WO2007043327A1 - 新規枯草菌変異株 - Google Patents

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WO2007043327A1
WO2007043327A1 PCT/JP2006/318986 JP2006318986W WO2007043327A1 WO 2007043327 A1 WO2007043327 A1 WO 2007043327A1 JP 2006318986 W JP2006318986 W JP 2006318986W WO 2007043327 A1 WO2007043327 A1 WO 2007043327A1
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region
strain
bacillus subtilis
fragment
gene
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PCT/JP2006/318986
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English (en)
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Ryosuke Kadoya
Keiji Endo
Masatoshi Tohata
Katsutoshi Ara
Naotake Ogasawara
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Kao Corporation
Nara Institute Of Science And Technology
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Publication date
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
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    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a novel Bacillus subtilis mutant, and more particularly, to a novel Bacillus subtilis mutant having improved secretory productivity of various proteins.
  • Bacillus subtilis is not only widely used in molecular biology research as a model of Gram-positive bacteria, but also widely used in the fermentation industry and the pharmaceutical industry as an amylase, protease, and other enzyme-producing bacteria. It's being used.
  • the complete base sequence of the Bacillus subtilis genome has already been determined by the Japan-European Joint Genome Project. The functional identification of about 4100 genes existing in the Bacillus subtilis genome has been completed.
  • Non-Patent Document 1 K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 20 03
  • Patent Document 1 JP-A-58-190390
  • Patent Document 2 JP-A-61-1381
  • Patent Document 3 International Publication No. 89/04866 Pamphlet
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 11-509096
  • Patent Literature 5 Patent No. 3210315
  • Patent Document 6 Special Table 2001-527401
  • Patent Document 7 Special Table 2002—520017
  • Patent Document 8 Special Table 2001— 503641
  • the present invention aims to provide a novel Bacillus subtilis mutant strain excellent in productivity of various enzymes by comprehensively analyzing gene-disrupted strains derived from Bacillus subtilis. Target.
  • the Bacillus subtilis mutant strain according to the present invention has a genome structure in which the region described in the column of the deletion region shown in Table 1 below is deleted.
  • the Bacillus subtilis mutant when the gene encoding the target protein is introduced so that it can be expressed, the secretory productivity of the target protein is significantly improved compared to the case where the gene is introduced into the wild type. ing.
  • the Bacillus subtilis mutant strain may be one into which a gene encoding the target protein has been introduced so as to be expressed.
  • the gene encoding the target protein contains a base sequence encoding a region corresponding to the secretion signal, or appropriately linked to DNA containing a base sequence encoding the region corresponding to the secretion signal upstream thereof.
  • the target protein may be at least one enzyme selected from the group consisting of cellulase, protease and amylase.
  • the Bacillus subtilis mutant strain may be prepared using 168 strains of Bacillus subtilis as a wild strain.
  • the genomic region described in the deletion region column in Table 1 below may include a region sandwiched by the oligonucleotides set in Table 2 below.
  • the invention's effect [0008] According to the present invention, a novel Bacillus subtilis mutant strain excellent in productivity of various enzymes can be provided.
  • Bacillus subtilis mutant according to the present invention not only can an industrial production method of various enzymes excellent in productivity be realized, but also biological materials useful for elucidation of production mechanisms of various enzymes and the like. Can be provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining an example of a method for deleting a predetermined region of Bacillus subtilis genome.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining a procedure for producing 168 ⁇ strain from Bacillus subtilis 168 strain.
  • FIG. 3 is a schematic diagram for explaining a procedure for preparing a recombinant plasmid pBRcatupp obtained by inserting a cat-upp cassette DNA fragment.
  • FIG. 4 is a schematic diagram for explaining a procedure for preparing a ⁇ deletion target region :: cat-upp strain.
  • FIG. 5 is a schematic diagram for explaining a procedure for preparing a ⁇ deletion target region strain.
  • FIG. 6 is a schematic diagram for explaining a procedure for producing a ⁇ deletion target region :: tet strain.
  • FIG. 7 pBR using C atupp A deletion target region is a schematic view for explaining a procedure of deleting the deletion target region in a predetermined mutant strain.
  • FIG. 8 is a schematic diagram for explaining the production process of a Bacillus subtilis mutant strain lacking a plurality of deletion regions according to the present invention.
  • the novel Bacillus subtilis mutant strain provided in the present invention can be obtained by deleting the large region of Bacillus subtilis genomic mosquito. These Bacillus subtilis mutants have improved secretory productivity of the target protein or polypeptide derived from the gene when the cloned gene is introduced.
  • the gene to be introduced may be either exogenous or endogenous as long as it encodes a protein.
  • the gene may contain a base sequence encoding a region corresponding to a secretion signal, or may be appropriately combined with DNA containing a base sequence encoding a region corresponding to a secretion signal in the upstream. It may be connected.
  • the gene may be introduced into the genome of a Bacillus subtilis mutant or may be introduced into an Bacillus subtilis mutant as an expression vector. Furthermore, the number of genes to be introduced may be one or plural. When multiple genes are introduced, multiple genes may be introduced in parallel on a single DNA fragment, or multiple genes may be introduced as different DNA fragments.
  • a method for introducing a gene conventionally known transformation methods, transduction methods and the like can be used without any limitation.
  • the gene to be introduced is not particularly limited, and examples thereof include secretory alkaline cellulase, secreted alkaline protease, and secreted alkaline amylase.
  • Table 1 shows the names and deletion regions of the novel Bacillus subtilis mutants according to the present invention.
  • each Bacillus subtilis mutant according to the present invention includes a genome in which other regions are deleted from the genomic DNA of a standard wild strain such as Bacillus subtilis 168 in addition to the deletion regions defined above. Some have a structure. Examples of other regions include a gene region excluding a growth essential gene and a non-coding region, and a region that does not decrease the above-described secretory productivity even if it is deleted on the genome is preferable.
  • the method for deleting the deletion region shown in Table 1 on the Bacillus subtilis genome is not particularly limited, and for example, the following method shown in Fig. 1 can be applied.
  • the deletion D prepared by the so-called S0E-PCR method (Gene, 77, 61 (1989))
  • the deletion region shown in Table 1 is deleted on the Bacillus subtilis genome by a method using a two-step single crossover method using a deletion plasmid inserted with an NA fragment.
  • the DNA fragment for deletion used in this method is an approximately 0.1 to 3 kb fragment adjacent to the upstream of the deletion target region (referred to as upstream fragment), and a DNA fragment (downstream fragment) in which approximately 0.1 to 3 kb fragment adjacent to the downstream is bound.
  • upstream fragment a DNA fragment adjacent to the downstream is bound.
  • a DNA fragment ligated to each other It is also possible to use a DNA fragment in which a drug resistance marker gene fragment such as a chloramphenicol resistance gene is bound downstream or upstream of the DNA fragment.
  • an upstream fragment and a downstream fragment of a deletion target gene, and if necessary, three fragments of a drug resistance marker gene fragment are prepared.
  • a primer to which a sequence of 10 to 30 base pairs at the end of the DNA fragment to be bound is added is designed.
  • a sequence corresponding to 10-30 bases upstream of the downstream fragment at the 5 ′ end of the primer positioned (annealed) at the downstream end of the upstream fragment is added to the 5 ′ end of the primer located at the upstream end of the downstream fragment (annealing).
  • the upstream fragment and the downstream fragment prepared in the first round are mixed to form a bowl, and the primer located on the upstream side (annealing) of the upstream fragment and the downstream side of the downstream fragment (key) Perform a second PCR using a pair of primers.
  • a deletion DNA fragment in which the upstream fragment and the downstream fragment are joined in this order can be amplified.
  • the drug resistance marker gene fragment is linked to the deletion DNA fragment
  • the drug resistance marker gene fragment is added so that a region corresponding to the downstream side of the downstream fragment is added in the first PCR. Amplify.
  • a pair of primers consisting of a primer located upstream of the upstream fragment (annealed) and a primer located downstream of the drug resistance marker gene fragment (annealed) are used. This For deletion of upstream fragment, downstream fragment and drug resistance marker gene fragment
  • DNA fragments can be amplified.
  • the deletion DNA fragment obtained by joining the upstream fragment and the downstream fragment in this order is amplified by the second PCR, the deletion DNA fragment is inserted into a plasmid containing a drug resistance marker gene, A DNA fragment for deletion having an upstream fragment, a downstream fragment and a drug resistance marker gene fragment in this order may be prepared.
  • the DNA fragment for deletion obtained by the above-mentioned method or the like is not amplified in a host bacterium using a normal restriction enzyme and DNA ligase, and can be easily obtained, such as plasmid DNA or a temperature sensitive plasmid.
  • a plasmid for deletion introduction is constructed by inserting the plasmid DNA into a removable plasmid DNA. Examples of plasmid DNA that is not amplified in the host bacterium include, but are not limited to, pUC18, pUC118, pBR322, and the like when Bacillus subtilis is used as the host.
  • the transformation of the host bacterium with the deletion plasmid is carried out by a combinatorial cell transformation method (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)) or the like, and the upstream fragment inserted into the plasmid or A transformant in which the deletion plasmid is fused into the genome DNA of the host fungus is obtained by homologous recombination between the downstream fragment and the homologous region on the genome.
  • a marker gene such as a chloramphee-chol resistance gene in the plasmid for introduction of deletion may be used as an index.
  • the sequence of upstream and downstream regions of the drug resistance gene on the genome to be deleted on the genome of the transformant obtained by culling is derived from the host fungus genome and the deletion plasmid. Duplicate things exist. Among these upstream or downstream regions, by causing homologous recombination in the genome in a region different from the region homologously recombined when obtaining the transformant, the drug on the genome together with the region derived from the deletion plasmid Deletion of target genes, such as resistance genes, occurs.
  • a method for causing homologous recombination in the genome for example, a method for inducing competence (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)) can be used.
  • Homologous recombination occurs. Strains that have undergone homologous recombination within the genome as intended can be selected from those strains that have become drug-sensitive because the drug resistance gene is lost at the same time and the drug resistance is lost. The For these strains, genomic DNA can be extracted and the deletion of the target gene can be confirmed by PCR.
  • a Bacillus subtilis mutant strain having a genome structure in which a predetermined region on the genome is deleted alone can be produced.
  • a Bacillus subtilis mutant strain having a genomic structure lacking a plurality of regions can be produced by a so-called LPQysis of protoplasts) transformation method.
  • LP transformation methods are described in “T. Akamatsu and J. Sekiguchi,“ Archives of Mi crobiologyj, 1987, 146th, p.353-357 ”and“ T. Akamatsu and ⁇ . Taguchi, “Bio science, Biotechnology, and Biochemistry J, 2001, Vol. 65, No. 4, p.823-829.
  • the LP transformation method protoplasts in which cell walls are lysed are used as donor DNA.
  • the added protoplast is destroyed by osmotic shock and released into the culture medium.
  • the donor DNA is believed to be incorporated into the recipient cell's competent cell.
  • the DNA damage to be introduced is greatly reduced as compared with general transformation methods.
  • a Bacillus subtilis mutant strain having a genome structure deleted alone is newly produced as a Bacillus subtilis mutant strain having a genome structure lacking a plurality of regions.
  • a Bacillus subtilis mutant strain having a genomic structure lacking a specific region referred to as the first deletion region
  • the second deletion region a different region is designated as the (second deletion region).
  • This set of interstrand exchange structures occurs at a position sandwiching the first deletion region in the donor DNA, so that the first deletion region in the donor DNA is introduced into the host DNA.
  • a Bacillus subtilis mutant strain having a genomic structure in which the first deletion region and the second deletion region are deleted can be produced.
  • a Bacillus subtilis mutant strain having a genomic structure lacking a plurality of regions can be produced as long as the gene essential for growth is not deleted.
  • the Bacillus subtilis mutant strain according to the present invention produced as described above has a protein or polypeptide encoded by the introduced gene as compared to a wild standard strain such as Bacillus subtilis 168. Excellent secretory production ability! / When you talk! It has several characteristics.
  • the target protein or target polypeptide produced using the Bacillus subtilis mutant of the present invention is not particularly limited. For example, industries used in various industries such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medicine, and diagnostics. Strength that can be used for industrial enzymes, bioactive peptides, etc. Industrial enzymes are particularly preferred.
