CN101321866B - 新型枯草杆菌突变株 - Google Patents

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Abstract

通过对来源于枯草杆菌的经基因破坏的菌株进行广泛的分析，本发明提供了各种酶的生产率非常优异的新型枯草杆菌突变株。根据本发明的枯草杆菌突变株具有通过使缺失区域栏中列举的区域缺失而制备的基因组结构。当导入有编码这些分泌性靶蛋白的基因使其得以表达时，与相同基因导入野生株的情况相比，这些枯草杆菌突变株的每种表现出的蛋白分泌生产率均有显著提高。

Description

新型枯草杆菌突变株
技术领域
本发明涉及新型枯草杆菌(Bacillus subtilis)突变株。本发明尤其涉及各种蛋白的分泌生产率提高的新型枯草杆菌突变株。
背景技术
枯草杆菌不仅作为革兰氏阳性细菌模型被广泛用于分子生物学研究，而且也作为生产各种酶如淀粉酶和蛋白酶的细菌被广泛用于发酵相关工业、制药工业和类似工业。枯草杆菌基因组的整个核苷酸序列已经由日本和欧洲联合基因组项目(joint Japanese and European genomeproject)确定。但枯草杆菌基因组中存在的大约4100个类型的基因的功能鉴定仍然没有完成。
迄今已经对具有大约4100个类型的存在于枯草杆菌基因组中的断裂基因的菌株进行了广泛地研究。由此已经提出271个基因对生长是至关重要的(K.Kobayashi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、100、4678-4683、2003)。
而且，已经通过使涉及枯草杆菌早期芽孢形成或类似过程的基因或蛋白酶基因、涉及D-丙氨酸添加至细胞壁或细胞膜内的磷壁酸的基因、或涉及表面活性肽(Surfactin)的生物合成或分泌的基因缺失或灭活，构建了各种细菌菌株(参见JP专利公开(Kokai)第58-190390A号(1983)、JP专利公开(Kokai)第61-1381A号(1986)、国际专利公开第89/04866号册子、JP专利公开(Kohyo)第11-509096A号(1999)、日本专利第321.0315号、JP专利公开(Kohyo)第2001-527401A号、JP专利公开(Kohyo)第2002-520017A号和JP专利公开(Kohyo)第2001-503641 A号)。但这些细菌菌株的蛋白生产率的提高程度不足。而且，迄今关于各种蛋白的生产率提高的枯草杆菌来源突变株或关于这些突变株的广泛分析尚没有获得有用的发现。
发明内容
本发明要达到的目的
考虑到上述的情况，本发明的目的是通过对来源于枯草杆菌的基因断裂株的广泛分析提供各种酶的生产率优异的新型枯草杆菌突变株。
达到目的的方式
为达到上述目的，本发明人广泛地分析了通过使枯草杆菌基因组的大区域缺失而获得的突变株，并因此成功地获得了许多各种酶的生产率优异的枯草杆菌突变株。因此完成了本发明。
根据本发明的枯草杆菌突变株具有通过使下表1中所示的缺失区域栏中所列举的区域缺失而制备的基因组结构。通过导入编码靶蛋白的基因使得该蛋白可以得以表达，制备这种枯草杆菌突变株，由此获得的枯草杆菌突变株与其中相同基因导入到野生型菌株内的情况相比，具有显著较高的靶蛋白分泌生产率。而且，这种枯草杆菌突变株可以是其中导入有编码靶蛋白的基因的突变株，使得该基因可以得以表达。而且，编码靶蛋白的基因可以含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列，或该基因可以适当地连接在含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列的DNA上游。在此上述靶蛋白可以是选自纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的至少一种酶。而且，这种枯草杆菌突变株可以使用枯草杆菌168株作为野生型菌株来制备。而且，如下表1中所列的在缺失区域栏中列举的基因组区域可以含有各自位于形成如下表2中所列的组的寡核苷酸之间的区域。
发明效果
根据本发明，可以提供具有优异的各种酶的生产率的新型枯草杆菌突变株。通过使用根据本发明的枯草杆菌突变株，不仅可以实现用于以优异的生产率生产各种酶的工业方法，而且也可以提供用于阐明各种酶的生产机制或类似作用的生物学材料。
本说明书包括日本专利申请第2005-298406号的说明书和/或附图中所公开内容的部分或全部，该申请是本申请的优先权文件。
附图说明
图1的示意图用于解释从枯草杆菌基因组缺失预定区域的方法的实施例。
图2的示意图用于解释从枯草杆菌168株制备枯草杆菌168Δupp株的方法。
图3的示意图用于解释经由插入cat-upp盒DNA片段构建重组质粒pBRcatupp的方法。
图4是解释制备Δ缺失靶区::cat-upp株的方法的示意图。
图5是解释制备Δ缺失靶区株的方法的示意图。
图6是解释制备Δ缺失靶区::tet株的方法的示意图。
图7的示意图用于解释使用pBRcatuppΔ缺失靶区在预定的突变株中使缺失靶区缺失的方法。
图8的示意图用于解释制备根据本发明的已经从其使多个缺失区域缺失的枯草杆菌突变株的方法。
具体实施方式
本发明详细地解释如下。
根据本发明提供的新型枯草杆菌突变株可以通过从枯草杆菌基因组缺失大的区域而获得。这些枯草杆菌突变株具有提高的靶蛋白或来源于导入其中的克隆基因的多肽的生产率。要被导入其中的基因可以是外源性或内源性的，只要它们能编码蛋白质。基因的例子可以是含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列的基因，或可以是适当地连接在含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列的其DNA上游的基因。而且，基因的例子可以导入至枯草杆菌突变株的基因组中，或也可以作为表达载体被导入至枯草杆菌突变株中。而且，要被导入其中的这种基因的数量可以是一条或多条。当导入多条基因时，多条基因可以经其排列而导入到一个DNA片段上的系(line)中，或可以作为不同的DNA片段而导入。基因导入技术不受特别限制。可以使用常规已知的转化方法、转导方法和类似方法。
要被导入其中的基因的例子包括但不限于，分泌性碱性纤维素酶、分泌性碱性蛋白酶和分泌性碱性淀粉酶。
根据本发明的新型枯草杆菌突变株的名称和缺失区域列在表1中。
表1
  枯草杆菌突变株名称   缺失区域
MGB533株   prophage6(yoaV-yobO)区、prophage1(ybbU-ybdE)区、prophage4(yjcM-yjdJ)区、PBSX(ykdA-xlyA)区、prophage5(ynxB-dut)区、prophage3(ydiM-ydjC)区、spb(yodU-ypqP)区、pks(pksA-ymaC)区、skin(spoIVCB-spoIIIC)区、pps(ppsE-ppsA)区、prophage2(ydcL-ydeJ)区、和ydcL-ydeK-ydhU区
MGB559株   prophage6(yoaV-yobO)区、prophage1(ybbU-ybdE)区、prophage4(yjcM-yjdJ)区、PBSX(ykdA-xlyA)区、prophage5(ynxB-dut)区、prophage3(ydiM-ydjC)区、spb(yodU-ypqP)区、pks(pksA-ymaC)区、skin(spoIVCB-spoIIIC)pps(ppsE-ppsA)区、prophage2(ydcL-ydeJ)区、ydcL-ydeK-ydhU区、和yisB-yitD区
MGB592株   prophage6(yoaV-yobO)区、prophage1(ybbU-ybdE)区、prophage4(yjcM-yjdJ)区、PBSX(ykdA-xlyA)区、prophage5(ynxB-dut)区、prophage3(ydiM-ydjC)区、spb(yodU-ypqP)区、pks(pksA-ymaC)区、skin(spoIVCB-spoIIIC)区、pps(ppsE-ppsA)区、prophage2(ydcL-ydeJ)区、ydcL-ydeK-ydhU区、yisB-yitD区、和yunA-yurT区
MGB604株   prophage6(yoaV-yobO)区、prophage1(ybbU-ybdE)区、prophage4(yjcM-yjdJ)区、PBSX(ykdA-xlyA)区、prophage5(ynxB-dut)区、prophage3(ydiM-ydjC)区、spb(yodU-ypqP)区、pks(pksA-ymaC)区、skin(spoIVCB-spoIIIC)区、pps(ppsE-ppsA)区、prophage2(ydcL-ydeJ)区、ydcL-ydeK-ydhU区、yisB-yitD区、yunA-yurT区、和cgeE-ypmQ区
MGB625株   prophage6(yoaV-yobO)区、prophage1(ybbU-ybdE)区、prophage4(yjcM-yjdJ)区、PBSX(ykdA-xlyA)区、prophage5(ynxB-dut)区、prophage3(ydiM-ydjC)区、spb(yodU-ypqP)区、pks(pksA-ymaC)区、skin(spoIVCB-spoIIIC)区、pps(ppsE-ppsA)区、prophage2(ydcL-ydeJ)区、ydcL-ydeK-ydhU区、yisB-yitD区、yunA-yurT区、cgeE-ypmQ区、和yeeK-yesX区
MGB653株   prophage6(yoaV-yobO)区、prophage1(ybbU-ybdE)区、prophage4(yjcM-yjdJ)区、PBSX(ykdA-xlyA)区、prophage5(ynxB-dut)区、prophage3(ydiM-ydjC)区、spb(yodU-ypqP)区、pks(pksA-ymaC)区、skin(spoIVCB-spoIIIC)区、pps(ppsE-ppsA)区、prophage2(ydcL-ydeJ)区、ydcL-ydeK-ydhU区、yisB-yitD区、yunA-yurT区、cgeE-ypmQ区、yeeK-yesX区、和ydiM-gutR-yebA区
Figure S200680045245XD00051
Figure S200680045245XD00061
Figure S200680045245XD00071
Figure S200680045245XD00081
此外，表1中所列的缺失区域也可被称为区域，每个区域都位于形成表2中所列组的寡核苷酸之间。
Figure S200680045245XD00101
Figure S200680045245XD00111
此外，根据本发明的各个枯草杆菌突变株的例子是具有如下基因组结构的突变株，该基因组结构通过从标准野生型菌株(例如，枯草杆菌168株)的基因组DNA中，除上文定义的缺失区域以外，还使其它区域缺失而制备。该“其它区域”的例子包括排除对生长很重要的基因的基因区域和非编码区。即使将其从基因组中缺失也不会降低进行上述分泌和生产能力的区域是优选的。
从枯草杆菌基因组中使表1所列的缺失区域缺失的方法不受具体限定。例如，在此可以应用下文所述并示于图1的方法。
具体来说，通过应用两步单交法，使用经由插入缺失用DNA片段而构建的用于缺失的质粒，从枯草杆菌基因组中使表1所列的缺失区域缺失(即通过SOE-PCR法制备(Gene、77、61(1989))。在该方法中使用的缺失用DNA片段是通过将相邻于受试区域(要被缺失的区域)上游的大约0.1-kb至3-kb的片段(称为上游片段)与相邻于其下游的大约0.1-kb至3-kb的片段(称为下游片段)连接而制备的DNA片段。而且，通过将抗药性标记基因片段如氯霉素抗性基因结合在DNA片段的下游或上游制备的DNA片段也可以在此使用。
首先，通过第一次PCR制备三个片段：受试基因(要进行缺失)的上游片段和下游片段；和如果需要的抗药性标记基因片段。这时，设计引物，其中将受试DNA片段(要进行结合)末端10-至30-碱基对的序列添加到引物上。例如，当上游片段和下游片段以该顺序连接时：对应于下游片段的上游侧上的10-30个核苷酸的序列被添加至位于(退火至)上游片段的下游侧上的引物的5’端；对应于上游片段的下游侧上的10-30核苷酸的序列被添加至位于(退火至)下游片段的上游侧上的引物的5’端。当上游片段和下游片段使用由此设计的引物组进行扩增时：与下游片段的上游侧对应的区域被添加至由此扩增的上游片段的下游侧；与上游片段的下游侧对应的区域被添加至由此扩增的下游片段的上游侧。
接下来，将通过第一次PCR制备的上游片段和下游片段混合。然后使用生成物作为模板，并使用包括位于(退火至)上游片段的上游侧的引物和位于(退火至)下游片段的下游侧的引物的一对引物，进行第二次PCR。通过将上游片段与下游片段以该顺序连接而制备的用于缺失的DNA片段可以通过第二次PCR来扩增。
此外，当抗药性标记基因片段与缺失用DNA片段连接时，抗药性标记基因片段通过第一次PCR扩增，以便加入与下游片段的下游侧对应的区域。随后，使用包括位于(退火至)上游片段的上游侧的引物和位于(退火至)抗药性标记基因片段的下游侧的引物的一对引物，进行第二次PCR。因此，通过将上游片段、下游片段和抗药性标记基因片段以该顺序连接而制备的缺失用DNA片段可以得以扩增。
而且，将通过以该顺序将上游片段连接至下游片段而制备的缺失用DNA片段通过第二次PCR进行扩增之后，将缺失用DNA片段插入到含有抗药性标记基因的质粒中。然后，可以制备以该顺序具有上游片段、下游片段和抗药性标记基因片段的用于缺失的DNA片段。
而且，使用通用限制性内切酶和DNA连接酶，通过将根据上述方法或类似方法得到的缺失用DNA片段插入到在宿主细菌内不被扩增的质粒DNA中，或者插入到很容易出去的质粒DNA(例如，温度敏感质粒)中，构建用于导入缺失的质粒。这种在宿主细菌内不被扩增的质粒DNA的例子包括但不限于，例如，当使用枯草杆菌作为宿主时的pUC18、pUC118和pBR322。
随后，通过感受态细胞转化方法(J.Bacterid.93、1925(1967))或类似方法，使用这种用于缺失的质粒，对宿主细菌进行转化。因此，通过在插入在质粒中的上游或下游片段和基因组上同源区之间的单交同源重组，可以获得其中用于缺失的质粒融合在宿主细菌的基因组DNA内的转化体。使用用于导入缺失的质粒的标记基因(如氯霉素抗性基因)的抗药性作为指示，可以对转化体进行选择。
在由此获得的转化体的基因组上，要被缺失的抗药性基因的上游和下游区序列冗余性地(redundantly)存在。具体来说，来源于宿主细菌基因组的这些上游和下游区序列和来源于缺失用质粒的相同序列冗余性地存在。在这些上游或下游区当中，通过使同源重组在基因组内在与获得转化体时已经进行过同源重组的区域不同的区域处发生，使得除了来源于缺失用质粒的区域的缺失以外，在基因组上还发生了(要被缺失的)靶基因例如抗药性基因的缺失。用于在基因组内引起同源重组的方法的例子是，例如，涉及诱导感受态的方法(J.Bacteriol.93.1925(1967))。即使在通常培养基中的简单培养中，也通过自发诱导发生同源重组。由于相关抗药性基因的缺失，基因组内已经进行过同源重组的细菌菌株如所预期已经同时丧失了其对药物的抗性。因此，可以从得到的药物敏感性细菌菌株中选择这种进行过同源重组的细菌菌株。从这些细菌菌株中提取基因组DNA，然后可以通过PCR法或类似方法确认靶基因的缺失。
当选择靶缺失株时，直接选择由抗药性菌株改变的药物敏感性细菌菌株是困难的。而且，考虑到基因组内发生同源重组的频率低达大约10-4或更低。因此，需要发明一些方法，例如提高所存在药物敏感性菌株的比例以便有效地获得靶缺失株的方法。用于浓集药物敏感株的方法的例子是利用如下事实的浓集方法：基于青霉素的抗生素例如氨苄青霉素杀菌性地作用于增殖的细胞，而这些抗生素不作用于未增殖的细胞(Methods in Molecular Genetics.Cold Spring Harbor Labs、(1970))。当进行使用氨苄青霉素或类似物进行浓集时，这对于使对制菌性地作用于宿主细胞的药物(例如四环素或氯霉素)有抗性的基因缺失是有效的。保留有这种抗药性基因的耐药菌株可以生长在含有适量具有制菌作用的相关药物的适当培养基中。缺少抗药性基因的药物敏感株即不增殖也不死亡。在这种条件下，加入适当浓度的基于青霉素的抗生素如氨苄青霉素，然后进行培养。要增殖的耐药株死亡，敏感株保持不受氨苄青霉素或类似物的影响，使得存在的敏感株的比例增加。将适当的琼脂培养基涂有进行过这种浓集过程的培养溶液，然后进行培养。通过影印法(replica method)或类似方法，确认已经出现的集落对标记药物存在或不存在抗性。因此，可以有效地选择敏感株。
如上所述，可以产生在基因组上具有缺少预定单个区域的基因组结构的枯草杆菌突变株。而且，通过LP(原生质体溶解)转化法，可以产生具有缺少多个区域的基因组结构的枯草杆菌突变株。LP转化法的使用可以参见“T.Akamatsu和J.Sekiguchi、“Archives ofMicrobiology，”1987、vol.146、p.353-357”和“T.Akamatsu和H.Taguchi、“Bioscience、Biotechnology、and Biochemistry，”2001、vol.65、No.4、p.823-8297”。具体来说，根据LP转化法，提供通过细胞壁溶解获得的原生质体作为受体细菌菌株的感受态细胞的供体DNA。据认为，在此加入的原生质体被渗压震扰破坏，然后，培养溶液中释放的供体DNA并入到受体细菌菌株的感受态细胞中。而且，不像使用通常的转化法，通过使用LP转化法可以大大减少要导入的DNA的损害。
通过应用LP转化法，可产生另一枯草杆菌突变株，其具有的基因组结构通过从具有含单个缺失的基因组结构的枯草杆菌突变株缺失多个区域而制备。具体来说，首先，制备具有缺少预定区域(称作第一缺失区域)的基因组结构的枯草杆菌突变株的原生质体。使该原生质体与具有缺少不同区域(第二缺失区域)的基因组结构的枯草杆菌突变株的感受态细胞共存。因此，在具有第一缺失区域的基因组DNA(供体DNA)和具有第二缺失区域的基因组DNA(宿主DNA)之间形成一组跨链交换结构(cross-strand exchange structure)。该组跨链交换结构在供体DNA中第一缺失区域位于其间的位置处产生。因此供体DNA中的第一缺失区域被导入到宿主DNA中。如上所述，通过应用LP转化法，可以产生具有缺少第一缺失区域和第二缺失区域的基因组结构的枯草杆菌突变株。通过应用该方法，可以产生具有缺少多个区域的基因组结构的枯草杆菌突变株，只要对生长必不可少的基因不被缺失。
如上所述生产的根据本发明的枯草杆菌突变株特征在于进行分泌和生产由导入基因所编码的蛋白或多肽的能力比野生标准细菌菌株如枯草杆菌168株要高。使用本发明的枯草杆菌突变株生产的靶蛋白或靶多肽的例子不受具体限定，包括工业用酶或生理学活性肽，其用于与去污剂、食品、纤维、饲料、化学产品、药品、诊断和类似方面相关的各种工业领域。特别优选工业用酶。工业用酶的实例包括，当根据功能分类时，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶/合成酶。其中，使用本发明的枯草杆菌突变株生产的靶蛋白的例子优选地包括水解酶，例如纤维素酶、α-淀粉酶和蛋白酶。
例如，在已经导入有纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶基因的枯草杆菌突变株中，从细菌体分泌出的酶的生产量相比较于其中已经导入有相同酶基因的野生标准细菌菌株而显著提高。根据本发明的枯草杆菌突变株中这些酶的分泌生产率可以通过不受限定地应用各种传统的已知技术来测量。
例如，纤维素酶的生产率可以如下进行测量。首先，将测试枯草杆菌突变株用具有纤维素酶基因的载体转化。接下来，培养由此获得的转化体，然后通过离心或类似方法去除细菌体，获得培养上清液。例如，将对硝基苯基-β-D-纤维三糖苷(cellotrioside)(SeikagakuCorporation)作为底物加入到每种由此获得的上清液中，然后使反应进行预设的时间。当反应进行时，根据420nm处吸光度(OD420nm)的变化，对产生的对硝基苯酚的量进行定量。因此，可以测量由已经导入到测试枯草杆菌突变株中的纤维素酶基因编码的纤维素酶的生产率。此外，以同样的方式测量标准野生型菌株如枯草杆菌168株的纤维素酶生产率，这样可以将测试枯草杆菌突变株的纤维素酶生产率评价为相对于标准野生型菌株的数值。
纤维素酶的例子是属于多糖水解酶类别第5家族的纤维素酶(Biochem.J.、280、309、1991)。在这些纤维素酶中，优选来源于微生物的纤维素酶，尤其是来源于属于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌的纤维素酶。其更为具体的例子是：来源于属于芽孢杆菌属的细菌KSM-S237株(FERM BP-7875)的包括SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶；来源于属于芽孢杆菌属的细菌KSM-64株(FERM BP-2886)包括SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶；或包括与相关氨基酸序列的同一性为70％、优选80％、更优选90％或更高、进一步优选95％或更高、且特别优选98％或更高的氨基酸序列的纤维素酶。此外，作为氨基酸序列比较的结果，具有SEQ IDNO：116所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶和具有SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶显示出大约92％的同一性。两种纤维素酶都适合作为用于本发明的纤维素酶的具体例子。更优选具有SEQ IDNO：116所示的氨基酸序列的碱性纤维素酶。
对于这种纤维素酶的生产，在本发明的枯草杆菌突变株当中，更优选使用选自表1中所列举的枯草杆菌突变株：MGB653株、MGB683株、MGB781株、MGB723株、MGB773株、MGB822株、MGB834株、MGB846株、MGB872株、MGB885株、MGB913株、MGB860株、MGB874株、MGB887株、NED02021株、NED0400株、NED0600株、NED0803株、NED0804株、NED1100株、NED1200株、NED1400株、NED1500株、NED1901株、NED 1902株、NED2201株、NED2202株、NED2402株、NED2500株、NED2602株、NED2702株、NED2802株、NED3000株、NED3200株、NED3303株、NED3701株、NED3800株、NED4000株、NED4001株、NED4002株和NED4100株。
例如，蛋白酶的生产率可以如下测量。首先，将测试枯草杆菌突变株用具有蛋白酶基因的载体转化。接下来，培养由此获得的转化体，然后通过离心或类似方法去除细菌体，获得培养上清液。例如，将琥珀酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酸对硝基苯胺(STANAPEPTIDE INSTITUTE、INC.)作为底物加入到每种由此获得的上清液中，然后使反应进行预设的时间。当反应进行时，根据420nm处吸光度(OD420nm)的变化，对产生的对硝基苯胺的量进行定量。因此，可以测量由已经导入到测试枯草杆菌突变株中的蛋白酶基因编码的蛋白酶的生产率。此外，以同样的方式测量标准野生型菌株如枯草杆菌168株的蛋白酶生产率，这样可以将测试枯草杆菌突变株的蛋白酶生产率评价为相对于标准野生型菌株的数值。
蛋白酶的具体例子包括来源于微生物的蛋白酶，尤其是来源于属于芽孢杆菌属的细菌的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。蛋白酶更具体的例子包括来源于克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16株(FERMBP-3376)的包括SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列的碱性蛋白酶和包括与相关氨基酸序列的同一性为70％、优选80％、更优选90％或更高、进一步优选95％或更高、且特别优选98％或更高的氨基酸序列的蛋白酶。
对于这种蛋白酶的生产，在本发明的枯草杆菌突变株当中，更优选使用选自下列的枯草杆菌突变株：MGB533株、MGB592株、MGB604株、MGB625株、MGB653株、MGB683株、MGB781株、MGB723株、MGB773株、MGB822株、MGB834株、MGB846株、MGB872株、MGB885株、MGB913株、MGB943株、MGB860株、MGB874株、MGB887株、NED0302株、NED0400株、NED0600株、NED0803株、NED1500株、NED1902株和NED3200株。
例如，碱性淀粉酶的生产率可以如下测量。首先，将测试枯草杆菌突变株用具有碱性淀粉酶基因的载体转化。接下来，培养由此获得的转化体，然后通过离心或类似方法去除细菌体，获得培养上清液。然后，例如，使用用于测定淀粉酶活性的试剂盒Liquitech Amy EPS(Roche Diagnostics)，可以测定包含在每种上清液中的碱性淀粉酶的活性。因此，可以测量由已经导入到测试枯草杆菌突变株中的碱性淀粉酶基因编码的碱性淀粉酶的生产率。此外，以同样的方式测量标准野生型菌株如枯草杆菌168株的碱性蛋白酶生产率，这样可以将测试枯草杆菌突变株的碱性淀粉酶生产率评价为相对于标准野生型菌株的数值。
淀粉酶的具体例子包括来源于微生物的α-淀粉酶。尤其是来源于属于芽孢杆菌属的细菌的液化型淀粉酶。淀粉酶更具体的例子包括来源于属于芽孢杆菌属的KSM-K38株细菌(FERM BP-6946)的包括SEQID NO：120所示的氨基酸序列的碱性淀粉酶和包括与相关氨基酸序列的同一性为70％、优选80％、更优选90％或更高、进一步优选95％或更高、且特别优选98％或更高的氨基酸序列的淀粉酶。
对于这种α-淀粉酶的生产，在本发明的枯草杆菌突变株当中，更优选使用选自下列的枯草杆菌突变株：MGB653株、NED0301株、NED0302株、NED0400株、NED0600株、NED0802株、NED0804株、NED0900株、NED1002株、NED1003株、NED1100株、NED1602株、NED2602株、NED2702株、NED3402株、NED3701株和NED3800株。
