JPH11509096A

JPH11509096A - 胞子形成できないバチルスを用いるタンパク質の生産

Info

Publication number: JPH11509096A
Application number: JP9505426A
Authority: JP
Inventors: プリースト，ファーガス，ジー．; フレミング，アラステア，ビー．; タンジェニー，マーティン; ジョージャンセン，パー，リナ; ディダーシェン，ボージュ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-07-07
Filing date: 1996-07-04
Publication date: 1999-08-17
Also published as: WO1997003185A1; EP0837925A1; AU6353896A; CN1190434A

Abstract

(57)【要約】本発明は、親株を真に非胞子生殖性に変異するために、Ｂ．サブチリスからの情報を用いることにより、胞子形成することができないＢ．サブチリス以外のバチルス属のバクテリアを得る方法を提供する。前記株は、有用な代謝物、特に酵素のようなポリペプチドの生産のために用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】胞子形成できないバチルスを用いるタンパク質の生産発明の分野本発明は、胞子形成できないように変異されているバチルス（Bacillus）属のバクテリアを用いることにより、種々の産物、特に転位されたポリペプチドを生産するための方法、前記バクテリアを生産するための方法、及び該方法に用いられるDNA 構成物に関する。発明の背景バチルス属のバクテリアは、医療及び種々の工業に用いるための種々のポリペプチド及びタンパク質の生産に用いられている。例えば、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）種は、アミラーゼ及びプロテアーゼのような工業的な酵素の生産のために広く用いられており、クローンされた遺伝子産物の工業的調製のための一般的な宿主である（１，２，３）。通常コンポストとして、かなりのトン数の消費された生物の処理の必要性を生ずるこの生物から、毎年数百トンの細胞外酵素が製造される。環境の観点から、土境に分散される場合にこの材料が死んでいることが重要である。これは一般に、化学薬品、放射線及び／又は熱でのそのスラッジの処理により行われる。ほとんどの生産株はSp^-であるが、この表現型を生ずる障害が、ランダム変異誘発の実行中に通常導入され、未知の機能及び効能のものとなる。それゆえ廃棄生物量中に低レベルの胞子が存在する可能性が高く、そして胞子撲滅を確実にするために、よりきびしく、より高価で、そしてより環境に許容されない殺菌条件を必要とすることにより、滅菌過程を複雑にする。更に、よりきびしい法律管理の生産株の導入は、十分に規定された胞子形成変異体の使用を高度に要求する。このような変異体は、好ましくは、（ｉ）胞子形成において全体的に欠陥があり、（ii）完全に安定であり、胞子生殖に戻ることができず、そして、（iii）細胞外酵素の合成及び分泌においてその親に類似するか又はそれより優るベきである。Ｂ．サブチリス（B ．subtilis）における胞子形成の遺伝学は、現在、発展段階であり（４，５）、そして十分にキャラクタライズされている（17，６，７）Ｂ．リケニホルミスの胞子形成遺伝子から、この密接に関係するＢ．サブチリスは同一でないなら類似した発達経路を追うであろうと思われる。胞子形成過程中に観察される最初の形態学的変化は、段階IIにおける非対称隔膜の合成である。最後に母細胞により包み込まれるであろうより小さな娘は、プレ胞子を生じさせる。母細胞及び成熟中の胞子における遺伝子発現は、一時的かつ空間的に配向した様式で胞子形成特異的プロモーターをRNA ポリメラーゼに翻訳させるシグマ因子のカスケードの規則正しい合成及び活性化により部分的に管理される（４，５）。 Spo IIAC遺伝子の産物であるσ^Fタンパク質（８，９）は、プレ分裂細胞中に存在するが、その活性はプレ胞子に制限され、隔膜形成後にのみ明らかになる上述のシグマ因子の１つである（14）。このシグマ因子は区画特異的遺伝子発現の確立のために重大であり（10）、それがないと、発達中の胞子中の多数の遺伝子の発現が防がれる。σ^Fの主な機能は、発達中の胞子における遺伝子発現の原因であるプレ胞子特異的シグマ因子σ^Gの発現の活性化である（11）。