JP2001510037A - グラム陽性微生物からのプロテアーゼ - Google Patents

グラム陽性微生物からのプロテアーゼ

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JP2001510037A JP2000503190A JP2000503190A JP2001510037A JP 2001510037 A JP2001510037 A JP 2001510037A JP 2000503190 A JP2000503190 A JP 2000503190A JP 2000503190 A JP2000503190 A JP 2000503190A JP 2001510037 A JP2001510037 A JP 2001510037A
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エイ エステル，デイヴィッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明はグラム陽性微生物中の新たなセリンプロテアーゼの同定に関する。本発明は枯草菌セリンプロテアーゼＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５の核酸およびアミノ酸配列を提供する。本発明はまた、ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５をコード化する遺伝子の一部または全てが突然変異または欠失された宿主細胞を提供する。本発明はまた、酵素のような所望の異型タンパク質をコード化する核酸を含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明のセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の属する技術分野 本発明は、グラム陽性微生物由来のセリンプロテアーゼに関するものである。
本発明は、バチルス属中で同定されるセリンプロテアーゼ１、２、３、４および
５の核酸およびアミノ酸配列を提供する。本発明はまた、宿主細胞中でセリンプ
ロテアーゼ１、２、３、４および５を産生する方法、並びに本発明のセリンプロ
テアーゼの内の少なくとも一つの一部または全てが突然変異または欠失された宿
主細胞中で異型タンパク質を産生する方法を提供する。
【０００２】発 明 の 背 景 バチルス属の細菌のようなグラム陽性微生物は、一部には、それらの発酵産生
物の培地中への分泌能力のために、大規模な工業発酵に用いられてきた。グラム
陽性細菌において、分泌されたタンパク質は、細胞膜および細胞壁を横切って移
送され、続いて、通常それらの先天的なコンフォメーションを維持する外部培地
中に放出される。
【０００３】 様々なグラム陽性微生物が、それらの生活周期においていくつかの段階で細胞
外および／または細胞内プロテアーゼを分泌することが知られている。多くのプ
ロテアーゼは、産業目的のために大量に産生されている。グラム陽性微生物中に
プロテアーゼが存在することの否定的な面は、分泌された異型すなわち異種タン
パク質の全体的な分解に寄与することである。
【０００４】 微生物中に見られるプロテアーゼの分類は、それらの触媒機構に基づき、これ
は、以下の四つの群に分けられる：セリンプロテアーゼ；金属プロテアーゼ；シ
ステインプロテアーゼ；およびアスパラギン酸プロテアーゼ。これらの範疇は、
それらの様々な阻害剤に対する感受性により区別することができる。例えば、セ
リンプロテアーゼはフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）および
ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＩＦＰ）により阻害され；金属プロテ
アーゼはキレート剤により阻害され；システイン酵素はヨードアセタミドおよび
重金属により阻害され；アスパラギン酸プロテアーゼはペプスタチンにより阻害
される。セリンプロテアーゼはアルカリ性の最適ｐＨを有し、金属プロテアーゼ
は中性付近で最適に活性であり、システインおよびアスパラギン酸酵素は酸性の
最適ｐＨを有している（Biotechnology Handbooks, Bacillus. vol.2, edited b
y Harwood, 1989 Plenum Press, New York）。
【０００５】 触媒活性のセリン残基に依存しているタンパク質分解酵素は、セリンプロテア
ーゼと呼ばれている。Methods in Enxymology, vol.244, Academic Press, Inc. 1994, 21頁に記載されているように、科Ｓ９のセリンプロテアーゼは、その周 りのアミノ酸が保存された触媒残基三連構造「Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ」を有し
ている。
【０００６】発 明 の 概 要 本発明は、それぞれ、図に示した核酸およびアミノ酸を有する、ここではＳＰ
１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５と称される、枯草菌の特徴付けられて
いない翻訳されたゲノム核酸配列中に見られる現在まで知られていなかったまた
は認識されていなかったＳ９型の五つのセリンプロテアーゼの予期せぬ意外な発
見に関するものである。本発明は、一部には、それら五つのセリンプロテアーゼ
中のアミノ酸三連構造Ｓ−Ｄ−Ｈの存在、並びにこの三連構造の周りのアミノ酸
の保存に基づくものである。本発明はまた、一部には、ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３
、ＳＰ４およびＳＰ５が、酵母（ＤＡＰ）からのセリンプロテアーゼジペプチジ
ルアミノペプチダーゼＢに関してと、互いに関して有する現在まで特徴付けられ
ていないか、認識されていない全体のアミノ酸の関連性に基づくものである。
【０００７】 本発明は、ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５に関する単離したポ
リヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。遺伝暗号の縮重のために、本発
明は、それぞれ、図２Ａ−２Ｂから図６に示したＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ
４およびＳＰ５の推定アミノ酸配列をコード化する核酸配列を包含する。
【０００８】 本発明は、タンパク質分解活性を有する、ここに開示した枯草菌ＳＰ１、ＳＰ
２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５のアミノ酸変種を包含する。枯草菌ＳＰ１、Ｓ
Ｐ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５、並びにそのタンパク質分解活性アミノ酸変
種には、洗浄組成物における用途がある。本発明のある態様において、グラム陽
性微生物から得られるＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５は、微生物
宿主発現系において工業発酵規模で産生される。別の態様において、グラム陽性
微生物から得られる、単離され、精製された組換えＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、Ｓ
Ｐ４およびＳＰ５は、洗浄剤のような洗浄目的のために意図された材料の組成物
中に用いられる。したがって、本発明は、グラム陽性微生物から得られるＳＰ１
、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５の内の少なくとも一つを含む洗浄組成物
を提供する。セリンプロテアーゼは、洗浄組成物中で単独で、または他の酵素お
よび／または媒介物質またはエンハンサーと組み合わせて用いてもよい。
【０００９】 グラム陽性微生物中の所望の異型タンパク質またはポリペプチドの産生は、産
生された異型タンパク質またはポリペプチドを分解する一つ以上のプロテアーゼ
の存在により妨げられるかもしれない。したがって、本発明はまた、それらのタ
ンパク質分解活性を不活化させることになる、ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４
