JP2001503641A - バシラス細胞のサーファクチン突然変異株におけるポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、以下の：（ａ）バシラス細胞の突然変異株を培養し、この場合、（ｉ）突然変異株は、ポリペプチドの産生を促す条件下で、ポリペプチドをコードする一次核酸配列とサーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または分泌に関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾を含有する二次核酸配列とを包含し、そして（ｉｉ）突然変異株は、同一条件下で培養された場合、バシラス細胞より少ないサーファクチンまたはそのアイソフォームを産生し；ならびに（ｂ）ポリペプチドを培地から単離する；工程からなるポリペプチドの製造方法に関する。本発明は、バシラス細胞の突然変異株、および突然変異株の製造方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 バシラス細胞のサーファクチン突然変異株におけるポリペプチドの製造方法 産業上の利用分野 本発明は、バシラス（Bacillus）細胞の突然変異株におけるポリペプチドの製 造方法、バシラス細胞の突然変異株の獲得方法およびバシラス細胞の突然変異株 に関する。 関連技術の説明 サーファクチン（Surfactin）は、バシラス属の数種により主に増殖の定常期 中に産生される顕著な界面活性を有する環状リポペプチドである（Carswell et al.，1994，Applied Microbiology and Biotechnology 41:281-285;Lin et al. ，1994，Applied and Environmental Microbiology 60:31-38;Morikawa et al. ，1992，Journal of Fermentation and Bioenginnering 74:255-261;Arima et a 1.，1968，Biochemical Biophysical Research Communications 31:488-494）。 このリポペプチドは、脂肪酸のカルボキシ基とグルタミン酸のアミノ基との間の アミド結合、および最後のＬｅｕのカルボキシル基と脂肪酸のヒドロキシル基と の間のエステル結合を介して３−ヒドロキシ−１３−メチルーテトラデカン酸と 結合する７個のアミノ酸L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leuを含有す る。炭素数１３、１４および１５の脂質鎖長を有する一連の同族体（Hosono and Suzuki，1983，Journal of Antibiotics 36:667-673;Razafindralambo et al. ，1993，Journal of Chromatography 639:81-85）、ならびに第７または第４番 目のアミノ酸が異なる［Ｖ ａ１７］−、［Ｉｌｅ７］−および［Ａｌａ４］−サーファクチンと呼ばれるア イソフォームが知られている（Peypoux et al.，1994，European Journal of Bi ochemistry 224:89-96;Baugmart et al.，1991，Biochemical Biophysical Rese arch Communications 177:998-1005）。 ｓｒｆオペロンによりコードされる多酵素複合体（multienzynecomplex）は、 伝えられる所では、いわゆるチオ鋳型（thiotemplate）メカニズムによるサーフ ァクチンの非リボソーム的生合成に関与する。オペロンは、少なくとも４個の遺 伝子ｓｒｆＡ、ｓｒｆＢ、ｓｒｆＣおよびｓｒｆＤを含有する。遺伝子ｓｒｆＡ 、ｓｒｆＢ、ｓｒｆＣおよびｓｒｆＤは、かつてはそれぞれｓｒｆＡＡ、ｓｒｆ ＡＢ、ｓｒｆＡＣおよびｓｒｆＡＤとして知られていた。ｓｒｆＡ、ｓｒｆＢお よびｓｒｆＣは、各々がサーファクチンを産生するためのサーファクチン基質ア ミノ酸の活性化に必要な１つ又はそれ以上のアミノ酸活性化ドメインを含有する サーファクチンシンセターゼサブユニットをコードする（van Sinderen et al. ，1993，Molecular Microbiology 8:833-841;Nakano and Zuber，1989，Journal of Bacteriology 8:821-831;Cosmina et al.，1993，MolecularMicrobiology 8 :821-831）。多酵素複合体は、３つの別々のタンパク質上に群生する７つの大型 ドメイン中に組織化される（Menkhaus et sl.，1993，Journal of Biological C hemistry 268:7678-7684;Gulli et al.，Biochemicaet Biophysica Acta 1205:1 9-28）。７つのドメインは、サーファクチンの７個のアミノ酸の活性化および結 合に関与する。チオ鋳型メカニズムにしたがって、特定のアミノ酸のアデニル化 および結合は対応するアミノ酸活性化ドメインで起こり、その過程は補因子４− ホスホパンテテインを必要とする。その後のトランス−チオエステル化反応によ り増殖ペプチド鎖を 生じ、その水準は多酵素サブユニットの空間配置により確定される。脂肪酸部分 がいつ、どのようにペプチドと結合し、どのようにしてエステル結合が形成され て分子環を作るのかは、現在は不明である。さらに、遺伝子ｓｒｆはサーファク チンの発現（分泌）に関与すると考えられる（Nakano et al.,1992,Molecular G eneral Genｅｔｉｃｓ２３２・３１３−３２３）。 バシラスは、元のタンパク質および組換えタンパク質の産生のための宿主細胞 系として確立されている。しかしながら、タンパク質発現および分泌の増大とい う望ましい特性を有するバシラス宿主が、必ずしも発酵がうまく行くための最も 望ましい特性を有するとは限らない。特に、発酵は、バイオマスが増大すると発 泡が増大するために、最適というわけではない。発泡が増大すると、発酵の生産 性が限定される。 したがって、商業的量のタンパク質の発現能力と、迅速増殖性および低発泡性 で、それにより発酵生産性を増強するといった申し分ない発酵特性とを併有する 改良型バシラス属宿主を提供することが、本発明の目的である。 本発明の要約 本発明は、（ａ）バシラス細胞の突然変異株を培養し、この場合、（ｉ）突然 変異株は、ポリペプチドの産生を促す条件下で、ポリペプチドをコードする一次 核酸配列とサーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または分泌に関与 する少なくとも１つの遺伝子の修飾を含有する二次核酸配列とを含み、そして（ ｉｉ）突然変異株は、同一条件下で培養された場合、バシラス細胞より少ないサ ーファクチンまたはそのアイソフォームを産生し；そして（ｂ）ポリペプチドを 培地から単離する、工程を含んでなるポリペプチドの 製造方法に関する。 本発明は、バシラス細胞の突然変異株およびバシラス細胞の突然変異株の獲得 方法にも関する。 図面の簡単な説明 図１は、ｐＳｈｖ２の制限酵素地図を示す。 図２は、ｐＳＪ３２００の制限酵素地図を示す。 図３は、ｐＳＪ２６６２の制限酵素地図を示す。 図４は、ｐＳＪ２８８２−ＭＣＳにおけるａｍｙＱプロモーター−ａｍｙＭ遺 伝子融合の構築を示す。 図５は、ｐＰＬ２４１９の制限酵素地図を示す。 図６は、ｐＣＡｓｕｂ２の制限酵素地図を示す。 図７は、ｐＢＡＮ−ＮＯＶの制限酵素地図を示す。 図８は、ｐＰＬ２５４１−ｔｅｔの制限酵素地図を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、（ａ）バシラス細胞の突然変異株を培養し、この場合、（ｉ）突然 変異株は、ポリペプチドの産生を促す条件下で、サーファクチンまたはそのアイ ソフォームの生合成または分泌に関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾、例え ば破壊によるバリサス細胞に関し、そして（ｉｉ）突然変異株は、同一条件下で 培養された場合、バシラス細胞より少ないサーファクチンまたはそのアイソフォ ームを産生し，そして（ｂ）ポリペプチドを培地から単離する、工程を含んでな るポリペプチドの製造方法に関する。 「サーファクチン」という用語は、炭素数１３〜１５の種々の鎖長を有する直 鎖または分枝鎖ｂ−ヒドロキシ脂肪酸に結合されるアミノ酸配列L-Glu-L-Leu-D- Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leuを有する 環状リポペプチドと、本明細書中では定義される。「アイソフォーム」という用 語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されたサー ファクチンの変異体、例えば［Ｖａｌ７］−、［Ｉｌｅ７］−および［Ａｌａ４ ］−サーファクチンと定義される。 本発明の方法では、バシラス細胞は、野生型バシラス細胞またはその突然変異 株である。本発明の実施に有用なバシラス細胞としては、バシラス・アルカロフ ィルス（Bacillusa lkalophilus）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bac illusamyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス（Bacillusbrevis）、バシラス ・サーキュランス（Bacilluscirculans）、バシラス・コアギュランス（Bacillu scoagulans）、バシラス・ファームス（Bacillus firmus）、バシラス・ラウッ ス（Bacillus lautus）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・ リケンホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウム（Bacill us megaterium）、バシラス・プミルス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステ アロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・ズブチリス （Bacillus subtilis）およびバシラス・チュリンジエンシス（Bacillus thurin giensis）の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様で は、バシラス細胞はデンプン液化バシラス・アミロリクエファシエンス、バシラ ス・レンタス、バシラス・リケニホルミス、バシラス・ステアロサーモフィルス またはバシラス・ズブチリスの細胞である。さらに好ましい実施態様では、バシ ラス細胞はバシラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＡＴＣＣ ６０５１ま たは６０５１Ａ、あるいはバシラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＮＣＦ Ｂ ７３６（ＮＣＤＯ ７３６）である。 バシラス細胞の突然変異株は、挿入または欠失に関する当業界で周知の方法を 用いてサーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または分泌に関与する １つ又はそれより多くの遺伝子の発現を低減または除去することにより構築され 得る。例えば、遺伝子に対して相同性の核酸断片を含有する組込みプラスミドを 遺伝子に挿入することにより、遺伝子の１つを中断することができ、これは相同 領域の重複を作り、そして重複領域間にベクターＤＮＡを導入するものである。 これは、挿入されたベクターが遺伝子のプロモーターをコード領域から分離する かまたは非機能性遺伝子生成物が生じる様にコード配列を中断する場合には、遺 伝子発現を除去することができる。さらに、サーファクチンまたはそのアイソフ ォームの生合成または分泌に関与する１つ又はそれ以上の遺伝子の発現に必要な または有益な１つ又はそれより多くの制御配列、例えばプロモーターを修飾する ことができる。あるいは、遺伝子発現は、遺伝子変換の方法により（例えば、Ig lesias and Trautner，1983，Molecular General Genetics 189:73-76参照）、 または遺伝子置換により低減または除去され得る。後者の方法では、遺伝子の突 然変異されたバージョンは、選択マーカーと関連して、非複製または温度感受性 プラスミド上に導入される。プラスミドの組込みのための選択は、プラスミドを 複製させない条件下でマーカーを選択することにより実行される。遺伝子置換を 導く第二の組換え事象についての選択は、選択マーカーの損失および突然変異し た遺伝子の獲得についてのコロニーの検査により実行される（例えば、Perego， 1993，In A.L.Sonneshein，J.A．Hoch，and R.Losick，editors，Bacillus subt ilisandOtherGram-Positive Bacteria，Chapter 42，American Society of Micr obiology，Washington，D.C.,1993参照）。