更に、母細胞における遺伝子発現の原因であるフローσ^Eのσ^Eへの処理も、Spo IIAC内のナンセンス変異によってブロックされる。Spo IIAC遺伝子の欠失は、σ^E依存である胞子の発達の全体的崩壊及び母細胞発達の遮断をおそらく導き得るだろう。これらの理由のため、及び以前の研究が、Spo IIAC変異体がＢ．サブチリスにおける細胞外酵素合成にほとんど影響を与え得ないことを示唆する（15，16）ことから、本発明者らは、Ｂ．リケニホルミスにおける欠失のための標的としてこれを選択した。発明の概要本発明は、転位したポリペプチドを生産するための方法であって、ｉ）突然変異のために胞子形成できないバチルス属のバクテリアであって、前記代謝物の産生に関連するポリペプチドをコードするDNA 構成物を含むバクテリアを、前記DNA 構成物の発現及び前記代謝物の産生を導く条件下で培養し、 ii）前記代謝物を回収することを含み、但し、前記バクテリアはＢ．サブチリス種に属さないことを特徴とする方法を提供する。本発明は、更に、変異のために胞子形成できないバチルス属の宿主バクテリア、及び該宿主を生産するための方法を提供する。本方法は、胞子形成過程に関連する１又は複数の遺伝子の欠失を可能にするためのＢ．サブチリスから供される情報の使用に基づく。 Spo IIAC遺伝子の欠失を、オーバーラップ伸長技術によるスプライシングを用いて試験管内で調製した。この遺伝子を温度感受性プラスミドにおいてバチルス・リケニホルミス内に導入し、そして組込み及び染色体からの除去の後、染色体遺伝子の正確に位置した欠失を調製した。変異されたバクテリアは全体的に無胞子生殖であり、細胞の極における非対称の隔膜を特徴とする不稔性の非胞子形成細胞を形成した。定性プレートテストは、バクテリアが通常のレベルのDN'ase、ポリガラクツロネートリアーゼ、プロテアーゼ、RN'ase及びキシラナーゼを合成したが、β−１，３−グルカナーゼによる加水分解ゾーン及びカルボキシメチルセルラーゼ活性が親株と比較して変異体で減少したことを示した。 72時間の長時間のインキュベーションの間、変異体及び親のバッチ培養においてアルカリプロテアーゼの合成は同じであったが、α−アミラーゼ産生量は、変異体で約30％削減された。この研究において、我々は、規定された遺伝子欠失を調製するために、Ｂ．リケニホルミスにおいて生体内組換えを用いることができ、そしてSpo IIACの欠失が、胞子形成が全体的かつ安定して欠損し、なおセリンプロテアーゼの通常の合成を保持しているがアミラーゼ合成が少し削減された株を発生させることを示す。本発明は、Ｂ．リケニホルミスにおいて例示されるが、本発明は更に他のバチルス、例えばＢ．レントゥス（B ．lentus）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（B ．amyloliquefaciens ）、Ｂ．トゥリンギエンシス（B ．thuringiensis）、Ｂ．アルカロフィルス（B ．alcaloghilus）、Ｂ．メセンテリクス（B ．mesentericus ）等に用いることができることが考えられる。表及び図面の簡単な記載表１は、バチルス・リケニホルミスの検出されたSpo IIAC対立遺伝子を有する pE194ts の切除度数を示す。図１は、Spo IIAにおいて欠失を形成するのに用いたオーバーラップ伸長によるスプライシングを示す。Ａ．用いたプライマーの詳細（図は、プライマーＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの３′−末端のヌクレオチド位置を示す）。Ｂ．欠失された株（DN286 Spo IIACD3）からのプライマーＡ及びＤを用いて形成されたPCR 産物を配列決定することにより得られたSpo IIAC遺伝子の配列。図２は、Spo IIACにおいて欠失を作り出す組込み及び切除反応を示す。図３は、不稔性非胞子形成表現型を示すSpo IIAC欠失変異体の培養物からの典型的な細胞の薄断片を示す。図４は、Ｂ．リケニホルミスDN286 及びDN286 Spo IIACD3における増殖、胞子形成及び細胞外酵素合成を示す。Ａ及びＢ；各々最小培地及び脳心臓注入物における株DN286 の増殖（■）及び胞子（□）並びにDN286 Spo IIACD3の増殖（●）。Ｃ及びＤ；各々最小培地及び脳心臓注入物における株DN286（■）及び本DN286 Spo IIACD3（●）によるセリンプロテアーゼ合成。Ｅ；最小培地（□、○）及び脳心臓注入物（■、●）における株DN286（□）及びDN286 Spo IIACD3（○）におけるアミラーゼ合成。