  • Industrial enzymes are classified according to their functions: acid reductase (Oxidoreductase transferase (Transansase), hydrolase (Hydrolase), eliminase (Lyase), isomerase (Isomerase), and synthetic enzymes. (Ligase / Synthetase), etc.
  • preferred examples of the target protein produced using the Bacillus subtilis mutant of the present invention include hydrolases such as cellulase, hyalamylase, and protease. .
  • the production amount of the enzyme secreted outside the cells is significantly improved as compared with the case of introduction into the wild standard strain.
  • the secretory productivity of these enzymes in the Bacillus subtilis mutant strain according to the present invention can be measured by applying conventionally known various techniques without limitation.
  • the productivity of cellulase can be measured as follows as an example. First, a test Bacillus subtilis mutant is transformed using a vector having a cellulase gene. Next, after culturing the obtained transformant, a supernatant of the culture solution from which the cells have been removed is obtained by centrifugation or the like. Then, for example, p-nitrophenyl- ⁇ -D-cellotrioside (Seikagaku Corporation) is added to the obtained supernatant as a substrate, reacted for a predetermined time, and the amount of P-nitrophenol released when the reaction is performed is determined. Quantify by changing absorbance at 420nm (OD420nm).
  • the productivity of the cellulase encoded by the cellulase gene introduced into the mutant strain of Bacillus subtilis can be measured.
  • the cellulase productivity in the test Bacillus subtilis mutant can be evaluated as a relative value by measuring the cellulase productivity in a standard wild-type strain such as Bacillus subtilis 168.
  • cellulases examples include cellulases belonging to Family 5 in the polysaccharide hydrolase classification (Biochem. J., 280, 309, 1991). Among them, cellulases derived from microorganisms, particularly bacteria belonging to the genus Bacillus are preferred. is there.
  • alkaline cellulase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 116 and the alkaline cellulase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 118 showed about 92% identity in comparison between the amino acid sequences, V, Both are preferred as specific examples of cellulase used in the present invention, but alkaline cellulase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 116 is more preferred.
  • Bacillus subtilis mutants of the present invention those described in Table 1.
  • the productivity of protease can be measured as follows. First, a test Bacillus subtilis mutant is transformed using a vector having a protease gene. Next, after culturing the obtained transformant, a culture supernatant from which the cells have been removed is obtained by centrifugation or the like. Then, for example, Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANA Peptide Institute) was added to the resulting supernatant as a substrate, and the reaction was performed for a predetermined time. The amount of ⁇ -nitroaline released is determined by the change in absorbance at 420 (OD42 Onm).
  • the productivity of the protease encoded by the protease gene introduced into the mutant strain of Bacillus subtilis can be measured.
  • the protease productivity in standard wild strains such as Bacillus subtilis 168 strain can be evaluated as a relative value.
  • proteases include serine-boiled proteases derived from microorganisms, particularly Bacillus bacteria, metal proteases, and the like. More specific examples include alkaline protease derived from Bacillus clausii KSM-K16 strain (FE RM BP-3376) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 119, and 70%, preferably the amino acid sequence. Is an amino acid sequence-protease having an identity of 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more.
  • the productivity of alkaline amylase can be measured as follows as an example.
  • a Bacillus subtilis mutant strain is transformed using a vector having an alkaline amylase gene.
  • a culture supernatant from which the cells are removed is obtained by centrifugation or the like.
  • the activity of alkaline amylase contained in the supernatant can be measured using Liquitech Amy EPS (Roche Diagnostics) which is a kit for measuring amylase activity.
  • the productivity of the alkaline amylase encoded by the alkaline amylase gene introduced into the mutant strain of Bacillus subtilis can be measured.
  • the alkaline amylase productivity in the test Bacillus subtilis mutant can be evaluated as a relative value by measuring the alkaline amylase productivity in standard wild strains such as Bacillus subtilis 168.
  • amylase examples include (X amylase derived from microorganisms, and liquid amylase derived from bacteria belonging to the genus Bacillus is particularly preferred.
  • the gene of the target protein or polypeptide introduced into the Bacillus subtilis mutant of the present invention is a transcription region containing a regulatory region involved in transcription, translation, and secretion of the gene, ie, a promoter and a transcription start site. It is desirable that at least one region selected from an initiation regulatory region, a translation initiation region including a ribosome binding site and an initiation codon, and a secretory signal peptide region force are bound in an appropriate form. In particular, transcription initiation control region, translation initiation system It is preferable that the three regions of the control region and the secretory signal region are combined.
  • the secretory signal peptide region is derived from a cellulase gene of a bacterium belonging to the genus Bacillus, and a transcription initiation region and a translation initiation region are provided. What is the 0.6-lkb region upstream of the cellulase gene? It is desirable that the cellulase gene be bound in an appropriate form to the target protein or polypeptide gene.
  • bacteria belonging to the genus Bacillus that is, KSM-S237 strain (FERM BP-7875), KSM-64 strain (FERM BP It is desirable that the transcription initiation regulatory region, translation initiation region, and secretory signal peptide region of the cellulase gene derived from -2886) be appropriately linked to the structural gene of the target protein or polypeptide.
  • the base sequence of base numbers 1 to 659 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 115 the base sequence of base numbers 1 to 696 of the cellulase gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 117, and the base sequence 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, a DNA fragment consisting of a base sequence having the identity, or It is desirable that the DNA fragment consisting of a base sequence from which a part of the base sequence is deleted is properly bound to the structural gene of the target protein or polypeptide.
  • a DNA fragment consisting of a base sequence from which a part of the base sequence has been deleted is a part of the base sequence that has been deleted, but has functions related to gene transcription, translation, and secretion. It means a DNA fragment that is held and struck.
  • mutant strains with various regions on the genome deleted were produced using 168 strains of Bacillus subtilis as a wild strain.
  • the correspondence between the primer name, the base sequence, and the sequence number is shown in Table 10 at the end.
  • genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 strains is used as a saddle type, and upp-AFW and upp-ARV and upp-BFW and upp-BRV primer sets are used.
  • Relic 1 The Okb fragment (al) adjacent to the upstream of the gene (BG 13408; uracil phosphoribosyH: ransferase) and the 1. Okb fragment (bl) adjacent to the downstream were amplified by PCR.
  • a 1.2 kb fragment (cl) containing the erythromycin resistance gene was obtained by PCR. Prepared. The PCR reaction was carried out at 20 / z L and the attached protocol was used using LATaq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • plasmid DNAlng 200 nM each of the above primers, 200 ⁇ each of dATP, dTTP, dCTP, and dGTP, LATaqO.2U, and the accompanying 10 X buffer solution were mixed so as to be IX.
  • PCR system GeneAmp9700 manufactured by Applied Biosystems
  • 72 ° C The temperature was maintained at C for 60 seconds, this was repeated 25 times, and finally, extension was completed at 72 ° C for 30 seconds.
  • SPI medium 0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium trihydrate hydrate, 0.50% glucose, 0.02% casamino
  • SPI medium 0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium trihydrate hydrate, 0.50% glucose, 0.02% casamino
  • the culture was shaken in acid (Difco), 5 mM magnesium sulfate, 0.25 ⁇ M manganese chloride, 50 ⁇ g / ml tryptophan) at 37 ° C until the value of growth (OD600) reached about S1.
  • the plasmid pSM5022 (Mol. Microbiol. 6, 309, 1992), which has been confirmed to be transcribed in Bacillus subtilis, ensures that the upp gene and the chloramphee-chol-resistance gene (cat) are transcribed.
  • the upp gene was linked downstream of the cat gene. Specifically, a 1.3 kb DNA fragment containing cat was amplified by PCR using cat-Fw and cat-Rv primer sets and pSM5022 as a saddle. In addition, PCR was performed using primers upp-Fw and upp-RV, and the 168 strain genome was truncated, and a 1. lkb DNA fragment containing the upp gene was obtained.
  • the 168 strain genome is used as a saddle, and PCR is adjacent to the upstream of the Prol region by 0.6 kb. Fragment (A) and a downstream 0.3 kb fragment (B) were prepared.
  • the Prol region is described as “deletion target region”.
  • Cg + glucose agar medium (7% dipotassium hydrogen phosphate, 3% potassium dihydrogen phosphate, 0.5% sodium citrate) to which this transformant was added with various concentrations of 5FU (manufactured by Sigma Aldrich) 1% ammonium sulfate, 0.1% magnesium sulfate, 0.05% gnoretamic acid, 0.5% glucose, 10ng / mL L-tryptophan, 0.55 ⁇ 0.17 ⁇ g / mL salt ⁇ A 43 ng / mL salt ⁇ copper dihydrate, 60 ng ZmL cobalt chloride hexahydrate, 60 ng ZmL molybdate (IV) sodium unihydrate, 1.5% agar) In the medium supplemented with 5FU of 0.5 g / mL or more, the growth was not observed.
  • 5FU manufactured by Sigma Aldrich
  • the A Prol:: cat-upp strain genome is in a saddle shape and the cat-upp cassette fragment (C) is used with the Prol- AFW and Prol-ERV and Prol-FFW and Prol-BRV primer sets.
  • C cat-upp cassette fragment
  • E Upstream of the 0.6 kb fragment
  • F downstream of the 0.3 kb fragment
  • G A 0.9 kb fragment
  • both fragments were bound was prepared by SOE—PCR using a primer set.
  • ⁇ Prol cat-upp strain was transformed by a combinatorial method, and a strain capable of growing on Cg + glucose agar medium supplemented with 1 ⁇ g / mL / 5FU was obtained. . The obtained strain was confirmed to be sensitive to chloramphee-chol, and the Prol region on the genome and the cat-upp cassette DNA fragment were deleted, and this was designated as ⁇ Prol strain.
  • ⁇ Prol :: cat-upp strain and ⁇ Prol strain are described as “ ⁇ deletion target region :: cat-upp strain” and “ ⁇ deletion target region strain”, respectively.
  • a Pro2 :: cat-u is prepared according to the procedure described in FIG. pp strain, APro3 :: cat-upp strain, APro4 :: cat-upp strain, APro5 :: cat-upp strain, APro6 :: cat-upp strain, APro7 : cat-upp strain, APBSX :: cat-upp strain ASPjS :: cat-upp strain, ⁇ SKIN : cat-upp strain, Apks :: cat-upp strain and Apps :: cat-upp strain were prepared.
  • 8 strain, ⁇ SKIN strain, Apks strain and Apps strain were prepared by the method described in FIG. Table 3 below shows the primer sets used to amplify fragment (A) to fragment (G) in the process of preparing each of these strains.
  • ⁇ ⁇ 7 strain also referred to as MGB01 strain.
  • double deletion strains of Pro7 region and Pro6 region were constructed as follows.
  • a Pro6 cat-upp strain genomic DNA in which the Pro6 region was replaced with a cat-upp cassette fragment was transformed into ⁇ ⁇ 7 strain by a combinatorial method, and LB agar containing lOppm of chloram fe-col. Colonies that grew on the medium were isolated as transformants.
  • the obtained chloramphee-cholesterol resistant transformant was transformed by a combination method using genomic DNA of ⁇ 6 strain, and added with 1 ⁇ g / mL of 5FU.
  • a strain capable of growing on an agar medium was obtained.
  • the resulting strain was confirmed to be susceptible to chloramphee-chol, and both a Pro6 region and a Pro7 region were deleted, and a double deletion strain containing no cat-upp cassette fragment was isolated. This strain was designated as MGB02 strain.
  • the MGB03 strain in which the Pro7 region, the Pro6 region, and the Prol region were sequentially deleted was constructed.
  • the MGB04 strain in which the Pro7 region, the Pro6 region, the Prol region, and the Pro4 region were sequentially deleted was constructed.
  • the MGB05 strain was constructed in which the Pro7 region, Pro6 region, Prol region, Pro4 region and PBSX region were sequentially deleted.
  • the MGB06 strain in which the Pro7 region, the Pro6 region, the Prol region, the Pro4 region, the PBSX region, and the Pro5 region were sequentially deleted was constructed.