さらに、サーファクチンの生合成ま たは分泌に関与する１つ又はそれより 多くの遺伝子の発現の低減または除去は、当業界で周知の方法を用いた無作為突 然変異誘発により成し遂げられ、その方法としては、転位（trans position）お よび化学的突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。 バシラス細胞の突然変異株は、サーファクチンの変異体またはアイソフォーム を産生するためにも構築され得る。変異体またはアイソフォームは、変異体が非 発泡性であるか、または界面活性低減を示すという点で、その元の天然源から単 離されたペプチドと異なる。サーファクチンの生合成に関与する１又は複数の遺 伝子の核酸配列の修飾は、当業界で周知の方法、例えばアミノ酸特異性の変化を 伴うペプチド合成及び変化したアミノ酸配列を有するペプチドの生産をコードす るハイブリッド遺伝子の構築をもたらすドメインコード領域の交換により成し遂 げられる（例えば、Stachelhaus et al.,1995，Science 269:60-72参照）。本発 明のさらに別の局面では、アミノ酸置換は、ＳｅｒとＡｌａとの置換のようなサ ーファクチン陰性表現型を付与し得る（D'Souza et al.，1993，Journal of Bac teriology 175:3502-3510;Vollenbroich et al.，1993，FEBS Letters 325:220- 224;Stachelhaus et al.，1995，上記）。類似の核酸配列は、生来のサーファク チン分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を生じるヌクレオチド置換の導 入により、サーファクチンリポペプチドの生合成に関与する遺伝子の核酸配列を 基礎にして構築され得る。ヌクレオチド置換の一般的説明に関しては、例えば、 Ford et al.，1991，Protein Expression and Purification2:95-107を参照され たい。 このような置換が、分子の機能に重要な領域の内外で成され得る、ということ は当業者には明らかである。ペプチドの界面活性特性に必須のアミノ酸残基は、 当業界で公知の手法、例えば部位特定突 然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発により同定され得る（例え ば、Cunningham and Wells，1989，Science 244:1081-1085参照）。後者の技法 では、突然変異は分子中のすべての残基に誘発され、そしてその結果生じる突然 変異体分子は界面活性に関して試験されて、分子の活性に重要なアミノ酸残基が 同定される。 本発明の方法では、サーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または 分泌に関与するバシラス細胞のあらゆる遺伝子が修飾され得る。例えば、遺伝子 は、ｓｒｆオペロンのあらゆる遺伝子、例えばｓｒｆＡ、ｒｆＢ、ｒｆしいおよ びｓｒｆＤである。あるいは、遺伝子ｓｆｐが修飾され得る。 本発明のさらに別の局面では、分子環を作るために脂肪酸部分をペプチドと結 合するのに、またはエステル結合を形成するのに関与する遺伝子（１または複数 ）は、バシラス細胞が発泡特性を欠くようにさせる修飾の対象であり得る。 本発明のさらに別の局面では、バシラス細胞の突然変異株はさらに、ポリペプ チドの生成、回収または適用に有害なその他の遺伝子の欠失または挿入を含有し 得る。例えば、好ましい実施態様では、バシラス細胞はプロテアーゼ欠損細胞で あり得る。別の好ましい実施態様では、バシラス細胞は、例えばｓｐｏＩＩＡＣ における欠失のために、胞子を生じない。ポリペプチドの生成、回収または適用 に有害なその他の遺伝子、例えばａｍｙＥ遺伝子も欠失され得る。 本発明の方法では、本発明の突然変異株は、ポリペプチドの産生を促す条件下 で培養した場合、非発泡性または発泡低減特性を有する。本発明のバシラス細胞 の突然変異株により産生されるサーファクチンリポペプチドのレベルは、当業界 で周知の方法を用いて決定し得る（例えば、Ohno et al.，1995，Biotechnology and Bioengiｎｅｅｒｉｎｇ 47:209-214およびGrossman et al.，1993，Journa l of Ba cteriology 175:6203-6211参照）。突然変異株細胞は、同一産生条件下で培養し た場合に、対応する親バシラス細胞よりも好ましくは少なくとも約２５％少ない 、さらに好ましくは少なくとも約５０％少ない、さらに好ましくは約７５％少な い、そして最も好ましくは少なくとも約９５％少ないサーファクチンリポペプチ ドを産生する。突然変異株細胞は、同一産生条件下で培養した場合に、対応する 親バシラス細胞よりも好ましくは少なくとも約２５％多い、さらに好ましくは少 なくとも約５０％多い、さらに好ましくは約７５％多い、そして最も好ましくは 少なくとも約９５％多いポリペプチドを産生する。 細胞は、当業界で既知の方法を用いて、ポリペプチドの産生に適した栄養培地 中で培養される。例えば、細胞は、適切な培地中で、ポリペプチドを発現および ／または単離させ得る条件下で、実験室での浸透フラスコ培養、小規模または大 規模発酵（連続、バッチ、供給バッチまたは固体発酵を含む）により、または工 業的発酵器中で培養され得る。培養は、当業界で既知の手法を用いて、炭素およ び窒素供給源ならびに無機塩を含有する適切な栄養培地中で行われる。適切な培 地は、商業的供給元から入手可能であり、または発表された（例えば、アメリカ 培養細胞コレクションのカタログの）組成物により調製され得る。分泌されたポ リペプチドは、培地から直接回収され得る。 ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な当業界で既知の方法を用いて検出さ れ得る。このような検出方法としては、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、 酵素基質の消失、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられる。例えば、酵素検定を用 いて、ポリペプチドの活性を決定し得る。酵素活性を決定するための手法は、多 数の酵素に関して当業界で既知である。 生じるポリペプチドは、当業界で既知の方法により単離され得る。例えば、ポ リペプチドは、従来の手法により栄養培地から単離され、その手法としては、遠 心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈澱が挙げられるが、これらに限定 されない。単離されたポリペプチドは次に、種々のクロマトグラフィー法、例え ばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティ ークロマトグラフィー等により精製され得る。 ポリペプチドは、当業界で既知の種々の手法により精製され、その例としては 、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマ トフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分離用等電点電気 泳動（ＩＥＦ））、差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出（ 例えば、Protein Purification，J．-C．Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，１９８９参照）が挙げられるが、これらに限定されない 。 ポリペプチドは、任意のポリペプチドであり得る。さらにポリペプチドは、バ シラスにとって生来的なものでもよく、異種性のものでもよい。「ポリペプチド 」という用語は、特定長のコードされた生成物を示すことを本明細書中では意味 せず、したがってペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を包含する。「ポ リペプチド」という用語は、コードされた生成物を生成するために組合される２ 以上のポリペプチドをも包含する。ポリペプチドは、１つ又はそれより多くがバ シラス細胞に対して異種であり得る少なくとも２つの異なるポリペプチドから得 られる部分的または完全ポリペプチド配列の組合せを含んで成るハイブリッドポ リペプチドも含む。ポリペプチドはさらに、前記のポリペプチドおよびハイブリ ッドポリペプチドの天然対立遺伝子変異体および工学的処理変体を含む。 好ましくは、ポリペプチドはホルモン、ホルモン変異体、酵素、受容体または その一部、抗体またはその一部、あるいはレポーターである。さらに好ましい実 施態様では、ポリペプチドはオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒド ロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼまたはリガーゼである。さらにもっと好まし い実施態様では、ポリペプチドはアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒド ラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチ ナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌク レアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グル コアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラ ッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分 解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパ ク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼ である。 本発明の方法では、バシラス細胞の突然変異株は、異種ポリペプチドをコード する核酸配列を含む組換え細胞であり、これはポリペプチドの組換え産生に有益 に用い得る。細胞は、好ましくは異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む ベクターでトランスフェクトされ、その後染色体中にベクターを組み込む。「形 質転換」とは、ベクターが染色体組込物として、または自己複製細胞外ベクター として保持されるように、二次核酸配列を含有するベクターを宿主細胞中に導入 することを意味する。組込みは一般に、核酸配列が細胞中で安定して保持される と思われるので、有益であると考えられる。ベクターの染色体中への組込みは、 相同組換え、非相同組換えまたは転位により起こる。 異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、あらゆる原核細胞供 給源、真核細胞供給源またはその他の供給源、例えば古細菌に由来する。本発明 の目的のために、「〜に由来する」という用語は、所与の供給源とともに本明細 書中で用いられる場合、ポリペプチドがその供給源によりまたはその供給源から の遺伝子が挿入された細胞により産生されることを意味する。 本発明の方法では、バシラス細胞の突然変異株は、バシラス細胞にとって生来 的であるポリペプチドの組換え体産生のためにも用いられる。生来のポリペプチ ドは、例えばポリペプチドをコードする遺伝子を異なるプロモーターの制御下に 置いてポリペプチドの発現を増強し、シグナル配列の使用により細胞外への当該 の生来のポリペプチドの輸送を促進し、そしてバシラス細胞により普通に産生さ れるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増大することにより、組換え 的に産生され得る。本発明は、「異種ポリペプチド」の用語の範囲内で、このよ うな発現がバシラス細胞にとって生来的でない遺伝的要素の使用、または宿主細 胞中で普通には起きない方法で機能するよう操作された生来の要素の使用を伴う 程度までの、同種性ポリペプチドの組換え体産生も包含する。 異種ポリペプチドをコードする核酸配列を単離またはクローン化するために用 いられる技法は当業界で既知であり、その例としてはゲノムＤＮＡからの単離、 ｃＤＮＡからの調製またはそれらの組合せが挙げられる。このようなゲノムＤＮ Ａからの核酸配列のクローニングは、例えば周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）を用いることにより実行され得る（例えば、Innis et al.，1990，PCR Prot ocols:A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York参照） 。クローニング法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する所望の核酸 断片の切出しおよび単離、断片のベクター分子への挿入、そして組換え体ベクタ ーのバシラス細胞中への 組入れを含むが、この場合、核酸配列の多重コピーまたはクローンが複製される 。