および／またはＳＰ５をコード化する遺伝子の一部または全ての突然変異または
欠失を、単独または、例えば、ａｐｒ、ｎｐｒ、ｅｐｒ、ｍｐｒのような他のプ
ロテアーゼ、または当業者に知られている他のプロテアーゼ中の欠失または突然
変異と共に有するグラム陽性微生物も包含する。本発明のある実施の形態におい
て、グラム陽性微生物は、バチルス属の細菌である。別の実施の形態において、
バチルス属は枯草菌である。
【００１０】 別の態様において、本発明のセリンプロテアーゼ中に一つ以上の欠失または突
然変異を有するグラム陽性微生物宿主は、さらに遺伝子操作されて、所望のタン
パク質を産生する。本発明のある実施の形態において、所望のタンパク質は、前
記グラム陽性宿主細胞に対して異型である。別の形態において、所望のタンパク
質は前記宿主細胞に対して相同である。本発明は、プロテアーゼのような相同タ
ンパク質をコード化する天然に存在する核酸の欠失または中断を有し、相同タン
パク質または組換え形態で再導入されたその変異株をコード化する核酸を有する
グラム陽性宿主細胞を包含する。別の実施の形態において、前記宿主細胞は相同
タンパク質を産生する。したがって、本発明はまた、グラム陽性微生物中で産生
される異型または相同のタンパク質の分解を減少させる方法および発現系であっ
て、前記異型タンパク質をコード化する核酸をバチルス属宿主細胞であって、Ｓ
Ｐ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５をコード化する遺伝子の内の少なく
とも一つの突然変異または欠失を含む宿主細胞を得て、該バチルス属宿主細胞を
、前記異型タンパク質の発現に適した条件下で増殖させる各工程を含む方法およ
び発現系を提供する。このグラム陽性微生物は、普通に、胞子形成性または非胞
子形成性であってもよい。
【００１１】 本発明は、枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５のグラム陽性
微生物相同体を検出する方法であって、枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４
およびＳＰ５をコード化する核酸の一部または全てを、ゲノムまたはｃＤＮＡ起
源いずれかのグラム陽性微生物由来の核酸とハイブリッド形成する工程を含む方
法を含む。
【００１２】 好ましい実施の形態の詳細な説明 定 義 ここに用いているように、バチルス属は、以下に限定されるものではないが、
枯草菌、B.licheniformis、B.lentus、B.brevis、B.stearothermophilus、B.alk
alophilus、B.amyloliquefaciens、B.coagulans、B.ciculans、B.lautusおよびB
.thuringiensisを含む、当業者に知られている全ての細菌を含む。
【００１３】 本発明は、グラム陽性微生物からの新たなＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４お
よびＳＰ５に関するものである。好ましい実施の形態において、グラム陽性微生
物はバチルス属である。別の好ましい実施の形態において、グラム陽性微生物は
枯草菌である。ここで用いているように、枯草菌ＳＰ１（ＹｕｘＬ）は、図１Ａ
−１Ｃおよび図２Ａ−２Ｂに示したＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を称し；ＳＰ
２（ＹｔｍＡ）は、図７Ａ−７Ｂおよび図３に示したＤＮＡおよび推定アミノ酸
配列を称し；ＳＰ３（ＹｉｔＶ）は、図８Ａ−８Ｂおよび図４に示したＤＮＡお
よび推定アミノ酸配列を称し；ＳＰ４（ＹｑｋＤ）は、図９Ａ−９Ｂおよび図５
に示したＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を称し；ＳＰ５（ＣＡＨ）は、図６に示
した推定アミノ酸配列を称する。本発明は、タンパク質分解活性を有する、ＳＰ
１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５の枯草菌アミノ酸配列のアミノ酸変種
を包含する。そのようなタンパク質分解アミノ酸変種は、洗浄組成物中に用いる
ことができる。
【００１４】 ここで用いているように、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
配列、およびその断面または部分、並びにセンサまたはアンチセンス鎖を示す、
二本鎖または一本鎖であってよい、ゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ
を称する。ここで用いているように、「アミノ酸」は、ペプチドまたはタンパク
質配列もしくはその部分を称する。「ポリヌクレオチド相同体」は、ここで用い
ているように、枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５に対して少
なくとも80％、少なくとも90％および少なくとも95％の同一性を有する、または
高ストリンジェンシーの条件下で枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４または
ＳＰ５に対してハイブリッド形成でき、セリンプロテアーゼ活性を有するアミノ
酸配列をコード化するグラム陽性微生物ポリヌクレオチドを称する。
【００１５】 「単離された」または「精製された」という用語は、ここで用いているように
、天然に関連している少なくとも一つの成分から除去された核酸またはアミノ酸
を称する。
【００１６】 ここに用いているように、「異型タンパク質」は、グラム陽性宿主細胞中では
天然に存在しないタンパク質またはポリペプチドを称する。異型タンパク質の例
としては、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、および
リパーゼのようなヒドロラーゼ；ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、
またはムターゼのようなイソメラーゼ；トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホ
スファターゼのような酵素が挙げられる。異型遺伝子は、増殖因子、サイトカイ
ン、配位子、受容体および阻害剤、並びにワクチンおよび抗体のような治療にお
いて重要なタンパク質またはペプチドをコード化してもよい。この遺伝子は、プ
ロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、
オキシダーゼおよびリパーゼのような、商業的に重要な工業用タンパク質または
ペプチドをコード化してもよい。関心のある遺伝子は、天然に存在する遺伝子、
突然変異した遺伝子または合成遺伝子であってもよい。
【００１７】 「相同タンパク質」は、グラム陽性宿主細胞中で先天的または天然に存在する
タンパク質またはポリペプチドを称する。本発明は、組換えＤＮＡ技術により相
同タンパク質を産生する宿主細胞を含む。本発明は、プロテアーゼのような相同
タンパク質をコード化する天然に存在する核酸の欠失または中断を有し、組換え
形態にある再導入された、相同タンパク質、またはその変異株をコード化する核
酸を有するグラム陽性宿主細胞を包含する。別の実施の形態において、宿主細胞
は相同タンパク質を産生する。
【００１８】 ここで用いているように、「過剰発現」は、宿主細胞中でのタンパク質の産生
を称する場合、タンパク質が、天然に存在する環境における産生よりも多量で産
生されることを意味する。
【００１９】 ここで用いているように、「タンパク質分解活性」という用語は、ペプチド結
合を加水分解できるタンパク質を意味する。タンパク質分解活性を有する酵素が
、Enzyme Nomenclature, 1992, edited Webb Academic Press, Inc.に記載され ている。
【００２０】 好ましい実施の形態の詳細な説明 枯草菌中のセリンプロテアーゼＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５
の予期せぬ発見により、宿主細胞を産生する原理、組換えにより産生された異型
タンパク質の分解を妨げるのに使用できる発現方法および発現系が提供される。
好ましい実施の形態において、宿主細胞は、天然に存在するセリンプロテアーゼ
における完全な欠失または不活化を有し、この突然変異が、タンパク質分解セリ