発明の詳細な記載上述の通り、本発明は、転移したポリペプチドを生産するための方法であって、ｉ）突然変異のため胞子形成できないバチルス属のバクテリアであって前記代謝物の生産に関連するポリペプチドをコードするDNA 構成物を含むバクテリアを、前記DNA 構成物の発現及び前記代謝物の生産を導く条件下で培養し、 ii）前記代謝物を回収することを含み、但し前記バクテリアはＢ．サブチリス種に属さないことを特徴とする方法を提供する。本発明によれば、前記バクテリアは、Ｂ．リケニホルミス（B ．licheniformis ）、Ｂ．レントゥス（B ．lentus）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（B ．amylol iquefaciens ）、Ｂ．トゥリンギエンシス（B ．thuringiensis）等を含む種からなる群に属することが好ましい。本発明の方法は、Spo IIAC遺伝子の欠失により胞子形成を不能にされているバチルスの使用により例示されるが、不可逆的に胞子形成過程を有効に破壊するいずれの他の変異も、例えばSpo２−変異及びSpo３−変異も本発明に含まれる。上述のように、本発明の方法は、好ましくは、前記変異が不可逆的であるバクテリアを利用する。本発明の方法は、主としていずれかのポリペプチド、特に転移されたポリペプチドの生産のために用いられることが考慮される。前記ポリペプチドはそのバクテリアに対して内因性でも外因性でもよく、それは、もとのポリペプチドが各々それ自体で又は特定の他の生物により生産されることを意味する。しかしながら、本発明の胞子形成欠損株は、二次代謝物の生産に用いることができることも考えられる。本発明の方法からの生成物は、好ましくは、酵素、特に工業用酵素例えばプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ、アミラーゼ等である。本発明の方法により生産できる他の生成物は、医療用酵素である。用語“転移ポリペプチド”とは、発現されたポリペプチドが、それが細胞膜を横切って転位されるのを可能にするシグナル配列を有することを示すことを意図する。特に、転移ポリペプチドは、分泌されるポリペプチド又は問題のバチルス細胞の分泌メカニズムに関連するポリペプチドであり得る。本発明は、胞子形成過程に関連する１又は複数の遺伝子が部分的又は完全に欠失されることによる突然変異のため胞子形成できないバチルス属に属するバクテリアを生産する方法も提供する。遺伝子組込み及び切除は、Ｂ．サブチリス及び他のグラム陽性バクテリアにおいて特定の変異を作り出すための一般的手順である（10，24，25）。ここで、我々は、Ｂ．リケニホルミスのような他のバチルスの染色体内に所定の変異を導入するための有効な手順であることを示す。Ｂ．サブチリスとＢ．リケニホルミスとの間の密接な関係を仮定すれば（26）、その染色体内への遺伝子の導入のために異種対立遺伝子を用いる可能性を検査することに関心があった。この方法において、本発明によれば、Ｂ．リケニホルミスのような他のバチルスにおけるゲノム操作のためにＢ．サブチリスからの大量の配列決定された遺伝子を用いることが可能である。相同性は、たとえ相同反応より低い頻度であっても、Ｂ．リケニホルミスのSpo IIAC対立遺伝子の、Ｂ．サブチリス染色体への組込みに十分であり、そしてこれらの組込み物は非胞子生殖性であるので組込みはおそらく正確な部位でおこっている。しかしながら、Ｂ．サブチリス宿主における切除は、組込みクロスオーバー点における第２部位組換えにより一定におこり、欠失物は回収されなかった。おそらく、この領域における高い相同性が組換えのホットスポットを導入し、結果として全ての子孫（いくつかの組込み物から検査された少なくとも2000）が完全なSpo IIAC遺伝子を保持した。逆の状態はＢ．リケニホルミスにおいて適するようであり；そしてＢ．リケニホルミス染色体内へ組込まれたＢ．サブチリス遺伝子は、完全に削り取るだろう。Ｂ．サブチリス及びＢ．リケニホルミスが同様の発達経路をたどることを仮定すると、Ｂ．リケニホルミスにおけるSpo IIAC中の欠失の結果は、Ｂ．サブチリスモデルの範囲で議論することができる。実際、Ｂ．サブチリスのSpo IIAC変異体に見られるのに極めて似た不稔性非胞子形成性細胞へのＢ．リケニホルミスDN 286 Spo IIACD3の分化（４）は、全体的にこの仮定を支持する。細胞外酵素は、一般に、指数増殖の後期及び胞子形成の段階II前の定常期早期に合成される（27）。