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源の配列またはそれ らのあらゆる組合せのものである。 本発明の方法では、異種ポリペプチドは、別のポリペプチドがポリペプチドま たはその断片のＮ末端またはＣ末端で融合した融合ポリペプチドも含むであろう 。融合ポリペプチドは、あるポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一 部）を別のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）に融合するこ とにより産生される。融合ポリペプチドの製造方法は当業界で既知であり、融合 ポリペプチドの発現が同一プロモーター（１または複数）およびターミネーター の制御下にある様に、ポリペプチドをコードするコード配列をリーディグフレー ム内に連結することを含む。 「核酸構築物」とは、天然遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ自 然に存在しない方法で組合され、そして並置された核酸のセグメントを含有する よう修飾された、一本鎖または二本鎖の核酸分子、と本明細書では定義される。 核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要なすべ ての制御配列を含有する場合には、発現カセットと同義である。「コード配列」 という用語は、本明細書中で用いる場合、前記の制御配列の制御下に置かれると 、ｍＲＮＡに転写され、本発明のポリペプチドに翻訳される配列である。コード 配列の境界は一般に、５‘末端の翻訳開始コドンＡＴＧと３’末端の翻訳停止コ ドンにより確定される。コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換え核 酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。 ポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、種々の方法で操作されてポ リペプチドの発現を提供し得る。ベクターに挿入する前の核酸配列の操作は、発 現ベクターに依存して、望ましいかまた は必要である。クローニング法を用いる核酸配列の修飾技法は、当業界で周知で ある。 ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する核酸構築物は、制御配列と適合 可能な条件下でバシラス細胞の突然変異株中でのコード配列の発現を指令し得る １つ又は複数の制御配列に作用可能に連結され得る。 「制御配列」という用語は、核酸配列のコード配列の発現に必要なまたは有益 なすべての成分を含むよう、本明細書では定義される。各制御配列は、ポリペプ チドをコードする核酸配列にとって生来的な、または外来のものである。このよ うな制御配列としては、リーダー、ブロモーター、シグナル配列および転写ター ミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列はプ ロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、特異的 制限部位を導入するためにリンカーを備えて、制御配列とポリペプチドをコード する核酸配列のコード領域との連結を促し得る。 制御配列は適切なプロモーター配列、即ち核酸の発現のためにバシラス細胞に 認識される核酸配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒 介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、特定のバシラス細胞中で転写 活性を示すあらゆる核酸配列であり、そしてバシラス細胞と同種のまたは異種の 細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。特にバシラ ス細胞における本発明の核酸構築物の転写を指図するのに適したプロモーターの 例は、大腸菌ｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コエリコラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バシラス・ズブチリス（Bacillu s subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バシラス・リケニホルミス （Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バシラス・ステアロサー モフィラス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成アミラーゼ遺伝子 （ａｍｙＭ）、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefac iens）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バシラス・リケニホルミス（Bacill us licheniformis）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、枯草菌ｘｙ１Ａおよび ｘｙ１Ｂ遺伝子そして原核細胞β−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモータ ー（Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731）、ならびにｔａｃプロモーター（DeBoer et al.， 1983，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 80:21-25）であ る。さらに別のプロモーターがScientificAmerican，1980，242:74-94，“Usefu l proteins from recombinant bacteria”およびSambrook et al.，1989（上記 ）に記載されている。 制御配列はまた、適当な転写ターミネーター、すなわちバシラス細胞により認 識される、転写の停止のための配列である。ターミネーター配列はポリペプチド をコードする核酸配列の３’末端に作用可能に連結される。バシラス細胞中で機 能するあらゆるターミネーターを本発明において選択して使用することができる 。 制御配列は、バシラス細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領 域である適切なリーダー配列でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコ ードする核酸配列の５’末端に作用可能に連結される。特定のバシラス細胞中で 機能的であるあらゆるリーダー配列が、本発明に用い得る。 発現ポリペプチドを細胞の分泌経路に向け得るポリペプチドのアミノ末端に結 合されるアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域でもあり得る。 シグナルペプチドコード領域は本発明の ポリペプチドにとって生来的であるかまたは外来供給源から得られる。核酸配列 のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域の セグメントと翻訳読取り枠を合わせて自然に連結されたシグナルペプチドコード 領域を本来的に含有し得る。あるいは、コード配列の５’末端は、分泌されるポ リペプチドをコードするコード配列の部分に対して外来性であるシグナルペプチ ドコード領域を含有し得る。外来シグナルペプチドコード領域は、コード配列が シグナルペプチドコード領域を通常含有しない場合に必要とされ得る。あるいは 、外来シグナルペプチドコード領域は、コード配列と通常関連する生来のシグナ ルペプチドコード領域に比べてポリペプチドの分泌増強を得るために、単に生来 のシグナルペプチドコード領域に取って代わり得る。シグナルペプチドコード領 域は、バシラス種からのアミラーゼまたはプロテアーゼ遺伝子から得られる。し かしながら、発現されたポリペプチドを特定のバシラス細胞の分泌経路に向け得 るあらゆるシグナルペプチドコード領域が、本発明に用い得る。 バシラス細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、バシラスＮＣＩＢ １ １８３７からのマルトース生成アミラーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフ ィルス（Bacillus stearothermophilus）α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・リ ケニホルミス（Bacillus licheniformis）ズブチリシン遺伝子、バシラス・リケ ニホルミスβ−ラクタマーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフィルス中性プ ロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および枯草菌ｐｒｓＡ遺伝 子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらに別のシグナルペプチ ドは、Simone and Palva，1993，Microbiological Reviews 57:109-137に記載さ れている。 本発明の方法では、核酸配列、プロモーター、ならびに転写およ び翻訳停止シグナルを包含する組換え体発現ベクターが、ポリペプチドの組換え 体産生のために用いられる。前記の種々の核酸および制御配列は一緒に連結され て、このような部位でのポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を 可能にする１つ又は複数の便利な制限部位を含み得る組換え体発現ベクターを産 生し得る。あるいは、核酸配列は、核酸配列またはその配列を含有する核酸構築 物を発現のために適切なベクター中に挿入することにより、発現され得る。発現 ベクターを作製するに際しては、コード配列は、コード配列が発現のためにそし ておそらくは分泌のために適切な制御配列と作用可能に連結されるように、ベク ター中に置かれる。 組換え体発現ベクターは、組換えＤＮＡ法を都合よく施され、核酸配列の発現 を引き起こし得るあらゆるベクターである。ベクターの選択は、典型的には、ベ クターとベクターが導入されるバシラス細胞との適合性による。ベクターは、線 状または閉環状プラスミドである。ベクターは、自律複製ベクター、即ち染色体 外実体として存在し、その複製が染色体の複製とは無関係なベクター、即ちプラ スミド、染色体外素子、ミニ染色体または人工染色体である。ベクターは、自己 複製を保証するためのあらゆる手段を含有し得る。あるいは、ベクターは、バシ ラス細胞中に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（ １または複数）と一緒に複製されるものであり得る。ベクターは、単一ベクター またはプラスミド、あるいはバシラス細胞のゲノム中に導入される全ＤＮＡを一 緒に含有する２つまたはそれ以上のベクターまたはプラスミド、あるいはトラン スポゾンであり得る。 ベクターは、バシラス細胞中に導入されると、バシラス細胞ゲノム中に組み込 まれる。組込みに関しては、ベクターはポリペプチド、または相同組換えによる ゲノム中へのベクターの安定組込みのた めのベクターのあらゆるその他の素子をコードする核酸配列に頼る。あるいは、 ベクターは、バシラス細胞のゲノム中への相同組換えによる組込みを指図するた めの付加的核酸配列を含有し得る。付加的核酸配列は、染色体中の正確な位置で バシラス細胞ゲノム中にベクターが組み込まれるようにし得る。正確な位置での 組込みの可能性を増大するために、組込み要素は、好ましくは８００〜１，５０ ０塩基対、さらに好ましくは４００〜１，５００塩基対、最も好ましくは８００ 〜１，５００塩基対といった十分な数の核酸を含有する必要があり、これは相同 組換えの可能性を増強するために対応する標的配列と高度に相同である。組込み 要素は、バシラス細胞のゲノム中の標的配列と相同なあるあらゆる配列であり得 る。さらに、組込み要素は、非コードまたはコード核酸配列であり得る。 自律複製に関しては、ベクターは、問題のバシラス細胞中でベクターを自律的 に複製させる複製起点をさらに包含する。細菌の複製起点の例は、大腸菌中での 複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およ びｐＡＣＹＣ１８４、ならびにバシラス中での複製を可能にするｐＵＢ１１０、 ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。複製の起点は 、バシラス細胞中でのその機能を温度感受性にさせるための突然変異を有してい てもよい（例えば、Ehrlich，1978，Proceedings ofthe National Academy of S ciences USA75:1433参照）。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の１つより多いコピーがバシラス 細胞中に挿入されて、核酸配列の発現を増幅し得る。