中に分泌し、他の株よりも産生量の多い株もあった。液 体培地ブロス中に観察されたスプチリシンの量は、脱脂粉乳り一寒天培地上に観 察されたハローの寸法に正比例していた。これらの細胞により分泌されるスブチ リシンの量の差により、ｐＡＭＢ３０２の多重コピーを染色体に組み込み、又は 遺伝子増幅［Ｙｏｕｎｇ　。

Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、、　１２９．１４９７−１５１２　（１ ９８３）；＾１ｂｅｒｔｉｎｉ他、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６２．１ ２０３−１２１１　（１９８５）］を実施した。

及１色比 ＢＺ２５／ｐＡＭＢ１１１からの野生型スブチリシン、及びＢＺ２５／ｐＡＭＢ １３１からの［＾ｓｐ”、　Ｓｅｒ”’、　５ｅｒ２目］−スブチリシンアナロ グを次のように単離及び精製した。各培養ブロスを１５．０００．で３０分間遠 心分離し、透明な上清中のタンパク質を（ＮＨ＝）２ｓｏ−（３５０２／ｌ）で 沈澱させた。沈澱を遠心分離により収集し、７５％アセトンと混和し、濾過及び 真空乾燥した。

酵素を更に精製するために、乾燥した沈澱を水に溶解させ、溶液を沢過してから ｐＨ６，３の０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で透析した。透析した溶液を２ ｚ１／ｗｉｎの速度でカルボキシメチルセルロースのカラム（ｚ、ｓｘ　１５ｃ ｍ）に通した。カラムを０．０２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，３）で洗浄後、 ０．１５ＨのＮａＣｌを含有する同一の緩衝液で酵素を溶出させた。ピークフラ クションをプールし、２，５容量のアセトンを添加することにより酵素を含有す るフラクションからのタンパク質が沈澱し、これはスクシニル−Ｌ−アラニル− Ｌ−アラニル−し−プロリル−し−フェニルアラニル−ｐ−ニトロアニリド（Ｖ ｅｇａＢｉｏｃｈｅｍｉｅａｌｓ）と混合したフラクションのサンプル中の色変 化により確認された。沈澱を遠心分離により収集し、０．００５Ｍ酢酸カルシウ ムに溶解させた（約１ｚ１／１０ｉｙ）　、得られた溶液を４℃で水で透析した 後、凍結乾燥した。

え４１段 純粋なスブチリシン又はスブチリシンアナログをＥＰＬＣＳｕｐｅｒｏｓｅ　１ ２カラムに加え、完全なく切断していない）タンパク質として溶出する物質を２ ０ＩｅＭＭＥＳ、　０．ＩＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭＣａＣＩｔ、　ｐＨ６，３中 にプールした。野生型スブチリシン、又は本発明のスブチリシンアナログのサン プルを、同一緩衝液、緩衝液＋３％ＳＤＳ、又は２０ｍＭ　ＭＥＳ、　０．ＩＭ 　ＮａＣ１，５Ｉｌ１Ｍ　ＣａＣｌ２及び１５ｍＭ　ＥＤＴ＾中で指定した温度 で１０分間インキュベートした。サンプルを５分間で室温まで冷却した後、０． ６％のアゾカゼインを加えたＴｒｉｓ−ＭＣＩ、　ｐＨ８，０中で室温（２０℃ ）で２０分間試験し、タンパク質分解活性を決定した。各サンプルのタンパク質 分解活性は１０１１８　ＣｌＩＣＩ２中２０℃における野生型又はアナログのい ずれかの元の活性の百分率として表し、第２表に示す。

５の＾Ｓテ１ＳｅｒｌｅＩＳｅｒ２１１スブチリシンアナロＬΔＬ１ 沼己房Ｌ　０％　ＳＤＳ　３％　ＳＤＳ　９％　ＳＤＳ＋　１５ｍＭ　ＥＤＴ＾ 叉４吐け ５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラム上でＦＰＬＣにより完全なスプチリシンを得た。