それゆえ、Spo IIACの変異は、これらの遺伝子の発現にほとんど又は全く影響がないことが予想され、そして実際、解釈できないβ−グルカナーゼの例外はあるが、プレートテストは、親株と比較して、変異体における細胞外酵素生産量の大きな変化はないことを示した。隔膜形成(septation)が完全になる前に発現される遺伝子Spo IIA 細胞内で発現されるだろう。これは、全ての段階０遺伝子及びいくつかの段階II遺伝子並びに調節遺伝子、例えばabr B ，hpr，sen 及びsin を含む（12）。その少なくとも９の独立した遺伝子又はシステムが存在するＢ．サブチリスにおけるapr E 発現に影響を与えるほとんど又は全ての制御（12）は、早期の定常期の現象であり、おそらくSpo IIAC変異体において有効に機能する。次に、変異体におけるセリンプロテアーゼ合成のパターン及び酵素収率は、図４に示すように、その親のものに適合するだろう。実際、Ｂ．サブチリスにおけるセリンプロテアーゼ合成についての同様の結果が、規定されない非胞子生殖性変異体を用いてArbidge ら（13）により報告されている。 amy E の発現は、apr E よりＢ．サブチリスにおいてはるかに少ない調節遺伝子を必要とする、代謝物抑制及びDegSU システムは、sen(28)及びpai(29)も関連するが、この遺伝子のための主な調節システムである（12）。なぜアミラーゼの合成がSpo IIAC変異により影響を受けないかは直ちに明らかではない。早期胞子形成シグマ因子σ^Hは、その遮断がσ^F及びσ^E合成を防ぐのでSpo IIA C 変異体内に蓄積することが可能である；前者は欠失のためであり、そして後者は、前駆体pro−σ^Eからの活性σ^E産生がσ^F依存性であるためである（11）。実際、Spo IIA 変異体におけるσ^Hの蓄積の増加についての証拠がある（Errih gton；J；personal communication）。これにより、α−アミラーゼ収率の減少は、Ｅ−σ^AのＥ−σ^Hによる部分的な置換のためであり得る。本発明の主な目的の１つは、工業的酵素生産の目的に適したバクテリアを提供することである。本明細書に記載される変異体は、研究室条件下で全体的に非胞子生殖性であり、胞子形成の分子生物学は、それが内生胞子を作り出すことができないことを予測する。約400bp を貫く欠失の逆転の見込みは最小であり、抑制が問題となり得る証拠はない。最後に、本バクテリアは、例えばアルカリプロテアーゼ合成において、その親と同等である。材料及び方法株及び増殖条件 DN286 はバチルス・リケニホルミス野生型株である。Ｂ．リケニホルミスNCIMB6346 はNCIMB から利用できる。バチルス・サブチリス168 は、D．A．Smith（University of Birmingham，UK ）から得た。大腸菌JM83を、全てのプラスミド作製のために用いた。ルリア（Luria）ブイヨン及びルリアブイヨン寒天（16）を、適切な抗生物質：アンピシリン（100mg／ml）及びエリトロマイシン（１mg／ml）を選択して慣用的に用いた、スピジゼンの（Spizizen's）最小塩培地（16）、シャエフェーの（Schaefer's）胞子形成培地（16）、及び脳心臓注入（BHI）ブイヨン（Oxoid）も用いた。インキュベーションは、他に指示がない限り37℃で行った。プラスミド大腸菌JM83におけるクローニングのためにプラスミドpUC19 を用いた。 pUC13 内でクローンされたＢ．リケニホルミスからの完全なSpo IIA オペロンは、M．Yudkin（University of Oxford，UK）よりご提供頂いた。複製のための温度感受性であるpE194 の変異体であるpE194ts は、P．Youngma n（University of Georgia，Athens，Ga，USA）よりご提供頂いた。 DNA 操作ほとんどの方法はSambrookら（18）に従うか又は以前に記載される（21）。DN A をアガロースゲルから切除し、精製した後、Gene−Clean IIキット（Bio 101 Inc.）を用いて連結した。ABI373A DNA シーケンサーを用いて、Department of Molecular Medicine，King College，University of London，UKにより供された自動DNA シーケンシングサービスを用いてPCR 産物のDNA 配列決定を行った。シーケンシングプライマー配列番号：１： 5′−CGATCATGGAAAATTTCATGGATG−3′ は、公開される配列（17）の塩基 943〜966 に相当する、提案される組換え連結部分の上流約100 塩基の領域に相補的であった。