核酸配列の安定増幅は、当 業界で周知の方法を用いて配列の少なくとも１つの追加コピーをバシラス細胞ゲ ノム中に組込み、そして形質転換体に関して選択することにより得られる。ゲノ ムＤＮＡ配列の増幅を達成するのに便利な方法は、ＷＯ９４／１４９６８に記載 されている。 ベクターは、好ましくは、形質転換細胞を容易に選択させ得る１つ又はそれ以 上の選択マーカーを含有する。選択マーカーは、その生成物が殺生物耐性、重金 属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性等を提供する遺伝子である。細菌 選択マーカーの例は、バシラス・ズブチリスまたはバシラス・リケニホルミス（ Bacillus licheniformis）からのｄａｌ遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマ イシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性 のような抗生物質耐性を付与するマーカーである。さらに、選択は、例えばＷＯ ９１／０９１２９に記載されているような同時形質転換により達成され得る。こ の場合の選択マーカーは別々のベクター上にある。 前記の要素を連結して本発明の組換え体発現ベクターを構築するために用いら れる手法は、当業者には周知である（例えば、Sambrook et al.，1989，上記、 参照）。 バシラス細胞の形質転換は、例えばプロトプラスト形質転換（例えば、Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168:111-115参照）により、コ ンピテント細胞（例えば、Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriolog y 81:823-829またはDubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecula r Biology 56:209-221参照）を用いて、エレクトロポレーション（例えば、Shig ekawa and Dower，1988，Biotechniques 6:742-751参照）により、または接合（ 例えば、Koehler and Thorne，1987 Journal of Bacteriology169:5271-5278参 照）により実行され得る。 以下の実施例により本発明をさらに説明するが、それらは本発明の範囲を限定 するものではない。 実施例 プライマーおよびオリゴ体はすべて、メーカーの使用説明書にしたがって、Ap plied Biosystems Model 394合成機（Applied Biosystems，Inc.，Foster City ，CA）で合成した。 実施例１：バシラス・ズブチリスドナーＢＷ１５４株の構築 数個の遺伝子（ｓｐｏＩＩＡＣ、ａＰｒＥ、ｎＰｒＥ、ａｍｙＥおよびｓｒｆ Ｃ）を、本明細書中に記載のバシラス・ズブチリス（Bacillus subtillis）Ａ１ ６４（ＡＴＣＣ ６０５１Ａ）および１６３０（ＮＣＦＢ ７３６）宿主株中で 欠失させた。この仕事を成し遂げるために、これらの遺伝子の欠失型を含有する プラスミドを、ｐＬＳ２０−媒介接合系（conjugntien system）を用いて、これ らの株に導入した（Koehler and Thorne，1987，上記）。要するに、これらの系 はｐＬＳ０と呼ばれる大型プラスミドを含有するバシラス・ズブチリス「ドナー 」株で構成される。ｐＬＳ２０は、ｐＬＳ２０をバシラス・ズブチリスの「レシ ピエント」株中に可動化するのに必要な機能をコードする。さらに、ｐＵＢ１１ ０およびｐＢＣ１６のようなプラスミドはこの接合系（ｐＬＳ２０の存在下での ）によっても可動化される。これらのプラスミドは、シス−作用領域（ｏｒｉＴ ）と、ｏｒｉＴＶとして作用しこれらのプラスミドのレシピエント株への可動化 を促すトランス−作用機能をコードする遺伝子（ｏｒｆ−β）とを含有する。ド ナー株がｐ１ｓ２０と、ｐＵＢ１１０またはｐＢＣ１６のどちらかを含有する場 合（この場合、ｏｒｆ−β機能はトランスで提供される）には、ｏｒｉＴのみを 含有するプラスミドも可動化され得る。 ｐＬＳ２０プラスミドまたはｐＸＯ５０３のような誘導体（Koehler and Thor ne，1987，上記）は、株が熟達した（proficient）ドナーであるためには存在し なければならない。さらに、接合完了後にドナー株に対する対抗選択（counter selection）の手段を有する のも望ましい。非常に「クリーン」（バックグラウンドなし）で且つ実行が容易 な対抗選択法が開発された。これは、ドナー株にｄａ１遺伝子（細胞壁合成に必 要なＤ−アラニンラセマーゼ酵素をコードする）の欠失を導入し、Ｄ−アラニン （このアミノ酸は、バシラス・ズブチリスのｄａｌ株が増殖するために、外から 培地に付加されねばならない）を欠く固体培地上での接合実験からの細胞混合物 を増殖させることによりドナー株に対して選択することを包含する。 前記の遺伝子を欠失するために、遺伝子の欠失型およびｏｒｉＴ配列を含有す るｐＥ１９４レプリコン（エリスロマイシン耐性）（Gryczan et al.，1982，Jo urnalofBacteriology152:722-735）を、バシラス・ズブチリスＡ１６４およびＡ １６３０株中に可動化されねばならなかった。適切なドナー株は、以下の特徴を 有するべきである：１）ｄａｌ遺伝子における欠失（対抗選択のために）、およ び２）それはｐｌｓ２０（ｐＥ１９４レプリコンがエリスロマイシン選択により 保持されねばならず且つｐＸＯ５０３はすでにこの抗生物質に耐性を付与してい るために、ｐＸＯ５０３は、この場合には適切でない）、ならびにｐＵＢ１１０ またはｐＢＣ１６のどちらかを含有して、ｏｒｆ−β機能をトランスで提供しな ければならない。バシラス・ズブチリスＢＷ１５４がドナー株としてどのように 構築されるかを以下に説明する。 （Ａ）バシラス・ズブチリスＢＷ９６を産生するためのバシラス・ ズブチリスにおけるｄａｌ欠失の導入 先ず、野生型バシラス・ズブチリス細胞は接合過程中に他種のバシラスを実際 に殺し、この殺す力はｂａｃ−１−である細胞では非常に低下するということが 従来示されていたために、ｂａｃ−１遺伝子に突然変異（この突然変異はジペプ チド抗生物質バシリシンを 合成する株の能力をなくする）を有するバシラス・ズブチリスの株を選択した。 したがって、ドナー株はすべて、ｂａｃ−１バックグラウンドで構築されている 。 適切なドナー株を構築する場合の第一工程は、ｂａｃ−１が存在するバシラス ・ズブチリス１Ａ７５８株（Bacillus Stock Center，Columbus，OH）中のｄａ ｌ遺伝子の一部を欠失することであった。細菌染色体上で野生型ｄａｌ遺伝子と 交換され得るｄａｌ遺伝子の欠失型は、in vitroで構築された。ｄａｌ遺伝子の ５’および３’部分は、遺伝子の５’部分（ヌクレオチド１９−４１９、ＡＴＧ コドンのＡが＋１である）を増幅するためにプライマー１および２を、遺伝子の ３’部分（ヌクレオチド６１８−１０３７）を増幅するためにプライマー３およ び４を用いてＰＣＲ増幅した。 増幅反応（１００μｌ）は以下の成分を含有した：２００ｎｇのバシラス・ズ ブチリス１６８染色体ＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、各々２００μＭのｄ ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液、 ならびに１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。Pitcher等（1989，Letters in Ap plied Microbiology 8:151-156）の手法にしたがって、バシラス・ズブチリス１ ６８染色体ＤＮＡを得た。以下の条件下で反応を実施した：９５℃で３分間、次 に９５℃で１分、５０℃で１分そして７２℃で１分 を各々３０回、その後７２℃で５分間。反応生成物は、アガロースゲル電気泳動 により分析した。５’及び３’末のＰＣＲ生成物を、メーカーの使用説明書にし たがって、ＴＡクローニングキット（Invitrogen，San Diego，CA）のｐＣＲＩ Ｉベクター中にクローニングした。ＰＣＲプライマーにより導入されたＢａｍＨ Ｉ部位がｐＣＲＩＩポリリンカーのＢａｍＨＩ部位に隣接するような配向（その 他の配向はＢａｍＨＩ部位を遥か遠くに離して置く）でｄａｌ遺伝子の５’半分 を含有するｐＣＲＩＩクローンを同定した。次に、ｄａｌ遺伝子の３’半分を含 有するｐＣＲＩＩクローンをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｄａｌ 遺伝子断片を、次に前記のｄａｌ遺伝子の５’半分を含有するｐＣＲＩＩクロー ンのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローニングして、遺伝子の５’末端 でＮｏｔＩ部位（ｐＣＲＩＩポリリンカーの一部）と、３’末端でＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位と接する中央部に〜２００ｂｐ欠失を有するｄａｌ遺伝子を含有するｐＣ ＲＩＩベクターを生成した。 このｄａｌ欠失を細菌染色体に導入するために、欠失遺伝子を温度感受性バシ ラス・ズブチリスレプリコンｐＥ１９４中にクローニングした（Gryczan et al. ，1982，上記）。次に欠失ｄａｌ遺伝子を２工程で染色体中に導入した：先ず、 相同組換えにより染色体ｄａｌ遺伝子座にプラスミドを組込み、その後プラスミ ドを除去（再び相同組換えにより）して、細菌染色体上にｄａｌ遺伝子の欠失型 を残すことに依る。これは、以下のようにして行った：欠失ｄａｌ遺伝子断片（ 前記）を温度感受性プラスミドｐＳＫ⁺／ｐＥ１９４（本質的に、ｐＳＫ⁺ベクタ ー配列をｄａｌ△断片により置換する）のＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にク ローン化した。プラスミドｐＳＫ⁺／ｐＥ１９４は、以下のように構築した：Blu escript ＳＫ⁺（Stratagene，La Jolla，CA）およびｐＥ１９４をＸｂａＩで 消化した。次にｐＳＫ⁺ベクターを仔牛腸アルカリ性ホスファターゼで処理し、 ２つのプラスミドを一緒に連結した。連結混合物を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形 質転換し、形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびＸ−ｇａｌ を含有するＬＢプレート上に選択した。数個の「白色」クローンからプラスミド を精製し、ｐＥ１９４およびｐＳＫ⁺から成るキメラを制限酵素消化とその後の ゲル電気泳動により同定した。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ で消化した。ｐＥ１９４レプリコンを包含する断片を次にゲル精製し、ゲル精製 ｄａｌ△遺伝子断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ）と連結した。連結混合物を用 いてｂａｌ−１株バシラス・ズブチリス １Ａ７５８（Bacillus Stock Center ，Columbus，OH）を形質転換し、トリプトン血液寒天ベース（ＴＢＡＢ）＋エリ スロマイシン（５μｇ／ｍｌ）プレート上で形質転換体を選択して、３４℃の許 容温度で増殖させた。プラスミドＤＮＡを５つのエリスロマイシン耐性形質転換 株から精製し、制限酵素消化／ゲル電気泳動により分析した。ｄａｌ欠失断片を 含有するｐＥ１９４に対応するプラスミドを同定した。このプラスミドを保有す る株は、その後、相同組換えによる染色体中へのｄａｌ欠失の導入のために用い られた。 一次交差（染色体上のｄａｌ遺伝子中へのｄａｌ欠失プラスミドの組込み）を 得るために、形質転換株をＤ−アラニン（０．１ｍｇ−ｍｌ）およびエリスロマ イシン（５μｇ／ｍｌ）を含有するＴＢＡＢプレート上に画線し、４５℃の非許 容温度で一夜増殖させた。同一条件下で大型コロニーを再画線して、染色体上の ｄａｌ遺伝子中に組み込まれた温度感受性プラスミドを含有する細胞の相同集団 を産生した。非許容温度では、プラスミドは複製できないため、染色体中にプラ スミドを含有する細胞だけがエリスロマイシン上で増 殖できた。二次交差（染色体からプラスミドを切り出して、ｄａｌ遺伝子の欠失 型を後に残す）を得るために、ループの多い細胞をＤ−アラニン（０．１ｍｇ／ ｍｌ）を補充した２０ｍｌのルリアブロスに移して、３４℃の許容温度で選択せ ずに後期対数期まで増殖させて複製起点および二次交差の発生を機能させた。細 胞をさらに４回移して（毎回１／１００希釈）プラスミドを染色体から切り出し て、集団の１つを隔離した。最後に、細胞を、Ｄ−アラニン（０．１ｍｇ／ｍｌ ）を補充したＴＢＡＢプレート上で３４℃で単一コロニー用に平板培養し、Ｄ− アラニン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含有しないＴＢＡＢプレートと、Ｄ−アラニン （０．１ｍｇ−ｍｌ）およびエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を含有するＴＢ ＡＢプレート上でレプリカ平板培養して、ｄａｌ−およびｅｒｍが存在するコロ ニーを評価した。