导入到本发明的枯草杆菌突变株中的靶蛋白或多肽的基因，合意地包括一个或多个以正确形式结合在基因上游的控制区(参与基因的转录、翻译和分泌)。具体地，这些区域选自含有启动子和转录起始点的转录起始控制区、含有核糖体结合位点和起始密码子的翻译起始区和分泌信号肽区。尤其是，优选结合包括转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号区的三个区域。而且，其中：分泌信号肽区来源于芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因；转录起始区和翻译起始区包括在位于纤维素酶基因上游0.6-kb至1-kb区域中的三个区域合意地以正确形式与靶蛋白或多肽的基因连接。例如，合意地，JP专利公开(Kokai)第2000-210081A号、JP专利公开(Kokai)第4-190793A号(1992)中所述的来源于芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因的转录起始控制区、翻译起始区和分泌信号肽区和类似区；即KSM-S237株(FERMBP-7875)或KSM-64株(FERM BP-2886)适当地与靶蛋白或多肽的结构基因连接。更具体地，合意地，由SEQ ID NO：115所示的核苷酸序列的第1-659号核苷酸范围的核苷酸序列、包括由SEQ ID NO：117所示的核苷酸序列的纤维素酶基因的核苷酸第1-696号范围的核苷酸序列、包括与相关核苷酸序列的同一性为70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、进一步优选95％或更高、且特别优选98％或更高的核苷酸序列的DNA片段、或者包括通过部分缺失而来源于任意一条上述核苷酸序列的核苷酸序列的DNA片段，合适地与靶蛋白或多肽的结构基因连接。此外，在此，这种包括通过部分缺失而来源于任意一条上述核苷酸序列的核苷酸序列的DNA片段是指缺少一部分相关核苷酸序列但保留了涉及基因转录、翻译和分泌功能的DNA片段。
实施例
本发明进一步参照实施例进行具体地描述。但本发明的技术范围并不受下列实施例所限制。
在实施例中，通过在作为野生型菌株的枯草杆菌168株的基因组上使各个区域缺失，产生突变菌株。此外，关于实施例中使用的各条引物，引物名称、核苷酸序列和SEQ ID NO的对应关系列在实施例结尾的表10中。
[实施例1]制备缺少多个区域的突变株
<制备含有cat-upp盒的upp基因缺陷株>
如图2中所示，使用从枯草杆菌168株提取的基因组DNA作为模板，upp-AFW和upp-ARV的引物组以及upp-BFW和upp-BRV的引物组，通过PCR对靠近基因组中upp基因(BG 13408；尿嘧啶磷酸核糖基转移酶)上游的1.0-kb片段(a1)和靠近其下游的1.0-kb片段(b1)进行扩增。而且，使用质粒pMutinT.3(Microbiology、144、3097、1998)作为模板以及Erm-FW和Erm-RV的引物组，通过PCR制备含有红霉素抗性基因的1.2-kb片段(c1)。此外，使用20μL反应系统和LATaq聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)根据所附试验方案进行PCR反应。对于(a1)和(b1)的制备，使用50ng枯草杆菌168株基因组(模板DNA)。对于(c1)的制备，将1ng质粒DNA、200nM每种上述引物、200uM各个dATP、dTTP、dCTP和dGTP、0.2U LATaq和附带的10x缓冲液混合，获得1x溶液。使用PCR系统(由Applied Biosystems、GeneAmp9700制造)用于扩增反应，在95℃下进行5分钟热变性；进行25个反应循环，每个循环由95℃15秒、55℃30秒和72℃60秒组成；然后最后在72℃下进行30秒反应，以完成延伸。如上所述获得的三个PCR扩增片段(a1)、(b1)和(c1)用Centricon(由MilliporeCorporation制造)纯化，然后将它们(每种0.5μL)混合。进一步加入引物upp-AFW和upp-BRV，在上述PCR条件下将72℃下的反应时间改变为3分钟，然后进行SOE-PCR。作为PCR的结果，得到3.2-kbDNA片段(d1)，其中三个片段以(a1)、(c1)和(b1)的顺序连接。使用该DNA片段通过感受态方法(J.Bacterid.、81、741、1960)，转化枯草杆菌168株。具体地，在37℃下将枯草杆菌168株在SPI培养基(0.20％硫酸铵、1.40％磷酸氢二钾、0.60％磷酸二氢钾、0.10％柠檬酸三钠二水合物、0.50％葡萄糖、0.02％酪蛋白氨基酸(Difco)、5mM硫酸镁、0.25μM氯化锰和50μg/ml色氨酸)中震荡培养，直至生长度(OD600)达到大约1。震荡培养后，将一部分培养溶液接种至SPII培养基(0.20％硫酸铵、1.40％磷酸氢二钾、0.60％磷酸二氢钾、0.10％柠檬酸三钠二水合物、0.50％葡萄糖、0.01％酪蛋白氨基酸(Difco)、5mM硫酸镁、0.40μM氯化锰和5μg/ml色氨酸)中，其量比培养溶液高9倍，然后震荡培养，直至生长度(OD600)达到大约0.4。由此，制备枯草杆菌168株的感受态细胞。随后，将含有上述DNA片段(d1)的5μL溶液(上述SOE-PCR的反应溶液)加入至100μL由此制备的感受态细胞悬液(SPII培养基的培养溶液)中。在37℃下震荡培养1小时后，用全部量的溶液涂在含有0.5g/mL红霉素的LB琼脂培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl和1.5％琼脂)上。在37℃下进行静置培养后，分离已经生长的集落作为转化体。从由此获得的转化体提取基因组。使用该基因组作为模板进行PCR，从而确认upp基因从基因组中缺失，并且upp基因用红霉素抗性基因置换。该菌株在本文中命名为168Δupp。此外，以与上述方法相似的方式使用如下所述的感受态法进行转化，不同之处在于所使用的DNA和用于选择转化体的琼脂培养基适当变化。
<cat-upp盒DNA片段的构建>
如图3中所示，upp基因连接在质粒pSM5022(Mol.Microbiol.6、309、1992)的氯霉素抗性基因(cat)的下游，其转录已经在枯草杆菌中确认，从而确保upp基因和cat基因的转录。具体来说，使用cat-Fw和cat-Rv的引物组，以pSM5022作为模板，通过PCR对含有cat的1.3-kb DNA片段进行扩增。而且，使用引物upp-Fw和upp-RV，以168株基因组作为模板，进行PCR，使得可以获得含有upp基因的1.1-kbDNA片段。接下来，纯化这两个片段，然后通过SOE-PCR连接。从而制备2.4-kb ca-upp盒DNA片段(C)，其中upp基因连接在cat基因的下游。而且，该片段插入到质粒pBR322的Cla I切割位点中，从而获得重组质粒pBRcatupp。
<制备含有cat-upp盒片段的Pro1区缺陷株>
如图4所示，使用Pro1-AFW和Pro1-ARV的引物组、Pro1-BFW和Pro1-BRV的引物组和168株的基因组作为模板，通过PCR制备靠近Pro1区上游的0.6-kb片段(A)和靠近相同区下游的0.3-kb片段(B)。此外，在图4中，Pro1区被标为“缺失靶区”。
接下来，使用由此获得的PCR扩增片段(A)和(b)和上述cat-upp盒片段(C)作为模板和引物Pro1-AFW和Pro1-BRV，进行SOE-PCR，使得三个片段以(A)、(C)和(B)的顺序连接。使用由此获得的DNA片段(D)，通过感受态方法对实施例2中所述的168Δupp株进行转化。分离出能够在含有10ppm氯霉素的LB琼脂培养基中生长的转化体。作为PCR的结果，确认在由此获得的转化体中，Pro1区已经从基因组中缺失，并被cat-upp盒DNA片段置换。而且，将该转化体在补充有各种浓度5FU(由Sigma-Aldrich Corporation制造)的Cg+葡萄糖琼脂培养基(7％磷酸氢二钾、3％磷酸二氢钾、0.5％柠檬酸钠、1％硫酸铵、0.1％硫酸镁、0.05％谷氨酸、0.5％葡萄糖、10ng/mL L-色氨酸、0.55μg/mL氯化钙、0.17μg/mL氯化锌、43ng/mL氯化铜二水合物、60ng/mL氯化钴六水合物、60ng/mL钼酸钠(IV)二水合物和1.5％琼脂)中培养。在补充有0.5μg/mL或更高浓度5FU的培养基上没有观察到生长。另一方面，在相同条件下，甚至在补充有5μg/mL 5FU的培养基上观察到转化体亲株168Δupp株的生长。基于上述结果，推断导入到转化体中的upp基因已经通过从cat基因启动子的转录而得到表达，使得转化体变得对5FU敏感。由此获得的菌株被命名为ΔPro1::cat-upp菌株。此外，在图4中，ΔPro1::cat-upp株被标为Δ缺失靶区::cat-upp株。
<从Pro1区缺陷株缺失cat-upp盒片段(C)>
如图5中所示，使用ΔPro1::cat-upp株基因组作为模板、Pro1-AFW和Pro1-ERV的引物组和Pro1-FFW和Pro1-BRV的引物组，扩增靠近cat-upp盒片段(C)上游的0.6-kb片段(E)和靠近相同片段下游的0.3-kb片段(F)。而且，使用由此获得的两个DNA片段作为模板以及Pro1-AFW和Pro1-BRV的引物组进行SOE-PCR，从而制备其中两个片段相互连接的0.9-kb片段(G)。上述ΔPro1::cat-upp株通过感受态方法使用片段(G)进行转化。因此，获得能够在补充有1μg/mL 5FU的Cg+葡萄糖琼脂培养基中生长的菌株。确认由此获得的菌株对氯霉素易感，以及在基因组上缺少Pro1区和cat-upp盒DNA片段。该菌株命名为ΔPro1株。此外，在图5中，ΔPro1::cat-upp株和ΔPro1株被分别标为“Δ缺失靶区::cat-upp株”和“Δ缺失靶区株”。
<单区缺陷株的制备1>
根据上述制备ΔPro1株的方法，通过图4中所解释的方法，制备ΔPro2::cat-upp株、ΔPro3::cat-upp株、ΔPro4::cat-upp株、ΔPro5::cat-upp株、ΔPro6::cat-upp株、ΔPro7::cat-upp株、ΔPBSX::cat-upp株、ΔSPβ::cat-upp株、ΔSKIN::cat-upp株、Δpks::cat-upp株和Δpps::cat-upp株。而且，通过图5中所解释的方法，制备ΔPro2株、ΔPro3株、ΔPro4株、ΔPro 5株、ΔPro6株、ΔPro7株、ΔPBSX株、ΔSPβ株、ΔSKIN株、Δpks株和Δpps株。制备这些各个菌株的步骤中用于扩增片段(A)至(G)的引物组列在下面的表3中。
<多缺陷株(MGB01株至MGB07株)的构建>
接下来，使用ΔPro7株(也称为MGB01株)，构建了缺少多个区的菌株(多缺陷株)。首先，如下构建缺少Pro6和Pro7区域的双缺陷株。具体地，使用ΔPro6::cat-upp株的基因组DNA通过感受态法转化ΔPro7株，在上述ΔPro6::cat-upp株中Pro6区已经被cat-upp盒片段置换。将已经在含有10ppm氯霉素的LB琼脂培养基上生长的集落分离作为转化体。接下来，将由此得到的氯霉素抗性转化体使用ΔPro6株的基因组DNA通过感受态法进行转化。由此，获得能够在补充有1μg/mL 5FU的Cg+葡萄糖琼脂培养基中生长的菌株。确认由此获得的菌株对氯霉素易感，并缺少Pro6和Pro7区。而且，分离出缺少cat-upp盒片段的双缺陷株。该菌株命名为MGB02株。
重复类似过程，从而构建MGB03株，在该菌株中Pro7区、Pro6区和Pro1区已经以该顺序被缺失。重复类似过程，从而构建MGB04株，在该菌株中Pro7区、Pro6区、Pro1区和Pro4区已经以该顺序被缺失。重复类似过程，从而构建MGB05株，在该菌株中Pro7区、Pro6区、Pro1区、Pro4区和PBSX区已经以该顺序被缺失。重复类似过程，从而构建MGB06株，在该菌株中Pro7区、Pro6区、Pro1区、Pro4区、PBSX区和ProS区已经以该顺序被缺失。重复类似过程，从而构建MGB07株，在该菌株中Pro7区、Pro6区、Pro1区、Pro4区、PBSX区、Pro5区和Pro3区已经以该顺序被缺失。
<各种单区缺陷株的制备例2>
使用与上述<单区缺陷株的制备1>所用方法不同的方法，构建SPβ区缺陷株、pks区缺陷株、SKIN区缺陷株、pps区缺陷株、Pro2区缺陷株、Pro5区缺陷株、NED0302区缺陷(ydcL-ydhU区缺陷)株、NED0803区缺陷(yisB-yitD区缺陷)株、NED3200区缺陷(yunA-yurt区缺陷)株、NED1902区缺陷(cgeE-ypmQ区缺陷)株、NED0501区缺陷(yeeK-yesX区缺陷)株、NED0400区缺陷(ydiM-yebA区缺陷)株、NED1100区(ykuS-ykqB区)缺陷株、NED4002区缺陷(pdp-rocR区缺陷)株、NED02021区缺陷(ycxB-sipU区缺陷)株、SKIN-Pro7区缺陷(spoIVCB-yraK区缺陷)株、NED3701区缺陷(sbo-ywhH区缺陷)株、NED0600区缺陷(cspB-yhcT区缺陷)株、NED4100区缺陷(yybP-yyaJ区缺陷)株、NED2702区缺陷(ytxK-braB区缺陷)株和NED1602区缺陷(yncM-fosB区缺陷)株。
构建单独缺少SPβ区的菌株的实例描述如下。如图6中所示，使用spB-AFW和spB-ARV2的引物组、spB-BFW2和spB-BRV的引物组，以及168株基因组作为模板，通过PCR制备靠近SPβ区上游的0.6-kb片段(H)和靠近该区下游的0.3-kb片段(I)。另外，在图6中，SPβ被标为“缺失靶区”。
使用tet-FW和tet-RV的引物组对四环素抗性基因区片段(J)进行扩增。随后，使用由此获得的PCR扩增片段(H)、(I)和(J)作为模板，使用引物spB-AFW和spB-BRV进行SOE-PCR，使得这三个片段以(H)、(J)和(I)的顺序连接。使用由此获得的DNA片段(K)通过感受态法转化上述的168Δupp株。由此，分离出能够在含有15ppm四环素的LB琼脂培养基中生长的转化体。根据PCR的结果，确认在由此获得的转化体中，SPβ区已经从基因组中被缺失，并被四环素抗性基因片段置换。该菌株被称为ΔSPβ::tet株。另外，在图6中，ΔSPβ::tet株被标为“Δ缺失靶区::tet株”。
类似地，制备各个缺少上述区域的菌株。每种由此制备的菌株都以与ΔSPβ::tet株相同的方式被称为“Δ缺失靶区::tet株”。
<从MGB07株缺失SPβ区>
使用上面制备的ΔSPβ::tet株的基因组DNA转化ΔPro7株，获得四环素抗性的MGB07ΔSPβ::tet株。同时，如下所述从基因组中去除四环素抗性基因片段。
如图7中所示，使用spB-AFW和spB-ERV的引物组以及spB-FFW和spB-BRV的引物组，以168株基因组作为模板，通过PCR制备靠近SPβ区上游的0.6-kb片段(L)和靠近该区下游的0.3-kb片段(M)。另外，在图7中，SPβ被标为“缺失靶区”。
随后，使用由此获得的PCR扩增片段(L)和(M)作为模板以及引物spB-AFW和spB-BRV进行SOE-PCR，使两个片段以(L)和(M)的顺序连接。将由此获得的DNA片段(N)插入至上述pBRcatupp的sac I-Kpn I限制性内切酶位点(切割后平端(blunt-ended aftercleavage))，从而构建用于去除四环素抗性基因片段的质粒pBRcatuppΔSPβ。另外，在图7中，pBRcatuppΔSPβ被标为“pBRcatuppΔ缺失靶区”。
用构建的pBRcatuppΔSPβ转化MGB07ΔSPβ::tet株。质粒上SPβ的上游或下游区和基因组上SPβ的上游或下游区之间发生单交换重组，使得该质粒被导入至基因组上，并获得表现出氯霉素抗性的MGB07ΔSPβ(pBR)株。
将由此获得的转化体MGB07ΔSPβ(pBR)株接种在50mL含有1.5μg/mL四环素的LB培养基(500-mL Sakaguchi瓶)中，至达到OD600＝0.3，然后在37℃下震荡培养。震荡培养1小时后，加入15mg氨苄青霉素(300μg/mL)，然后继续培养，同时在加入后每2小时添加15mg氨苄青霉素。培养8.5小时后，将培养溶液用2％氯化钠水溶液洗涤，然后将无药物的LB琼脂培养基涂以该溶液。在已生长的集落当中，选择对氯霉素易感并缺失了质粒区的集落。
使用所选择的细菌菌株的基因组DNA作为模板进行PCR，从而确认了SPβ区和四环素抗性基因片段的缺失。由此，获得MGB08株。
<从MGB08株缺失pks区和Pro5区的回复(reversion)>
根据上述方法(图7)，使用Δpks::tet株从上面制备的MGB08株中缺失pks区。通过从MGB08株中缺失pks区制备的菌株被命名为MGB09株。通过PCR确认由此获得的MGB09株的基因组DNA。pks区已经被缺失，但证实在基因组上存在有位置靠近pks区的Pro5区内的序列，表明有Pro5区的回复。这可能由下列原因造成：当使用Δpks::tet株的基因组DNA转化MGB08株时，在Δpks::tet株基因组上pks区的上游区和该基因组上Pro5区的下游区；以及MGB08株基因组上的相应区域之间发生了同源重组，同时导入有四环素抗性基因并且缺失了pks区。
<从MGB09株缺失SKIN区和Pro7区的回复>
根据上述方法(图7)，使用ΔSKIN::tet株从上面制备的MGB09株中缺失SKIN区。通过从MGB09株中缺失SKIN区制备的菌株被命名为MGB10株。通过PCR确认由此获得的MGB10株的基因组DNA。SKIN区已经被缺失，但证实在基因组上存在有位置靠近SKIN区的Pro7区内的序列，表明有Pro7区的回复。这可能由下列原因造成：当使用ΔSKIN::tet株的基因组DNA转化MGB09株时，在ΔSKIN::tet株基因组上SKIN区的上游区和该基因组上Pro7区的下游区；以及MGB09株基因组上的相应区域之间发生了同源重组，同时导入有四环素抗性基因并且缺失了SKIN区。
<从MGB10株缺失pps区>
根据上述方法(图7)使用Δpps::tet株从上面制备的MGB10株中缺失pps区。通过从MGB10株中缺失pps区制备的菌株被命名为MGB11株。通过PCR确认由此获得的MGB11株的基因组DNA，pps区已经被缺失，没有其它区的回复。
<从MGB11株缺失Pro2区>
根据上述方法(图7)使用ΔPro2::tet株从上面制备的MGB11株中缺失Pro2区。通过从MGB11株中缺失Pro2区制备的菌株被命名为MGB12株。通过PCR确认由此获得的MGB12株的基因组DNA，Pro2区已经被缺失，没有其它区的回复。
<从MGB12株缺失Pro5区>
为了再次缺失在制备MGB09株时经历回复的Pro5区，根据上述方法(图7)使用ΔPro5::tet株从上面制备的MGB12株中缺失Pro5区。通过从MGB12株中缺失Pro5区制备的菌株被命名为MGB11d株。通过PCR确认由此获得的MGB11d株的基因组DNA，Pro5区已经被缺失，没有其它区的回复。
如上所述制备的MGB11d株具有的基因组结构中已经缺失了枯草杆菌168株的Pro6(yoaV-yobO)区、Pro1(ybbU-ybdE)区、Pro4(yjcM-yjdJ)区、PBSX(ykdA-xlyA)区、Pro5(ynxB-dut)区、Pro3(ydiM-ydjC)区、SPβ(yodU-ypqP)区、pks(pksA-ymaC)区、SKIN(spoIVCB-spoIIIC)区、pps(ppsE-ppsA)区和Pro2(ydcL-ydeJ)区。
<构建根据本发明的枯草杆菌突变株>
从如上所述制备的MGB11d株制备根据本发明的枯草杆菌突变株(见图8)。具体地，根据上述方法(图7)使用ΔNED0302::tet株从MGB11d株缺失NED0302区。通过从MGB 11d株缺失NED0302区制备的菌株被命名为MGB533株。由此获得的MGB533株具有的基因组结构中，除MGB11d株中的缺失区以外，还已经缺失了NED0302区。
随后，以下列的顺序缺失NED0803区、NED3200区、NED1902区、NED0501区、NED0400区、NED1100区和NED4002区，从而构建突变株。由此构建的突变株分别命名为MGB559株、MGB592株、MGB604株、MGB625株、MGB653株、MGB683株和MGB781株。
此外，NED3200区含有Pro2区。在构建MGB592株时ydeK-ydhU区实际上已经从MGB559株中被缺失。而且，NED1902区含有SPβ区。在构建MGB604株时实际上已经从MGB592株中缺失的区域是cgeE-phy和yppQ-ypmQ区。类似地，NED0400区含有Pro3区。在构建MGB653株时gutR-yebA区实际上已经从MGB625株中被缺失。
接下来，根据上述方法(图7)使用ΔNED40002::tet株从构建的MGB625株中缺失NED40002区。通过从MGB625株中缺失NED40002区制备的菌株被命名为MGB723株。
随后，以下列顺序缺失NED02021区、SKIN-Pro7区、NED3701区、NED0600区、NED4100区、NED2702区、NED0400区和NED1100区，从而构建突变株。由此构建的突变株分别命名为MGB773株、MGB822株、MGB834株、MGB846株、MGB872株、MGB885株、MGB913株和MGB943株。
另外，SKIN-Pro7区含有SKIN区。在构建MGB822株时yrkS-yraK区实际上已经从MGB773株中被缺失。类似地，在构建MGB913株时gutR-yebA区实际上已经从MGB885株中被缺失。
接下来，根据上述方法(图7)使用ΔNED4100::tet株从构建的MGB834株中缺失NED4100区。通过从MGB834株中缺失NED4100区制备的菌株被命名为MGB860株。
随后，通过以下列顺序缺失NED1602区和NED2702区构建突变株。由此构建的突变株分别命名为MGB874株和MGB887株。
在制备这些菌株中每一个的步骤中用于扩增片段(H)至(N)的引物组列在下表4中。
Figure S200680045245XD00291
[实施例2]各自缺少单个区域的突变株
在该实施例中，枯草杆菌168株的各个特定区域用cat-upp盒或氯霉素抗性基因置换，从而制备各个缺少特定区域的突变株。
<通过用cat-upp盒置换构建单区域缺陷株>
用cat-upp盒进行置换的区域列在下表5中。
表5
  名称   缺失靶区
  NED0100   ybbU-yceK
  NED0202   ycxB-ydbP
  NED0302   ydcL-ydhU
  NED0802   yhxD-yhjP
  NED0803   yisB-yitD
  NED0804   yitH-yitZ
  NED0900   oppA-yjbK
  NED1400   gid-ylxL
  NED1500   spoVS-ymzA
  NED1802   yoxC-yocS
  NED2500   yqeD-yrzL
  NED3402   yvdM-yvcP
  NED4000   dltA-rocR
另外，NED0100区含有Pro1区。MED0302区含有Pro2区，NED1500区含有pks区，NED1802区含有Pro6区，NED2500区含有SKIN-Pro7区。
在该实施例中，根据图4中所述的方法，通过用实施例1中制备的cat-upp盒片段置换特定区域而构建突变株。而且，在该实施例中，图4中的片段(A)、片段(B)、片段(C)和(D)分别称为片段(O)、片段(P)、片段(Q)和片段(R)。在制备这些菌株的每一个的步骤中用于扩增片段(P)至(R)的引物组列在下表6中。
Figure S200680045245XD00311
<通过用氯霉素抗性基因置换构建单区域缺陷株>
通过用四环素抗性基因置换靶区，然后用氯霉素抗性基因置换四环素抗性基因的中央部分，从而进行用氯霉素抗性基因对区域的置换。用氯霉素抗性基因进行置换的区域列在下表7中。
表7
Figure S200680045245XD00321
另外，NED0400区含有Pro3区，NED1002区含有Pro4区，NED1003区含有PBSX区，NED1902区含有SPβ区。
首先，缺失NED0301区的方法解释如下。使用NED0301-AFW和NED0301-ARV的引物组、NED0301-BFW和NED0301-BRV的引物组，以168株基因组作为模板，通过PCR扩增靠近NED0301区上游的0.6-kb片段(S)和靠近该区下游的0.3-kb片段(T)。而且，使用tet-FW和tet-RV的引物组扩增四环素抗性基因区片段(U)。随后，使用由此获得的PCR扩增片段(S)、(T)和(U)作为模板，使用引物NED0301-AFW和NED0301-BRV进行SOE-PCR。由此，获得的片段(V)中，三个片段以(S)、(U)和(T)的顺序连接。使用由此获得的片段(V)通过感受态法转化实施例1中制备的168Δupp株。分离出能够在含有15ppm四环素的LB琼脂培养基中生长的转化体。根据PCR的结果，确认在由此获得的转化体中，NED0301区已经从基因组中被缺失，并被四环素抗性基因片段置换。接下来，使用tet-FW和tet-ARV的引物组和tet-BFW和tet-RV的引物组扩增四环素抗性基因上游侧上的0.5-kb片段(W)和该基因下游侧上的0.5-kb片段(X)。而且，使用质粒pSM5022(在实施例1中使用)作为模板，使用cat-FW和cat-RV扩增含有氯霉素抗性基因的1.3-kb片段(Y)。随后，使用由此获得的PCR扩增片段(W)、(X)和(Y)作为模板，使用引物tet-FW和tet-RV进行SOE-PCR。由此，获得片段(Z)，其中三个片段以(W)、(Y)和(X)的顺序连接。使用由此获得的片段(Z)通过感受态法转化上述四环素抗性株。因此，分离出能够在含有10ppm氯霉素的LB琼脂培养基上生长的转化体。根据PCR的结果，确认在由此获得的转化体中，一部分四环素抗性基因已经被缺失，并被氯霉素抗性基因置换。缺少NED0301区的菌株被命名为NED0301株。
类似地，制备缺少表7所列区域的各个突变株。每个由此制备的菌株以与NED0301株相同的方式命名。在制备每个这些菌株的步骤中用于扩增片段(S)至(V)的引物组列在下表8中。
Figure S200680045245XD00341
[实施例3]突变株的评价
在实施例3中，评价在实施例1和2中制备的根据本发明的枯草杆菌突变株的分泌生产率。在该实施例中，使用碱性纤维素酶、碱性蛋白酶和碱性淀粉酶作为要导入进枯草杆菌突变株中的靶蛋白。
<分泌和产生碱性纤维素酶的评价>
如下所述进行碱性纤维素酶的分泌生产率的评价。具体地，将重组质粒pHY-S237通过原生质体转化法导入每个细菌菌株，在上述重组质粒中来源于芽孢杆菌属KSM-S237株(FERM BP-7875)的碱性纤维素酶基因(JP专利公开(Kokai)第2000-210081 A号)片段(3.1kb)已经插入到穿梭载体pHY300PLK的BamH I限制性内切酶切割位点中。将每种由此获得的重组细菌菌株在37℃下在10mL LB培养基中震荡培养过夜。而且，将0.05mL培养溶液接种在50mL 2×L-麦芽糖培养基(2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰4-5水合物和15ppm四环素)中，然后在30℃下震荡培养3天。通过离心从培养溶液的上清液中去除菌体。测定每种此上清液中的碱性纤维素酶活性，从而获得已经通过培养而分泌并在菌体外产生的碱性纤维素酶的量。