酵素アッセイ酵素分泌の定性的評価は、以前に記載されたプレート検出法に基づいている（ 22）。基質としてアゾカゼインを用いて培養上清においてアルカリプロテアーゼをアッセイした。リン酸カリウム緩衝液（50mM，pH9.0，１ml）及び培養上清（1.0ml ）を、３分、37℃で平衡化し、リン酸緩衝液中0.8 ％アゾカゼイン溶液0.5 mlを加えることによりその反応を開始した。適切な時期に、0.5 ml反応混合物を0.5 mlの氷冷20％TCA で沈殿させ、その混合物を遠心し、そしてその上清の吸光度を 405nm において測定した。活性は、上清のml当り分当りの吸光度の変化として表される。37℃においてPhadebasアミラーゼ基質（Pharmacia）を用いて、培養上清中でアミラーゼをアッセイし、Phadebas及びNelson-Somogi 還元糖アッセイによりアッセイされたアミラーゼの希釈液で作製された標準曲線を用いて、可溶性デンプンからの還元糖（マルトース）の遊離に変換した。単位は、ml遊離マルトース当量／分／ml上清である。全てのバッチ培養を少なくとも２回行った；供される図は、結果の再現パターンを表す。電子顕微鏡法炭素源として0.5 ％マルトースを含む最小培地中で増殖した細胞を遠心により収集し、50mM NaCl を含む10mM Tris 緩衝液pH８で洗浄した。細胞を酢酸ウラニル水溶液で染色し（４％で２時間）、Robards 及びWilson（23）に従って、クエン酸鉛で対比染色した。薄断片を、Jeol 100S 透過顕微鏡下で見た。実施例実施例１ Spo IIACの欠失の調製オーバーラップ伸長反応によるスプライシング（SOE）を用いた（19）。Spo I IAC 遺伝子のプロモーター近位領域を、プライマーＡ（配列番号：２）：５′−GCGGCGAATTCAGCTTGACCCGACGATGGATGAACTG−３′ 及びＢ（配列番号：３）：５′-CACGACCTCTTCTGAACTGAAGTTCTTTCACTTCATGGTCTTTAAGCTG−３′ との反応で増幅し、そしてSpo IIAC遺伝子のプロモーター遠位領域を、プライマーＣ（配列番号：４）：５′−GACCATGAAGTGAAAGAACTTCAGTTCAGAAGAGGTCGTGATGGCC−３′ 及びＤ（配列番号：５）：５′−GCGGCGGATCCTGCCTGCAACATGAGCAGCCTCAGC−３′ との分離反応において増幅した。プライマーＡ及びＤ中の下線の配列は、各々Eco RI及びBam HI部位を表す。その反応混合物は、200ng のテンプレートDNA（Ｂ．リケニホルミスのクローン化S po IIA オペロン）、100pmol の各々のプライマー、最終濃度125mM の各々のdNT P，６mlのMgCl₂（25mM）、10mlの（×10）Taq 緩衝液、及び全部で 100mlとなる量の滅菌Millipore 水を含んでいた。増幅プログラムは、10分間、95℃での変性の後、１ユニットのTaq ポリメラーゼ（Promega）を加える最初のサイクルからなり、そしてその反応混合物は軽鉱油 100mlでカバーされる。この後、２分間、95℃での変性、２分間、55℃でのアニーリング、及び３分間、72℃での伸長の35サイクルが行われる。95℃12分、55 ℃／２分及び72℃／６分の伸長ステップの更なるサイクルでプログラムを完了した。 464 及び382bp PCR 産物を、エタノール沈殿により濃縮し、Gene-Cleanキットを用いて精製し、SOE 反応（上述と同じ条件）におけるプライマーＡ及びＤと共に、テンプレート（各々300ng）として用いてフラグメントADを含む806 塩基対S po IIAC 欠失物を形成した。実施例２バチルス・リケニホルミス及びＢ．サブチリスへの欠失の導入フラグメントADを、プライマーＡ及びＤ内に含まれる各々Bam HI及びEco RI制限部位を通してpUC19 内にクローンし、大腸菌JM83内に形質転換し、そして挿入物と共にプラスミドを含むコロニーを、40mg／mlのＸ−gal を含むLBアンピシリンプレート上でスクリーニングした。次に、クローンからの組換えプラスミドを、前者をウシ腸のアルカリホスファターゼで処理した後に、各々のレプリコン内の特有のPst Ｉ部位を通してpE194t s に連結した。連結混合物を大腸菌JM83内に形質転換し、その組換え体を、ミニー調製物のアガロースゲル電気泳動により検出した。次に、大腸菌から調製されたプラスミドを用いて、Ｂ．リケニホルミスDN286（10）のプロトプラスト及びＢ．サブチリス168（20，７）のコンピテント細胞を形質転換した。 pE194 ベースの欠失されたSpo IIAC対立遺伝子を含む、Ｂ．