５０のコロニーの内２つが、この表現型を生じた。その結果生 じた株をバシラス・ズブチリスＢＷ９６ ｂａｃ−１、ｄａｌ株と命名した。 （Ｂ）接合熟達ドナー株バシラス・ズブチリスＢＷ１５４を産生す るためのｂａｃ−１，ｄａｌ欠失バシラス・ズブチリス株へ のｐＬＳ２０およびｐＢＣ１６の導入 バシラス・ズブチリスＢＷ９６中にプラスミドｐＬＳ２０およびｐＢＣ１６を 導入するために、ドナー株を選定した。この場合、ドナー株は以下の特性を有す るべきである．基本的に、ｐＬＳ２０およびｐＢＣ１６をともに含有するエリス ロマイシン感受性バシラス・ズブチリス株（ドナー株に対する対立選択を提供す るために）。ｐＬＳ２０およびｐＢＣ１６を含有するｄａｌ−欠失バシラス・ズ ブチリス株を適切なドナー株として選択したが、これは以下のようにして構築さ れた：バシラス・ズブチリスＤＮ１６８６（米国特許第４，９２０，０４８号） をｐＨＶ１２４８で形質転換して（Peti t et al.，1990，Journal of Bacteriology 172:6736-6740）、細胞をエリスロ マイシン耐性にした。接合要素ｐＬＳ２０を、バシラス・ズブチリス（natto） ３３３５ ＵＭ８との接合により、ｐＢＣ１６とともにバシラス・ズブチリスＤ Ｎ１６８６（ｐＨＶ１２４８）に移した（Koehler and Thorne，1987、上記）。 トランス接合体を、ｄａｌ欠失を保有するテトラサイクリンおよびエリスロマイ シン耐性コロニーとして選択した。ｐＬＳ２０を保有するコロニーを、接合によ りその他のバシラス・ズブチリス株にｐＢＣ１６を移すその能力により評価した 。最後に、接合株は、温度を５０℃に上げることによりｐＨＶ１２４８がキュア ー（cure）されて、ドナー株：ｐＬＳ２０およびｐＢＣ１６を含有するバシラス ・ズブチリスＤＮ１６８６を産生した。 これらのプラスミドをバシラス・ズブチリスＢＷ９６中に導入するためには、 適切な対抗選択法が実行されねばならず、したがってバシラス・ズブチリスＢＷ ９６は温度感受性プラスミドｐＳＫ＋／ｐＥ１９４で形質転換されてエリスロマ イシン耐性を付与したが、これはその後、非許容温度での増殖により除去され得 る。ｐＬＳ２０およびｐＢＣ１６プラスミドを、以下の手法にしたがって、ｐＬ Ｓ２０およびｐＢＣ１６を含有するバシラス・ズブチリスＤＮ１６８６からバシ ラス・ズブチリスＢＷ９６（ｐＳＫ⁺／ｐＥ１９４を保有する）中に可動化した 。１片の各々の細胞型を、Ｄ−アラニン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＴＢＡＢ プレート上で一緒に混合し、３３℃で５時間インキュベートした。細胞をプレー トから掻き取り、１ｍｌのＬＢ培地に移した。細胞を種々の希釈で、テトラサイ クリン（１０μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）およびＤ−アラ ニン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＴＢＡＢプレート上に塗り広げ、３４℃で増 殖させて、ｐＢＣ１６を、そして多くの 場合に同時にｐＬＳ２０を獲得するレシピエント細胞に関して選択した。ｐＬＳ ２０もトランス接合体中に存在するか否かを試験するために、１０個のコロニー を、バシラス・ズブチリスＰＬ１８０１中にｐＢＣ１６を移すそれらの能力に関 して試験した。バシラス・ズブチリスＰＬ１８０１は、遺伝子ａｐｒおよびｎｐ ｒの欠失を有するバシラス・ズブチリス１６８（Bacillus Stock Center，Colum bus，OH）である。しかしながら、バシラス・ズブチリス１６８も用い得る。ｐ ＢＣ１６を可動化し得るドナーは、ｐＬＳ２０を同様に含有しなければならない 。一旦接合熟達（conjugate proficient）株（バシラス・ズブチリスｂａｃ−１ ，ｄａｌ−含有ｐＬＳ２０＋ｐＢＣ１６＋ｐＳＫ⁺／ｐＥ１９４）が同定される と、ｐＳＫ⁺／ｐＥ１９４プラスミドは、テトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）お よびＤ−アラニン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地中で４５℃で一夜、細 胞を増殖させることにより、株から除去し、Ｄ−アラニン（５０μｇ／ｍｌ）を 補充したＴＢＡＢプレート上で３３℃で単一コロニーに関して平板培養し、エリ スロマイシン感受性コロニーを同定した。この手法により、ｐＬＳ２０およびｐ ＢＣ１６を含有するバシラス・ズブチリスｂａｃｌ，ｄａｌであるバシラス・ズ ブチリスが産生された。 バシラス株およびプラスミドの要約を表Ｉに示す。 表Ｉ：細菌株およびプラスミド バシラス・ズブチリス株： バシラス・ズブチリス（natto） ｐＬＳ２０ ＤＮ１６８６ ｄａｌ− ＤＮ１２８０ ｄａｌ− ＭＴ１０１ ＤＮ１２８０（ｐＸＯ５０３） １Ａ７５８ １６８ｂａｃ−１（Baclllus Stock Center， Columbus，Ohio） ＢＷ９６ １Ａ７５８ｄａｌ△ ＢＷ９７ １Ａ７５８ｄａｌ△：：ｃａｔ（ｐＸＯ５０３ ） ＢＷ９９ １Ａ７５８ｄａｌ△（ｐＰＬ２５４１−tet） ＢＷ100 1A758da1△（Pxo503）（Pp12541−tet） ＰＬ１８０１ ａｐｒ△，ｎｐｒ△ プラスミド： ｐＢＣ１６ Ｍｏｂ⁺，Ｔｃ^r ｐＥ１９４ 温度感受性 ｐＬＳ２０ Ｔｒａ⁺ ｐＸＯ５０３ Ｔｒａ⁺，ＭＬＳ^r（＝ｐＬＳ２０：：Tn917 ） Pp12541-tet Ｍｏｂ⁺，Ｔｃ^r（ｐＥ１９４ｔｓ ｏｒｉ） ｐＣＡｓｕｂ２ Ｍｏｂ⁺，Ｃｍ^r，Ａｐ^r，（ｐＥ１９４ts o ri） Psk⁺/Pe194 Em^r，Ap^r，温度感受性 ｐＳｈｖ２ Ｔｒａ⁺，Ｅｍ^r，Ｃｍ^r，温度感受性 ｐＨＶ１２４８ Ｅｍ^r，温度感受性 Ｔｒａ⁺は、プラスミドがそれを保有するあらゆるバシラス・ズブチリスに関 して接合する能力を付与する、即ちプラスミドはドナーからレシピエント細胞に 接合可能プラスミドを可動化するための機能のすべてをコードすることを意味す る。 Ｍｏｂ⁺は、プラスミドがＴｒａ⁺プラスミド（ｐＬＳ２０またはｐＸＯ５０３ ）を含有する株により接合を経て可動化され得ることを意味する。プラスミドは 、シス−作用配列とトランス−作用タ ンパク質をコードする遺伝子（ｐＢＣ１６の場合には、それぞれｏｒｉＴおよび ｏｒｆ−β）とを、またはｏｒｉＴ配列（ｐＰＬ２５４−ｔｅｔの場合には、こ こでｐＢＣ１６のようなトランスでｏｒｆ−β機能を提供するプラスミドも同様 に細胞中に存在しなければならない）のみを含有しなければならない。 実施例２：バシラス・ズブチリスＡ１６４（ＡＴＣＣ ６０５１ Ａ）のｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子の欠失 細胞が胞子形成のＩＩ段階を進行するのを可能にするシグマＦをコードするｓ ｐｏＩＩＡＣ遺伝子の欠失型を、重複延長（ＳＯＥ）技法によりスプライシング して作製した（Horton et al.，1989，Gene 77:61-68）。Pitcher等（1989，上 記）の方法により、バシラス・ズブチリスＡ１６４（ＡＴＣＣ ６０５１Ａ）染 色体ＤＮＡを得た。ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの上流２０５ヌク レオチドからＡＴＧ開始の下流２０９ヌクレオチドに延びるバシラス・ズブチリ スＡ１６４染色体ＤＮＡからの領域のＰＣＲ増幅のために、下記に示すプライマ ー５および６を合成した。上流プライマーの下線ヌクレオチドを付加して、Ｈｉ ｎｄＩＩＩ部位を作製した。下流プライマーの下線ヌクレオチドは、ＡＴＧ翻訳 開始コドンの上流塩基５０７〜５２４と相補的である。プライマー７および８を 合成して、ＡＴＧ翻訳開始コドンの下流５０７から８８４ヌクレオチドに延びる 領域をＰＣＲ増幅した。プライマー７の下線領域は、上流断片を増幅するために 用いられるプライマー６の３’半分と正しく相補的である。 ２組のプライマーを用いて、別々のＰＣＲ増幅において上流および下流ｓｐｏ ＩＩＡＣ断片を増幅した。増幅反応（２５μｌ）は、以下の成分を含有した：２ ００ｎｇのバシラス・ズブチリスＡ１６４染色体ＤＮＡ、０．５μＭの各プライ マー、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１ｘＴ ａｑポリメラーゼ緩衝液、ならびに０．６２５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ 。以下の条件下で反応を実施した：９６℃で３分間、次に９６℃で１分、５０℃ で１分そして７２℃で１分を各々３０回、その後７２℃で３分間で、増幅断片へ の末端アデニン残基の付加を保証した（Invitrogen，San Diego，CA）。１．５ ％アガロースゲルを通す電気泳動により、予測生成物の増幅を立証した。 前記の各増幅反応物２．５μｌを含有する新規のＰＣＲ混合物を、次に同一条 件下で実行したが、しかしプライマー５および８だけを含有し、１０８９ヌクレ オチドの「スプライス化」断片を産生したが、これは２９８内部ヌクレオチドを 欠くｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子を表す。この断片を、メーカーの使用説明書にしたが って、Invitrogen TAクローングキットを用いてｐＣＲＩＩベクター中にクロー ン化して、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片として切り出した後、ＨｉｎｄＩＩ Ｉ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＳｈｖ２中にクローン化した。ｐＳｈｖ２は、ｐＵＢ １１０のｏｒｉＴを含有するＸｂａＩ切断ｐＢＣＳＫ⁺（Stratagene，La Jolla ，CA）をＸｂａＩで切断したｐＥ１９４と連結し、その後ＳｓｔＩ適合末端を含 有するＰＣＲ増幅断片としてｐＵＢ１１０からのｏｒｉＴを連結することにより 構築されるシャトルベクターである（図１）。ｏｒｉ断片は、ｐＬＳ２０媒介性 接合によりバシラス・ズブチリスＡ１６４中への プラスミドの可動化を可能にする（Battisti et al.，1985，Journal of Bacter iology 162:543-550）。ｐＳｈｖ２−△ｓｐｏＩＩＡＣをドナー株バシラス・ズ ブチリスＢＷ１５４中に形質転換した（実施例１）。バシラス・ズブチリスＢＷ １５４（ｐＳｈｖ２−△ｓｐｏＩＩＡＣ）をドナー株として用いて、欠失遺伝子 を含有するシャトルベクターをバシラス・ズブチリスＡ１６４中に導入した。 欠失遺伝子と無傷（intact）染色体遺伝子との交換は、ｐＳｈｖ２−△ｓｐｏ ＩＩＡＣで形質転換したバシラス・ズブチリスＢＷ１５４とバシラス・ズブチリ スＡ１６４との接合、エリスロマイシン耐性トランス接合体の選択、及び４５℃ での増殖により実行した。この温度では、ｐＥ１９４レプリコンは不活性で、細 胞は、ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子座での欠失遺伝子を含有するプラスミドのキャンベ ル組込みによりエリスロマイシン耐性を保持し得るだけである。ｐＥ１９４レプ リコンの機能に関して許容される温度である３４℃で、抗生物質選択を伴わずに 、ＬＢ培地中で株を２ラウンド増殖させて、ベクターＤＮＡのループアウト、お よび無傷ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子の欠失遺伝子との置換を引き起こす二次組換えを 実行した。遺伝子置換が起きていたコロニーを、以下の判定基準にしたがって選 択した：１）シャトルベクターｐＳｈｖ２によりコードされるエリスロマイシン （ｅｒｍ）耐性の不存在、２）胞子形成培地での不透明性の低下（これは胞子形 成が成されなかったことを示す）、及び３）１０８９ヌクレオチド（これは遺伝 子の非欠失型を示す）の代わりに７９１ヌクレオチドの断片を得るためのプライ マー５および８を用いたＰＣＲ増幅。 実施例３：バシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣのｎ ｐｒＥ遺伝子の欠失 中性プロテアーゼ（ｎｐｒＥ）遺伝子（ＧＴＧ開始コドンの下流 ヌクレオチド４０−６１０）の上流部分を、下記に示すプライマー９および１０ を用いて、実施例２に記載した方法で調製したバシラス・ズブチリスＡ１６４△ ｓｐｏＩＩＡＣ染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ｎｐｒＥ遺伝子（ヌクレオチ ド１０４０−１５６０）の下流部分を、下記のプライマー１１および１２を用い てＰＣＲ増幅した。プライマー１０および１１は、２つの断片間で１５塩基対重 複するよう意図された（下線で示す）。増幅反応（２５μｌ）は、実施例２と同 一成分を含有し、同一条件下で実行した。 増幅上流および下流断片を、メーカーの使用説明書（Qiagen，Chatsworth，CA ）にしたがってQiaex IIキットでゲル精製した。約２０ｎｇの各精製断片を含有 する新規のＰＣＲ混合（１００μｌ）を実施した。ＳＯＥ反応を、以下の条件下 で実施した：プライマーの非存在下で１〜３周期で、「スプライス化」断片を生 成し、４〜３０周期でプライマー９および１２の存在下で、実施例２に明記した 条件下。増幅ＳＯＥ断片をｐＣＲＩＩベクター中でクローン化し、制限分析によ り立証した。