  • the MGB07 strain was constructed in which the Pro7 region, Pro6 region, Prol region, Pro4 region, PBSX region, Pro5 region and Pro3 region were sequentially deleted.
  • the tetracycline resistance gene region fragment CO was amplified using a primer set of tet-FW and tet-RV.
  • SOE-PCR with primers spB-AFW and spB-BRV was performed using the obtained PCR-amplified fragment (H) (I) ⁇ as the saddle shape, and the three fragments were (H) (J) (I) in this order. They were combined so that Using the obtained DNA fragment (K), the above-described 168 A upp strain was transformed by a combinatorial method, and a transformant capable of growing on an LB agar medium containing 15 ppm of tetracycline was isolated.
  • the obtained transformant was confirmed by PCR to delete the SP ⁇ region with a genomic force and replaced with a tetracycline-resistant gene fragment, and this was designated as A SP
  • 8 tet strain.
  • 8: strain is described as “ ⁇ deleted target region: strain”.
  • the ⁇ Pro7 strain was transformed with the genomic DNA of the ⁇ SP
  • the genomic strength of the tetracytalin resistance gene fragment was removed as follows.
  • the genomic DNA of the selected strain was used as a saddle and PCR was performed to confirm that the SP ⁇ region and the tetracycline resistance gene fragment were deleted, and strain MGB08 was obtained.
  • MGB09 strain A strain in which the pks region was deleted from the MGB08 strain was named MGB09 strain.
  • MGB09 strain A strain in which the pks region was deleted from the MGB08 strain was named MGB09 strain.
  • pps region of MGB10 strain produced above was performed using the ⁇ pps :: tet strain according to the method described above (FIG. 7).
  • a strain in which the pps region was deleted from MGB10 strain was named MGB11 strain.
  • the pps region was deleted without restoring other regions.
  • a strain in which the Pro2 region was deleted from MGB11 strain was named MGB12 strain.
  • MGB12 strain When the obtained genomic DNA of the MGB12 strain was confirmed by PCR, the Pro2 region was deleted without restoring other regions.
  • the Pro5 region was deleted from the MGB12 strain prepared above according to the method described above (Fig. 7).
  • a strain in which the Pro5 region was deleted from MGB12 strain was designated as MGBlld strain.
  • the MGBlld strain prepared as described above is the Pro6 (yoaV-yobO) region, ProKybbU-ybdE) region, Pro4 (yjcM-yjdj) region, PBSX (ykdA-xlyA) region in Bacillus subtilis 168 strain, Pro5 (y nxB-dut) region, Pro3 (ydiM-ydjC) region, SP j8 (yodU-ypqP) region, pks (pksA-ymaC) region, SKIN (spoIVCB-spoIIIC) region, pps (ppsE-ppsA) region And Pro2 (ydcL-ydej) region has a deleted genomic structure.
  • the Bacillus subtilis mutant strain according to the present invention was prepared from the MGB1 Id strain prepared as described above (see FIG. 8) as follows. That is, according to the method described above (FIG. 7), deletion of the NE D0302 region of the MGBlld strain was performed using the ANED0302 :: tet strain. A strain in which the NED0302 region was deleted from the MGBlld strain was named MGB533 strain. The obtained MGB533 strain has a genomic structure in which the NED0302 region is deleted in addition to the deletion region in the MGBlld strain.
  • the NED0803 region, the NED3200 region, the NED1902 region, the NED0501 region, the NED0400 region, the NED1100 region, and the NED4002 region were deleted in that order to construct a mutant strain.
  • the constructed mutants were named MGB559, MGB592, MGB604, MGB625, MGB653, MGB683 and MGB781, respectively.
  • the NED3200 region includes the Pro2 region, and the actual region deleted from the MGB559 strain when constructing the MGB592 strain is the ydeK-ydhU region.
  • the NED1902 region contains the SP ⁇ region, and the actual regions deleted from the MGB592 strain during the construction of the MGB604 strain are the cge E-phy region and the yppQ-ypmQ region.
  • the NED0400 region includes the Pro3 region, and the actual region deleted from the MGB625 strain during the construction of the MGB653 strain is the gutR-yebA region.
  • deletion of the NED40002 region from the constructed MGB625 strain was performed using the A NED40002 :: tet strain in accordance with the method described above (Fig. 7).
  • a strain in which the NED40002 region was deleted from MGB625 strain was designated as MGB723 strain.
  • the NED02021 region, the SKIN-Pro7 region, the NED3701 region, the NED0600 region, the NED4100 region, the NED2702 region, the NED0400 region, and the NED1100 region were deleted in this order to construct a mutant strain.
  • the constructed mutant strains were named MGB773 strain, MGB822 strain, MGB834 strain, MGB846 strain, MGB872 strain, MGB885 strain, MGB913 strain and MGB943 strain, respectively.
  • the SKIN-Pro7 region contains the SKIN region, and the actual region deleted from the MGB773 strain during the construction of the MGB822 strain is the yrkS-yraK region.
  • NED0400 contains the Pro3 region, and the actual region deleted from the MGB885 strain when constructing the MGB913 strain is the region of utR-yebA.
  • the NED1602 region and the NED2702 region were deleted in order to construct a mutant strain.
  • the constructed mutant strains were named MGB874 strain and MGB887 strain, respectively.
  • Table 4 below shows primer sets used for amplifying fragment (H) to fragment (N) in the step of producing each of these strains.
  • the NED0100 region includes the Prol region
  • the NED0302 region includes the Pro2 region
  • the NED1500 region includes the pks region
  • the NED1802 region includes the Pro6 region
  • the NED2500 region includes the SKIN-Pro7 region.
  • a mutant strain was constructed by substituting a specific region with a cat-upp cassette fragment according to the method shown in FIG. .
  • Fragment (A), Fragment (B), Fragment (C) and Fragment (D) in FIG. 4 are represented as Fragment (0), Fragment (P), Fragment (Q) and Fragment (R), respectively. It is called.
  • Table 6 below shows the primer sets used to amplify fragment (P) to fragment (R) in the process of producing each of these strains.
  • the replacement of the region with the chloramphenicol resistance gene was performed by first replacing the target region with the tetracycline resistance gene, and then replacing the center of the tetracycline resistance gene with the chloramphenicol resistance gene.
  • Table 7 summarizes the regions to be replaced with the chlorambue-chol resistance gene.
  • the NED0400 region includes the Pro3 region
  • the NED1002 region includes the Pro4 region
  • the NED1003 region includes the PBSX region
  • the NED1902 region includes the SP j8 region.
  • NED0301-AFW and NED0301-ARV NED0301-BFW and NED0301-BRV primer sets
  • S 0.6 kb fragment adjacent to the upstream of the NED0301 region by PCR
  • T 0.3 kb fragment
  • U tetracycline resistance gene region fragment
  • the upstream 0.5 kb fragment (W) and the downstream 0.5 kb fragment of the tetracycline resistance gene Piece (X) was amplified. Furthermore, using the plasmid PSM5022 used in Example 1 as a saddle, a 1.3 kb fragment (Y) containing the chloramphee-chol resistance gene was amplified using cat-FW and cat-RV.
  • Example 3 the secretory productivity of the Bacillus subtilis mutant strains according to the present invention produced in Examples 1 and 2 was evaluated.
  • alkaline cellulase, alkaline protease, and alkaline amylase were used as target proteins to be introduced into the Bacillus subtilis mutant.
  • alkaline cellulase secretion productivity was performed as follows.
  • the alkaline cellulase gene fragment (3.1 kb) derived from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) is the BamHI restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK.
  • the recombinant plasmid PHY-S237 inserted into was introduced into each strain by protoplast transformation. Recombinant strains obtained in this way were added to 10 mL of LB medium.
  • genomic DNA extracted from Bacillus clausii KSM-K16 strain (FERM BP-3376) was used as a cage, and PCR was performed using a primer set of S237pKAPpp-F and KAPter-R (Bglll).
  • a 1.3 kb DNA fragment encoding an alkaline protease having an amino acid sequence (Appl. Microbiol. BiotechnoL, 43, 473, (199 5)) was amplified.
  • KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a saddle type
  • PCR was performed using the S237ppp-F2 (BamHI) and S237pKAPpp-R primer sets.
  • a 0.6 kb DNA fragment containing the promoter region of the alkaline cellulase gene Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081 was amplified.
  • the two fragments obtained were mixed to form a cage, and SOE-PCR using a primer set of S237ppp-F2 (BamHI) and KAPter-R (Bglll) was performed, so that the promoter region of the alkaline cellulase gene was obtained.
  • a 1.8 kb DNA fragment to which an alkaline protease gene was ligated downstream was obtained.
  • the obtained 1.8 kb DNA fragment was inserted into the BamHI-Bglll restriction enzyme cleavage point of the shuttle vector pHY300PLK (carton) to construct a plasmid pHYKAP (S237p) for evaluating alkaline protease productivity.
  • the constructed plasmid pHYKAP (S237p) was introduced into each strain by protoplast transformation.
  • the recombinant strain thus obtained was subjected to shaking culture for 3 days under the same conditions as in the above-mentioned evaluation of alkaline cellulase secretion production. After incubation, the cells are centrifuged The alkaline protease activity of the culture supernatant was measured, and the amount of alkaline protease secreted and produced outside the cells by culture was determined.
  • the activity of protease in the culture supernatant was measured as follows. That is, on the culture diluted appropriately with 2 mM CaCl solution.
  • the secretion productivity of alkaline amylase was evaluated as follows. Specifically, genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) was used as a template, and PCR was performed using primer sets of K38matu-F2 (ALAA) and SP64K38-R (Xbal). Then, a 1.5 kb DNA fragment encoding alkaline amylase (Appl. Environ. Microbiol, 67, 1744, (2001)) was amplified. In addition, genomic DNA extracted from Bacillus sp.
  • KSM-S237 strain (FERM BP-7 875) was used as a template, and PCR was performed using primer sets of S237ppp-F2 (BamHI) and S237ppp-R2 (ALAA). Then, a 0.6 kb DNA fragment containing the promoter region of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081) and the region encoding the secretory signal sequence was amplified.
  • the constructed plasmid pHYK38 (S237ps) was introduced into each strain by protoplast transformation.
  • the recombinant strain obtained in this manner was subjected to shaking culture for 5 days under the same conditions as those described above for evaluation of alkaline cellulase secretion production.
  • alkaline amylase activity is measured in the supernatant of the culture solution from which the cells have been removed by centrifugation. The amount of secreted amylase was determined.
  • Liquitech Amy EPS (Roche Diagnostics) was used to measure the amylase activity in the culture supernatant.
  • Table 9 summarizes the secretory production capacities of alkaline cellulase, alkaline protease, and alkaline amylase.
  • the secretory production ability of various enzymes is shown as a relative value when the amount of enzyme production in Bacillus subtilis 168 strain into which each gene is similarly introduced is defined as 100.