リケニホルミス及びＢ．サブチリスを28℃で、エリトロマイシンを含む50ml LBブイヨン内で一晩、増殖させた。サンプルを希釈して、エリトロマイシンを含む３mlの軟質寒天と混合し、LB寒天Emプレート上に積層し、28℃（複製を許容）及び40℃（非許容性）でインキュベートした。組込みの頻度は、非許容性の温度において増殖するものに対する許容性の温度で増殖するコロニーの数の比であった。次に、40℃で単離された組込み物を37℃でルーチン的に増殖させた。組込まれたプラスミドの切取りを、抗生物質選択のないLBブイヨン中で30℃で細胞を増殖させることにより行った。希釈したサンプルをLB寒天上にプレートし、37℃で一晩、インキュベートして、コロニー複製物をエリトロマイシンを含む及びそれを含まないLB寒天上にプレートした。切取りのEm^rコロニーの数に対するコロニーの総数の比として決定した。実施例３ Spo IIACにおける欠失の調製Ｂ．リケニホルミスのSpo IIAC遺伝子中の欠失を、オーバーラップ伸長によるスプライシング(SOE)技術を用いて調製した。材料及び方法に記載されるプライマーを用いて、クローンされたSpo IIAオペロンから、２つの独立したPCR 増幅を行った。１つの産物（AB）は、下流遺伝子（Spo IIAB）の遠端及びSpo IIAC遺伝子の近位領域を含んでいた。第２の産物（CD）は、Spo IIACの遠位領域及び上流非コード化領域の部分をカバーしていた。プライマーＢ及びＣ中の相同（オーバーラップ）の伸長領域を用いて、産物AB及びCDを含み、プライマーＡ及びＤを組み込む第３のPCR 増幅を開始した。これは、372bp の欠失を含むSpo IIAC遺伝子の端を含むフラグメントを生じた。（フラグメントAD、図１参照）。フラグメントADをpUC19 内にクローンし、各々のレプリコン内の特有のPst Ｉ部位を通してpE194ts に連結してシカトルプラスミドpHWM2（図２）を作り出し、大腸菌に形質転換した。次に、大腸菌から調製されたプラスミドを用いてＢ．リケニホルミスDN286 のプロトプラスト及びＢ．サブチリス168 のコンピテント細胞を形質転換した。各々の形質転換体からのクローンがpHWM2 を含むことを制限酵素分析により確認し、組込み及び切取りのために用いた。実施例４欠失されたSpo IIAC対立遺伝子の組込み及び切取り pHWM2 を含むＢ．リケニホルミス及びＢ．サブチリス細胞を、28℃で一晩、増殖させて選択（Em含有）及び非選択培地上にプレートし、45℃でインキュベートした。45℃においてエリトロマイシンプレート上で増殖することができた細胞の割合として評価した組込み頻度は、Ｂ．リケニホルミスについて約10^-4及び（Ｂ．リケニホルミス対立遺伝子を含む）Ｂ．サブチリスについて100 倍低かった（表１）。28℃で培養することによる組込まれたプラスミド内のローリングサークル複製の活性化の後に、いくつかの組込み物をプラスミドの切取りについてテストした時、その頻度は、Ｂ．リケニホルミスについて10^-2〜10^-3であった。２つのコロニー（組込み体１及び２）において、切取りは組込み部位を通して一定であり、野生型、Spo⁺子孫を回収した。しかしながら、他の３つのクローンについて、切取りはEm^S誘導体においてSpo IIAC遺伝子の欠失を生ずる第２の部位の組換えを通してであった（図２参照）。興味深いことに、その挿入はＢ．サブチリスにおいて極めて不安定であったが、一定の切取りが挿入点においておこり、48時間の長い増殖期間の後でさえSpo^-子孫は回収されなかった（表１）実施例５Ｂ．リケニホルミスDN286 Spo IIACD3のキャラクタリゼーションＢ．リケニホルミス組込み体３（表３）からの欠失株を更なる研究のために選択した。野生型及びEco RIで切断されている欠失株からのサザンブロットされた染色体DNA への、Ｂ．リケニホルミスからの標識されたSpo IIA オペロンのハイブリダイゼーションは、親の4.2kb と比較して変異体で3.8kb のより小さいハイブリダイズするフラグメントを示した（データは示さない）。プライマーＡ及びＤを用いる変異体及び親株の染色体DNA からのPCR 増幅は、その変異体が約370bp の欠失を処理したことを示した。その変異体からの PCR 産物を配列決定した時、プライマーＢ及びＣの間の連結点に正確に位置した欠失が示された（図１Ｂ）。電子顕微鏡により、Spo IIA 変異体の形態学的確認を行った。Ｂ．サブチリスSpo IIAC変異体の典型である“不稔性非胞子形成体” 細胞中の２つの非対称隔膜が明らかに見られた（図３）。