次に断片をＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片としてｐＳｈｖ２中でクロー ン化した。このプラスミドｐＳｈｖ２−△ｎｐｒＥをバシラス・ズブチリスＢＷ １５４中に形質転換して、接合に適したドナー株を生成した。次にプラスミドを バシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣ中に可動化した。△ｎｐｒＥ遺 伝子を、実施例２に記載したように温度転移によりバシラス・ズブチリスＡ１６ ４△ｓｐｏＩＩＡＣの染色体中に導入した。１％無 脂肪乾燥ミルクを補充したＴＢＡＢ寒天プレート上でｅｒｍ^sコロニーをパッチ ングし、３７℃で一夜インキュベートすることにより、ｎｐｒＥ表現型を評価し た（ｎｐｒＥ株は清澄化ゾーンの顕著な低減を示した）。プライマー９および１ ２を用いた染色体ＤＮＡでのＰＣＲ分析により、４３０塩基対欠失が立証された 。 実施例４：バシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎ ｐｒＥのａｐｒＥ遺伝子の欠失 ＳＯＥを用いて、アルカリ性プロテアーゼをコードするバシラス・ズブチリス ａｐｒＥ遺伝子の欠失型を作製した。ａｐｒＥの上流部分を、実施例２に記載し たようにして調製したバシラス・ズブチリスＡ１６４染色体ＤＮＡから、下記の プライマー１３及び１４を用いて、ＰＣＲ増幅し、翻訳開始コドンの上流１８９ ヌクレオチドから開始の下流３２８ヌクレオチドに延びる断片を作製した。プラ イマー１３の下線を施したヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ部位を付加するために含 有された。プライマー１４の下線ヌクレオチドを付加して、下流ＰＣＲ断片との 相補性を提供し、ＳａｌＩ部位を付加した。ａｐｒＥ遺伝子の下流部分を、プラ イマー１５および１６を用いてＰＣＲ増幅して、ａｐｒＥ翻訳開始コドンの下流 ７８９ヌクレオチドから１３０６ヌクレオチドに延びる断片を作製した。プライ マー１４および１５の下線付き領域を付加して、上流および下流断片との間の相 補性を提供した。プライマー１６の下線ヌクレオチドは、ＩＩｉｎｄＩＩＩ部位 を付加するために含有された。増幅反応（２５μｌ）は、実施例２と同一成分を 含有し、同一条件下で実行した。 増幅された上流および下流断片を、メーカーの使用説明書（Qiagen，Chatswor th，CA）にしたがってQiaquick PCR精製キットを用いて精製した。次に２つの精 製断片を、プライマー１３および１６を用いて一緒にスプライシングした。増幅 反応（５０μｌ）は、前記と同一成分を含有したが、但し、染色体ＤＮＡを各々 ２μｌの上流および下流ＰＣＲ生成物で置換した。反応物を、９６℃で３分間（ ｄＮＴＰおよびＴａｑポリメラーゼを用いずに）を１回、次に９６℃で１分そし て７２℃で１分を各々３０回で、インキュベートした。これにより、コード領域 から４６０ヌクレオチドを欠くａｐｒＥの欠失型が生じた。反応生成物をアガロ ースゲル電気泳動により単離し、ｐＣＲＩＩ中でクローン化して、ＥｃｏＲＩ− ＨｉｎｄＩＩＩ断片として切り出した後、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＳ ｈｖ２中でクローン化して、ｐＳｈｖ２−△ａｐｒＥを産生した。このプラスミ ドを、バシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎｐｒＥ中に接合転移 するために前記のドナー株中に導入した。 ａｐｒＥの欠失遺伝子との置換を、ｓｐｏＩＩＡＣおよびｎｐｒＥに関して前 記と同様に実行した。ａｐｒＥが欠失したコロニーをエリスロマイシン感受性、 および１％無脂肪乾燥ミルクを含有する上張りを用いた寒天プレート上での清澄 ゾーンの低減により選択した。ａｐｒＥの欠失をＰＣＲにより確証した。 バシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎｐｒＥ△ａ ｐｒＥは、本明細書中ではバシラス・ズブチリスＡ１６４△３と呼ばれる。 実施例５：バシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎ ｐｒＥ△ａｐｒＥのａｍｙＥ遺伝子の欠失 ＳＯＥを用いて、バシラス・ズブチリスα−アミラーゼをコードするａｍｙＥ 遺伝子の欠失型を作製した。ａｍｙＥの上流部分を、下記のプライマー１７及び １８を用いて、バシラス・ズブチリスＡ１６４染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅した 。これにより、ａｍｙＥ翻訳開始コドンの上流４２１ヌクレオチドからａｍｙＥ コード配列のヌクレオチド７７に延びる断片を作製し、上流末端にＳａｌＩ部位 を、下流末端にＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位を付加した。ａｍｙＥの下流部分を 、下記のプライマー１９および２０を用いてＰＣＲ増幅した。これにより、ａｍ ｙＥコード配列のヌクレオチド４４５からヌクレオチド９５３に延びる断片を作 製し、上流末端にＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位を、下流末端にＨｉｎｄＩＩＩ部 位を付加した。制限部位を下線で示す。増幅反応（２５μｌ）は、実施例２と同 一成分を含有し、同一条件下で実行した。 次に２つの断片を、プライマー１７および２０を用いて、ＰＣＲにより一緒に スプライシングした。増幅反応（２５μｌ）は前記と同一成分を含有したが、但 し、染色体ＤＮＡを各々２μｌの上流および下流ＰＣＲ生成物と置換した。反応 物を、９６℃で３分間（ｄＮＴＰおよびＴａｑポリメラーゼを用いずに）を１回 、次に９６℃で１分そして７２℃で１分を各々３０回で、インキュベートした。 この反応物を、２つ（ＳｆｉＩとＮｏｔＩ部位）の間の相補性領域で重複させて ２つの断片を融合し、コード領域から３６７ヌクレオチドを欠き、ａｍｙＥの２ つの部分の間に組み入れられたＳｆｉＩ部位とＮｏｔＩ部位を有するａｍｙＥの 断片を生じた。反応生成物 を、標準的方法にしたがって、１％アガロースゲルを用いた電気泳動により単離 した。この断片を、メーカーの使用説明書にしたがって、ｐＣＲＩＩ中でクロー ン化して、ｐＣＲＩＩ−△ａｍｙＥを産生した。 ＮｏｔＩで消化し、結合末端にクレノウ断片およびｄＮＴＰをフィルインし、 プラスミドを再連結することにより、ｐＳｈｖ２を作製した。欠失ａｍｙＥ断片 をｐＣＲＩＩ−△ａｍｙＥからＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として切り出し、 ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＳｈｖ２．１中でクローン化して、ｐＳｈｖ２ ．１−△ａｍｙＥを産生した。このプラスミドを、バシラス・ズブチリスＡ１６ ４△ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎｐｒＥ△ａｐｒＥ中に接合転移するために前記のドナー 株中に導入した。 ａｍｙＥの欠失遺伝子との置換を、ｓｐｏＩＩＡＣ）ｎｐｒＥおよびａｐｒＥ に関して前記と同様に実行した。遺伝子置換が起きていたコロニーをエリスロマ イシン感受性、およびデンプン青色上張りプレート上の清澄ゾーンの生成が成さ れないことにより選択した。ａｍｙＥの欠失を、プライマー１７および２０を用 いて染色体Ｄ ＮＡからの欠失遺伝子のＰＣＲ増幅により確証した。 実施例６：バシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎ ｐｒＥ△ａｐｒＥ△ａｍｙＥ△ｓｒｆＣを生成するた めのバシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣ △ｎｐｒＥ△ａｐｒＥ△ａｍｙＥのｓｒｆＣ遺伝子の 欠失 サーファクチンオペロンのｓｒｆＣにおける欠失を作製するために、下記のプ ライマー２１〜２４を合成した。プライマー２１は、ｓｒｆＣ遺伝子の既存のＨ ｉｎｄＩＩＩ部位（下線）を重複して、プライマー２２と一緒に、ｓｒｆＣの翻 訳開始の下流の４１０ヌクレオチドから８４８ヌクレオチドに延びる領域のＰＣ Ｒ増幅を可能にする。プライマー２２の下線部分は、ＡＴＧ開始コドンの下流の ヌクレオチド１７０９−１７２５と相補的である。プライマー２３及び２４は、 ｓｒｆＣの翻訳開始の下流の１７０９−２２１２ヌクレオチドのＰＣＲ増幅を可 能にする。プライマー２３の下線部分は、ＡＴＧコドンの下流のヌクレオチド８ ３５−８４８と相補的である。増幅反応物（２５μｌ）は、実施例２と同一成分 を含有し、同一条件下で実行した。 Qiagen PCRスピンカラム（Qiagen，Chatsworth，CA）でＰＣＲ生成物からプラ イマーおよびその他の夾雑物を除去した。２つのＰＣＲ生成断片間の相補性によ り、ＳＯＥによるスプライシングが可 能になった。ＰＣＲ生成物（各々２μｌまたは約５０ｎｇ）を、前記と同jtjＰ ＣＲ条件下で、「外部プライマー」であるプライマー２１および２４と一緒にス プライシングしたが、但し、最初の３回はプライマーの付加前に実行して、重複 領域を延長した。ＳＯＥ反応により、ｓｒｆＣ遺伝子の内部８５９ヌクレオチド を欠いた９５５ヌクレオチド断片が生じた。欠失部分は、７番目のアミノ酸ロイ シンをサーファクチン分子に付加するのに関与するｓｒｆＣの領域を示し、さら に、チオエステラーゼ活性部位様領域の前でペプチドを終結させるフレームシフ ト突然変異を引き起こすが、これはＳｒｆＣタンパク質からのサーファクチン放 出に伴うものと考えられる（Cosmina et al.，1993，上記）。 ｓｒｆＣの欠失遺伝子との置換を、ｓｐｏＩＩＡＣ、ｎｐｒＥ、ａｐｒＥおよ びａｍｙＥに関して前記と同様に実行した。遺伝子置換が起きていたコロニーを エリスロマイシン感受性、および血液寒天プレート上の清澄ゾーンの生成が成さ れないこと（Grossman etal.，1993，Journal of Bacteriology 175:6203-6211 ）、ならびに５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した、１０％スクロー ス、４％ダイズ粉、０．４２％無水リン酸二ナトリウムおよび０．５％炭酸カル シウムから成る５０ｍｌのＰＳ−１培地を含入する２５０ｍｌ振盪フラスコ中で ２５０ｒｐｍで３７℃で４日間培養した場合に発泡が認められないことにより、 選択した。ｓｒｆＣの欠失を、プライマー２１および２４を用いて染色体ＤＮＡ からの欠失遺伝子のＰＣＲ増幅により確証した。 バシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎｐｒＥ△ａｐｒＥ△ａｍ ｙＥ△ｓｒｆＣは、本明細書中ではバシラス・ズブチリスＡ１６４△５と呼ばれ る。 実施例７：バシラス・ズブチリスＡ１６３０△ｓｐｏＩＩＡＣ△ ｎｐｒＥ△ａｐｒＥ△ａｍｙＥ△ｓｒｆＣの構築 バシラス・ズブチリスＡ１６４欠失に関して構築された欠失プラスミドを用い て、バシラス・ズブチリスＡ１６４△ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎｐｒＥ△ａｐｒＥ△ａ ｍｙＥ△ｓｒｆＣ（バシラス・ズブチリスＡ１６４△５）に関して実施例１〜６ に記載した同一手法にしたがって、バシラス・ズブチリスＡ１６３０（ＮＣＦＢ ７３６、かつてはＮＣＤＯ ７３６）から、バシラス・ズブチリスＡ１６３０ △ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎｐｒＥ△ａｐｒＥ△ａｍｙＥ△ｓｒｆＣを構築した。 バシラス・ズブチリスＡ１６３０△ｓｐｏＩＩＡＣ△ｎｐｒＥ△ａｐｒＥ△ａ ｍｙＥ△ｓｒｆＣは、本明細書中ではバシラス・ズブチリスＡ１６３０△５と呼 ばれる。 実施例８：ａｍｙＱプロモーター−ａｍｙＭ転写カセットのバシ ラス・ズブチリスＡ１６４株中への組込みのためのベ クターの構築 バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）アミラ ーゼ（BAN，Novo Nordisk A/S，Bagsveard，Denmark）をコードするａｍｙＱ遺 伝子のプロモーターのすぐ下流にNOVAMYL（ａｍｙＭ）遺伝子およびその元のリ ボソーム結合部位を置く転写融合体を構築した。ａｍｙＱプロモーター（BANプ ロモーター）を、下記のプライマー２５および２６を用いて、前記の実施例２と 同一条件で、ＰＣＲ増幅し、ｐＣＲＩＩベクター中でクローニングして、シーケ ンシングし、無エラー増幅を立証し、次に、ＳｆｉＩおよびＳｓｔＩで切断され ていた大腸菌−バシラス・ズブチリスシャトルベクターｐＨＰ１３−ａｍｙＭＣ Ｓの多重クローニング部位中に連結した。 ｐＵＣ９をＡａｔＩＩで切断し、クレノウ断片およびデオキシリボヌクレオチ ドでブラント末端化し、次にＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ｐＨＰ１３ の変異体であるｐＨＰ１３−ａｍｐＭＣＳ（Haima et al.，1987，Molecular an d General Genetics 209:335-342）を構築した。大型の２．２ｋｂ断片をQiaex キット（Qiagen，Thousand Oaks，CA）でゲル精製した。