完全なスブチリシンを、１５−ＭＭＥＳ、４Ｊ　ＣａＣ１ｚ又は４ＩＩＭＥＤＴ ＾を含有するｐＨ６，３の０．５８　ＮａＣｌ、及び各種の量のＳＤＳ中で室温 （２０℃）で３０分間インキュベートした６次にＴｒｉｓ−ＣＩ、　ｐＨ８，０ 中の０．６％アゾカゼイン中で２０分間インキュベートすることにより酵素のタ ンパク質分解活性を決定した。試験した各サンプルのタンパク質分解活性を、０ ％ＳＤＳ及び１０ｍＭ　Ｃａ”中のサンプルの元の活性の百分率として第３表に 示す。

策」ｊｌ スブ　−シンのタンパク　Ｓ ％　ＳＤＳ　４＋ｉＭ　Ｃａ’１　４ｍＭ　ＥＤＴ＾Ｏｔｏｏ　９４ ０．１　１００　７６ ０．２５　１００　４５ ０．５０　７６　１３ ０．７５　６３　３ １．０　６０　０ ２・０２９０ ３．０　１７　０ ＾ｓ？＠　５ｃｒ１６１　５ｅｒ２１−スブ　リシンアナログのタンハｚＩｊｌ Ｌ活１− ％ＳＤＳ　４ｍＭ　Ｃａ”　４＋ｅＭ　ＥＤＴ＾０．１　１００　９５ ０．２５　１００　８６ ０．５０　１００　８１ ０．７５　９６　７９ １．０　９６　７８ ２．０　８６　６９ ３．０　７１　６５ 火１ｊｕｌ ［＾ｓ、ｔｓ、　５ｅｒ１ｏｅ、　Ｓｅ、２１１］スブチリシンアナログ、［＾ ｓｐ”、　にｌｕ’嘗　５ｅ、１０１．８ｅ％ＩＩ］スブチリシンアナログ及び Ｃａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシンの安定性を３種類の温度（２５℃、３７℃及び ５０℃）で２種類の緩衝液（０，０６Ｍリン酸ナトリウムｐ。

９．０、又は０．１２Ｎグリシン酸ナトリウムｐＨ１１，０＞中で試験した。結 果を第４表に各条件下の酵素の半減期として示す。

！１表 八、　０．１２Ｎグリシン酸ナトリウムｐＨ１１，０＋ｏ、２％ＳＤＳ中入１士 丈ンＺ　痔佳扛ユ　ｊ胆＝ユ　昏但固ユ［＾５ｐ）−Ｓｅｒ’°、Ｓｅｒ　２１ １コアナログ　１１０日間　３５．２時間　６．７時間Ｃｉｒｌｓｂｅｒｇスブ チリシン　２日間　８．４時間　０．５３時間［八ｓｐ１＠、　（，１ｕ７１． ３ｅｒ１１１１．　Ｓｅ、ＪＩＳ］アナログ　１５４日間　３５．３時間　７． ８時間Ｂ、０．０６Ｍリン酸ナトリウムｐ１１９．０＋ｏ、２％Ｓ［ｌＳ中各１ ±丈ンと　痔佳葦才　的胆へ才　昏但打ユ［＾ｓｐ”、　Ｓｅｔ’°、　５ｅｒ ２ゝ６］アナログ　７９．２時間　１６．０時間　０．５２時間Ｃａｒｌｓｂｅ ｒｇスブチリシン　１７．３時間　２．４時間　０．１８時間［＾５ｐ）−Ｇｌ ｕチー５ｅｒｌ！、　５ｅｔ２１＠コアナログ　８６．３時間　２２．０時間　 ０．９６時０Ｃ，０，１２Ｍグリシン酸ナトリウムｐＴ１１１．ｏ＋５ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ中入ズ±迭２Ｚ　許但釘ユ　４豆ハユ　ら胆収ユ［＾Ｓｐｔｍ、　５ｅｒ １１１１１．５ｅｒ２１″コアナログ　２８．７時間　１．８７時間　０．２５ 時間Ｃａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシン　２４時間　１．７１時間　０，４５時間 ［八ｓｐ”、　Ｃ１ｕ）％、　Ｓｅ、１０％、　Ｓｅ、２１１１アナログ　２１ ．５時間　１．４２時間　０．２０時間り、　０．０６Ｍリン酸ナトリウムｐＨ ９，０＋５麟Ｎ　ＥＤＴＡ中冬スカＷン７　Ｌ％佳葦ユ　持叱パユ　賃巧智及［ 八ｓｐ１％、　Ｓｅ、１６％、　Ｓｅｔ”−コアナログ　２７．４時間　１．７ ５時間　０．２３時間Ｃａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシン　２６．３時間　１．６ ８時間　０．３２時間［＾５ｐ）−Ｃ１ｕフ−５ｅｒ＋６＊、　Ｓｅ、２１１］ アナログ　１９．７時間　１．３６時間　０．１７時間以上、本発明の好適態様 について記載したが、変形及び改良が当業者に想到されることは理解されよう、 従って、本文中に記載した特定のカルシウム以外のカルシウム結合部位で残基を 置換しても同様に安定性を改良できることが予想される。＾５ｎ−Ｇｌｙ配列を 有する他の酵素及びこの配列を含む他のタンパク質で同様に置換すると安定性を 更に改良できるものと予想される。更に、本発明のスブチリシンアナログはいず れも参考資料として本発明の一部とする例えば米国特許第３７３２１７０号、３ ７４９６７１号及び３７９０４８２号に記載されているような洗剤配合物中の野 生型スブチリシンよりもすぐれた特性を有することが予想される。