ンプロテアーゼ遺伝子産物の宿主細胞による産生を欠失または不活化することと
なるグラム陽性宿主細胞である。本発明の別の実施の形態において、宿主細胞を
さらに遺伝子操作して、所望のタンパク質またはポリペプチドを産生してもよい
。
【００２１】 どのような種類の宿主細胞を遺伝子操作して、グラム陽性セリンプロテアーゼ
ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５を産生することも望ましいであろ
う。そのような宿主細胞は、単離または精製され、洗浄剤のような洗浄製品に用
いられるセリンプロテアーゼを大量に産生する大規模発酵に用いられる。
【００２２】Ｉ．セリンプロテアーゼ核酸およびアミノ酸配列 図に示された配列を有するＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、およびＳＰ４ポリヌクレ
オチドが、枯草菌セリンプロテアーゼＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、およびＳＰ４を
コード化する。当業者により理解されるように、遺伝暗号の縮重のために、様々
なポリヌクレオチドが枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５をコ
ード化できる。本発明はそのようなポリヌクレオチドの全てを包含する。
【００２３】 本発明は、相同体がタンパク質分解活性を有するタンパク質をコード化する限
りは、枯草菌に対して少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくと
も95％の同一性を有する、それぞれ、グラム陽性微生物セリンプロテアーゼＳＰ
１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５をコード化するＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ
３、ＳＰ４およびＳＰ５ポリヌクレオチド相同体を包含する。
【００２４】 枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５のグラム陽性ポリヌクレ
オチド相同体は、例えば、クローニングされたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブ
ラリー」）、ゲノムＤＮＡライブラリーから、従来技術において知られている標
準的な方法により、一度同定された化学合成により、ｃＤＮＡクローニングによ
り、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡまたはその断片のクローニン
グにより得てもよい（例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd. Oxford, U.K. Vol. I,II.を参照のこと）。好まし い供給源は、ゲノムＤＮＡからのものである。ゲノムＤＮＡ由来の核酸配列は、
暗号領域に加えて、調節領域を含んでいてもよい。その供給源が何であれ、単離
されたセリンプロテアーゼ遺伝子は、その遺伝子の増殖に適したベクター中に分
子的にクローニングされるべきである。
【００２５】 ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡ断片が産生さ
れ、そのうちのいくつかが所望の遺伝子をコード化する。該ＤＮＡは、様々な制
限酵素を用いて特定の部位で分割されてもよい。あるいは、マンガンの存在下で
ＤＮアーゼを用いてＤＮＡを断片化してもよく、または該ＤＮＡを、例えば、超
音波処理により、物理的に剪断しても差し支えない。次いで、線状ＤＮＡ断片を
、以下に限定されるものではないが、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル
電気泳動並びにカラムクロマトグラフィーを含む、標準的な技術により、サイズ
にしたがって分離することができる。
【００２６】 一旦ＤＮＡ断片が産生されたら、ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ
５を含有する特定のＤＮＡ断片の同定を様々な方法で行ってもよい。例えば、本
発明の枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５遺伝子またはその特
定のＲＮＡ、もしくはプローブまたはプライマーのようなその断片を単離し、標
識付けし、次いで、ハイブリッド形成アッセイに用いて、グラム陽性ＳＰ１、Ｓ
Ｐ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５遺伝子を検出してもよい（Benton,W. and Da
vis,R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M.And Hogness,D., 1975, Proc.N
atl.Acad.Sci. USA 72:3961）。前記プローブと実質的な配列類似性を共有する それらのＤＮＡ断片は、ストリンジェント条件下でハイブリッド形成する。
【００２７】 したがって、本発明は、グラム陽性ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳ
Ｐ５ポリヌクレオチド相同体を検出する方法であって、枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、
ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５の核酸配列の一部または全てを、ゲノムまたはｃＤ
ＮＡ起源いずれかのグラム陽性微生物核酸とハイブリッド形成する工程を含む方
法を提供する。
【００２８】 また、中程度から最大のストリンジェンシーの条件下で枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２
、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５のヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成で
きるグラム陽性微生物ポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。ハイ
ブリッド形成条件は、ここで引用される、BergerおよびKimmel（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego CA）に教示されたように、核酸結合複合体の溶融温度（Ｔｍ ）に基づき、以下に説明されるように定義された「ストリンジェンシー」を与え
る。
【００２９】 「最大ストリンジェンシー」は典型的に約Ｔｍ−５℃（前記プローブのＴｍよ
り５℃低い）で生じ；「高ストリンジェンシー」はＴｍから約５℃から10℃低い
温度で生じ；「中程度ストリンジェンシー」はＴｍから約10℃から20℃低い温度
で生じ；「低ストリンジェンシー」はＴｍから約20℃から25℃低い温度で生じる
。当業者には理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリッド形成を用
いて、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出することができ、一方で、
中間または低ストリンジェンシーハイブリッド形成を用いて、ポリヌクレオチド
配列相同体を同定または検出することができる。
【００３０】 ここに用いている「ハイブリッド形成」は、「核酸の鎖が塩基対合により相補
鎖と結合するプロセス」を含む（Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnolog
y, Stockton Press, New York NY）。
【００３１】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において行われる増幅のプロセスが、Di
effenbach CW and GS Dveksler（1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Col