ｐＨＰ１３をＨｐａＩ （エリスロマイシン耐性遺伝子内部で切断）で切断し、ブラント末端化した後、 ｐＵＣ９の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有する２．１ｂ ｐＵＣ ９断片に連結した。最後に、ｐＵＣ９ ＭＣＳを、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５および１ｍＭ ＥＤＴＡ中で下記の２つのオリゴヌク レオチド２７および２８の各々 １００ｐｍｏｌをアニーリングし、５分間沸騰 させて、２時間掛形質転換徐々に室温に冷却することにより作製した新規のＭＣ Ｓと置き換えた。 ＢＡＮ^TM（ａｍｙＱ）プロモーターをＰＣＲ増幅するために用いられるプライ マーはＳｆｉＩおよびＳｓｔＩ部位を導入したため、転写融合体を構築するため には、ＮＯＶＡＭＹＬ（ａｍｙＭ）オープンリーディングフレームの上流にＳｓ ｔＩ部位を置く必要があった。したがって、ＳｓｔＩリンカーを含有する５’Ｐ ＣＲプライマ ー（下記のプライマー２７）は、ＮＯＶＡＭＹＬ（ａｍｙＭ）リボソーム結合部 位の上流に４つのヌクレオチドをアニーリングするよう意図された。このＰＣＲ プライマーはすぐ下流に位置し、したがって潜在的ステム構造を増幅から省く。 ＰｖｕＩＩ部位と重複するＰＣＲプライマー（下記のプライマー２８）を、Ｓｓ ｔＩ含有プライマーとともに用いて、実施例２に記載した条件下で、鋳型ＤＮＡ として、ＮＯＶＡＭＹＬのＮ末端をコードする３２７ヌクレオチド断片であるｐ ＳＪ３２００（図２）２００ｎｇを用いて、増幅した。 ＮＯＶＡＭＹＬ遺伝子を、ＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片として、大型ＭＣＳを含 有するｐＵＢ１１０の誘導体であるｐＳＪ２６６２（図３）中にクローニングす ることによりプラスミドｐＳＪ３２００（図２）を構築した。 ａｍｙＭ遺伝子を再構築するために、３２７ヌクレオチドのＰＣＲ増幅断片を ＳｓｔＩ−ＰｖｕＩＩ断片として切り出し、下流２．２ｋｂ ＰｖｕＩＩ−Ｓｓ ｔＩ断片（ａｍｙＭの後者部分をコードする）と一緒に、３方連結で、ＳｓｔＩ 切断ｐＵＣ１１８中にクローニングした。次に、再構築ａｍｙＭ遺伝子をＳｓｔ Ｉ断片として取り出して、ｐＳＪ２８８２−ＭＣＳに含まれるａｍｙＱプロモー ターの下流にクローン化した。図４は、これらのクローニング工程を要約する。 ｐＳＪ２８８２−ＭＣＳはｐＨＰ１３に由来する（Haima et al.，1987，Molecu lar General Genetics 209:335-542）が、しかしＳｆｉＩ−ＮｏｔＩに挟まれた ＭＣＳを含有し、ｐＵＢ１ １０からのｏｒｉＴ領域を含有するＳｓｔＩ ０．５ｋｂ断片も含有する。この 後者断片は、ｐＬＳ２０−媒介性接合によるバシラス・ズブチリスＡ１６４中へ のプラスミドの可動化を可能にする（Battisti et al.，1985，Journal of Bact eriology 162:543-550）。 連結反応物をバシラス・ズブチリスＰＬ１８０１ｓｐｏＩＩＥ中に直接形質転 換した。ｐＳＪ２８８２−ＭＣＳ中でのａｍｙＱプロモーターに対するａｍｙＭ 開放読取枠の適正な配向を、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するデ ンプン青色プレート上で増殖させたコロニーを取り巻くハローの存在または非存 在により、確定した。 組込みベクターｐＣＡｓｕｂ２を構築するために、ｐＰＬ２４１９（図５）の ネオマイシン耐性遺伝子をＢｃｌＩおよびＢｇｌＩＩでの消化により切り出し、 そしてｐＭＩ１１０１からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ （ｃａｔ）遺伝子含有ＢａｍＨＩ断片と置き換えて（Youngman et al.，1984，P lasmid 12.1-9）、プラスミドｐＰＬ２４１９−ｃａｔを作製した。（ＢａｍＩ ＩＩ付着末端は、ＢｃｌＩおよびＢｇｌＩＩ付着末端と適合性である）次に、ｐ ＰＬ２４１９−ｃａｔの多重クローニング部位（ＭＣＳ）を、５０ｍＭ ＮａＣ ｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５および１ｍＭ ＥＤＴＡ中で下記の２つの オリゴヌクレオチド２７および２８の各々１００ｐｍｏｌを混合して下記の２つ のオリゴヌクレオチド（配列番号：３１と配列番号：３２）を一緒にアニーリン グし５分間沸騰させて２時間掛形質転換徐々に室温に冷却することにより作製し た新規のＭＣＳと置き換えた： アニール化オリゴヌクレオチド（２μｌ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩ切 断ｐＰＬ２４１９−ｃａｔ２μｇ）と連結して、ｐ２４１９ＭＣＳ５−ｃａｔを 生成した。次に、ａｍｙＥのヌクレオチド９４２−１７５１（GenBank Locus BS AMYL，寄託番号Ｖ００１０１，Ｊ０１５４７）を、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩ（Ａ ｓｐ７１８）リンカーを含有する下記のブライマー（配列番号：３３および配列 番号：３４）、及び鋳型としてバシラス・ズブチリスＡ１６４△５染色体ＤＮＡ （実施例２と同様に調製）を用いて実施例２と同様にＰＣＲ増幅し、ＮｏｔＩお よびＡｓｐ７１８消化されたｐ２４１９ＭＣＳ５中に挿入して、組込みベクター ｐＣＡｓｕｂ２（図６）を生成した。ＣＡｓｕｂは、バシラス・ズブチリス宿主 中で用いるための、クロラムフェニコール耐性アミラーゼ相同性を示す。 このベクターを単独でバシラス・ズブチリス１６８に組み込んで、デンプン青 色上張りプレート上で平板培養すると、アミラーゼ活性の完全排除が認められた 。ａｍｙＱプロモーター−ａｍｙＭ構築物をＳｆｉＩ−ＮｏｔＩカセットとして ｐＳＪ２８８２−ＭＣＳから取り出し、同一酵素で切断したｐＣＡｓｕｂ２中に クローン化して、完全組込みベクターｐＢＡＮ−ＮＯＶ（図７）を生成した。実施例９：バシラス・ズブチリスドナー株ＢＷ１００の構築 実施例８に記載されているように、ｐＥ１９４ベースの「スレー ブ」(slave)組込みプラスミド、例えばｐＣＡｓｕｂ２（クロラムフェニコール 耐性を付与し，ｏｒｉを含有する）を保持および可動化できる適切なドナー株を 構築した。このようなドナー株は、以下の特性を有するべきである．基本的に、 ｂａｃ−１，ｄａｌ−が欠失しており、ｐＬＳ２０またはｐＸＯ５０３及びｐＥ １９４−ベースの「ヘルパー」プラスミド（「ヘルパー」および「スレーブ」の 両方を可動化するためのｏｒｉＴおよびｏｒｆ−βの両方、並びに「スレーブ」 プラスミドを複製させそしてプラスミドレプリコンとして保持されるためにトラ ンスにｒｅｐＦタンパク質を提供するためのｒｅｐＦも含有する）（ＷＯ９１／ ０９１２９）を含有する。本株は以下のように構築した：バシラス・ズブチリス ＢＷ９６をヘルパープラスミドｐＰＬ２５４１−ｔｅｔ（図８）で形質転換する と、ドナー株に対する対立選択が提供されて、バシラス・ズブチリスＢＷ９９を 生じた。次に、プラスミドｐＸＯ５０３を、ドナー株としてバシラス・ズブチリ スＢＷ９７を用いて、接合を介してバシラス・ズブチリス中に導入した。バシラ ス・ズブチリスＢＷ９７は、以下のように構築した：先ず、ｐＸＯ５０３プラス ミドをバシラス・ズブチリスＭＴ１０１ドナー株からｂａｃ−１株バシラス・ズ ブチリスＩＡ７５８に可動化し、ＴＢＡＢ＋エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ） プレート上でトランス接合に関して選択した（ｄａｌ−ドナーは、Ｄ−アラニン が培地中に含有されていないため、増殖しない）。これにより、ｐＸＯ５０３プ ラスミドを保有するバシラス・ズブチリスのｂａｃ−１株が産生された。バシラ ス・ズブチリスＭＴ１０１は、バシラス・ズブチリスＤＮ１２８０に由来し、こ れはｄａｌ遺伝子に欠失を含有するバシラス・ズブチリス１６８の誘導体である （Diderichsen，In A.T．Ganesan and J.A．Hoch，editors，Bacillus Molecula r Genetics and Biotechnology Applica tions，Academic Press，Inc.，New York，1986）。 次に、実施例８に記載されたＢａｍＨＩ部位に挟まれたｃａｔ遺伝子カセット （クロラムフェニコール耐性を付与する）を、ｐＣＲＩＩ−ｄａｌ△プラスミド のＢａｍＨＩ部位に挿入した。このプラスミドは、ＳｃａＩでリンカー化され、 接合プラスミドｐＸＯ５０３を含有するｂａｃ−１株中に形質転換されて、ＴＢ ＡＢ＋Ｄ−アラニン（０．１ｍｇ／ｍｌ）＋クロラムフェニコール（５μｇ／ｍ １）上でクロラムフェニコール耐性に関して選択され（二重交差相同組換えによ り）、バシラス・ズブチリスＢＷ９７、ｂａｃ−１，ｄａｌ△：：ｃａｔ接合熟 達ドナー株が得られた。最後に、バシラス・ズブチリスＢＷ９７を、ｐＰＬ２５ ４１−ｔｅｔを含有するバシラス・ズブチリスＢＷ９９と接合させ、ＴＢＡＢプ レート＋Ｄ−アラニン（０．１ｍｇ／ｍｌ）＋テトラサイクリン（１０μｇ／ｍ ｌ）＋エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）上でトランス接合に関して選択して、 ドナー株である、ｐＸＯ５０３およびヘルパープラスミドｐＰＬ２５４１−ｔｅ ｔを含有するバシラス・ズブチリスＢＷ１００：ｂａｃ−１，ｄａｌ欠失バシラ ス・ズブチリス株を得た。 実施例１０：バシラス・ズブチリスＡ１６４株におけるａｍｙＱ プロモーター−ａｍｙＭカセットの組込みおよび増 幅 ｐＢＡＮ−ＮＯＶ中のａｍｙＱプロモーター−ａｍｙＭカセット、ならびにヘ ルパープラスミドｐＰＬ２５４１−ｔｅｔを含有する実施例９に記載したバシラ ス・ズブチリスＢＷ１００ドナー株を、ｐＬＳ２０媒介性接合（Battisti et al .，1985，上記）により、バシラス・ズブチリスＡ１６４△３およびバシラス・ ズブチリスＡ１６４△５株と接合させた。 次に、バシラス・ズブチリスＡ１６４△３および△５株トランス 接合体を、５μｇのクロラムフェニコールを補充したＬＢブロス１０ｍｌを含有 する１２５ｍｌ振盪フラスコ中で、４５℃で２連続継代の間増殖させ、次に４５ ℃で平板培養して、ｐＰＬ２５４１−ｔｅｔヘルパープラスミドの複製を遮断し 、ａｍｙＥ遺伝子座での組込みプラスミドの組込みに関して選択した。次に、組 込み体を、１５、３０）４５、６０および８０μｇ／ｍｌの漸増クロラムフェニ コール濃度のクロラムフェニコールで平板培養して、クロラムフェニコール含有 ａｍｙＱプロモーター−ａｍｙＭカセットの増幅に関して選択した。 実施例１１：ａｍｙＱプロモーター−ａｍｙＭカセットで形質転 換したバシラス・ズブチリスＡ１６４株の振盪フラ スコ培養 ａｍｙＱプロモーター−ａｍｙＭカセットの染色体組込みコピーまたは組込み ベクター単独を含有するバシラス・ズブチリスＡ１６４△３およびバシラス・ズ ブチリスＡ１６４△５を、３７℃で４日間、５０ｍｌのＰＳ−１培地を含む２５ ０ｍｌの振盪フラスコ中で、２５０ｒｐｍで培養した。 培養上清を、約５０および１００時間でサンプリングし、２ｍＭ ＰＭＳＦ最 終濃度で処理し、凍結させた。ＮＯＶＡＭＹＬ発現を概算するために、上清を等 容量の２ｘLaemmli負荷緩衝液と混合し、直ちに沸騰させて、１４％または８− １６％アクリルアミドＴＲＩＳ−グリシンゲル（市販供給元（NOVEX，SanDiego ，CA）から購入）上に載せた。既知量のＮＯＶＡＭＹＬ標準も同一ゲル上に載せ て、生成されたＮＯＶＡＭＹＬの量を概算した。いくつかの場合には、基質とし てマルトトリオースを用いて、ＮＯＶＡＭＹＬ力価を確定した。特に、酵素の試 料を、ｐＨ５．０で、３７℃で３０分間、マルトトリオースとともにインキュベ ートした。次に、ｐＨを約 １１に調整して、反応を停止させた。マルトトリオースからグルコースおよびマ ルトースへの分解により生じたグルコースの量を次に、グルコースデヒドロゲナ ーゼおよびＮＡＤＨを用いて、標準条件下で３４０ｎｍで測定する。既知量のＮ ＯＶＡＭＹＬ標準（Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark）も実施する。結果 は、培養２日後では、ｓｒｆＣの欠失を有さない株は発泡の頭高は８cmであった が、これに比して、ｓｒｆＣ欠失株に関する発泡頭高は０．５cmであることを示 した。ｓｒｆＣ欠失株によるサーファクチン産生の欠損は、血液寒天プレート上 での溶血の欠損により確証された。結果は、両株が同量のＮＯＶＡＭＹＬを産生 したが、しかしｓｒｆＣ欠失株は、非欠失株に比して、発泡の顕著な低減を示し たことも明示する。 実施例１２：バシラス・ズブチリスＡ１６４株の発酵 組込まれ／増幅された、そしてスレーブプラスミドｐＣＡｓｕｂ２単独により 組込まれ／増幅されたバシラス・ズブチリスＡ１６４△３およびバシラス・ズブ チリスＡ１６４△５を、典型的炭素および窒素供給源、ならびに無機塩、微量元 素から成る１．５リットルの培地と、培地１リットル当たり３ｍｌの消泡剤（Si gma混合型２８９，Sigma Chemical Company，St．Louis，MO）を含入する３リッ トル発酵器中で各々培養した。培養を１．５リットル／分で空気とともに散布し て、１０００〜１５００ｒｐｍで２つの標準rushtonタービンで攪拌した。３７ ℃〜３９℃の間の温度で、発酵を保持した。 