その欠失は、胞子を検出することができない実完に非胞子生殖性培養物を生じた。BHI、最小培地（図４）及びSchaeffer's 胞子形成培地（データは示さない）での72時間の増殖の後、その親の胞子形成頻度は各々の場合、約２％であった。同じ３つの条件下で90％〜100 ％の胞子形成を示したＢ．リケニホルミスNCIM B6346 と比較することにより、DN286 の自然の低い胞子形成比率を確認した。いずれの培地中でも、Spo IIAD3 誘導体において胞子は検出されなかった。胞子の欠如にかかわらず、BHI 中で増殖させた場合、その変異体における生存性の大きな損失又は細胞溶解についての証拠はなく、その細胞集団は、インキュベーション期間全体を通して約４×10⁹cfu／mlで安定して維持された。しかしながら、最小培地において、変異体を36時間を超えてインキュベートした場合、生存性がいくらか損失し、その最終的細胞集団は、10倍高いピークの後、３×10⁸cfu／ mlに達した。生存性の損失は、最小培地で増殖する親におけるものより低かった。実施例６Ｂ．リケニホルミスDN286 Spo IIACD3における細胞外酵素合成最初のプレートテストは、変異体株が、合成された細胞外酵素の量において親といくらか異なることを示すことを示唆した。特に、β−１，３−グルカナーゼ及びカルボキシメチルセルラーゼからの加水分解ゾーンは、親株と比較して変異体で削減されたが、α−アミラーゼ、DN'ase、ポリガラクツロネートリアーゼ、プロテアーゼ、RN'ase及びキシラナーゼの合成は大きく影響を受けなかった。変異体及びその親を、72時間、豊富な（BHI）及び最小培地中で増殖させた。胞子形成及びセリンプロテアーゼの合成をモニターした（図４）。プロテアーゼ産生量は親及び変異体の両方で同様であった。最小培地において、酵素収率は、両方の株において約40時間のインキュベーション後にピークに達し、その後安定して続いた。BHI において、酵素収率は少し抑制され、両方の株において約48時間のインキュベーション後にピークに達した。酵素収率のその後の減少は、塩培地よりBHI 培地で低かった。両方の培地において、セリンプロテアーゼの収率は、Spo IIAC欠失により影響を受けなかった。 α−アミラーゼ合成は、親と比較して、変異体のバッチ培養の間、一貫してより遅く開始し、結果として、これらの発酵は、プロテアーゼのものより長時間、続いた（84時間）。両方の培地において、変異体からの酵素の収量は、親から得られたものの約70％であった。しかしながら、その酵素収量を生物量の単位当りの特異活性として表すと、変異体は、特に生物量が最小培地中で減少する時の増殖サイクルの後期において、その親とほぼ同様であった。本発明は、その実施形態を示すのみである実施例を通して詳説される。これは、多くの他の実施形態が当業者に明らかであろうから、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。明細書中の参考文献１． Diderichsen，B.，G．B．Poulsen and P．L．Jorgensen．1991． Cloning and expression of a chromosomal alpha-amylase gene from Bacillus stearothermophilus．Res．Microbiol． 142: 793-796．２． Leen，R．W．van，J．G．Bakhuis，R．F．W．C．van Beckhoven，M．Bruge，L．C．J．Dorssers，R．W．J．Hommes， P．J．Lemson，B．Noordam，N．L．M．Persoon and G． Wagemaker．Production of human-interleukin 3 using industrial microorganisms．Bio/Technol．9: 47-52．３． de Boer，A．S.，F．Priest and B．Diderichsen．1994．on the industrial use of Bacillus licheniformis: a review． Appl．Microbiol．Biotechnol．40: 595-598．４． Errington，J．1993．Bacillus subtilis sporulation: regulation of qene expression and control of morphogenesis Microbiol．Rev．57：1-33．５． 