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Abstract

　枯草菌に由来する遺伝子破壊株を網羅的に解析し、各種酵素の生産性に優れた新規な枯草菌変異株を提供する。 　本発明に係る枯草菌変異株は、欠損領域の欄に記載された領域を欠失させたゲノム構造を有するものである。この枯草菌変異株は、分泌型の目的タンパク質をコードする遺伝子が発現可能に導入された際に、当該目的タンパク質の分泌生産性が、野生株に同遺伝子が導入された場合と比較して有意に向上している。

Description

新規枯草菌変異株
技術分野
[0001] 本発明は、新規な枯草菌変異株に関し、特に、各種タンパク質の分泌生産性が向 上した新規枯草菌変異株に関する。
背景技術
[0002] 枯草菌は、グラム陽性菌のモデルとして広く分子生物学の研究に供されているのみ ならず、アミラーゼやプロテアーゼと!、つた各種酵素の生産菌として発酵工業及び医 薬品工業等に広く利用されている。 日欧共同ゲノムプロジェクトにより、枯草菌ゲノム の全塩基配列が既に決定されている力 枯草菌ゲノムに存在する約 4100種類の遺 伝子に関する機能同定は完了して 、な 、。
[0003] 現在まで、枯草菌ゲノムに存在する約 4100種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研 究され、 271個の遺伝子が成育に必須であることが指摘されている (非特許文献 1)。
[0004] また、枯草菌等の胞子形成初期に関わる遺伝子やプロテアーゼ遺伝子、又は細胞 壁或いは細胞膜中のティコ酸への D-ァラニン付加に関わる遺伝子、更にはサーファ クチンの生合成或いは分泌に関わる遺伝子を単独に欠失又は不活性ィ匕した菌株が 構築されている (特許文献 1、特許文献 2、特許文献 3、特許文献 4、特許文献 5、特 許文献 6、特許文献 7、特許文献 8参照)。し力しながら、それらの菌株によるタンパク 質の生産性の向上は十分ではなぐまた、現在まで、各種タンパク質の生産性が向 上した枯草菌由来の変異株及び当該変異株の網羅的解析に関する有用な知見は 得られていない。
非特許文献 1 : K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 20 03
特許文献 1：特開昭 58-190390号公報
特許文献 2：特開昭 61-1381号公報
特許文献 3：国際公開第 89/04866号パンフレット
特許文献 4：特表平 11-509096号公報 特許文献 5 :特許第 3210315
特許文献 6：特表 2001-527401
特許文献 7：特表 2002— 520017
特許文献 8：特表 2001— 503641
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、枯草菌に由来する遺伝子破壊株を網羅 的に解析し、各種酵素の生産性に優れた新規な枯草菌変異株を提供することを目 的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 上記課題を解決するため、本発明者らは、枯草菌ゲノムの大領域を欠失させた変 異株を網羅的に解析し、各種酵素の生産性に優れた多くの枯草菌変異株を取得す ることに成功し、発明を完成するに至った。
[0007] 本発明に係る枯草菌変異株は、下記表 1に示す、欠損領域の欄に記載された領域 を欠失させたゲノム構造を有するものである。この枯草菌変異株は、目的タンパク質 をコードする遺伝子が発現可能に導入された際に、当該目的タンパク質の分泌生産 性が、野生株に同遺伝子が導入された場合と比較して有意に向上している。また、 枯草菌変異株は目的タンパク質をコードする遺伝子が発現可能に導入されたもので あってもよい。更に、目的タンパク質をコードする遺伝子は、分泌シグナルに相当す る領域をコードする塩基配列を含むか、或いは、その上流において分泌シグナルに 相当する領域をコードする塩基配列を含む DNAと適切に連結したものであってもよい 。ここで、上記目的タンパク質はセルラーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼからなる群 力も選ばれる少なくとも 1つの酵素であってもよい。さらにまた、枯草菌変異株は、枯 草菌 168株を野生株として作製されたものであってもよい。さら〖こ、下記表 1における 欠損領域の欄に記載されたゲノム領域は、下記表 2のオリゴヌクレオチド 'セットにより 挟み込まれる領域を含むものであってもよ 、。
発明の効果 [0008] 本発明により、各種酵素の生産性に優れた新規な枯草菌変異株を提供することが できる。本発明に係る枯草菌変異株を用いることによって、生産性に優れた各種酵 素の工業的生産方法を実現することができるのみならず、各種酵素の産生メカニズ ム等の解明に有用な生物材料を提供することができる。
[0009] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-298406号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]枯草菌のゲノム上力 所定の領域を欠失させる方法の一例を説明するための 模式図である。
[図 2]枯草菌 168株から 168 Δ ιιρρ株を作製する手順を説明するための模式図である。
[図 3]cat-uppカセット DNA断片を挿入してなる組換えプラスミド pBRcatuppを作製す る手順を説明するための模式図である。
[図 4] Δ欠失標的領域:: cat-upp株を作製する手順を説明するための模式図である。
[図 5] Δ欠失標的領域株を作製する手順を説明するための模式図である。
[図 6] Δ欠失標的領域:: tet株を作製する手順を説明するための模式図である。
[図 7]pBRCatupp A欠失標的領域を用いて、所定の変異株における欠失標的領域を 欠失させる手順を説明するための模式図である。
[図 8]本発明に係る複数の欠失領域を欠失した枯草菌変異株の作製過程を説明す るための模式図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0012] 本発明にお 、て提供される新規な枯草菌変異株は、枯草菌ゲノムカも大領域を欠 失させることで取得できる。これら枯草菌変異株は、クローユングした遺伝子を導入し た場合に当該遺伝子に由来する目的タンパク質またはポリペプチドの分泌生産性が 向上したものである。ここで、導入する遺伝子は、タンパク質をコードするものであれ ば良ぐ外来性及び内在性のいずれであっても良い。当該遺伝子は、分泌シグナル に相当する領域をコードする塩基配列を含むものであってもよいし、或いは、その上 流において分泌シグナルに相当する領域をコードする塩基配列を含む DNAと適切に 連結したものであってもよい。また、当該遺伝子は、枯草菌変異株のゲノムに導入さ れても良いし、発現ベクターとして枯草菌変異株に導入されてもよい。さらに、導入す る遺伝子は、 1つであっても良いし、複数であっても良い。複数の遺伝子を導入する 場合には、複数の遺伝子を 1つの DNA断片上に並列させて導入しても良いし、複数 の遺伝子をそれぞれ異なる DNA断片として導入してもよ ヽ。遺伝子を導入する手法と しては、何ら限定されることなぐ従来公知の形質転換方法、形質導入方法等を使用 することができる。
[0013] また、導入する遺伝子としては、特に限定されな!ヽが、例えば、分泌型アルカリセル ラーゼ、分泌型アルカリプロテアーゼ及び分泌型アルカリアミラーゼを挙げることがで きる。
[0014] 本発明に係る新規枯草菌変異株の名称及び欠失領域を表 1に示す。
[表 1]
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
9
9868l£/900Zdf/X3d LZ££ 0/L00Z OAV
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
なお、表 1に示した欠失領域は、表 2に示す一対のオリゴヌクレオチド 'セットにより 挟み込まれる領域として言 ヽ換えることができる。
[表 2]
Figure imgf000010_0001
[0019] なお、本発明に係る各枯草菌変異株には、枯草菌 168株等の標準野生株のゲノム DNAから上述のように定義した欠失領域に加えてその他の領域を欠失したゲノム構 造を有するものも含まれる。その他の領域としては、例えば、生育必須遺伝子を除く 遺伝子領域及び非コード領域が挙げられ、ゲノム上力 欠失しても上述した分泌生 産能を低下させな 、領域が好ま 、。
[0020] 表 1に示した欠失領域を枯草菌ゲノム上力 欠失させる方法としては、特に限定さ れないが、例えば図 1に示す以下の方法を適用することができる。
[0021] すなわち、いわゆる S0E- PCR法（Gene,77,61 (1989))によって調製される欠失用 D NA断片を挿入した欠失用プラスミドを用いた 2段階の 1重交差法を用いる方法によつ て、表 1に示した欠失領域を枯草菌ゲノム上力 欠失させる。本方法で用いる欠失用 DNA断片は、欠失対象領域の上流に隣接する約 0.1〜3kb断片 (上流断片と称する） 、同じく下流に隣接する約 0.1〜3kb断片が結合した DNA断片（下流断片と称する）と を連結した DNA断片である。また当該 DNA断片の下流或 、は上流にクロラムフエニコ ール耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させた DNA断片を用い ることちでさる。
[0022] まず、 1回目の PCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに 必要に応じて薬剤耐性マーカー遺伝子断片の 3断片を調製する。この際、結合対象 となる DNA断片の末端 10〜30塩基対の配列を付加したプライマーを設計する。例え ば、上流断片及び下流断片をこの順で結合させる場合、上流断片の下流末端に位 置する（ァニールする）プライマーにおける 5'末端に、下流断片の上流側 10〜30塩 基に相当する配列を付加し、また下流断片の上流末端に位置する (ァニールする） プライマーにおける 5'末端に、上流断片の下流側 10〜30塩基に相当する配列を付 加する。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片及び下流断片を増幅 した場合、増幅された上流断片の下流側には下流断片の上流側に相当する領域が 付加されることとなり、増幅された下流断片の上流側には上流断片の下流側に相当 する領域が付加されることとなる。
[0023] 次に 1回目に調製した上流断片及び下流断片を混合して铸型とし、上流断片の上 流側に位置する（ァニールする）プライマー及び下流断片の下流側に位置する（ァ- ールする）プライマーからなる 1対のプライマーを用いて 2回目の PCRを行う。この 2回 目の PCRにより、上流断片及び下流断片をこの順で結合した欠失用 DNA断片を増幅 することができる。
[0024] なお、欠失用 DNA断片に薬剤耐性マーカー遺伝子断片を連結する場合には、 1回 目の PCRにおいて、下流断片の下流側に相当する領域を付加するように、薬剤耐性 マーカー遺伝子断片を増幅する。さらに 2回目の PCRにおいて、上流断片の上流側 に位置する（ァニールする）プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側に 位置する（ァニールする）プライマーからなる一対のプライマーを使用する。これによ り、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片の順で結合した欠失用
DNA断片を増幅することができる。
[0025] また、上流断片及び下流断片をこの順で結合した欠失用 DNA断片を 2回目の PCR によって増幅した後、薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに欠失用 DNA断片 を挿入することで、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片をこの順 で有する欠失用 DNA断片を調製しても良い。
[0026] 更に、上述の方法などによって得られる欠失用 DNA断片を、通常の制限酵素と DN Aリガーゼを用いて宿主菌内で増幅されな 、プラスミド DNA、又は温度感受性プラス ミド等、容易に除去できるプラスミド DNAに挿入することによって、欠失導入用プラスミ ドを構築する。宿主菌内で増幅されないプラスミド DNAの例としては、例えば枯草菌 を宿主とする場合、 pUC18、 pUC118、 pBR322などが挙げられる力 これらに限定され るものではない。
[0027] 次 、で、欠失用プラスミドによる宿主菌の形質転換をコンビテントセル形質転換法 ( J. Bacteriol. 93, 1925 (1967))などによって行い、プラスミドに挿入された上流断片或 いは下流断片とゲノム上の相同領域間での 1重交差の相同組換えによって欠失用プ ラスミドが宿主菌ゲノム DNA内に融合した形質転換体を得る。形質転換体の選択に は欠失導入用プラスミドのクロラムフエ-コール耐性遺伝子などのマーカー遺伝子に よる薬剤耐性を指標に行えば良い。
[0028] カゝくして得られる形質転換体のゲノム上には欠失すべきゲノム上の薬剤耐性遺伝 子の上流領域及び下流領域の配列について、宿主菌ゲノム由来と欠失用プラスミド に由来するものが重複して存在している。この上流領域又は下流領域のうち、形質 転換体を獲得する際に相同組換えした領域と異なる領域でゲノム内相同組換えを起 こさせることにより、欠失用プラスミド由来の領域と共にゲノム上の薬剤耐性遺伝子な ど欠失すべき標的遺伝子の欠失が生じる。ゲノム内の相同組換えを起こさせる方法 としては、例えばコンビテンスを誘導する方法 (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967))が挙げ られる力 単に通常の培地での培養中においても自然誘発的に相同組換えが生じる 。 目的通りにゲノム内相同組換えを起こした菌株は同時に薬剤耐性遺伝子を欠失し て薬剤に対する耐性能を失うため、薬剤感受性となった菌株より選択することができ る。こうした菌株カもゲノム DNAを抽出し、 PCR法などによって目的遺伝子の欠失を確 認すれば良い。
[0029] 目的の欠失株を選択する際、薬剤耐性から感受性に変化した菌株を直接選択する ことは難しぐまたゲノム内での相同組換えは約 10— 4以下の低い頻度で生じるものと考 えられる。そこで、目的欠失株を効率的に取得するためには薬剤感受性株の存在比 率を高めるなどの工夫を施すことが望ましい。薬剤感受性株の濃縮方法としては、例 えばアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質力 増殖細胞に対して殺菌的に作用し 、一方、非増殖細胞には作用しないことを利用した濃縮法 (Methods in Molecular Ge netics, Cold Spring Harbor Labs, (1970))などが挙げられる。アンピシリンなどによる 濃縮を行う場合、例えばテトラサイクリンやクロラムフエ-コールなどの様に宿主細胞 に対して静菌的に作用する薬剤に対する耐性遺伝子の欠失に関して有効である。こ うした静菌的作用の薬剤を適量含む適当な培地において、当該薬剤耐性遺伝子を 保持する耐性株は増殖可能であり、当該薬剤耐性遺伝子を欠失した感受性株は増 殖も死滅もしな 、。この様な条件下にお 、て適当な濃度のアンピシリンなどのべ-シ リン系抗生物質を添加して培養を行うと、増殖しょうとする耐性株が死滅する一方、感 受性株はアンピシリンなどの作用を受けず、結果として感受性株の存在比率が高ま ることになる。この様な濃縮操作を行った培養液を適当な寒天培地に塗抹、培養し、 出現したコロニーのマーカー薬剤に対する耐性の有無をレプリカ法などによって確 認することにより、効率的に感受性株を選択することが可能となる。