d Spring Harbor Press, Plainview NY）に記載されている。枯草菌ＳＰ１、Ｓ Ｐ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５からの少なくとも約10のヌクレオチドから約
60ほどの多くのヌクレオチドまで、好ましくは、約12から30までのヌクレオチド
、そしてより好ましくは、約20−25のヌクレオチドの核酸配列を、プローブまた
はＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【００３２】 枯草菌アミノ酸配列ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５（図２Ａ−
２Ｂから図６までに示された）を、枯草菌ゲノム核酸配列のＦＡＳＴＡ検索によ
り同定した。枯草菌ＳＰ１（ＹｕｘＬ）を、図２Ａ−２Ｂにおいて「dap2_yeast
」と称する、Ｓ９型セリンプロテアーゼとして分類されるセリンプロテアーゼＤ
ＡＰに対するその構造相同性により同定した。図２Ａ−２Ｂに示したように、Ｓ
Ｐ１は、示されたアミノ酸三連構造「Ｓ−Ｄ−Ｈ」を有している。各々の残基の
周りのアミノ酸の保存が、図２Ａ−２Ｂから図６までに示されている。ＳＰ２（
ＹｔｍＡ）；ＳＰ３（ＹｉｔＶ）；ＳＰ４（ＹｑｋＤ）およびＳＰ５（ＣＡＨ）
が、ＳＰ１（ＹｕｘＬ）に対するそれらの構造および全体のアミノ酸相同性によ
り同定された。ＳＰ１およびＳＰ４は、それぞれ、ParsotおよびKebayashiに記 載されたが、セリンプロテアーゼまたはＳ９科のセリンプロテアーゼとしては特
徴付けられなかった。
【００３３】II．発現系 本発明は、グラム陽性微生物における所望の異型または相同タンパク質の向上
した産生および分泌を行う宿主細胞、発現方法および発現系を提供する。ある実
施の形態において、宿主細胞は、それぞれの活性が欠失されるようにグラム陽性
ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５をコード化する遺伝子において欠
失または突然変異を有するように遺伝子操作されている。本発明の別の実施の形
態において、グラム陽性微生物は、本発明のセリンプロテアーゼを産生するよう
に遺伝子操作されている。
【００３４】 宿主細胞中のグラム陽性セリンプロテアーゼの不活性化 天然に存在するセリンプロテアーゼを産生できない発現宿主細胞を産生するに
は、その宿主細胞のゲノムからの前記天然に存在する遺伝子の置換および／また
は不活性化が必要である。好ましい実施の形態において、前記突然変異は非復帰
突然変異である。
【００３５】 グラム陽性セリンプロテアーゼをコード化する核酸を突然変異させる方法の一
つは、前記核酸またはその一部をクローニングし、部位特異的突然変異誘発によ
り該核酸を変異させ、その変異された核酸をプラスミド上で細胞中に再導入する
ことである。相同組換えにより、その変異された遺伝子を染色体中に導入しても
よい。親宿主細胞において、結果は、天然に存在する核酸および変異された核酸
は、染色体上で縦に並んで位置しているということである。二回目の組換え後、
変異した配列が、それによって親宿主細胞の後代のために染色体遺伝子中に突然
変異を効果的に導入した染色体中にとどまっている。
【００３６】 セリンプロテアーゼタンパク質分解活性を不活性化させる別の方法は、染色体
遺伝子コピーを欠失させることによるものである。好ましい実施の形態において
、全遺伝子が欠失され、この欠失は、復帰が不可能なように行われる。別の好ま
しい実施の形態において、前記染色体中に残された核酸配列が、プラスミドコー
ド化セリンプロテアーゼ遺伝子との相同組換えには短すぎる場合には、部分的欠
失が行われる。別の好ましい実施の形態において、触媒アミノ酸残基をコード化
する核酸が欠失される。
【００３７】 天然に存在するグラム陽性微生物セリンプロテアーゼの欠失は、以下のように
行っても差し支えない。その５’および３’末端領域を含むセリンプロテアーゼ
遺伝子を、単離し、クローニングベクター中に挿入する。このセリンプロテアー
ゼ遺伝子の暗号領域を、インビトロでベクターから欠失し、親宿主細胞中での天
然に存在する遺伝子との相同組換えを提供するのに十分な量の５’および３’末
端隣接配列を後に残す。次いで、このベクターをグラム陽性宿主細胞中に形質転
換させる。このベクターが隣接領域における相同組換えにより染色体中に組み込
まれる。この方法により、プロテアーゼ遺伝子が欠失されているグラム陽性株が
得られる。
【００３８】 組込み方法に用いられるベクターは、好ましくはプラスミドである。選択マー
カーを含めて、所望の組換え微生物の同定を容易にしてもよい。さらに、当業者
により正しく認識されるように、そのベクターは、好ましくは、染色体中に選択
的に組み込むことのできるものである。これは、複製の誘導性起源、例えば、温
度感受性起源を前記プラスミド中に導入することにより行っても差し支えない。
形質転換体を、前記複製の起源が感受性である温度で成長させることにより、そ
のプラスミドの複製機能が不活性化され、それによって、染色体の組込体を選択
する手段を提供する。組込体は、抗体物質のような選択マーカーの存在下で高温
での成長に関して選択してもよい。組込機構は、国際特許出願公開第WO88/06623
号に記載されている。
【００３９】 キャンベル型機構による組込は、プロテアーゼ遺伝子の５’末端隣接領域にお
いて生じて、セリンプロテアーゼ遺伝子座における染色体中の全プラスミドベク
ターを運搬するプロテアーゼ陽性株が得られる。非正統的組換えにより異なる結
果が得られるので、核酸塩基配列決定法または制限地図等により、完全な遺伝子
が欠失されているか否かを決定する必要がある。
【００４０】 天然に存在するセリンプロテアーゼ遺伝子を不活性化させる別の方法は、グラ
ム陽性微生物を、突然変異誘発性であるオリゴヌクレオチドにより形質転換する
ことにより染色体遺伝しコピーを突然変異誘発することである。あるいは、染色
体セリンプロテアーゼ遺伝子を、相同組換えにより突然変異遺伝子と置換しても
差し支えない。
【００４１】 本発明は、本発明のセリンプロテアーゼの欠失または突然変異並びにapr、pr 、epr、mprおよび当業者に知られている他のものにおける欠失または突然変異の
ような、追加のプロテアーゼ欠失または突然変異を有する宿主細胞を包含する。
米国特許第5,264,366号には、aprおよびnprが欠失されたバチルス属宿主細胞が 開示されており、米国特許第5,585,253号には、eprが欠失されたバチルス属宿主
細胞が開示されており、Margot et al., 1996, Microbiology 142:3437-3444に は、wprが欠失された宿主細胞が開示されており、欧州特許第0369817号には、mp
rが欠失されたバチルス属宿主細胞が開示されている。
【００４２】III．セリンプロテアーゼの産生 宿主細胞中でセリンプロテアーゼを産生するために、グラム陽性微生物ＳＰ１
、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５をコード化する核酸の少なくとも一つの
コピー、そして好ましくは多数のコピーを含む発現ベクターを、セリンプロテア
ーゼの発現に適した条件下で宿主細胞中に形質転換させる。本発明によれば、グ
ラム陽性微生物ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５もしくはそれらの
断片をコード化するポリヌクレオチド、または枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、
ＳＰ４またはＳＰ５のアミノ酸変異株をコード化する融合タンパク質またはポリ
ヌクレオチド相同体を用いて、宿主細胞中のそれらの発現を支持する組換えＤＮ
Ａ分子を産生してもよい。好ましい実施の形態において、前記グラム陽性宿主細
胞はバチルス属に属する。別の好ましい実施の形態において、前記グラム陽性宿
主細胞は枯草菌である。
【００４３】 当業者により理解されるように、自然に生じないコドンを有するポリヌクレオ
チド配列を産生することが好ましいであろう。特定のグラム陽性宿主細胞により
好まれるコドン（Murray E et al. (1989) Nuc Acids Res 17:477-508）を選択 して、例えば、発現速度を増大させたり、天然に存在する配列から産生された写
しよりも、長い半減期のような所望の特性を有する組換えＲＮＡ写しを産生する
ことができる。