更に、実用的な理由により多くの工業プロセスはほとんどの酵素の安定性温度範 囲よりも高い温度で実施される。

従って、本文中では洗剤用を強調したが、本発明の熱安定スブチリシンアナログ は従来安定なスブチリシンが必要とされている洗剤産業のような所定の産業に有 利であるのみならず、例えば固形スープの製造のための植物及び動物タンパク質 の加水分解のようにタンパク質を加水分解するための化学的手段を使用する産業 でも有用であり得る。

従って、本発明は請求の範囲に該当する限りこのようなあらゆる変形及び改良を 包含する。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　３ ＝ｅ６０＆４　ＤＮＡ −ＰＰ１”−２２ＤＮＡ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、　７ ３’　ｓ’ 国際調査報告 ＰＣＴ／ｌ、１ｓ８８１０１０３８ Ａ　ｔ　ｔ　ａ　Ｃｋｌ　ｍ　ｅ　ｎヒ　Ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ｐｃ’ｒ／工Ｓ入／ ２１０；　Ｐａｒｔ　工。

１Ｍｌ１１１ＲＩｌ１６Ｍａｌ　ａｅａ“＋ｅａ＋：ａｎ　）ｌ。　？Ｃ７１ｔ ＪＳ８ａ１０Ｉ０３ＢｌＲ１＃ｌ＋’ｎ＋１１１１ｎ１＾６″′・・ｆｉｌ・口 ”″　Ｐ（：”／Ｕｓ８１！／［１１０ｉ１！