纤维素酶活性测定如下。加入50μL0.4mM对硝基苯基-β-D-纤维三糖苷(Seikagaku Corporation)，然后与50μL已用1/7.5M磷酸盐缓冲溶液(pH7.4 Wako Pure Chemical Industries、Ltd.)适当稀释的样品溶液混合，在30℃下反应。基于420nm处测量的吸光度(OD420nm)变化对反应释放的对硝基苯酚的量进行定量。使得每分钟释放1μmol对硝基苯酚的酶量确定为1U。
<分泌和产生碱性蛋白酶的评价>
如下所述进行碱性蛋白酶的分泌生产率的评价。具体地，使用从克劳氏芽孢杆菌KSM-K16株(FERM BP-3376)提取的基因组DNA作为模板，使用S237pKAPpp-F和KAPter-R(BglII)的引物组进行PCR。由此，扩增编码具有氨基酸序列的碱性蛋白酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.、43、473，(1995))的1.3-kb DNA片段。而且，使用从(芽孢杆菌属)KSM-S237株(FERM BP-7875)提取的基因组DNA作为模板，使用S237ppp-F2(BamH I)和S237pKAPpp-R的引物组进行PCR。扩增含有碱性纤维素酶基因启动子区的0.6-kb DNA片段(JP专利公开(Kokai)第2000-210081A号)。随后，使用两种由此获得的片段的混合物作为模板，使用S237ppp-F2(BamH I)和KAPter-R(Bgl II)的引物组进行SOE-PCR。由此，获得1.8-kb DNA片段，其中碱性蛋白酶基因连接在碱性纤维素酶基因启动子区的下游。将由此获得的1.8-kbDNA片段插入到穿梭载体pHY300PLK(Yakult Honsha Co.、Ltd.)的BamH I-Bgl II限制性内切酶切割位点，从而构建用于评价碱性蛋白酶生产率的质粒pHYKAP(S237p)。
将由此构建的质粒pHYKAP(S237p)通过原生质体转化法导入各个细菌菌株。将由此获得的重组细菌菌株在与上文<分泌和产生碱性纤维素酶的评价>中所用条件相同的条件下震荡培养3天。培养后，通过离心从培养溶液的上清液中去除菌体。测定上清液中的碱性蛋白酶活性。获得通过培养已经分泌并在菌体外产生的碱性蛋白酶的量。培养上清液中的蛋白酶活性测定如下。具体地，将100μL含有7.5mM琥珀酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酸对硝基苯胺(STANA PEPTIDEINSTITUTE、INC.)作为底物的75mM硼酸-KCl缓冲溶液(pH 10.5)加入到50μl已经用2mM CaCl2溶液适当稀释的培养上清液中并与其混合，然后在30℃下反应。基于420nm处测量的吸光度(OD420nm)的变化，对由反应所释放的对硝基苯胺的量进行定量。使得每分钟释放1μmol对硝基苯胺的酶量确定为1U。
<分泌和产生碱性淀粉酶的评价>
如下评价碱性淀粉酶的分泌生产率。具体地，使用从芽孢杆菌属KSM-K38株(FERM BP-6946)提取的基因组DNA作为模板，使用K38matu-F2(ALAA)和SP64K38-R(Xba I)的引物组进行PCR，从而扩增编码碱性淀粉酶(Appl.Environ.Microbiol..67、1744，(2001))的1.5-kb DNA片段。而且，使用从芽孢杆菌属KSM-S237株(FERMBP-7875)提取的基因组DNA作为模板，以及S237ppp-F2(BamH I)和S237ppp-R2(ALAA)的引物组进行PCR，从而扩增含有启动子区和编码碱性纤维素酶基因分泌信号序列的区域的0.6-kb DNA片段(JP专利公开(Kokai)第2000-210081A号)。随后，使用将由此获得的两种片段混合而获得的混合物作为模板，以及S237ppp-F2(BamH I)和SP64K38-R(Xba I)的引物组进行SOE-PCR。由此，获得2.1-kb DNA片段，其中碱性淀粉酶基因连接在启动子和编码碱性纤维素酶基因分泌信号序列的区域的下游。将由此获得的2.1-kb DNA片段插入至穿梭载体pHY300PLK(Yakult Honsha Co.、Ltd.)的BamH I-Xba I限制性内切酶切割位点，从而构建用于评价碱性淀粉酶生产率的质粒pHYK38(S237ps)。
将由此构建的质粒pHYK38(S237ps)通过原生质体转化法导入各个细菌菌株。将由此获得的重组细菌菌株在与上文<分泌和产生碱性纤维素酶的评价>中所用条件相同的条件下震荡培养5天。培养后，通过离心从培养溶液的上清液中去除菌体。测定上清液中的碱性淀粉酶活性，从而得到通过培养已经分泌并在菌体外产生的碱性淀粉酶的量。使用Liquitech Amy EPS(Roche Diagnostics)测定培养上清液中的淀粉酶活性。具体地，将100μL R1·R2混合物(R1(连接酶)∶R2(淀粉酶底物)＝5∶1(Vol.))加入到50μl已经用1％NaCl-1/7.5M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4；Wako Pure Chemical Industries、Ltd.)适当稀释的样品溶液中并与其混合，然后在30℃下反应。基于405nm处测量的吸光度(OD405nm)的变化，对由反应所释放的对硝基苯酚的量进行定量。使得每分钟释放1μmol对硝基苯酚的酶量确定为1U。
<结果>
分泌和产生碱性纤维素酶、碱性蛋白酶和碱性淀粉酶的能力总结在表9中。另外，在表9中，分泌和产生每种酶的能力表示成相对于标有数值100的相关酶的量(由其中类似地导入有各个基因的枯草杆菌168株所产生)的相对值。
表9
枯草杆菌突变株  生产率纤维素酶野生株100  生产率蛋白酶野生株100  生产率淀粉酶野生株100
  MGB533株  87  101  86
  MGB559株  95  96  58
  MGB592株  90  102  69
  MGB604株  89  109  78
  MGB625株  91  111  52
  MGB653株  134  200  104
Figure S200680045245XD00381
Figure S200680045245XD00391
Figure S200680045245XD00401
Figure S200680045245XD00411
序列表
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均全文并入作为参考。
序列表
<110>花王株式会社
     国立大学法人奈良先端科学技术大学院大学
<120>新型枯草杆菌突变株
<130>PH-2844-PCT
<150>JP 2005-298406
<151>2005-10-13
<160>463
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义prophagel(ybbU-ybdE)区一个末端的寡核苷酸
<400>1
taagattatc taaaggggtg                                                            20
<210>2
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义prophagel(ybbU-ybdE)区另一末端的寡核苷酸
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catacaagac ggaaattt                                                              18
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义ybbU-ybdG-yceK区一个末端的寡核苷酸
<400>3
taagattatc taaaggggtg                                                            20
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<223>人工序列的说明：定义ybbU-ybdG-yceK区另一末端的寡核苷酸
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<223>人工序列的说明：定义ycxB-ydbP区一个末端的寡核苷酸
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<223>人工序列的说明：定义ycxB-ydbP区另一末端的寡核苷酸
<400>6
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义ycxB-sipU区一个末端的寡核苷酸
<400>7
atataaaagg atcagcactg                                                            20
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<223>人工序列的说明：定义ydcD-ydcK区另一末端的寡核苷酸
<400>10
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<223>人工序列的说明：定义prophage2(ydcL-ydeJ)区一个末端的寡核苷酸
<400>11
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义prophage2(ydcL-ydeJ)区另一末端的寡核苷酸
<400>12
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ydcL-ydeK-ydhU区一个末端的寡核苷酸
<400>13
gcccacaaac tgcccactta                                                            20
<210>14
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义ydcL-ydeK-ydhU区另一末端的寡核苷酸
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gggcaatccg tggaacgggt                                                            20
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<223>人工序列的说明：定义prophage3(ydiM-ydjC)区一个末端的寡核苷酸
<400>15
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<223>人工序列的说明：定义prophage3(ydiM-ydjC)区另一末端的寡核苷酸
<400>16
ttattaaagt ctacaaat                                                              18
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义ydiM-gutR-yebA区一个末端的寡核苷酸
<400>17
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义ydiM-gutR-yebA区另一末端的寡核苷酸
<400>18
tccatagcgc cgaagaatct                                                            20
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<223>人工序列的说明：定义yeeK-yesX区一个末端的寡核苷酸
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atgtgaagga gagagtaaat                                                            20
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<223>人工序列的说明：定义yeeK-yesX区另一末端的寡核苷酸
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cgtcttatcc cttagtcctc                                                            20
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义cspB-yhcT区一个末端的寡核苷酸
<400>21
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<223>人工序列的说明：定义cspB-yhcT区另一末端的寡核苷酸
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<223>人工序列的说明：定义yhdP-yhaL区一个末端的寡核苷酸
<400>23
tatacaaggt gcttttctta                                                            20
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义yhdP-yhaL区另一末端的寡核苷酸
<400>24
cattgagccg cacagctttt                                                            20
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义yhxD-yhjP区一个末端的寡核苷酸
<400>25
cagctccttt cataaagcta                                                            20
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<223>人工序列的说明：定义yhxD-yhjP区另一末端的寡核苷酸
<400>26
caaaaaagaa ccctcttttt                                                            20
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义yisB-yitD区一个末端的寡核苷酸
<400>27
gatgtaaggg aggagcggat                                                            20
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<223>人工序列的说明：定义yisB-yitD区另一末端的寡核苷酸
<400>28
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<213>人工序列
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<223>人工序列的说明：定义yitH-yitZ区一个末端的寡核苷酸
<400>29
ctgttcggga aaaaagaggg                                                            20
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<223>人工序列的说明：定义yitH-yitZ区另一末端的寡核苷酸
<400>30
gcggtgccgc atttcagccg                                                            20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义oppA-yjbK区一个末端的寡核苷酸
<400>31
tgaaaattat tattaggggg                                                            20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义oppA-yjbK区另一末端的寡核苷酸
<400>32
gggcggaaag gaagagcatc                                                            20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义prophage4(yjcM-yjdJ)区一个末端的寡核苷酸
<400>33
ttattaagta gcggaaggca                                                            20
<210>34
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义prophage4(yjcM-yjdJ)区另一末端的寡核苷酸
<400>34
tgcaaaaaga gccacaca                                                              18
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yjcM-ctaO-yjgB区一个末端的寡核苷酸
<400>35
aacgatttag tatcaattta                                                            20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yjcM-ctaO-yjgB区另一末端的寡核苷酸
<400>36
ggtagatcaa ttaggaggga                                                            20
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义PBSX(ykdA-xlyA)区一个末端的寡核苷酸
<400>37
gacctgcaag tgctgctgat                                                            20
<210>38
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义PBSX(ykdA-xlyA)区另一末端的寡核苷酸
<400>38
gatcttctct ttcgtcgc                                                              18
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yjqB-htrA区一个末端的寡核苷酸
<400>39
ggtaaagggg ggcgttcaag                                                            20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yjqB-htrA区另一末端的寡核苷酸
<400>40
agagaaacgg agtgaacatg                                                            20
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ykuS-ykqB区一个末端的寡核苷酸
<400>41
gcactctagt aaacggaggt                                                            20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ykuS-ykqB区另一末端的寡核苷酸
<400>42
gacggcttat ttggctgcta                                                            20
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义slp-ylaM区一个末端的寡核苷酸
<400>43
cccgctttga gcgagggct                                                             19
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义slp-ylaM区另一末端的寡核苷酸
<400>44
taagcatatg acataaatta                                                            20
<210>45
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ctaA-ylbE区一个末端的寡核苷酸
<400>45
cgcctaaggc tttggtctt                                                             19
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ctaA-ylbE区另一末端的寡核苷酸
<400>46
cccttcttcg gggcctttta                                                            20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义gid-ylxL区一个末端的寡核苷酸
<400>47
taaactagga gatgtgaaag                                                            20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义gid-ylxL区另一末端的寡核苷酸
<400>48
cacagcttta tccgacaatc                                                            20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义pks(pksA-ymaC)区一个末端的寡核苷酸
<400>49
atcagaggaa ggtaataatg                                                            20
<210>50
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义pks(pksA-ymaC)区另一末端的寡核苷酸
<400>50
cattctgttt ccaattgt                                                              18
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义spoVS-ymzA区一个末端的寡核苷酸
<400>51
aaaactaagg gggagcagaa                                                            20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义spoVS-ymzA区另一末端的寡核苷酸
<400>52
cataacatga aaaaaaactg                                                            20
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义prophage5(ynxB-dut)区一个末端的寡核苷酸
<400>53
ccataattac gttgaaatct                                                            20
<210>54
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义prophage5(ynxB-dut)区另一末端的寡核苷酸
<400>54
aatcacacag catggaga                                                              18
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yncM-fosB区一个末端的寡核苷酸
<400>55
gcggcttttt gctgcttcgt                                                            20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yncM-fosB区另一末端的寡核苷酸
<400>56
ccttatatga aatatggttg                                                            20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义pps(ppsE-ppsA)区一个末端的寡核苷酸