[0030] 以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を単独で欠失したゲノム構造を有する枯 草菌変異株を製造することができる。さらに、複数の領域を欠失したゲノム構造を有 する枯草菌変異株は、いわゆる、 LPQysis of protoplasts)形質転換方法によって製造 することができる。 LP形質転換法は、『T. Akamatsu及び J. Sekiguchi, 「Archives of Mi crobiologyj , 1987年，第 146卷， p.353- 357』及び『T. Akamatsu及び Η. Taguchi, 「Bio science, Biotechnology, and BiochemistryJ , 2001年，第 65卷，第 4号， p.823- 829』を 参照することで利用することができる。すなわち、 LP形質転換法では、細胞壁を溶解 させたプロトプラストを供与体 DNAとして、レシピエント菌株のコンビテントセルに供与 する。添加されたプロトプラストは浸透圧ショックにより破壊され、培養液中に放出され た供与体 DNAがレシピエント菌株のコンビテントセルに取り込まれるものと考えられて いる。また、 LP形質転換方法によれば、一般的な形質転換方法に比べて、導入すベ き DNAの損傷は大幅に軽減する。
[0031] この LP形質転換法を適用することによって、単独で欠失したゲノム構造を有する枯 草菌変異株力 複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株をあらたに 製造することができる。具体的には、先ず、特定の領域 (第 1の欠失領域と呼ぶ)を欠 失したゲノム構造を有する枯草菌変異株をプロトプラストィ匕し、異なる領域を (第 2の 欠失領域)を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株のコンビテントセルと共存さ せる。これにより、第 1の欠失領域を有するゲノム DNA (供与体 DNA)と、第 2の欠失領 域を有するゲノム DNA (宿主 DNA)との間で一組の鎖間交換構造を形成することとな る。この一組の鎖間交換構造が供与体 DNAにおける第 1の欠失領域を挟み込んだ 位置で生じることによって、供与体 DNAにおける第 1の欠失領域が宿主 DNAに導入 されることとなる。このようにして、 LP形質転換法を適用することによって、第 1の欠失 領域及び第 2の欠失領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株を製造するこ とができる。この方法を応用すれば、成育に必須な遺伝子を欠失しない限り、複数の 領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株を製造することができる。
[0032] 以上のようにして製造された本発明に係る枯草菌変異株は、枯草菌 168株等の野 生標準菌株と比較して、導入した遺伝子によりコードされるタンパク質またはポリぺプ チドの分泌生産能が優れて！/ヽると！ヽつた特徴を有する。本発明の枯草菌変異株を用 いて生産される目的タンパク質又は目的ポリペプチドは、特に限定されず、例えば洗 剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業に使用される産業用酵素 や生理活性ペプチドなどが挙げられる力 特に産業用酵素であることが好ましい。産 業用酵素には、機能別に分類すると、酸ィ匕還元酵素 (Oxidoreductase 転移酵素 (Tr ansferase)、加水分解酵素 (Hydrolase)、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase)及 び合成酵素 (Ligase/Synthetase)等が含まれる。この中でも、本発明の枯草菌変異株 を用いて生産される目的タンパク質としては、好適には、セルラーゼ、ひ -アミラーゼ、 プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
[0033] 例えば、遺伝子としてセルラーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼを導入した枯草菌 変異株においては、野生標準菌株に導入した場合と比較して菌体外に分泌する酵 素生産量が著しく向上して 、る。本発明に係る枯草菌変異株におけるこれら酵素の 分泌生産性は、従来公知の各種手法を限定されることなく適用して測定することがで きる。
[0034] セルラーゼの生産性は、一例として以下のようにして測定することができる。先ず、 セルラーゼ遺伝子を有するベクターを用いて供試枯草菌変異株を形質転換する。次 に、得られた形質転換体を培養した後、遠心分離等によって菌体を除いた培養液上 清を得る。そして、得られた上清に基質として例えば、 p-nitrophenyl- β -D-cellotrios ide (生化学工業)を添加し、所定時間反応させ、反応を行った際に遊離する P-ニトロ フエノール量を 420nmにおける吸光度 (OD420nm)変化により定量する。これにより、供 試枯草菌変異株に導入したセルラーゼ遺伝子にコードされるセルラーゼの生産性を 測定することができる。なお、枯草菌 168株等の標準野生株におけるセルラーゼの生 産性を同様に測定することで、供試枯草菌変異株におけるセルラーゼ生産性を相対 値として評価することができる。
[0035] セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991 )中でファミリー 5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特に Bacillus 属細菌由来のセルラーゼが好適である。より具体的な例として、配列番号 116で示さ れるアミノ酸配列からなる Bacillus属細菌 KSM- S237株（FERM BP-7875)由来のアル カリセルラーゼ、または、配列番号 118で示されるアミノ酸配列力 なる Bacillus属細菌 KSM-64株（FERM BP-2886)由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列 と 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好 ましくは 98%以上の同一性を有するアミノ酸配列力 なるセルラーゼが挙げられる。 尚、配列番号 116で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼと配列番号 118 で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼは、アミノ酸配列間の比較にお Vヽて約 92%の同一性を示し、 V、ずれも本発明で用いるセルラーゼの具体的な例とし ては好適であるが、配列番号 116で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ がより好適である。
[0036] 力かるセルラーゼの生産においては、本発明の枯草菌変異株のうち、表 1記載の中 の MGB653株、 MGB683株、 MGB781株、 MGB723株、 MGB773株、 MGB822株、 MGB 834株、 MGB846株、 MGB872株、 MGB885株、 MGB913株、 MGB860株、 MGB874株、 MGB887株、 NED02021株、 NED0400株、 NED0600株、 NED0803株、 NED0804株、 N ED1100株、 NED1200株、 NED1400株、 NED1500株、 NED1901株、 NED1902株、 NE D2201株、 NED2202株、 NED2402株、 NED2500株、 NED2602株、 NED2702株、 NED2 802株、 NED3000株、 NED3200株、 NED3303株、 NED3701株、 NED3800株、 NED400 0株、 NED4001株、 NED4002株及び NED4100株から選ばれる枯草菌変異株を用いる のがより好ましい。
[0037] プロテアーゼの生産性は、一例として以下のようにして測定することができる。先ず 、プロテアーゼ遺伝子を有するベクターを用いて供試枯草菌変異株を形質転換する 。次に、得られた形質転換体を培養した後、遠心分離等によって菌体を除いた培養 液上清を得る。そして、得られた上清に基質として例えば、 Succinyl-L-Alanyl-L-Ala nyl-L-Alanine p-Nitroanilide (STANAペプチド研究所)を添カ卩し、所定時間反応させ 、反応を行った際に遊離する ρ-ニトロア-リン量を 420 における吸光度変化 (OD42 Onm)により定量する。これにより、供試枯草菌変異株に導入したプロテアーゼ遺伝子 にコードされるプロテアーゼの生産性を測定することができる。なお、枯草菌 168株等 の標準野生株におけるプロテアーゼの生産性を同様に測定することで、供試枯草菌 変異株におけるプロテアーゼ生産性を相対値として評価することができる。
[0038] プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特に Bacillus属細菌由来のセリンブ 口テアーゼゃ金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号 11 9で示されるアミノ酸配列からなるバチルスクラウジ（Bacillus clausii) KSM- K16株 (FE RM BP-3376)由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と 70%、好ましくは 80 %、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の 同一性を有するアミノ酸配列力 なるプロテアーゼが挙げられる。
[0039] 力かるプロテアーゼの生産においては、本発明の枯草菌変異株のうち、 MGB533株
MGB592株、 MGB604株、 MGB625株、 MGB653株、 MGB683株、 MGB781株、 MGB 723株、 MGB773株、 MGB822株、 MGB834株、 MGB846株、 MGB872株、 MGB885株、 MGB913株、 MGB943株、 MGB860株、 MGB874株、 MGB887株、 NED0302株、 NED0 400株、 NED0600株、 NED0803株、 NED1500株、 NED1902株及び NED3200株から選 ばれる枯草菌変異株を用いるのがより好ま 、。
[0040] アルカリアミラーゼの生産性は、一例として以下のようにして測定することができる。
先ず、アルカリアミラーゼ遺伝子を有するベクターを用いて供試枯草菌変異株を形 質転換する。次に、得られた形質転換体を培養した後、遠心分離等によって菌体を 除いた培養液上清を得る。そして、例えば、アミラーゼ活性測定キットであるリキテック Amy EPS (ロシュ'ダイァグノスティック社)を使用して、上清に含まれるアルカリアミラー ゼの活性を測定することができる。これにより、供試枯草菌変異株に導入したアルカリ アミラーゼ遺伝子にコードされるアルカリアミラーゼの生産性を測定することができる。 なお、枯草菌 168株等の標準野生株におけるアルカリアミラーゼの生産性を同様に 測定することで、供試枯草菌変異株におけるアルカリアミラーゼ生産性を相対値とし て評価することができる。
[0041] アミラーゼの具体例としては、微生物由来の (X アミラーゼが挙げられ、特に Bacill us属細菌由来の液ィ匕型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号 120 で示されるアミノ酸配列からなる Bacillus属細菌 KSM- K38株（FERM BP-6946)由来の アルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 90% 以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有するァミノ 酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。
[0042] かかる a アミラーゼの生産においては、本発明の枯草菌変異株のうち、 MGB653 株、 NED0301株、 NED0302株、 NED0400株、 NED0600株、 NED0802株、 NED0804株 、 NED0900株、 NED1002株、 NED1003株、 NED1100株、 NED1602株、 NED2602株、 NED2702株、 NED3402株、 NED3701株及び NED3800株から選ばれる枯草菌変異株 を用いるのがより好ましい。
[0043] 本発明の枯草菌変異株に導入される目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子は 、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモータ 一及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを 含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域力 選ばれる 1以上の領域が 適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制 御領域及び分泌シグナル領域力 なる 3領域が結合されて 、ることが好ましぐ更に 分泌シグナルペプチド領域がバチルス (Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来の ものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流 0.6〜 lkb領域であるもの力 目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合 されていることが望ましい。例えば、特開 2000-210081号公報ゃ特開平 4-190793号 公報等に記載されて ヽるバチルス (Bacillus)属細菌、すなわち KSM- S237株（FERM BP-7875)、 KSM-64株（FERM BP-2886)由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御 領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリべ プチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番 号 115で示される塩基配列の塩基番号 1〜659の塩基配列、配列番号 117で示される 塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号 1〜696の塩基配列、また当該塩基 配列に対して 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好まし くは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有する塩基配列からなる DNA断 片、或 、は上記 、ずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなる DNA断片 力 目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが 望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなる DNA断片と は、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機 能を保持して ヽる DNA断片を意味する。
実施例
[0044] 以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以 下の実施例に限定されるものではない。