【００４４】 本発明にしたがって用いてもよい変性されたＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４
またはＳＰ５ポリヌクレオチド配列は、それぞれ、同一または機能的に同等のＳ
Ｐ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５相同体をコード化するポリヌクレオ
チドとなる、異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換を含む。ここで用
いているように、「欠失」は、それぞれ、一つ以上のヌクレオチドまたはアミノ
酸配列がないヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化として定義されてい
る。
【００４５】 ここで用いているように、「挿入」または「添加」は、天然に存在するＳＰ１
、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５と比較して、それぞれ、一つ以上のヌク
レオチドまたはアミノ酸残基が添加されるこことなったヌクレオチドまたはアミ
ノ酸配列の変化を意味する。
【００４６】 ここで用いているように、「置換」は、それぞれ、異なるヌクレオチドまたは
アミノ酸により一つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が置き換えられたことに
より生じる。
【００４７】 コード化されたタンパク質は、サイレント変化を生じ、機能的なＳＰ１、ＳＰ
２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５変異株を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入また
は置換を示してもよい。変異株が分泌を変調する能力を保持している限りは、残
基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類
似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負に荷電した
アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電し
たアミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性価を有
する無荷電極性頭部基を有するアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリ
ン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン、フ
ェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
【００４８】 遺伝子産生物のクローニング、加工および／または発現を変調するために、本
発明のＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５ポリヌクレオチドを操作し
てもよい。例えば、従来技術でよく知られている技術、例えば、部位特異的突然
変異誘発を用いて、突然変異を導入して、例えば、新たな制限部位を挿入したり
、グリコシル化パターンを変性したり、コドン優先性を変更したりしてもよい。
【００４９】 本発明のある実施の形態において、グラム陽性微生物ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３
、ＳＰ４またはＳＰ５ポリヌクレオチドを異型配列にライゲーションして、融合
タンパク質をコード化してもよい。融合タンパク質を、セリンプロテアーゼヌク
レオチド配列と異型タンパク質配列との間に位置する分割部位を含むように操作
して、そのセリンプロテアーゼを分割し、異型部分から精製してもよい。
【００５０】VI．ベクター配列 グラム陽性微生物中で本発明のセリンプロテアーゼを発現させるのに用いられ
る発現ベクターは、ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５からなる群よ
り選択されるセリンプロテアーゼに関連する少なくとも一つのプロモータを含み
、このプロモータは宿主細胞中で機能的である。本発明のある実施の形態におい
て、前記プロモータは、選択されたセリンプロテアーゼのための野生型プロモー
タであり、本発明の別の実施の形態において、前記プロモータは、前記セリンプ
ロテアーゼとは異型性であるが、宿主細胞中においてまだ機能的である。本発明
のある好ましい実施の形態において、セリンプロテアーゼをコード化する核酸は
、微生物ゲノム中に安定に組み込まれる。
【００５１】 好ましい実施の形態において、発現ベクターは、好ましくは、該ベクターに特
有の少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む多数のクローニング部
位カセットを含んで、核酸操作を容易にする。好ましい実施の形態において、ベ
クターはまた、一つ以上の選択マーカーを含む。ここに用いているように、選択
マーカーは、ベクターを含有する宿主の選択を容易にする、グラム陽性宿主中で
発現できる遺伝子を称する。そのような選択マーカーの例としては、以下に限定
されるものではないが、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クラムフェニコ
ールおよびテトラサイクリンのような抗生物質が挙げられる。
【００５２】Ｖ．形質転換 ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５の産生に、細菌、菌類、ほ乳類
および昆虫細胞を含む、様々な宿主細胞を用いることができる。一般的な形質転
換方法が、Current Protocols In Molecular Biology（vol.1, edited by Ausub
el et al., John Wiley & Sons, Inc. 1987, Chapter 9）に教示されており、リ
ン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストランを用いた形質転換およびエレクトロ
ポレーションを含む。植物形質転換法が、Rodriquez（WO95/14099, published 2
6 May 1995）に教示されている。
【００５３】 好ましい実施の形態において、宿主細胞はグラム陽性微生物であり、別の好ま
しい実施の形態においては、宿主細胞はバチルス属である。本発明のある実施の
形態において、本発明の一つ以上のセリンプロテアーゼをコード化する核酸が、
バチルス属宿主細胞内で複製できる発現ベクターを介して、宿主細胞中に導入さ
れる。バチルス属の適切な複製プラスミドが、ここに引用されている、Molecula
r Biologial Methods for Bacillus, Ed. Harwood and Cutting, John Wiley & Sons, 1990に記載されている（プラスミドについてのchapter 3を参照のこと） 。枯草菌の適切な複製プラスミドが92頁に列記されている。
【００５４】 別の実施の形態において、本発明のセリンプロテアーゼをコード化する核酸が
、微生物ゲノム中に安定に組み込まれる。好ましい宿主細胞はグラム陽性宿主細
胞である。別の好ましい宿主はバチルス属である。別の好ましい宿主は枯草菌で
ある。いくつかの計画が、バチルス属中でのＤＮＡの直接クローニングに関する
文献に記載されている。プラスミドマーカーレスキュー形質転換には、部分的に
相同なレジデントプラスミドを運搬するコンピテント細胞による供与体プラスミ
ドの摂取が含まれる（Contente et al., Plasmid 2:555-571 (1979); Haima et
al., Mol.Gen.Genet. 223:185-191 (1990); Weinrauch et al., J.Bacteriol. 1
54(3):1077-1087 (1983); and Weinrauch et al., J.Bacteriol. 169(3):1205-1
211 (1987)）。入ってきた供与体プラスミドは、染色体形質転換と似たプロセス
においてレジデント「ヘルパー」プラスミドの相同領域と再結合する。
【００５５】 原形質体形質転換による形質転換が、枯草菌についてはChang and Cohen,(197