<400>57
cctcttatta tgagaactgg                                                            20
<210>58
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义pps(ppsE-ppsA)区另一末端的寡核苷酸
<400>58
ctctgtccgc taatccgc                                                              18
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义prophage6(yoaV-yobO)区一个末端的寡核苷酸
<400>59
tgctgatatg ctgcgggatt                                                            20
<210>60
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义prophage6(yoaV-yobO)区另一末端的寡核苷酸
<400>60
acgccacatt cgtgtgtg                                                              18
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yoxC-yocS区一个末端的寡核苷酸
<400>61
ataagaaaag gagtgaacat                                                            20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yoxC-yocS区另一末端的寡核苷酸
<400>62
gtaccctttt tgatgcatat                                                            20
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yojO-yozE区一个末端的寡核苷酸
<400>63
cgccaaaaag cataggatta                                                            20
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yojO-yozE区另一末端的寡核苷酸
<400>64
gacatcagga ggggaaaccc                                                            20
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义spb(yodU-ypqP)区一个末端的寡核苷酸
<400>65
atgtcattaa tatcagtaca                                                            20
<210>66
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义spb(yodU-ypqP)区另一末端的寡核苷酸
<400>66
gttcacagga gatacagc                                                              18
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义cgeE-ypmQ区一个末端的寡核苷酸
<400>67
ggtttgtgca aacgcctatt                                                            20
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义cgeE-ypmQ区另一末端的寡核苷酸
<400>68
ggctggaaag gatggatgtc                                                            20
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ypzC-drm区一个末端的寡核苷酸
<400>69
agcatgaggt tacgggcagt                                                            20
<210>70
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ypzC-drm区另一末端的寡核苷酸
<400>70
ggaggctttc aagatgcctg                                                            20
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yqxK-yqjP区一个末端的寡核苷酸
<400>71
gaactgagtt aatctttagc                                                            20
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yqxK-yqjP区另一末端的寡核苷酸
<400>72
tgaagacaag gagcgaaagg                                                            20
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义zwf-yqzF区一个末端的寡核苷酸
<400>73
cgaataaagt gaggtacttt                                                            20
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义zwf-yqzF区另一末端的寡核苷酸
<400>74
cgcgggctga cttgattgcg                                                            20
<210>75
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yqgZ-yqgN区一个末端的寡核苷酸
<400>75
agcggatctt cggtttttca                                                            20
<210>76
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yqgZ-yqgN区另一末端的寡核苷酸
<400>76
ctattccgag ggggatgaga                                                            20
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义skin(spoIVCB-spoIIIC)区一个末端的寡核苷酸
<400>77
catacttttg tggaggtgac                                                            20
<210>78
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义skin(spoIVCB-spoIIIC)区另一末端的寡核苷酸
<400>78
gagatccggc ttcttctg                                                              18
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义prophage7(yrkM-yraK)区一个末端的寡核苷酸
<400>79
atcagaggaa ggtaataatg                                                            20
<210>80
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义prophage7(yrkM-yraK)区另一末端的寡核苷酸
<400>80
cattctgttt ccaattgt                                                              18
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义SKIN-Pro7(spoIVCB-yraK)区一个末端的寡核苷酸
<400>81
catacttttg tggaggtgac                                                            20
<210>82
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义SKIN-Pro7(spoIVCB-yraK)区另一末端的寡核苷酸
<400>82
cattctgttt ccaattgt                                                              18
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yqeD-yrzL区一个末端的寡核苷酸
<400>83
gagtgaccat agacatgtta                                                            20
<210>84
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yqeD-yrzL区另一末端的寡核苷酸
<400>84
gcgaatttgg gaaagagg                                                              18
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yrzF-yrxA区一个末端的寡核苷酸
<400>85
gagcaaagaa ggtgaatgaa                                                            20
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yrzF-yrxA区另一末端的寡核苷酸
<400>86
gccggcttct tcgagggctt                                                            20
<210>87
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ytxK-braB区一个末端的寡核苷酸
<400>87
ctaagctgct tttaaaacac                                                            20
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ytxK-braB区另一末端的寡核苷酸
<400>88
aacgcaggcg ttctgtgaca                                                            20
<210>89
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ytzH-ytbQ区一个末端的寡核苷酸
<400>89
ctgaagggat gtgtaccgtt                                                            20
<210>90
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ytzH-ytbQ区另一末端的寡核苷酸
<400>90
cggcaaatta tgaggagctg                                                            20
<210>91
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ytvB-ytoA区一个末端的寡核苷酸
<400>91
cgggcggaga ttgaggacaa                                                            20
<210>92
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ytvB-ytoA区另一末端的寡核苷酸
<400>92
ggtaaagtaa gacgaagcag                                                            20
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义pckA-mntA区一个末端的寡核苷酸
<400>93
acgataaagg aaggtttcat                                                            20
<210>94
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义pckA-mntA区另一末端的寡核苷酸
<400>94
tggcaaagag gaggagaaat                                                            20
<210>95
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yunA-yurT区一个末端的寡核苷酸
<400>95
aaatttctcg acaagggaa                                                             19
<210>96
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yunA-yurT区另一末端的寡核苷酸
<400>96
tcgaaggagg gaaaaacagt                                                            20
<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yurZ-yuxN区一个末端的寡核苷酸
<400>97
ttttcggaat attccttctc                                                            20
<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yurZ-yuxN区另一末端的寡核苷酸
<400>98
gctgttccgc atctttggcg                                                            20
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义smpB-yvbK区一个末端的寡核苷酸
<400>99
cgaatcaagc actatgcctt                                                            20
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义smpB-yvbK区另一末端的寡核苷酸
<400>100
cggcggcttt tttatgcttt                                                            20
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yvdM-yvcP区一个末端的寡核苷酸
<400>101
aggaattgac tcccttattc                                                            20
<210>102
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yvdM-yvcP区另一末端的寡核苷酸
<400>102
gtacatataa gggggatcaa                                                            20
<210>103
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义sbo-ywhH区一个末端的寡核苷酸
<400>103
gggaggattc aattatgaaa                                                            20
<210>104
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义sbo-ywhH区另一末端的寡核苷酸
<400>104
gacgatgtct ggatgttttt                                                            20
<210>105
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ywcB-ywaE区一个末端的寡核苷酸
<400>105
cgaataaaag gaggaaagcc                                                            20
<210>106
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义ywcB-ywaE区另一末端的寡核苷酸
<400>106
tactggattc ccgtcaaagc                                                            20
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义dltA-rocR区一个末端的寡核苷酸
<400>107
ccgcgaatac cggttcatat                                                            20
<210>108
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义dltA-rocR区另一末端的寡核苷酸
<400>108
gatcaggctt cctgctccgg                                                            20
<210>109
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义dltA-hutM区一个末端的寡核苷酸
<400>109
ccgcgaatac cggttcatat                                                            20
<210>110
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义dltA-hutM区另一末端的寡核苷酸
<400>110
ccatgctgag cggggtgtgc                                                            20
<210>111
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义pdp-rocR区一个末端的寡核苷酸
<400>111
ggcgccttcg cttccgcggc                                                            20
<210>112
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义pdp-rocR区另一末端的寡核苷酸
<400>112
gatcaggctt cctgctccgg                                                            20
<210>113
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yybP-yyaJ区一个末端的寡核苷酸
<400>113
ccgcgtcggg atgctttttc                                                            20
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：定义yybP-yyaJ区另一末端的寡核苷酸
<400>114
gcagatccgc actgactttt                                                            20
<210>115
<211>3150
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属(Bacillus sp.)KSM-S237
<220>
<221>CDS
<222>(573)..(3044)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(573)..(659)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(660)..(3044)
<400>115
gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa   60
taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt  120
gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac  180
gcctttttat aattatttat acctagaacg aaaatactgt ttcgaaagcg gtttactata  240
aaaccttata ttccggctct tttttaaaac agggggtaaa aattcactct agtattctaa  300
tttcaacatg ctataataaa tttgtaagac gcaatatgca tctctttttt tacgatatat  360
gtaagcggtt aaccttgtgc tatatgccga tttaggaagg ggggtagatt gagtcaagta  420
gtaataatat agataactta taagttgttg agaagcagga gagcatctgg gttactcaca  480
agttttttta aaactttaac gaaagcactt tcggtaatgc ttatgaattt agctatttga  540
ttcaattact ttaaaaatat ttaggaggta at atg atg tta aga aag aaa aca    593
                                    Met Met Leu Arg Lys Lys Thr
                                                    -25
aag cag ttg att tct tcc att ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta    641
Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu
        -20                 -15                 -10
ttt ccg gca gct ctt gca gca gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt    689
Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe
     -5              -1   1               5                  10
aaa cat tta tta ggt aat gac aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc    737
Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly
                 15                  20                  25
gca tta caa tta caa gaa gtc gat gga caa atg aca tta gta gat caa    785
Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln
             30                  35                  40
cat gga gaa aaa att caa tta cgt gga atg agt aca cac gga tta cag    833
His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln
         45                  50                  55
tgg ttt cct gag atc ttg aat gat aac gca tac aaa gct ctt tct aac    881
Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn
     60                  65                  70
gat tgg gat tcc aat atg att cgt ctt gct atg tat gta ggt gaa aat     929
Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn
 75                  80                  85                  90
ggg tac gct aca aac cct gag tta atc aaa caa aga gtg att gat gga     977
Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly
                95                  100                 105
att gag tta gcg att gaa aat gac atg tat gtt att gtt gac tgg cat    1025
Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His
            110                 115                 120
gtt cat gcg cca ggt gat cct aga gat cct gtt tat gca ggt gct aaa    1073
Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys
        125                 130                 135
gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta tac cct aat aat cca cac att    1121
Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile
    140                 145                 150
att tat gag tta gcg aat gag ccg agt agt aat aat aat ggt gga gca    1169
Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala
155                 160                 165                 170
ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg aaa gcg gta aaa gaa tat gct    1217
Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala
                175                 180                 185
gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa agc ggt aat gca gat gac aac    1265
Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn
            190                 195                 200
att atc att gtt ggt agt cca aac tgg agt cag cgt ccg gac tta gca    1313
Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala
        205                 210                 215
gct gat aat cca att gat gat cac cat aca atg tat act gtt cac ttc    1361
Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe
    220                 225                 230
tac act ggt tca cat gct gct tca act gaa agc tat ccg tct gaa act    1409
Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr
235                 240                 245                 250
cct aac tct gaa aga gga aac gta atg agt aac act cgt tat gcg tta    1457
Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu
                255                 260                 265
gaa aac gga gta gcg gta ttt gca aca gag tgg gga acg agt caa gct    1505
Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala
            270                 275                 280
agt gga gac ggt ggt cct tac ttt gat gaa gca gat gta tgg att gaa    1553
Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu
        285                 290                 295
ttt tta aat gaa aac aac att agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat    1601
Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn
    300                 305                 310
aaa aat gaa gta tct ggt gca ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct    1649
Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser
315                 320                 325                 330
aac gca acc aat ctt gac cca ggt cca gat cat gtg tgg gca cca gaa    1697
Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro Asp His Val Trp Ala Pro Glu
                335                 340                 345
gaa tta agt ctt tct gga gaa tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg    1745
Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val
            350                 355                 360
aac tat gag cca atc gac cgt aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac    1793
Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp
        365                 370                 375
ttt aat gat gga acg aag caa gga ttt gga gtg aat tcg gat tct cca    1841
Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro
    380                 385                 390
aat aaa gaa ctt att gca gtt gat aat gaa aac aac act ttg aaa gtt    1889
Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val
395                 400                 405                 410
tcg gga tta gat gta agt aac gat gtt tca gat ggc aac ttc tgg gct    1937
Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala
                415                 420                 425
aat gct cgt ctt tct gcc aac ggt tgg gga aaa agt gtt gat att tta    1985
Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu
            430                 435                 440
ggt gct gag aag ctt aca atg gat gtt att gtt gat gaa cca acg acg    2033
Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr
        445                 450                 455
gta gct att gcg gcg att cca caa agt agt aaa agt gga tgg gca aat    2081
Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn
    460                 465                 470
cca gag cgt gct gtt cga gtg aac gcg gaa gat ttt gtc cag caa acg    2129
Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr
475                 480                 485                 490
gac ggt aag tat aaa gct gga tta aca att aca gga gaa gat gct cct    2177
Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro
                495                 500                 505
aac cta aaa aat atc gct ttt cat gaa gaa gat aac aat atg aac aac    2225
Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn
            510                 515                 520
atc att ctg ttc gtg gga act gat gca gct gac gtt att tac tta gat    2273
Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp
        525                 530                 535
aac att aaa gta att  gga aca gaa gtt gaa att cca gtt gtt cat gat    2321
Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile Pro Val Val His Asp
    540                 545                 550
cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct gtt ttt gaa gac ggt aca cgt    2369
Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg
555                 560                 565                 570
caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct ggt gtg aaa aca gct tta aca    2417
Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr
                575                 580                 585
att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg tta tca tgg gaa ttt gga tat    2465
Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr
            590                 595                 600
cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg gca aca gct cca cgt tta gat    2513
Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp
        605                 610                 615
ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt gag aat gat tat gta gct ttt    2561
Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe
    620                 625                 630
gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca aca gaa ggc gca atg aat atc    2609
Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile
635                 640                 645                 650
aat tta gta ttc cag cca cct act aac ggg tat tgg gta caa gca cca    2657
Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro
                655                 660                 665
aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa tta gag gaa gcg aat caa gta    2705
Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val
            670                 675                 680
aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa att aac gta aga gat att aca    2753
Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr
        685                 690                 695
aac att caa gat gac acg tta cta cgt aac atg atg atc att ttt gca    2801
Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met Met Ile Ile Phe Ala
    700                 705                 710
gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga gtc ttt gta gat aat gtt cgt    2849
Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe Val Asp Asn Val Arg
715                 720                 725                 730
ttt gag ggg gct gct act act gag ccg gtt gaa cca gag cca gtt gat    2897
Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu Pro Glu Pro Val Asp
                735                 740                 745
cct ggc gaa gag acg cca cct gtc gat gag aag gaa gcg aaa aaa gaa    2945
Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu
            750                 755                 760
caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa gaa gca gta aaa gaa gaa aag    2993
Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys
        765                 770                 775
aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca gtc aaa aat gag gct aag aaa  3041
Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys
    780                 785                 790
aaa taatctatta aactagttat agggttatct aaaggtctga tgtagatctt       3094
Lys
795
ttagataacc tttttcttgc ataactggac acagagttgt tattaaagaa agtaag    3150
<210>116
<211>824
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属KSM-S237
<400>116
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile
                -25                 -20                 -15
Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Ala Ala Leu Ala Ala Glu Gly
            -10                 -5               -1   1
Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
      5                  10                  15
Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
 20                  25                  30                  35
Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly
                 40                  45                  50
Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
             55                  60                  65
Ala Tyr Lys Ala Leu Ser Asn Asp Trp Asp Ser Asn Met Ile Arg Leu
         70                  75                  80
Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile
     85                  90                  95
Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
100                 105                 110                 115
Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp
                120                 125                 130
Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu
            135                 140                 145
Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
        150                 155                 160
Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
    165                 170                 175
Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys
180                 185                 190                 195
Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp
                200                 205                 210
Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
            215                 220                 225
Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
        230                 235                 240
Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
    245                 250                 255
Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
260                 265                 270                 275
Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp
                280                 285                 290
Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