[0045] 本実施例では、枯草菌 168株を野生株としてゲノム上の様々な領域を欠失させた変 異株を製造した。なお、本実施例で使用した各種のプライマーに関し、プライマー名 と、塩基配列と、配列番号との対応を末尾に表 10として示した。
[0046] 〔実施例 1〕複数領域を欠失した変異株の作製
く upp遺伝子欠失株（cat-uppカセットを含む）の作製〉
図 2に示すように、枯草菌 168株力も抽出したゲノム DNAを铸型とし、 upp-AFWと up p-ARV、及び upp-BFWと upp-BRVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上の upp遺 伝子（BG 13408 ; uracil phosphoribosyH:ransferase)の上流に隣接する 1. Okb断片（ al)、及び下流に隣接する 1. Okb断片 (b l)を PCRにより増幅した。また、プラスミド p MutinT3 (Microbiology , 144, 3097 , 1998)を铸型として、 Erm- FWと Erm- RVプライマ 一のセットを用いてエリスロマイシン耐性遺伝子を含む 1. 2kb断片（cl)を、 PCRに よって調製した。尚、 PCR反応は反応系を 20 /z Lとして、 LATaqポリメラーゼ (タカラ バイオ社製）を用いて添付のプロトコールに従い、 (al) , (b l)については铸型 DNA である枯草菌 168株ゲノム 50ng、（c l)についてはプラスミド DNAlng、上記プライマ 一を各 200nM、 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTPを各 200 μ Μ、 LATaqO. 2U、添 付の 10 X緩衝液を I Xとなるように混合した。増幅反応には、 PCRシステム（アプライ ドバイオシステム社製 GeneAmp9700)を用い、 95°Cで 5分間の熱変性の後、 95°Cで 15秒、次に 55°Cで 30秒、さらに 72°Cで 60秒間恒温し、これを繰り返し 25回おこな い、最後に 30秒間 72°Cで伸長を完了させた。このようにして得られた上記 3つ（al) 、（bl)及び (c l)の PCR増幅断片をセントリコン (ミリポア社製）にて精製後、各 0. 5 Lを混合し、さらに、プライマー upp- AFWと upp- BRVをカ卩えて上記 PCR条件の 72 °Cでの恒温を 3分間に変更し、 SOE— PCRをおこなった。この PCRの結果、 3断片 を (al)、（c l)及び (bl)の順になる様に結合させた 3. 2kbの DNA断片（dl)を得た 。この DNA断片を用いてコンビテント法 (J.Bacteeriol.,81 ,741 , 1960)により枯草菌 16 8株の形質転換を行った。すなわち、枯草菌 168株を SPI培地 (0.20%硫酸アンモニゥ ム、 1.40%リン酸水素二カリウム、 0.60%リン酸二水素カリウム、 0.10%クェン酸三ナトリ ゥムニ水和物、 0.50%グルコース、 0.02%カザミノ酸（Difco)、 5mM硫酸マグネシウム、 0.25 μ Μ塩化マンガン、 50 μ g/mlトリプトファン）において 37°Cで、生育度 (OD600) の値力 S1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を 9倍量の SPII培 地（0.20%硫酸アンモ-ゥム、 1.40%リン酸水素二カリウム、 0.60%リン酸二水素力リウ ム、 0.10%クェン酸三ナトリウム二水和物、 0.50%グルコース、 0.01%カザミノ酸 (Difco) 、 5mM硫酸マグネシウム、 0.40 μ Μ塩化マンガン、 5 μ g/mlトリプトファン）に接種し、 更に生育度 (OD600)の値力 .4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌 168株の コンビテントセルを調製した。次 、で調製したコンビテントセル懸濁液 (SPII培地にお ける培養液） 100 /z Lに上記 DNA断片（dl)を含む溶液 (上記 SOE— PCRの反応液 ) 5 Lを添加し、 37°Cで 1時間振盪培養後、 0. 5gZmLのエリスロマイシンを含む L B寒天培地（1%トリプトン、 0. 5%酵母エキス、 l%NaCl、 1. 5%寒天）に全量を塗 沫した。 37°Cにおける静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した 。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを铸型とする PCRによって upp遺伝子 がゲノム上力も欠失し、エリスロマイシン耐性遺伝子に置換して 、ることを確認した。 以後この株を 168 Δ uppと表記する。尚、後述するコンビテント法による形質転換は、 使用する DNAや形質転換体選抜の為の寒天培地を適宜変更する他は、上述の方 法と同様にして行った。
[0047] < cat- uppカセット DNA断片の構築 >
図 3に示すように、 upp遺伝子とクロラムフエ-コール耐性遺伝子 (cat)の転写が確 実に行われる様、枯草菌で転写が確認されているプラスミド pSM5022 (Mol. Microbiol . 6, 309 ,1992)の cat遺伝子の下流に upp遺伝子を結合させた。即ち、 cat- Fwと cat- R vのプライマーセットを用い、 pSM5022を铸型として、 PCRにより catを含む 1. 3kbの D NA断片を増幅した。また、プライマー upp-Fwと upp-RVを用いて 168株ゲノムを铸型 として PCRを行い upp遺伝子を含む 1. lkbの DNA断片を得た。次にこれら 2断片を 精製後、 SOE— PCRにより結合し、 cat遺伝子の下流に upp遺伝子が結合した 2. 4k bの ca- uppカセット DNA断片（C)を調製した。更にこの断片をプラスミド pBR322の Cla I切断部位に挿入することにより組換えプラスミド pBRcatuppを得た。
[0048] < Prol領域欠失株（cat- uppカセット断片を含む）の作製〉
図 4に示すように、 Prol- AFWと Prol- ARV、 Proト BFWと Proト BRVの各プライマー セットを用いて、 168株ゲノムを铸型として、 PCRによって Prol領域の上流に隣接する 0. 6kbの断片 (A)及び下流に隣接する 0. 3kbの断片（B)を調製した。なお、図 4に ぉ ヽて、 Prol領域は「欠失標的領域」と記載した。
[0049] 次 、で、得られた PCR増幅断片 (A)及び (B)と、上述の cat-uppカセット断片 (C)と を铸型として、プライマー Prol-AFWと Prol-BRVによる SOE— PCRを行って 3断片を (A)、 (C)及び (B)の順になる様に結合させた。得られた DNA断片 (D)を用いてコ ンピテント法により実施例 2で示した 168 Δ upp株の形質転換を行 ヽ、 lOppmのクロラム フエ二コールを含む LB寒天培地に生育可能な形質転換体を分離した。得られた形 質転換体は PCRによって Prol領域がゲノム上から欠失し、 cat-uppカセット DNA断 片に置換していることを確認した。更に、本形質転換体を種々の濃度の 5FU (シグマ アルドリッチ社製)を添加した Cg +グルコース寒天培地（7%リン酸水素二カリウム、 3 %リン酸二水素カリウム、 0. 5%クェン酸ナトリウム、 1 %硫酸アンモ-ゥム、 0. 1 %硫 酸マグネシウム、 0. 05%グノレタミン酸、 0. 5%グルコース、 10ng/mL L—トリプトフ アン、 0. 55 μ
Figure imgf000021_0001
0. 17 μ g/mL塩ィ匕亜 43ng/mL塩ィ匕 銅二水和物、 60ngZmL塩化コバルト六水和物、 60ngZmLモリブデン酸 (IV)ナトリ ゥムニ水和物、 1. 5%寒天）上で培養を行った力 0. 5 g/mL以上の 5FUを加え た培地では生育が認められなカゝつた。一方、形質転換体の親株である 168 A upp株は 同一条件で 5 g/mLの 5FUを加えた培地でも生育が観察された。以上の結果から 、形質転換体に導入された upp遺伝子が cat遺伝子プロモーターからの転写により発 現して 5FUに感受性になったものと推定された。このようにして得られた株を Δ Prol : : cat- upp株とした。なお、図 4において、 A Prol ::cat- upp株は、 Δ欠失標的領域:: cat- upp株と ti載し 7こ。
[0050] く Prol領域欠失株からの cat-uppカセット断片（C)の削除 >
図 5に示すように、 A Prol : :cat- upp株ゲノムを铸型とし、 Prol- AFWと Prol- ERV及 び Prol-FFWと Prol-BRVのプライマーセットを用いて cat-uppカセット断片（C)の上流 に隣接する 0. 6kbの断片 (E)、下流に隣接する 0. 3kbの断片 (F)を増幅し、更に、 得られた両 DNA断片を铸型とし Prol-AFW及び Prol-BRVプライマーセットによる S OE— PCRによって、両断片が結合した 0. 9kbの断片（G)を調製した。この断片（G )によって、上述の Δ Prol : :cat- upp株をコンビテント法により形質転換し、 1 μ g/mL /の 5FUを添加した Cg +グルコース寒天培地に生育可能な株を取得した。得られた 株にぉ 、てクロラムフエ-コール感受性と、ゲノム上の Prol領域及び cat-uppカセット DNA断片が欠失していることを確認し、これを Δ Prol株とした。なお、図 5において、 Δ Prol ::cat-upp株及び Δ Prol株は、それぞれ「 Δ欠失標的領域:: cat-upp株」「 Δ欠 失標的領域株」と記載した。
[0051] <単独領域欠失株の作製 1 >
上述した Δ Prol株の作製手順に準じて、図 4で説明した方法により、 A Pro2::cat-u pp株、 APro3::cat- upp株、 APro4::cat- upp株、 APro5::cat- upp株、 APro6::cat- upp 株、 APro7::cat- upp株、 APBSX::cat- upp株、 ASPjS ::cat- upp株、 Δ SKIN: :cat- upp 株、 Apks::cat-upp株及び Apps::cat-upp株を作製した。また、図 5で説明した方法 により、 ΔΡΙΌ2株、 ΔΡΙΌ3株、 ΔΡΙΌ4株、 ΔΡΙΌ5株、 ΔΡΙΌ6株、 ΔΡΙΌ7株、 APBSX株 、 ASP|8株、 Δ SKIN株、 Apks株及び Apps株を作製した。これら各株を作製するェ 程における、断片 (A)〜断片 (G)を増幅する際に使用したプライマーセットを下記の 表 3に示す。
[表 3]
Figure imgf000022_0001
[0052] <多重欠失株の構築（MGB01株〜 MGB07株まで） >
次に、 Δ ΡΙΌ7株 (MGB01株とも称する）を用いて、複数の領域が欠失した株（多重 欠失株）を構築した。まず、 Pro7領域及び Pro6領域の二重欠失株を以下のように構 築した。すなわち、 Pro6領域が cat-uppカセット断片で置換された A Pro6::cat-upp株 のゲノム DNAを用いて Δ ΡΙΌ7株をコンビテント法により形質転換し、 lOppmのクロラム フエ-コールを含む LB寒天培地に生育したコロニーを形質転換体として分離した。 次に、得られたクロラムフエ-コール耐性の形質転換体を、 Δ ΡΙΌ6株のゲノム DNAを 用いてコンビテンと法により形質転換し、 1 μ g/mLの 5FUを添カ卩した Cg +ダルコ一 ス寒天培地に生育可能な株を取得した。得られた株にぉ 、てクロラムフエ-コール感 受性を確認し、 Pro6領域と Pro7領域の両方が欠失し、更に、 cat-uppカセット断片を 含まな 、二重欠失株を分離した。この株を MGB02株と命名した。
[0053] 同様の操作を繰り返すことによって Pro7領域、 Pro6領域及び Prol領域を順次欠失 させた MGB03株を構築した。同様の操作を繰り返すことによって Pro7領域、 Pro6領域 、 Prol領域及び Pro4領域を順次欠失させた MGB04株を構築した。同様の操作を繰り 返すことによって Pro7領域、 Pro6領域、 Prol領域、 Pro4領域及び PBSX領域を順次欠 失させた MGB05株を構築した。同様の操作を繰り返すことによって Pro7領域、 Pro6領 域、 Prol領域、 Pro4領域 PBSX領域及び Pro5領域を順次欠失させた MGB06株を構築 した。同様の操作を繰り返すことによって Pro7領域、 Pro6領域、 Prol領域、 Pro4領域 、 PBSX領域、 Pro5領域及び Pro3領域を順次欠失させた MGB07株を構築した。
[0054] <各単独領域欠失株の作製 2 >
上述したく単独領域欠失株の作製 1 >とは異なる方法で、 SP |8領域、 pks領域、 SK IN領域、 pps領域、 Pro2領域、 Pro5領域、 NED0302領域 (ydcL- ydhU領域）、 NED080 3領域 (yisB- yitD領域）、 NED3200領域 (yunA- yurT領域）、 NED1902領域（cgeE-yp mQ領域）、 NED0501領域 (yeeK- yesX領域）、 NED0400領域 (ydiM- yebA領域）、 NE D1100領域 (ykuS- ykqB領域）、 NED4002領域（pdp- rocR領域）、 NED02021領域 (ycx B- sipU領域）、 SKIN-Pro7領域（spoIVCB- yraK領域）、 NED3701領域（sbo- ywhH領 域）、 NED0600領域（cspB- yhcT領域）、 NED4100領域 (yybP- yyaj領域）、 NED2702 領域 (ytxK-braB領域）及び NED 1602領域 (yncM-fosB領域）を単独で欠失した株を 構築した。
[0055] ここでは、 SP β領域を単独で欠失した株の構築例を説明する。図 6に示すように、 s pB- AFWと spB- ARV2、及び spB- BFW2と spB- BRVのプライマーセットを用いて、 168 株ゲノムを铸型として、 PCRによって SP |8領域の上流に隣接する 0. 6kbの断片 (H) 及び下流に隣接する 0. 3kbの断片 (I)を調製した。なお、図 6には、 SP |8を「欠失標 的領域」と記載した。
[0056] また tet- FWと tet-RVのプライマーセットを用いて、テトラサイクリン耐性遺伝子領域 断片 COを増幅した。次いで、得られた PCR増幅断片 (H) (I) ωを铸型として、プライ マー spB- AFWと spB- BRVによる SOE— PCRを行って 3断片を（H) (J) (I)の順にな る様に結合させた。得られた DNA断片 (K)を用いてコンビテント法により、上述した 1 68 A upp株の形質転換を行い、 15ppmのテトラサイクリンを含む LB寒天培地に生育 可能な形質転換体を分離した。得られた形質転換体は PCRによって SP β領域がゲ ノム上力 欠失し、テトラサイクリン耐性遺伝子断片に置換していることを確認し、これ を A SP |8 ::tet株とした。なお、図 6には、厶3卩|8 : 株を「厶欠失標的領域: 株」と 記載した。
[0057] 同様にして上述した各領域を単独で欠失した株を作製した。作製した株は、 A SP i8 : :tet株と同様に「Δ欠失標的領域:: tet株」と呼称する。
[0058] く MGB07株からの SP j8領域の欠失 >
上記で作製した Δ SP |8：: tet株のゲノム DNAを用いて Δ Pro7株を形質転換し、テトラ サイクリン耐性株 MGB07 A SP |8 ::tet株を取得した。一方、次の様にしてテトラサイタリ ン耐性遺伝子断片のゲノム上力 の除去を行った。
[0059] 図 7に示すように、 spB- AFWと spB- ERV、及び spB- FFWと spB- BRVのプライマーセ ットを用いて、 168株ゲノムを铸型として PCRによって SP |8領域の上流に隣接する 0.