9)Mol.Gen.Genet 168:111-115に；B.metateriumについてはVorobjeva et al., (
1980) FEMS Microbiol.Letters 7:261-263に；B.amyloliquefaciensについてはS
mith et al., (1986) Appl.and Env.Microbiol. 51:634に；B.thuringiensisに ついてはFisher et al., (1981) Arch.Microbiol. 139:213-217に；B.sphaericu
sについてはMcDonald (1984) J.Gen.Microbiol. 130:203に；そしてB.larvaeに ついてはBakhiet et al., (1985) 49:577に記載されている。バチルス属原形質 体の形質転換についてのMann et al.,（1986, Current Microbiol. 13:131-135 ）およびHolubova（1985, Folia Microbiol. 30:97）の報告書には、リポソーム
を含有するＤＮＡを用いてＤＮＡを原形質体中に導入する方法が開示されている
。
【００５６】VI．形質転換体の同定 宿主細胞が、グラム陽性ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５をコー
ド化する突然変異されたまたは天然に存在する遺伝子により形質転換されている
場合、マーカー遺伝子発現の存在／不在の検出が、関心のある遺伝子が存在する
か否かを示すことができる。しかしながら、その発現は、確認すべきである。例
えば、セリンプロテアーゼをコード化する核酸がマーカー遺伝子配列中に挿入さ
れている場合、挿入物を含有する組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によ
り同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子を、一つのプロモータの制
御下でセリンプロテアーゼをコード化する核酸と縦に並んで配置しても差し支え
ない。誘導または選択に反応するマーカー遺伝子の発現は、通常、同様にセリン
プロテアーゼの発現を示す。
【００５７】 あるいは、セリンプロテアーゼの暗号配列を含有し、そのタンパク質を発現す
る宿主細胞は、当業者に知られている様々な方法により同定してもよい。これら
の方法としては、以下に限定されるものではないが、核酸またはタンパク質の検
出および／または定量のための膜ベース、溶液ベース、またはチップベースの技
術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成およびタンパ
ク質生物検定または免疫学的検定技術が挙げられる。
【００５８】 セリンポリヌクレオチド配列の存在は、枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ
４またはＳＰ５のプローブ、部分または断片を用いた、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成または増幅により検出することができる。
【００５９】VII．プロテアーゼ活性の検定 プロテアーゼ活性を検出し、測定する様々な検定法が当業者に知られている。
フォーリン法を用いて比色によりまたは280ｎｍでの吸光度として測定されたカ ゼインまたはヘモグロビンからの酸溶性ペプチドの放出に基づく検定法がある（
Bergmeyer et al., 1984, Methods of Enzymatic Analysis vol:5, Peptidase,
Proteinases and their Inhibitors, Verlag Chemie, Weinheim）。他の検定法 としては、色素基質の可溶化が挙げられる（Ward, 1983, Proteinases, in Micr
obial Enzymes and Biotechnology (W.M. Fogarty, ed.), Applied Science, Lo
ndon, pp.251-317）。
【００６０】VIII．組換えタンパク質の分泌 グラム陽性宿主細胞中で異型または相同タンパク質の分泌のレベルを測定し、
分泌されたタンパク質を検出する手段には、そのタンパク質に特異的な多クロー
ン性または単クローン性抗体のいずれかを使用することが含まれる。そのような
例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩ
Ａ）および蛍光励起細胞分離法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらと他の検定法
が、とりわけ、Hampton R et al.（1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN）およびMaddox DE et al.（1983, J Exp Med 1
58:1211）に記載されている。
【００６１】 様々な標識および接合技術が、当業者に知られており、様々な核酸およびアミ
ノ酸検定法に使用することができる。特定のポリヌクレオチド配列を検出するた
めの標識ハイブリッド形成またはＰＣＲプローブを産生する手段としては、オリ
ゴラベリング、ニックトランスレーション、末端標識または標識ヌクレオチドを
用いたＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ヌクレオチド配列、またはそのうち
のある部分を、ｍＲＮＡプローブの産生のためにベクター中にクローニングして
もよい。そのようなベクターは、従来技術で知られており、市販されており、Ｔ
７、Ｔ３またはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチ
ドを添加することにより、インビトロでＲＮＡプローブを合成するのに用いても
よい。
【００６２】 ファーマシアバイオテック（Pharmacia Biotech: ニュージャージー州、ピス キャタウェイ）、プロメガ（Promega:ワイオミング州、マジソン）、およびユー
エスバイオケミカル社（US Biochemical Corp:オハイオ州、クリーブランド）の
ような多くの会社が、これらの方法のための市販のキットおよび実験計画を供給
している。適切なリポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光
剤、化学発光剤、または色素剤並びに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子等が挙げ
られる。このような標識の使用を教示している特許としては、米国特許第3,817,
837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437 号、同第4,275,149号および同第4,366,241号が挙げられる。また、組換え免疫グ
ロブリンも、ここに引用する米国特許第4,816,567号に示したように産生しても よい。
【００６３】IX．タンパク質の精製 異型または相同タンパク質をコード化するポリヌクレオチド配列で形質転換さ
れたグラム陽性宿主細胞を、細胞培地からコード化されたタンパク質の発現およ
び回収に適した条件下で培養してもよい。セリンプロテアーゼ活性の突然変異ま
たは欠失を含む組換えグラム陽性宿主細胞により産生されたタンパク質を培地中
に分泌させる。他の組換え構成物が、前記異型または相同ポリヌクレオチド配列
を、溶性タンパク質の精製を促進させるポリペプチドドメインをコード化するヌ
クレオチド配列に結合させてもよい（Kroll DJ et al. (1993) DNA Cell Biol 1
2:411-53）。
【００６４】 そのような精製促進ドメインとしては、以下に限定されるものではないが、固
定化された金属上で精製できるヒスチジン−トリプトファンモジュールのような
金属キレート化ペプチド（Porah J (1992) Protein Expr Purif 3:263-281）、 固定化された免疫グロブリン上で精製できるタンパク質Ａドメイン、およびＦＬ
ＡＧＳ延長／親和性精製系に用いられるドメイン（イミュネックス社:Immunex C
orp, ワシントン州、シアトル）が挙げられる。精製ドメインと異型タンパク質 との間の因子ＸＡまたはエンテロキナーゼ（インビトロゲン: Invitrogen,カリ フォルニア州、サンディエゴ）のような分割可能なリンカー配列を含めて、精製