発泡の作用により発酵器から出される液体の量を測定することにより、発泡の 量を定量的に査定した。ＮＯＶＡＭＹＬは、実施例１１と同様に測定した。 結果は、バシラス・ズブチリスＡ１６４△３が発酵の５時間以内 に泡を生じ始め、この場合、泡は発酵器の１．５リットル上部スペースを満たし て、排気ラインを通って、目盛付捕獲フラスコ中に溢れ始めた。１０〜２０分以 内に、７００〜９００ｍｌの液体容量が典型的には、発泡により発酵器から失わ れた。この期間の後、系は安定化したが、元の容量の４５％〜６０％が発酵器中 に残り、株を大規模製造には不適にした。バシラス・ズブチリスＡ１６４△５に よる同様の発酵は、発酵の少なくとも５０時間の間に発泡によるいかなる容量損 失も起きなかった。生じたＮＯＶＡＭＹＬの量（／ｍｌ）は、両株で同様であっ た。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１１月２４日（１９９８．１１．２４） 【補正内容】 請求の範囲 １． （ａ）バシラス細胞の突然変異株をポリペプチドの産生を促す条件下で 培養し、ここで、（ｉ）前記突然変異株は、ポリペプチドをコードする一次核酸 配列と、ｓｒｆＡ、ｓｒｆＢ、ｓｒｆＣ、ｓｒｆＤおよびｓｆｐ遺伝子からなる 群から選択されるサーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または分泌 に関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾を含有する二次核酸配列とを含有し、 そして（ｉｉ）突然変異株は、同一条件下で培養された場合、バシラス細胞より 少ないサーファクチンまたはそのアイソフォームを産生し；そして （ｂ）ポリペプチドを培地から単離する； 工程を含んでなるポリペブチドの製造方法。 ２．バシラス細胞がバシラス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus） 、バシラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシ ラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・サーキュランス（Bacillus cl rculans）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バシラス・フ ィルムス'(Bacillus firmus)、バシラス・ラウツス(Bacillus lautus)、バシラ ス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・リケニホルミス（Bacilluslicheni formis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プミ ルス(Bacillus pumilus)、バシラス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stear othermophilus)、バシラス・ズブチリス(Bacillus subtilis)またはバシラス・ チュリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）細胞である請求項１の方法。 ３．バシラス細胞がバシラス・ズブチリス細胞である請求項２の方法。 ４．バシラス細胞がバシラス・ズブチリスＡＴＣＣ ６０５１またはバシラス ・ズブチリスＡＴＣＣ ６０５１Ａである請求項３の方法。 ５．バシラス細胞がバシラス・ズブチリスＮＣＦＢ ７３６である請求項３の 方法。 ６．遺伝子がｓｒｆＡである請求項１の方法。 ７．遺伝子がｓｒｆＢである請求項１の方法。 ８．遺伝子がｓｒｆＣである請求項１の方法。 ９．遺伝子がｓｒｆＤである請求項１の方法。 １０．遺伝子がｓｆｐである請求項１の方法。 １１．同一条件下で培養した場合に、突然変異株細胞がバシラス細胞よりも少 なくとも約２５％少ないサーファクチンまたはそのアイソフォームを産生する請 求項１の方法。 １２．修飾がサーファクチンまたはそのアイソフォームの非発泡性変異体の産 生を引き起こす請求項１の方法。 １３．突然変異株細胞がプロテアーゼをコードする１つ又はそれより多くの遺 伝子の修飾をさらに包含する請求項１の方法。 １４．遺伝子がｎｐｒＥおよび／またはａｐｒＥである請求項１３の方法。 １５．突然変異株細胞がｓｐｏＩＩＡＣおよび／またはａｍｙＥ遺伝子の修飾 をさらに包含する請求項１の方法。 １６．異種ポリペプチドをコードする一次核酸配列の少なくとも２つのコピー と、ｓｒｆＡ、ｓｒｆＢ、ｓｒｆＣ、ｓｒｆＤおよびｓｆｐ遺伝子からなる群か ら選択されるサーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または分泌に関 与する少なくとも１つの遺伝子の修飾を含有する二次核酸配列とを含む対応する 親バラス細胞の突然変異株であって、同一条件下で培養した場合にバシラス細胞 より少ないサーファクチンまたはそのアイソフォームを産生する突然変異株。 １７．生来のポリペプチドをコードする一次核酸配列の少なくとも２つのコピ ーと、ｓｒｆＡ、ｓｒｆＢ、ｓｒｆＣ、ｓｒｆＤおよびｓｆｐ遺伝子からなる群 から選択されるサーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または分泌に 関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾を含有する二次核酸配列とを含むバシラ ス細胞の突然変異株であって、同一条件下で培養した場合にバシラス細胞より少 ないサーファクチンまたはそのアイソフォームを産生する突然変異株。 １８．（ａ）ｓｒｆＡ、ｓｒｆＢ、ｓｒｆＣ、ｓｒｆＤおよびｓｆｐ遺伝子か らなる群から選択されるサーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成また は分泌に関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾を含有する一次核酸配列とバシ ラス細胞にとって異種性であるポリペプチドをコードする二次核酸配列とをバシ ラス細胞中に導入し、そして （ｂ）核酸配列を含有する、工程（ａ）からの突然変異株を同定する； 工程を含んで成る請求項１６の突然変異株の獲得方法であって、突然変異株細胞 が、同一条件下で培養した場合にバシラス細胞より少ないサーファクチンまたは そのアイソフォームを産生することを特徴とする方法。 １９．（ａ）ｓｒｆＡ、ｓｒｆＢ、ｓｒｆＣ、ｓｒｆＤおよびｓｆｐ遺伝子か らなる群から選択されるサーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成また は分泌に関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾を含有する一次核酸配列とバシ ラス細胞にとって生来のポリペプチドをコードする二次核酸配列とをバシラス細 胞中に導入し ；そして （ｂ）核酸配列を包含する工程（ａ）からの突然変異株を同定する； 工程を含んで成る請求項１７の突然変異株の獲得方法であって、突然変異株細胞 が、同一条件下で培養した場合にバシラス細胞より少ないサーファクチンまたは そのアイソフォームを産生することを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07 1:08 1:09 1:10 1:11 1:125） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アダムス，リー エフ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，コーウェル ブールバード 1880 (72)発明者 ブラウン，スティーブン アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，ミウォク プレイス 3708

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）バシラス（Bacillus）細胞の突然変異株を培養し、ここで、（ｉ） 該突然変異株は、ポリペプチドの産生を促す条件下で、ポリペプチドをコードす る一次核酸配列とサーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または分泌 に関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾を含有する二次核酸配列とを含み、そ して（ｉｉ）突然変異株は、同一条件下で培養された場合、バシラス細胞より少 ないサーファクチンまたはそのアイソフォームを産生し；そして （ｂ）ポリペプチドを培地から単離する； 工程を含んでなるポリペプチドの製造方法。 ２．バシラス細胞がバシラス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、 バシラス・アミロリクマファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラ ス・ブレビス(Bacillus brevis)、バシラス・サーキュランス（Bacillus circul ans）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バシラス・フィル ムス(Bacillus firmus)、バシラス・ラウトス(Bacillus lautus)、バシラス・レ ンタス(Bacillus lentus)、バシラス・リケンホルミス（Bacillus licheniformi s）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プミルス( Bacillus pumilus)、バシラス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearother mophilus)、バシラス・ズブチリス(Bacillus subtilis)またはバシラス・チュリ ンジエンシス（Bacillus thuringiensis）細胞である請求項１の方法。 ３．バシラス細胞がバシラス・ズブチリス細胞である請求項２の方法。 ４．バシラス細胞がバシラス・ズブチリスＡＴＣＣ ６０５１またはバシラス ・ズブチリスＡＴＣＣ ６０５１Ａである請求項３の 方法。 ５．バシラス細胞がバシラス・ズブチリスＮＣＦＢ ７３６である請求項３の 方法。 ６．遺伝子がｓｒｆオペロンの遺伝子である請求項１の方法。 ７．遺伝子がｓｒｆＡである請求項６の方法。 ８．遺伝子がｓｒｆＢである請求項６の方法。 ９．遺伝子がｓｒｆＣである請求項６の方法。 １０．遺伝子がｓｒｆＤである請求項６の方法。 １１．遺伝子がｓｆｐである請求項１の方法。 １２．同一条件下で培養した場合に、突然変異株がバシラス細胞よりも少なく とも約２５％少ないサーファクチンまたはそのアイソフォームを産生する請求項 １の方法。 １３．修飾がサーファクチンまたはそのアイソフオームの非発泡性変異体の産 生を引き起こす請求項１の方法。 １４．ポリペプチドがバシラス細胞と異種である請求項１の方法。 １５．突然変異株がプロテアーゼをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子の修 飾をさらに包含する請求項１の方法。 １６．遺伝子がｎｐｒＥおよび／またはａｐｒＥである請求項１５の方法。 １７．突然変異株がｓｐｏＩＩＡＣおよび／またはａｍｙＥ遺伝子の修飾をさ らに包含する請求項１の方法。 １８．異種ポリペプチドをコードする一次核酸配列とサーファクチンまたはそ のアイソフォームの生合成または分泌に関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾 を含有する二次核酸配列とを含むバラス細胞の突然変異株であって、同一条件下 で培養した場合にバシラス細胞より少ないサーファクチンまたはそのアイソフォ ームを産生す る突然変異株。 １９．生来のポリペプチドをコードする一次核酸配列とサーファクチンまたは そのアイソフォームの生合成または分泌に関与する少なくとも１つの遺伝子の修 飾を含有する二次核酸配列との少なくとも２つのコピーを包含するバシラス細胞 の突然変異株であって、同一条件下で培養した場合にバシラス細胞より少ないサ ーファクチンまたはそのアイソフォームを産生する突然変異株。 ２０．（ａ）サーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または分泌に 関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾を含有する一次核酸配列とバシラス細胞 にとって異種性であるポリペプチドをコードする二次核酸配列とをバシラス細胞 中に導入し；そして （ｂ）核酸配列を包含する工程（ａ）からの突然変異株を同定する； 工程を含んで成る請求項１９の突然変異株の獲得方法。 ２１．（ａ）サーファクチンまたはそのアイソフォームの生合成または分泌に 関与する少なくとも１つの遺伝子の修飾を包含する一次核酸配列とバシラス細胞 にとって生来のポリペプチドをコードする二次核酸配列とをバシラス細胞中に導 入し；そして （ｂ）核酸配列を包含する工程（ａ）からの突然変異株を同定する； 工程を含んで成る請求項１９の突然変異株の獲得方法。