6kbの断片 (L)及び下流に隣接する 0. 3kbの断片（M)を調製した。なお、図 7には
、 SP j8を「欠失標的領域」と記載した。
[0060] 次!、で、得られた PCR増幅断片（L) (M)を铸型として、プライマー spB-AFWと spB
-BRVによる SOE— PCRを行って 2断片を (L) (M)の順になる様に結合させた。得ら れた DNA断片（N)を、上述した pBRcatuppの ^ Ι-ΚΕΠΙ制限酵素部位 (切断後に平 滑末端化）に挿入して、テトラサイクリン耐性遺伝子断片削除用プラスミド pBRcatupp Δ SP j8を構築した。なお、図 7には、 pBRcatupp Δ SP j8を「pBRcatupp Δ欠失標的領 域」と記載した。
[0061] 構築した pBRcatupp Δ SP j8〖こて MGB07 Δ SP j8：: tet株を形質転換し、プラスミド上の SP |8上流または下流の領域と、ゲノム上の SP |8上流または下流の領域との間で一重 交差の組換えが起こったことにより、プラスミドがゲノム上に導入され、クロラムフエニコ ール耐性を示す株 MGB07 Δ SP j8 (pBR)株を取得した。
[0062] 得られた形質転^ ¾MGB07 Δ SP j8 (pBR)株をテトラサイクリン 1.5 μ g/mLを含む LB 培地 50mL (500mL容坂ロフラスコ）に、 OD600=0.3となる様に植菌し、 37°Cで振盪培 養して 1時間目にアンピシリン 15mg (300 μ g/mL)をカ卩え、以降 2時間毎にアンピシリン 15mgを添加しながら培養を継続、培養 8.5時間後に培養液を 2%塩化ナトリウム水溶液 で洗浄後、薬剤を含まない LB寒天培地に塗沫した。生育したコロニーのうち、プラス ミド領域の脱落に伴ってクロラムフエ-コール感受性となったものを選抜した。
[0063] 選抜した菌株のゲノム DNAを铸型とし、 PCRを行うことにより、 SP β領域及びテトラサ イクリン耐性遺伝子断片が欠失して ヽることを確認し、 MGB08株を取得した。
[0064] < MGB08株からの pks領域の欠失と Pro5領域の復帰 >
上記で作製した MGB08株力もの pks領域の欠失を、上述した方法（図 7)に準じ、 Δ pks::tet株を用いて行った。 MGB08株から pks領域を欠失させた株を MGB09株と命名 した。取得した MGB09株のゲノム DNAを PCRにて確認したところ、 pks領域は欠失し て!、たが、 pks領域とゲノム上で近 、位置に存在する Pro5領域内部の配列の存在が 認められ、 Pro5領域が復帰していることが分かった。これは A pks::tet株のゲノム DNA を用いて MGB08株を形質転換した際に、 pks領域の欠失に伴うテトラサイクリン耐性 遺伝子の導入と同時に、 A pks::tet株ゲノム上の pks領域の上流領域と Pro5領域下流 の領域力 MGB08株ゲノム上の相当する領域との間で相同組換えが起こったことに よるものと考えられた。
[0065] < MGB09株からの SKIN領域の欠失と Pro7領域の復帰 >
上記で作製した MGB09株力もの SKIN領域の欠失を、上述した方法（図 7)に準じ、 Δ SKIN::tet株を用いて行った。 MGB09株から SKIN領域を欠失させた株を MGB10株 と命名した。取得した MGB10株のゲノム DNAを PCRにて確認したところ、 SKIN領域 は欠失して 、たが、 SKIN領域とゲノム上で近 、位置に存在する Pro7領域内部の配列 の存在が認められ、 Pro7領域が復帰していることが分かった。これは A SKIN::tet株の ゲノム DNAを用いて MGB09株を形質転換した際に、 SKIN領域の欠失に伴うテトラサ イクリン耐性遺伝子の導入と同時に、 Δ SKIN: :tet株ゲノム上の SKIN領域の上流領域 と Pro7領域下流の領域力 MGB09株ゲノム上の相当する領域との間で相同組換え が起こったことによるものと考えられた。
[0066] <MGB10株からの pps領域の欠失 >
上記で作製した MGB10株力もの pps領域の欠失を、上述した方法（図 7)に準じ、 Δ pps::tet株を用いて行った。 MGB10株から pps領域を欠失させた株を MGB11株と命名 した。取得した MGB11株のゲノム DNAを PCRにて確認したところ、他の領域が復帰 することなく pps領域が欠失して 、た。
[0067] <MGB11株からの Pro2領域の欠失 >
上記で作製した MGB11株力 の Pro2領域の欠失を、上述した方法（図 7)に準じ、 A Pro2::tet株を用いて行った。 MGB11株から Pro2領域を欠失させた株を MGB12株と 命名した。取得した MGB12株のゲノム DNAを PCRにて確認したところ、他の領域が 復帰することなく Pro2領域が欠失して 、た。
[0068] <MGB12株からの Pro5領域の欠失 >
MGB09株を作製する際に復帰した Pro5領域を再び欠失させるため、上記で作製し た MGB12株からの Pro5領域の欠失を、上述した方法（図 7)に準じ、 A Pro5::tet株を 用いて行った。 MGB12株から Pro5領域を欠失させた株を MGBlld株と命名した。取 得した MGB1 Id株のゲノム DNAを PCRにて確認したところ、他の領域が復帰すること なく Pro5領域が欠失して 、た。
[0069] 以上のように作製された MGBlld株は、枯草菌 168株における、 Pro6(yoaV-yobO) 領域、 ProKybbU- ybdE)領域、 Pro4(yjcM- yjdj)領域、 PBSX(ykdA- xlyA)領域、 Pro5(y nxB- dut)領域、 Pro3(ydiM- ydjC)領域、 SP j8 (yodU- ypqP)領域、 pks(pksA- ymaC)領 域、 SKIN(spoIVCB- spoIIIC)領域、 pps (ppsE- ppsA)領域及び Pro2(ydcL- ydej)領域 が欠失されたゲノム構造を有して 、る。 [0070] <本発明に係る枯草菌変異株の構築 >
本発明に係る枯草菌変異株は、上述したように作製した MGB1 Id株から以下のよう に作製した（図 8参照)。すなわち、上述した方法（図 7)に準じ、 MGBlld株力 の NE D0302領域の欠失を、 A NED0302::tet株を用いて行った。 MGBlld株から NED0302 領域を欠失させた株を MGB533株と命名した。取得した MGB533株は、 MGBlld株に おける欠失領域の他に NED0302領域が欠失したゲノム構造を有することとなる。
[0071] その後、 NED0803領域、 NED3200領域、 NED1902領域、 NED0501領域、 NED0400 領域、 NED1100領域及び NED4002領域を順に欠失させて変異株を構築した。構築 された変異株を、それぞれ MGB559株、 MGB592株、 MGB604株、 MGB625株、 MGB6 53株、 MGB683株及び MGB781株と命名した。
[0072] なお、 NED3200領域は Pro2領域を含んでおり、 MGB592株構築の際に MGB559株 より欠失された実際の領域は ydeK-ydhUの領域である。また NED1902領域は SP β領 域を含んでおり、 MGB604株構築の際に MGB592株より欠失された実際の領域は cge E-phyの領域と yppQ-ypmQの領域である。同様に NED0400領域は Pro3領域を含ん でおり、 MGB653株構築の際に MGB625株より欠失された実際の領域は gutR-yebAの 領域である。
[0073] 次に、上述した方法（図 7)に準じ、構築された MGB625株からの NED40002領域の 欠失を、 A NED40002::tet株を用いて行った。 MGB625株から NED40002領域を欠失 させた株を MGB723株と命名した。
[0074] その後、 NED02021領域、 SKIN- Pro7領域、 NED3701領域、 NED0600領域、 NED41 00領域、 NED2702領域、 NED0400領域及び NED 1100領域を順に欠失させて変異株 を構築した。構築された変異株を、それぞれ MGB773株、 MGB822株、 MGB834株、 M GB846株、 MGB872株、 MGB885株、 MGB913株及び MGB943株と命名した。
[0075] なお、 SKIN- Pro7領域は SKIN領域を含んでおり、 MGB822株構築の際に MGB773 株より欠失された実際の領域は yrkS-yraKの領域である。同様に NED0400は Pro3領 域を含んでおり、 MGB913株株構築の際に MGB885株より欠失された実際の領域は g utR-yebAの領域である。
[0076] 次に、上述した方法（図 7)に準じ、構築された MGB834株からの NED4100領域の欠 失を、 A NED4100::tet株を用いて行った。 MGB834株から NED4100領域を欠失させ た株を MGB860株と命名した。
[0077] その後、 NED1602領域及び NED2702領域を順に欠失させて変異株を構築した。構 築された変異株を、それぞれ MGB874株及び MGB887株と命名した。
[0078] これら各株を作製する工程における、断片 (H)〜断片 (N)を増幅する際に使用し たプライマーセットを下記の表 4に示す。
[表 4]
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
〔実施例 2〕単独領域を欠失した変異株
本例では、枯草菌 168株における特定の領域を、 cat-uppカセットで置換或いはクロ ラムフエ-コール耐性遺伝子で置換することによって、当該領域を単独で欠失した変 異株を作製した。 < cat-uppカセットでの置換による単独領域欠失株の構築 >
cat-uppカセットで置換する対象の領域を下記表 5にまとめた。
[表 5]
Figure imgf000030_0001
[0081] なお、 NED0100領域は Prol領域を含んでおり、 NED0302領域は Pro2領域、 NED15 00領域は pks領域、 NED1802領域は Pro6領域、 NED2500領域は SKIN-Pro7領域をそ れぞれ含んでいる。
[0082] 本例では、実施例 1で作製した cat-uppカセット断片を用いて図 4に示した方法に準 じて特定の領域を cat-uppカセット断片で置換してなる変異株を構築した。なお、本 例では、図 4における断片 (A)、断片 (B)、断片 (C)及び断片 (D)を、それぞれ断片 (0)、断片 (P)、断片 (Q)及び断片 (R)と呼称する。これら各株を作製する工程にお ける、断片 (P)〜断片 (R)を増幅する際に使用したプライマーセットを下記の表 6に 示す。
[表 6]
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0
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クロラムフエ-コール耐性遺伝子での領域置換は、まずテトラサイクリン耐性遺伝子 で対象となる領域を置換した後、テトラサイクリン耐性遺伝子の中央部をクロラムフエ 二コール耐性遺伝子で置換することにより行った。クロラムフエ-コール耐性遺伝子 で置換する対象の領域を下記表 7にまとめた。
[表 7]
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0002
[0084] なお、 NED0400領域は Pro3領域を含んでおり、 NED1002領域は Pro4領域、 NED10 03領域は PBSX領域、 NED1902領域は SP j8領域をそれぞれ含んでいる。