を促進させても差し支えない。
【００６５】Ｘ．本発明の使用 遺伝子操作された宿主細胞 本発明は、タンパク質分解活性が減少したまたは完全に欠失するようにＳＰ１
、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５をコード化する天然に存在する遺伝子中
に好ましくは非復帰性突然変異または欠失を含む遺伝子操作された宿主細胞を提
供する。この宿主細胞は、米国特許第5,264,366号に開示された成熟中性プロテ アーゼおよび／または成熟サブチリシンプロテアーゼの欠失のような、追加のプ
ロテアーゼ欠失を含んでもよい。
【００６６】 好ましい実施の形態において、宿主細胞はさらに、所望のタンパク質またはポ
リペプチドを産生するように遺伝子操作されている。好ましい実施の形態におい
て、宿主細胞はバチルス属である。別の好ましい実施の形態において、宿主細胞
は枯草菌である。
【００６７】 別の実施の形態において、宿主細胞は、グラム陽性ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、
ＳＰ４またはＳＰ５を産生するように遺伝子操作されている。好ましい実施の形
態において、該宿主細胞は、大規模発酵条件下で成長させられ、前記ＳＰ１、Ｓ
Ｐ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５が単離および／または精製され、洗浄剤のよ
うな洗浄組成物中で用いられる。洗浄剤配合物が、国際特許出願公開第WO95/106
15号に開示されている。本発明のセリンプロテアーゼは、様々な洗浄組成物を配
合するのに有用である。様々な既知の化合物が、本発明のセリンプロテアーゼを
含む組成物中に有用な適切な界面活性剤である。これらの例としては、米国特許
第4,404,128号および同第4,261,868号に開示されているような、非イオン、陰イ
オン、陽イオン、陰イオンまたは両性イオン洗浄剤が挙げられる。適切な洗浄剤
組成物は、米国特許第5,204,015号の実施例７に記載されているものである。従 来技術では、洗浄組成物として使用できる異なる配合物がよく知られている。さ
らに、本発明のシステインプロテアーゼを、例えば、バーソープまたは液体石鹸
用途、皿洗い配合物、コンタクトレンズ洗浄溶液または製品、ペプチド加水分解
、水処理、織物用途、タンパク質製品中の融合分割酵素等に使用することができ
る。本発明のセリンプロテアーゼは、洗浄剤組成物中において向上した性能を提
供するであろう（別の洗浄剤プロテアーゼと比較して）。ここに用いているよう
に、洗浄剤における向上した性能は、標準的な洗濯周期の後の通常の評価により
決定されるように、草または血液のようなある酵素感受性のしみの増大した洗浄
力として定義される。
【００６８】 本発明のセリンプロテアーゼを、約0.01重量％から約５重量％までのレベルで
（好ましくは、0.1％から0.5％まで）6.5から12.0までのｐＨを有する既知の粉 末または液体洗浄剤に配合することができる。これらの洗浄剤組成物は、既知の
プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはエンドグリコシダーゼ
、並びにビルダーおよび安定剤を含んでも差し支えない。
【００６９】 セリンプロテアーゼを従来の洗浄組成物に加えることにより、どのような特別
の用途限定も生じない。言い換えれば、ｐＨが上述した範囲内にあり、温度が記
載したセリンプロテアーゼ変性温度未満である限りは、前記洗浄剤に適したどの
ような温度およびｐＨも本発明の組成物に適している。さらに、セリンプロテア
ーゼは、単独で、またはビルダーおよび安定剤と組合せのいずれかで、洗浄剤を
含まずに洗浄組成物中に用いても差し支えない。
【００７０】 本発明のある態様は、本発明のセリンプロテアーゼを含む織物の処理用の組成
物である。この組成物を用いて、例えば、RD216,034、欧州特許第134,267号、米
国特許第4,533,359号、および欧州特許第344,259号のような公報に記載されてい
るような絹または羊毛を処理しても差し支えない。
【００７１】 プロテアーゼは、米国特許第5,612,055号、同第5,314,692号および同第5,147,
642号に記載されているように、動物用飼料の添加物の一部として動物用飼料に 含まれても差し支えない。
【００７２】ポリヌクレオチド 枯草菌ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５ポリペプチド、またはそ
のいずれかの部分が、ハイブリッド形成技術およびＰＣＲ技術によりグラム陽性
微生物ポリヌクレオチド相同体の存在を検出する原理を提供する。
【００７３】 したがって、本発明のある態様は、グラム陽性ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ
４またはＳＰ５もしくはそれらの部分をコード化するゲノムおよびｃＤＮＡを含
む、ポリヌクレオチド配列を検出するのに使用できる核酸ハイブリッド形成およ
びＰＣＲプローブを提供する。
【００７４】 本発明を実施する様式および方法は、以下の実施例を参照して、当業者によっ
てより完全に理解されるであろう。それらの実施例は、本発明の範囲または特許
請求の範囲をいかようにも制限することを意図したものではない。
【００７５】 実施例１ ゲノムライブラリーの調製 以下の実施例は、バチルス属ライブラリーの調製を説明するものである。
【００７６】 バチルス属細胞からのゲノムＤＮＡを、Current Protocols In Molocular Bio
logy vol.1, edited by Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. 1987, chap
ter 2.4.1に教示されたように調製する。一般的に、飽和液体培地からのバチル ス属細胞を溶解させ、プロテイナーゼＫによる消化によりタンパク質を除去する
。細胞壁デブリ、多糖類、および残りのタンパク質を、ＣＴＡＢによる選択的沈
殿により除去し、高分子量のゲノムＤＮＡを、イソプロパノール沈殿により得ら
れた上澄みから回収する。特別に透明なゲノムＤＮＡが望ましい場合には、塩化
セシウム勾配でバチルス属ゲノムＤＮＡを精製する追加の工程を加える。
【００７７】 精製したゲノムＤＮＡを得た後、このＤＮＡにSar3A消化を施す。Sar3Aは、４
つの塩基対ＧＡＴＣを認識し、いくつかの都合よいファージラムダおよびコスミ
ドベクターに適合する断片を産生する。前記ＤＮＡに部分的消化を施して、無作
為の断片を得る機会を増やす。
【００７８】 部分的に消化されたバチルス属ゲノムＤＮＡに、ベクター中へのクローニング
前に１％アガロースゲル上でのサイズ分別を行う。あるいは、スクロース勾配上
でのサイズ分別を用いても差し支えない。このサイズ分別工程から得られたゲノ
ムＤＮＡをアガロースから精製し、宿主細胞中に使用するのに適したクローニン
グベクター中にライゲーションし、この宿主細胞中に形質転換する。
【００７９】 実施例II グラム陽性微生物の検出 以下の実施例は、グラム陽性微生物ＳＰ１の検出を説明するものである。同一
の方法を用いて、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５を検出することができる
。
【００８０】 グラム陽性微生物由来のＤＮＡを、Current Protocols in Molecular Biology
, Chap.2 or 3に開示された方法にしたがって調製する。この核酸に、ＳＰ１由 来のプローブまたはプライマーによるハイブリッド形成および／またはＰＣＲ増
幅を施す。好ましいプローブは、保存されたアミノ酸残基を含有する核酸部分を
含む。
【００８１】 核酸プローブを、50ピコモルの核酸および250ｍＣｉの［ガンマ３２Ｐ］アデ ノシン三リン酸（イリノイ州、シカゴのアメルシャム社）およびＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（マサチューセッツ州、ボストンのデュポンＮＥＮ（登録商標）
）を組み合わせることにより標識付ける。標識付けられたプローブを、セファデ
ックスＧ−２５超微細樹脂カラム（ファーマシア）で精製する。ゲノムまたはｃ
ＤＮＡ起源いずれかの核酸試料の典型的な膜ベースのハイブリッド形成分析に、