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:10） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フレミング，アラステア，ビー. イギリス国，スコットランド，エジンバライーエイチ 14 ４エーエス，リッカートン，シー／オーエリオット−ワットユニバーシティ (72)発明者タンジェニー，マーティンイギリス国，スコットランド，エジンバライーエイチ 14 ４エーエス，リッカートン，シー／オーエリオット−ワットユニバーシティ (72)発明者ジョージャンセン，パー，リナデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (72)発明者ディダーシェン，ボージュデンマーク国，デーコー−2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．代謝物を生産するための方法であって、ｉ）突然変異のために胞子形成できないバチルス属のバクテリアであって前記代謝物の生産に関連するポリペプチドをコードするDNA 構成物を含むバクテリアを、前記DNA 構成物の発現及び前記代謝物の産生を導く条件下で培養するステップと、 ii）前記代謝物を回収するステップと、を含み、但し前記バクテリアはＢ．サブチリス種に属さないことを特徴とする方法。２．前記バクテリアが、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レントゥス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．トゥリンギエンシスを含む種の群に属することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記突然変異が、Spo ２変異、Spo ３変異、Spo IIAC変異を含む突然変異の群から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。４．前記突然変異が不可逆的であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。５．前記代謝物が内因性又は外因性ポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。６．前記ポリペプチドが転移されることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記ポリペプチドが酵素であることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。８．前記酵素が工業用酵素であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の方法。９．前記酵素が医療用酵素であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の方法。 10．胞子形成過程に関連する１又は複数の遺伝子が部分的又は完全に削除されることによる突然変異のため胞子形成できないバチルス属に属するバクテリアを生産する方法。 11．前記バクテリアが、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レントゥス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．トゥリンギエンシスを含む種の群に属することを特徴とする請求項10に記載の方法。 12．前記変異が、Spo ２変異、Spo ３変異、Spo IIAC変異を含む変異の群から選択されることを特徴とする請求項10又は11に記載の方法。 13．前記変異が不可逆的であることを特徴とする請求項10〜12のいずれかに記載の方法。 14．突然変異のために胞子形成できないＢ．サブチリスを除くバチルス属に属するバクテリア。 15．前記バクテリアが、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レントゥス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｂ．トゥリンギエンシスを含む種の群に属することを特徴とする請求項14に記載のバクテリア。 16．前記変異が、Spo ２変異、Spo ３変異、Spo IIAC変異を含む変異の群から選択されることを特徴とする請求項14又は15に記載のバクテリア。 17．前記変異が不可逆的であることを特徴とする請求項14〜16のいずれかに記載のバクテリア。