[0085] 以下、先ず NED0301領域を欠失させる方法について説明する。 NED0301-AFWと N ED0301- ARV、 NED0301- BFWと NED0301- BRVの各プライマーセットを用いて、 168 株ゲノムを铸型として、 PCRによって NED0301領域の上流に隣接する 0. 6kbの断片 (S)及び下流に隣接する 0. 3kbの断片 (T)を増幅した。また、 tet- FWと tet- RVのプ ライマーセットを用いて、テトラサイクリン耐性遺伝子領域断片 (U)を増幅した。。次 いで、得られた PCR増幅断片（S) (T) (U)を铸型として、プライマー NED0301- AFW と NED0301-BRVによる SOE— PCRを行って 3断片を（S) (U) (T)の順になる様に結 合させた断片 (V)を取得した。得られた断片 (V)を用いてコンビテント法により実施 例 1で作製した 168 Δ upp株の形質転換を行 ヽ、 15ppmのテトラサイクリンを含む LB 寒天培地に生育可能な形質転換体を分離した。得られた形質転換体は PCRによつ て NED0301領域がゲノム上力 欠失し、テトラサイクリン耐性遺伝子断片に置換して いることを確認した。次に tet- FWと tet-ARV、 tet- BFWと tet-RVの各プライマーセット を用いて、テトラサイクリン耐性遺伝子の上流側 0.5kb断片 (W)及び下流側 0.5kb断 片 (X)を増幅した。更に実施例 1で使用したプラスミド PSM5022を铸型として、 cat-FW と cat- RVを用いてクロラムフエ-コール耐性遺伝子を含む 1.3kbの断片（Y)を増幅し た。次いで、得られた PCR増幅断片 (W) (X) (Y)を铸型として、プライマー tet-FWと t et- RVによる SOE— PCRを行って 3断片を (W) (Y) (X)の順になる様に結合させた 断片 (Z)を取得した。得られた断片 (Z)を用いてコンビテント法により上記テトラサイク リン耐性株の形質転換を行 、、 lOppmのクロラムフエ-コールを含む LB寒天培地上 に生育可能な形質転換体を分離した。得られた形質転換体は、 PCRによってテトラ サイクリン耐性遺伝子の一部が欠失し、クロラムフエ-コール耐性遺伝子に置換して V、ることを確認した。 NED0301領域を欠失した菌株を NED0301株と命名した。
同様にして、上記表 7に示した各領域を単独で欠失させた変異株を作製し、 NED03 01株と同様にして命名した。これら各株を作製する工程における、断片 (S)〜断片（ V)を増幅する際に使用したプライマーセットを下記の表 8に示す。
[表 8]
Figure imgf000034_0001
[0087] 〔実施例 3〕変異株の評価
実施例 3では、実施例 1及び 2で作製した本発明に係る枯草菌変異株における、分 泌生産能を評価した。本例では、枯草菌変異株に導入する目的タンパク質として、了 ルカリセルラーゼ、アルカリプロテアーゼ及びアルカリアミラーゼを使用した。
[0088] <アルカリセルラーゼ分泌生産評価 >
アルカリセルラーゼ分泌生産性評価は以下の様に行った。即ち、バチルスエスピ 一（Bacillus sp.) KSM- S237株（FERM BP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（ 特開 2000-210081号公報）断片（3.1 kb)がシャトルベクター pHY300PLKの BamHI制 限酵素切断点に挿入された組換えプラスミド PHY-S237を、プロトプラスト形質転換法 によって各菌株に導入した。これによつて得られた組換え菌株を 10 mLの LB培地で 一夜 37°Cで振盪培養を行い、更にこの培養液 0.05 mLを 50 mLの 2 X L—マルトース 培地（2%トリプトン、 1%酵母エキス、 1% NaCl、 7.5%マルトース、 7.5 ppm硫酸マンガン 4-5水和物、 15 ppmテトラサイクリン）に接種し、 30°Cにて 3日間振盪培養を行った。 遠心分離によって菌体を除！ヽた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培 養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
[0089] セルラーゼ活性測定については、 1/7.5Mリン酸緩衝液 (pH7.4和光純薬)で適宜 希釈したサンプル溶液 50 μ Lに 0.4mM p-nitrophenyl- β - D- cellotrioside (生化学ェ 業)を 50 Lカ卩えて混和し、 30°Cにて反応を行った際に遊離する ρ-ニトロフエノール量 を 420nmにおける吸光度 (OD420nm)変化により定量した。 1分間に 1 molの ρ-ニトロ フエノールを遊離させる酵素量を 1Uとした。
[0090] <アルカリプロテアーゼ分泌生産評価 >
アルカリプロテアーゼの分泌生産性評価は以下の様に行った。即ち、バチルスクラ ウジ（Bacillus clausii) KSM- K16株（FERM BP- 3376)より抽出したゲノム DNAを铸型と して、 S237pKAPpp- Fと KAPter- R(Bglll)のプライマーセットを用いて PCRを行い、アミ ノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ (Appl. Microbiol. BiotechnoL, 43, 473, (199 5))をコードする 1.3kbの DNA断片を増幅した。またバチルスエスピー（Bacillus sp.) K SM- S237株（FERM BP- 7875)より抽出したゲノム DNAを铸型として、 S237ppp- F2(Ba mHI)と S237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いて PCRを行 、、アルカリセルラーゼ遺 伝子（特開 2000-210081号公報）のプロモーター領域を含む 0.6kbの DNA断片を増幅 した。次いで、得られた 2断片を混合して铸型とし、 S237ppp-F2(BamHI)と KAPter-R( Bglll)のプライマーセットを用いた SOE- PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺 伝子のプロモーター領域の下流にアルカリプロテアーゼ遺伝子が連結した 1.8 kbの DNA断片を得た。得られた 1.8 kbの DNA断片をシャトルベクター pHY300PLK (ャクル ト）の BamHI-Bglll制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プ ラスミド pHYKAP(S237p)を構築した。
[0091] 構築したプラスミド pHYKAP(S237p)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に導 入した。これによつて得られた組換え菌株を、上記くアルカリセルラーゼ分泌生産評 価〉と同様の条件にて 3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体 を除 、た培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に 分泌生産されたアルカリプロテア一ゼの量を求めた。培養上清中のプロテアーゼの 活性測定は以下のとおり行った。すなわち、 2mM CaCl溶液で適宜希釈した培養上
2
清 50 μ 1に、 7.5mMの Succiny卜 L— Alany L— Alany L— Alanine p— Nitroanilide (STANA ペプチド研究所)を基質として含む 75mMほう酸- KC1緩衝液 (ρΗΙΟ.5)を 100 /z Lカロえ て混和し、 30°Cにて反応を行った際に遊離する トロア-リン量を 420nmにおける 吸光度変化 (OD420nm)により定量した。 1分間に 1 μ molの ρ- -トロア-リンを遊離さ せる酵素量を 1Uとした。
[0092] <アルカリアミラーゼ分泌生産評価 >
アルカリアミラーゼの分泌生産性評価は以下の様に行った。即ち、バチルスエスピ 一（Bacillus sp.) KSM- K38株 (FERM BP-6946)より抽出したゲノム DNAを铸型として、 K38matu— F2(ALAA)と SP64K38— R(Xbal)のプライマーセットを用いて PCRを行 ヽ、ァ ルカリアミラーゼ（Appl. Environ. Microbiol, 67, 1744, (2001))をコードする 1.5kbの D NA断片を増幅した。またバチルスエスピー（Bacillus sp.) KSM- S237株（FERM BP-7 875)より抽出したゲノム DNAを铸型として、 S237ppp- F2(BamHI)と S237ppp- R2(ALAA )のプライマーセットを用いて PCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開 2000-2100 81号公報）のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域を含む 0.6kbの DNA断片を増幅した。次いで、得られた 2断片を混合して铸型とし、 S237ppp-F2(Bam HI)と SP64K38- R(Xbal)のプライマーセットを用いた SOE- PCRを行うことによって、アル カリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域の 下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した 2.1kbの DNA断片を得た。得られた 2.1kb の DNA断片をシャトルベクター pHY300PLK (ヤクルト）の BamHI- Xbal制限酵素切断 点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミド pHYK38(S237ps)を構築した
[0093] 構築したプラスミド pHYK38(S237ps)をプロトプラスト形質転換法によって各菌株に 導入した。これによつて得られた組換え菌株を、上記くアルカリセルラーゼ分泌生産 評価〉と同様の条件にて 5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌 体を除 ヽた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に 分泌生産されたアミラーゼの量を求めた。培養上清中のアミラーゼの活性測定にはリ キテック Amy EPS (ロシュ'ダイァグノスティック社)を使用した。すなわち 1% NaCl-1/7.5 Mリン酸緩衝液 (pH7.4和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液 50 Lに、 100 μ Lの R1 · R2混合液 (R1 (カップリング酵素)： R2(アミラーゼ基質) =5： 1 (Vol.))をカ卩えて混 和し、 30°Cにて反応を行った際に遊離する ρ-ニトロフエノール量を 405nmにおける吸 光度 (OD405nm)変化により定量した。 1分間に 1 μ molの ρ-ニトロフエノールを遊離さ せる酵素量を 1Uとした。
<結果 >
アルカリセルラーゼ、アルカリプロテアーゼ及びアルカリアミラーゼの各酵素につい て、分泌生産能を表 9にまとめた。なお、表 9において、各種酵素の分泌生産能は、 各遺伝子を同様に導入した枯草菌 168株における酵素生産量を 100としたときの相対 値で示している。
[表 9]
Figure imgf000038_0001
[表 10]
Figure imgf000039_0001
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Figure imgf000043_0001
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
表 1に示す、欠損領域の欄に記載された領域を欠失させたゲノム構造を有する枯 草菌変異株。
[表 1]
Figure imgf000044_0001
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目的タンパク質をコードする遺伝子が発現可能に導入された際に、当該目的タンパ ク質の分泌生産性が、野生株に同遺伝子が導入された場合と比較して有意に向上し ていることを特徴とする請求項 1記載の枯草菌変異株。
目的タンパク質をコードする遺伝子が発現可能に導入されたことを特徴とする請求 項 1又は 2記載の枯草菌変異株。
上記目的タンパク質をコードする遺伝子が、分泌シグナルに相当する領域をコード する塩基配列を含むか、或いは、その上流において分泌シグナルに相当する領域を コードする塩基配列を含む DNAと適切に連結していることを特徴とする請求項 2又は 3記載の枯草菌変異株。
[5] 上記目的タンパク質がセルラーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼからなる群から選 ばれる少なくとも 1つの酵素であることを特徴とする請求項 2乃至 4いずれか一項記載 の枯草菌変異株。
[6] 枯草菌 168株を野生株とすることを特徴とする請求項 1乃至 5いずれか一項記載の 枯草菌変異株。
[7] 表 1における欠損領域の欄に記載されたゲノム領域は、表 2のオリゴヌクレオチド' セットにより挟み込まれる領域を含むことを特徴とする請求項 1乃至 6いずれか一項 記載の枯草菌変異株。
[表 2]
Figure imgf000049_0001
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