各々毎分10７カウントを含有する部分を用いる。
【００８２】 制限エンドヌクレアーゼ消化を施したＤＮＡ試料を、0.7％のアガロースゲル 上で分別し、ナイロン膜に移す（ニューハンプシャー州、ダーハムのNytran Plu
s, Schleicher & Schuell）。ハイブリッド形成を、40℃で16時間に亘り行う。 非特異的シグナルを除去するために、続いて、0.1×食塩クエン酸ナトリウムお よび0.5％のドデシル硫酸ナトリウムまでの増大したストリンジェント条件下に おいて室温でブロットを洗浄する。ブロットを数時間に亘りフイルムに露出し、
そのフイルムを現像し、ハイブリッド形成パターンを視覚的に比較して、枯草菌
ＳＰ１のポリヌクレオチド相同体を検出する。この相同体に確認のための核酸塩
基配列決定を行う。核酸塩基配列決定の方法が、従来技術においてよく知られて
いる。従来の酵素的方法では、ＤＮＡポリメラーゼクレノー断片であるSEQUENAS
E（登録商標）（オハイオ州、クリーブランドのユーエスバイオケミカル社）ま たはＴａｑポリメラーゼを用いて、関心のあるＤＮＡテンプレートにアニールし
たオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡ鎖を延長する。
【００８３】 上述した説明および実施例の様々な他の例および変更は、本発明の精神および
範囲から逸脱せずにこの開示を読んだ後には当業者にとって明確であり、そのよ
うな例または変更は添付した特許請求の範囲内に含めることが意図される。ここ
に参照した全ての出版物および特許が、完全にここに引用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ−１Ｃは、ＳＰ１（ＹＵＸＬ）のＤＮＡ（配列番号１番）および推定ア
ミノ酸配列（配列番号２番）を示している。
【図２】 図２Ａ−２Ｂは、ＳＰ１（ＹＵＸＬ）のＤＡＰ（dap_yeast）（配列番号３番 ）とのアミノ酸配列の整合を示している。図２Ａ−２Ｂ、３および４に関して、
アミノ酸三連構造Ｓ−Ｄ−Ｈが示されている。
【図３】 図３は、ＳＰ１（ＹＵＸＬ）（配列番号２番）のＳＰ２（ＹＴＭＡ）（配列番
号５番）とのアミノ酸配列の整合を示している。
【図４】 図４は、ＳＰ１（ＹＵＸＬ）（配列番号２番）のＳＰ３（ＹＩＴＶ）（配列番
号７番）とのアミノ酸配列の整合を示している。
【図５】 図５は、ＳＰ１（ＹＵＸＬ）（配列番号２番）のＳＰ４（ＹＱＫＤ）（配列番
号９番）とのアミノ酸配列の整合を示している。
【図６】 図６は、ＳＰ１（ＹＵＸＬ）（配列番号２番）のＳＰ５（ＣＡＨ）（配列番号
１０番）とのアミノ酸配列の整合を示している。
【図７】 図７Ａ−７Ｂは、ＳＰ２（ＹＴＭＡ）（配列番号５番）のＤＮＡ（配列番号４
番）および推定アミノ酸配列を示している。
【図８】 図８Ａ−８Ｂは、ＳＰ３（ＹＩＴＶ）（配列番号７番）のＤＮＡ（配列番号６
番）および推定アミノ酸配列を示している。
【図９】 図９Ａ−９Ｂは、ＳＰ４（ＹＱＫＤ）（配列番号９番）のＤＮＡ（配列番号８
番）および推定アミノ酸配列を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/56 (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA07 BA80 CA02 CA09 DA07 EA03 EA06 GA11 HA13 HA14 4B050 DD02 LL04 4B065 AA01X AA15X AA15Y AC14 AC20 BA02 CA24 CA27 4H003 EC02

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５からなる群よ
    り選択されたセリンプロテアーゼをコード化する遺伝子の一部または全てが突然
    変異または欠失されたグラム陽性微生物であって、該突然変異または欠失により
    、前記ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４またはＳＰ５のタンパク質分解活性が不
    活性化されることを特徴とするグラム陽性微生物。
  2. 【請求項２】 バチルス属の細菌であることを特徴とする請求項１記載のグ
    ラム陽性微生物。
  3. 【請求項３】 前記細菌が、B.licheniformis、B.lentus、B.brevis、B.ste
    arothermophilus、B.alkalophilus、B.amyloliquefaciens、B.coagulans、B.cic
    ulans、B.lautusおよびB.thuringiensisからなる群より選択されることを特徴と
    する請求項２記載の微生物。
  4. 【請求項４】 前記微生物が異型タンパク質を発現できることを特徴とする
    請求項１記載の微生物。
  5. 【請求項５】 前記異型タンパク質が、ホルモン、酵素、増殖因子およびサ
    イトカインからなる群より選択されることを特徴とする請求項４記載の微生物。
  6. 【請求項６】 前記異型タンパク質が酵素であることを特徴とする請求項５
    記載の微生物。
  7. 【請求項７】 前記酵素が、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、およびリパ
    ーゼ；ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、またはムターゼのようなイ
    ソメラーゼ；トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼからなる群よ
    り選択されることを特徴とする請求項６記載の微生物。
  8. 【請求項８】 ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５からなる群よ
    り選択される少なくとも一つのセリンプロテアーゼを含む洗浄組成物。
  9. 【請求項９】 ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５からなる群よ
    り選択されるセリンプロテアーゼをコード化する核酸を含む発現ベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 バチルス属宿主細胞中で異型タンパク質を産生する方法で
    あって、 (a) 前記異型タンパク質をコード化する核酸を含み、セリンプロテアーゼ１ 、セリンプロテアーゼ２、セリンプロテアーゼ３、セリンプロテアーゼ４および
    セリンプロテアーゼ５をコード化する遺伝子の内の少なくとも一つが突然変異ま
    たは欠失されたバチルス属宿主細胞を得て、 (b) 該バチルス属宿主細胞を、前記異型タンパク質の発現に適した条件下で 増殖させる、 各工程を含むことを特徴とする方法。
  12. 【請求項１２】 前記バチルス属宿主細胞が、枯草菌、B.licheniformis、B
    .lentus、B.brevis、B.stearothermophilus、B.alkalophilus、B.amyloliquefac
    iens、B.coagulans、B.ciculans、B.lautusおよびB.thuringiensisからなる群よ
    り選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記バチルス属宿主細胞が、ａｐｒ、ｎｐｒ、ｅｐｒ、ｗ
    ｐｒおよびｍｒｐをコード化する遺伝子の内の少なくとも一つが突然変異または
    欠失されていることを特徴とする請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 セリンプロテアーゼ１、セリンプロテアーゼ２、セリンプ
    ロテアーゼ３、セリンプロテアーゼ４およびセリンプロテアーゼ５からなる群よ
    り選択されるセリンプロテアーゼをコード化する遺伝子の内の少なくとも一つが
    突然変異または欠失されているグラム陽性微生物。
  15. 【請求項１５】 ａｐｒ、ｎｐｒ、ｅｐｒ、ｗｐｒおよびｍｒｐをコード化
    する遺伝子の内の少なくとも一つが突然変異または欠失されていることを特徴と
    する請求項１４記載の微生物。
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