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．（１）天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのカルシウム結合部位 に存在するアミノ酸の１個以上を、負の電荷を有するアミノ酸により置換させ、
2. （２）天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンの任意のＡｓｎ−Ｇｌｙ配 列の１個以上を欠失ヌは別のアミノ酸により置換させることにより修飾された天 然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓのアミノ酸配列を有することを特徴とするスブチ リシンアナログ。 ２．アナログがＣａｒｌｓｂｅｒｇスブチリシン、ＤＹスブチリシン、ＢＰＨ′ スブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓのａｐｒＡスブチリシン及 びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｕｓからのスブチリシンから選択さ れる天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアナログであることを特徴 とする請求項１に記載のスブチリシンアナログ。
3. ３．Ａｓｐ４１、Ｌｅｕ７５、Ａｓｎ７６、Ａｓｎ７７、Ｓｅｒ７８、Ｉｌｅ７ ９、Ｇｌｙ８０、Ｖａｌ８１、Ｔｈｒ２０８及びＴｙｒ２１４により表されるカ ルシウム結合部位のアミノ酸の１個以上が負の電荷を有するアミノ酸で置換され ていることを特徴とする請求項１に記載のスブチリシンアナログ。
4. ４．負の電荷を有するアミノ酸がＡｓｐ又はＣｌｕであることを特徴とする請求 項３に記載のスブチリシンアナログ。
5. ５．Ａｓｎ７６がＡｓｐ７６で置換されていることを特徴とする請求項４に記載 のスブチリシンアナログ。
6. ６．Ａｓｎ７７がＡｓｐ７７で置換されていることを特徴とする請求項４に記載 のスブチリシンアナログ。
7. ７．Ｉｌｅ７９がＧｌｕ７９で置換されていることを特徴とする請求項４に記載 のスブチリシンアナログ。
8. ８．Ａｓｎ７６がＡｓｐ７６で置換され且つＡｓｎ７７がＡｓｐ７７で置換され ていることを特徴とする請求項４に記載のスブチリシンアナログ。
9. ９．Ａｓｎ７６がＡｓｐ７６で置換され且つＩｌｅ７９がＣｌｕ７９で置換され ていることを特徴とする請求項４に記載のスブチリシンアナログ。
10. １０．Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列中のＡｓｎ残基が異なるアミノ酸の残基により置換さ れていることを特徴とする請求項１に記載のスブチリシンアナログ。
11. １１．該Ａｓｎ−Ｇｌｙ中のＡｓｎ残基が、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、 Ｇｌｕ及びＩｌｅから構成される群から選択されたアミノ酸の残基により置換さ れていることを特徴とする請求項１０に記載のアナログ。
12. １２．Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列中のＡｓｎ残基がＳｅｒにより置換されていることを 特徴とする請求項１１に記載のスブチリシンアナログ。
13. １３．１０９位のＡｓｐ残基がＳｅｒにより置換されていることを特徴とする請 求項１２に記載のスブチリシンアナログ。
14. １４．２１８位のＡｓｎ残基がＳｅｒにより置換されていることを特徴とする請 求項１２に記載のスブチリシンアナログ。
15. １５．１０９及び２１８位のＡｓｎ残基がＳｅｒにより置換されていることを特 徴とする請求項１２に記載のスブチリシンアナログ。
16. １６．［Ａｓｐ７６，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８］スブチリシン、［Ａｓｐ７ ７，Ｓｅ１０９，Ｓｅｒ２１８］スブチリシン、［Ｃｌｕ７９，Ｓｅｒ１０９， Ｓｅｒ２１８］スブチリシン、［Ａｓｐ７６，Ａｓｐ７７，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅ ｒ２１８］スブチリシン及び［Ａｓｐ７６，Ｇｌｕ７９，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ ２１８］スブチリシンから構成される群から選択されることを特徴とする請求項 １５に記載のスブチリシンアナログ。
17. １７．Ｂａｃｉｌｌｕｓスブチリシンが第１表に示した天然に産生するアミノ酸 配列を有していることを特徴とする請求項１に記載のスブチリシンアナログ。
18. １８．［Ａｓｐ７６，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８］スブチリシンであることを 特徴とする請求項１７に記載のスブチリシンアナログ。
19. １９．［Ａｓｐ７７，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８］スブチリシンであることを 特徴とする請求項１７に記載のスブチリシンアナログ。
20. ２０．［Ｇｌｕ７９，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８］スブチリシンであることを 特徴とする請求項１７に記載のスブチリシンアナログ。
21. ２１．［Ａｓｐ７６，Ａｓｐ７７，Ｓｅｒ１０９，Ｓｅｒ２１８］スブチリシン であることを特徴とする請求項１７に記載のスブチリシンアナログ。
22. ２２．［Ａｓｐ７６，Ｇｌｕ７９，Ｓｅｒ１０９，Ｓｃｒ２１８］スブチリシン であることを特徴とする請求項１７に記載のスブチリシンアナログ。
23. ２３．カルシウム結合部位及びＡｓｎ−Ｇｌｙ配列を含むアミノ酸配列を有する ＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアナログをコードするＤＮＡ配列であって、（ １）カルシウム結合部位におけるアミノ酸の１個以上をコードするコドンが欠失 しているか又は負の電荷を有するアミノ酸をコードするコドンにより置換されて おり、（２）Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列中のアミノ酸の１個以上をコードするコドンが 欠失しているか又は別のアミノ酸残基をコードするコドンにより置換されている ことを特徴とする前記ＤＨＡ配列。
24. ２４．カルシウム結合部位を有するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンの熱及びｐＨ 安定性を改良するための方法であって、カルシウム結合部位のアミノ酸残基を負 の電荷を有するアミノ酸で置換し、Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列中のアミノ酸の１個以上 を置換又は欠失させることを特徴とする前記方法。
25. ２５．洗剤配合物中に有効量の請求項１に記載のスブチリシンアナログを含有す ることを特徴とする組成物。
26. ２６．天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのカルシウム結合部位に存 在するアミノ酸の１個以上を、負の電荷を有するアミノ酸により置換させること により修飾された天然に産生するＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンのアミノ酸配列 を有することを特徴とするスブチリシンアナログ。