            295                 300                 305
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
        310                 315                 320
Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro
    325                 330                 335
Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
340                 345                 350                 355
Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys
                360                 365                 370
Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
            375                 380                 385
Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn
        390                 395                 400
Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val
    405                 410                 415
Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp
420                 425                 430                 435
Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val
                440                 445                 450
Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser
            455                 460                 465
Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala
        470                 475                 480
Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr
    485                 490                 495
Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu
500                 505                 510                 515
Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala
                520                 525                 530
Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
            535                 540                 545
Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser
        550                 555                 560
Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser
    565                 570                 575
Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala
580                 585                 590                 595
Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp
                600                 605                 610
Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
            615                 620                 625
Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
        630                 635                 640
Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
    645                 650                 655
Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
660                 665                 670                 675
Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys
                680                 685                 690
Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
            695                 700                 705
Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
        710                 715                 720
Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
    725                 730                 735
Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
740                 745                 750                 755
Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys
                760                 765                 770
Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
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Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys
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cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt    120
cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca    180
acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta    240
tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc  300
tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa  360
atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc  420
tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat  480
aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga  540
aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttta  600
ggaggtaat atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att  651
          Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile
                          -25                 -20
ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg aca gct ctt gca gca    699
Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala
-15                 -10                 -5               -1   1
gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac    747
Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp
              5                  10                  15
aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc    795
Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val
         20                  25                  30
gat gga caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta    843
Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu
     35                  40                  45
cgt gga atg agt aca cac gga tta caa tgg ttt cct gag atc ttg aat     891
Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn
 50                  55                  60                  65
gat aac gca tac aaa gct ctt gct aac gat tgg gaa tca aat atg att     939
Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile
                 70                  75                  80
cgt cta gct atg tat gtc ggt gaa aat ggc tat gct tca aat cca gag     987
Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu
             85                  90                  95
tta att aaa agc aga gtc att aaa gga ata gat ctt gct att gaa aat    1035
Leu Ile Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn
        100                 105                 110
gac atg tat gtc atc gtt gat tgg cat gta cat gca cct ggt gat cct    1083
Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro
    115                 120                 125
aga gat ccc gtt tac gct gga gca gaa gat ttc ttt aga gat att gca    1131
Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala
130                 135                 140                 145
gca tta tat cct aac aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag    1179
Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu
                150                 155                 160
cca agt agt aac aat aat ggt gga gct ggg att cca aat aat gaa gaa    1227
Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu
            165                 170                 175
ggt tgg aat gcg gta aaa gaa tac gct gat cca att gta gaa atg tta    1275
Gly Trp Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu
        180                 185                 190
cgt gat agc ggg aac gca gat gac aat att atc att gtg ggt agt cca    1323
Arg Asp Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro
    195                 200                 205
aac tgg agt cag cgt cct gac tta gca gct gat aat cca att gat gat    1371
Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp
210                 215                 220                 225
cac cat aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct    1419
His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala
                230                 235                 240
tca act gaa agc tat ccg cct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac    1467
Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn
            245                 250                 255
gta atg agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gca gta ttt    1515
Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe
        260                 265                 270
gca aca gag tgg gga act agc caa gca aat gga gat ggt ggt cct tac    1563
Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr
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ttt gat gaa gca gat gta tgg att gag ttt tta aat gaa aac aac att    1611
Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile
290                 295                 300                 305
agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca    1659
Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala
                310                 315                 320
ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca aca agt ctt gac cca    1707
Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro
            325                 330                 335
ggg cca gac caa gta tgg gta cca gaa gag tta agt ctt tct gga gaa    1755
Gly Pro Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu
        340                 345                 350
tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt    1803
Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg
    355                 360                 365
aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa    1851
Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln
370                 375                 380                 385
gga ttt gga gtg aat gga gat tct cca gtt gaa gat gta gtt att gag    1899
Gly Phe Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu
                390                 395                 400
aat gaa gcg ggc gct tta aaa ctt tca gga tta gat gca agt aat gat    1947
Asn Glu Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp
            405                 410                 415
gtt tct gaa ggt aat tac tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc gac ggt    1995
Val Ser Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly
        420                 425                 430
tgg gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gaa aaa ctt act atg gat    2043
Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp
    435                 440                 445
gtg att gtt gat gag ccg acc acg gta tca att gct gca att cca caa    2091
Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln
450                 455                 460                 465
ggg cca tca gcc aat tgg gtt aat cca aat cgt gca att aag gtt gag    2139
Gly Pro Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu
                470                 475                 480
cca act aat ttc gta ccg tta gga gat aag ttt aaa gcg gaa tta act    2187
Pro Thr Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr
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ata act tca gct gac tct cca tcg tta gaa gct att gcg atg cat gct    2235
Ile Thr Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala
        500                 505                 510
gaa aat aac aac atc aac aac atc att ctt ttt gta gga act gaa ggt    2283
Glu Asn Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly
    515                 520                 525
gct gat gtt atc tat tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt    2331
Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val
530                 535                 540                 545
gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct    2379
Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser
                550                 555                 560
gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct    2427
Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser
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ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg    2475
Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala
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tta tca tgg gaa ttt gga tac cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg    2523
Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp
    595                 600                 605
gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt    2571
Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly
610                 615                 620                 625
gaa aat gat tat gta act ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca    2619
Glu Asn Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala
                630                 635                 640
aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac    2667
Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn
            645                 650                 655
ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa    2715
Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu
        660                 665                 670
tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa    2763
Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys
    675                 680                 685
att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt    2811
Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg
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aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga    2859
Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg
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gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg    2907
Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro
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gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg ccg cct gtc gat    2955
Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp
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gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa    3003
Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys
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gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca    3051
Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala
770                 775                 780                 785
atc aaa aat gag gct acg aaa aaa taatctaata aactagttat agggttatct   3105
Ile Lys Asn Glu Ala Thr Lys Lys
                790
aaaggtctga tgcagatctt ttagataacc tttttttgca taactggaca tagaatggtt  3165
attaaagaaa gcaaggtgtt tatacgatat taaaaaggta gcgattttaa attgaaacct  3225
ttaataatgt cttgtgatag aatgatgaag taatttaaga gggggaaacg aagtgaaaac  3285
ggaaatttct agtagaagaa aaacagacca agaaatactg caagctt                3332
<210>118
<211>822
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属KSM-64
<400>118
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile
                -25                 -20                 -15
Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala Glu Gly
            -10                 -5               -1   1
Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
      5                  10                  15
Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly
 20                  25                  30                  35
Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly
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Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn
             55                  60                  65
Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile Arg Leu
         70                  75                  80
Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu Leu Ile
     85                  90                  95
Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met
100                 105                 110                 115
Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp
                120                 125                 130
Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala Ala Leu
            135                 140                 145
Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
        150                 155                 160
Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
    165                 170                 175
Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Asp
180                 185                 190                 195
Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp
                200                 205                 210
Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His
            215                 220                 225
Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
        230                 235                 240
Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
    245                 250                 255
Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
260                 265                 270                 275
Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp
                280                 285                 290
Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp
            295                 300                 305
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
        310                 315                 320
Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro
    325                 330                 335
Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
340                 345                 350                 355
Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys
                360                 365                 370
Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe
            375                 380                 385
Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu Asn Glu
        390                 395                 400
Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp Val Ser
    405                 410                 415
Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly Trp Gly
420                 425                 430                 435
Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile
                440                 445                 450
Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln Gly Pro
            455                 460                 465
Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu Pro Thr
        470                 475                 480
Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr Ile Thr
    485                 490                 495
Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala Glu Asn
500                 505                 510                 515
Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly Ala Asp
                520                 525                 530
ValIle Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile
            535                 540                 545
Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe
        550                 555                 560
Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val
    565                 570                 575
Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser
580                 585                 590                 595
Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr
                600                 605                 610
Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn
            615                 620                 625
Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu
        630                 635                 640
Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr
    645                 650                 655
Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu
660                 665                 670                 675
Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn
                680                 685                 690
Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met
            695                 700                 705
Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe
        710                 715                 720
Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu
    725                 730                 735
Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys
740                 745                 750                 755
Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala
                760                 765                 770
Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ile Lys
            775                 780                 785
Asn Glu Ala Thr Lys Lys
        790
<210>119
<211>380
<212>PRT
<213>克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16
<400>119
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
  1               5                  10                  15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys
             20                  25                  30
Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe
         35                  40                  45
Val Glu Gln Ile Glu Ala Asn Asp Asp Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu
     50                  55                  60
Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val
 65                  70                  75                  80
Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp
                 85                  90                  95
Pro Thr Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala
            100                 105                 110
Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His
        115                 120                 125
Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr
    130                 135                 140
Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe
145                 150                 155                 160
Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His
                165                 170                 175
Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly
            180                 185                 190
Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser
        195                 200                 205
Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly
    210                 215                 220
Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro
225                 230                 235                 240
Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val
                245                 250                 255
Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr
            260                 265                 270
Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn
        275                 280                 285
Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val
    290                 295                 300
Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala
                325                 330                 335
Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg
            340                 345                 350
Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Gly Leu Gly Asn Thr Asn Leu Tyr
        355                 360                 365
Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
    370                 375                 380
<210>120
<211>480
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属KSM-K38
<400>120
Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu
  1               5                  10                  15
Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu
             20                  25                  30
Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
         35                  40                  45
Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
     50                  55                  60
Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
 65                  70                  75                  80
Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn
                 85                  90                  95
Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp
        115                 120                 125
Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser
    130                 135                 140
Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe
145                 150                 155                 160
Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg
                165                 170                 175
Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn
            180                 185                 190
Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val
        195                 200                 205
Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp
    210                 215                 220
Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr
225                 230                 235                 240
Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu
                245                 250                 255
Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe
            260                 265                 270
Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu
        275                 280                 285
Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met
    290                 295                 300
Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala
305                 310                 315                 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu
                325                 330                 335
Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu
            340                 345                 350
Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly
        355                 360                 365
Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu
    370                 375                 380
Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg
                405                 410                 415
Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser
            420                 425                 430
Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp
        435                 440                 445
Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp
    450                 455                 460
Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln
465                 470                 475                 480
<210>121
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于upp基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>121
agtcaacttc agcggtgttc                                                            20
<210>122
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于upp基因和红霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>122
gtgcgcggaa cccctatttg tcccatcaac aattacacac ttc                                  43
<210>123
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于upp基因和红霉素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>123
cgttactaaa gggaatgtat gaaatcccca aaaggggg                                        38
<210>124
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于upp基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>124
gcggacgaaa tcaacaatcc                                                            20
<210>125
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于扩增红霉素抗性基因的正向PCR引物的寡核苷酸
<400>125
acaaataggg gttccgcgca c                                                          21
<210>126
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于扩增红霉素抗性基因的反向PCR引物的寡核苷酸e
<400>126
acattccctt tagtaacg                                                              18
<210>127
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于扩增氯霉素抗性基因的正向PCR引物的寡核苷酸
<400>127
cgcattaaag cttatcggca atagttaccc                                                 30
<210>128
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于扩增氯霉素抗性基因的反向PCR引物的寡核苷酸
<400>128
gcccaagcgg gttttaggat catcgatccc ggaaatcgat tataggtatg tggttttgta                60
ttgg                                                                             64
<210>129
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于扩增upp基因的正向PCR引物的寡核苷酸
<400>129
gccattccaa tacaaaacca catacctata atcgatgatc ctaaaacccg cttgggctta                60
tgcccggcgg g                                                                     71
<210>130
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于扩增upp基因的正反向PCR引物的寡核苷酸
<400>130
atcgatttcc ggtaccggaa ctcgagcctt gagctcaaaa aatcattcat ccgcaagcct                60
tgc                                                                              63
<210>131
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于扩增ybbU基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>131
ctgcaaacgc aatggaagct ctatgcg                                                    27
<210>132
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ybbU基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>132
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaacac ccctttagat aatcttatcc                60
<210>133
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ybdE基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>133
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat aaatttccgt cttgtatgtg cgacaaacgg                60
<210>134
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ybdE基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>134
tgaaaacttg ctgtacagcc cc                                                         22
<210>135
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ybbU基因上游区和ybdE基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>135
ccgtttgtcg cacatacaag acggaaattt ataaaaacac ccctttagat aatcttatcc                60
<210>136
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ybdE基因下游区和ybbU基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>136
ggataagatt atctaaaggg gtgtttttat aaatttccgt cttgtatgtg cgacaaacgg                60
<210>137
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydiM基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>137
ccagatttag atggaaagcc                                                            20
<210>138
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydiM基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>138
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaaggg gcagaactga ttcagc                    56
<210>139
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydjC基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>139
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat atttgtagac tttaataaga aacgaaaggc                60
<210>140
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydjC基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>140
tcacgatgcc tatgatctaa aggtttgggg                                                 30
<210>141
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydiM基因上游区和ydjC基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>141
gcctttcgtt tcttattaaa gtctacaaat ccccaatcaa atagatggaa aattaggctc                60
<210>142
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydjC基因下游区和ydiM基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>142
gagcctaatt ttccatctat ttgattgggg atttgtagac tttaataaga aacgaaaggc                60
<210>143
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjcM基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>143
gccagtccaa gaccgtcact tcagccatgc                                                 30
<210>144
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjcM基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>144
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaaatg ccttccgcta cttaataagc                60
tgttggg                                                                          67
<210>145
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjdJ基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>145
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat tgtgtggctc tttttgcatc                           50
<210>146
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjdJ基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>146
cggtatgggt gaaacgaacg tctgtgtgga gc                                              32
<210>147
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjcM基因上游区和yjdJ基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>147
gatgcaaaaa gagccacaca ctacttaata agctgttggg                                      40
<210>148
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjdJ基因下游区和yjcM基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>148
cccaacagct tattaagtag tgtgtggctc tttttgcatc                                      40
<210>149
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yrkM基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>149
tccgcactac acattgccgt gataaatggg                                                 30
<210>150
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yrkM基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>150
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaacat tattaccttc ctctgataat                60
gaaatat                                                                          67
<210>151
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yraK基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>151
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat cggaacaatt ggaaacagaa tgggttgaat                60
tc                                                                               62
<210>152
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yraK基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>152
gcctcatgag ctgccaatgt ttgatgatcc                                                 30
<210>153
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yrkM基因上游区和yraK基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>153
gaattcaacc cattctgttt ccaattgttc cgcattatta ccttcctctg ataatgaaat                60
at                                                                               62
<210>154
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yraK基因下游区和yrkM基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>154
atatttcatt atcagaggaa ggtaataatg cggaacaatt ggaaacagaa tgggttgaat                60
tc                                                                               62
<210>155
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykdA基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>155
tgcggaggcc caaggacgcc                                                            20
<210>156
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykdA基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>156
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaaatc agcagcactt gcaggtcgct                60
<210>157
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于xlyA基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>157
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat gcgacgaaag agaagatcgc ag                        52
<210>158
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于xlyA基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>158
gtctgacagc attgtcacgg                                                            20
<210>159
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykdA基因上游区和xlyA基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>159
gcgatcttct ctttcgtcgc cagcagcact tgcaggtcgc                                      40
<210>160
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用作xlyA基因下游区和ykdA基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>160
gcgacctgca agtgctgctg gcgacgaaag agaagatcgc                                      40
<210>161
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yodU基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>161
tttttcccta gttacgtccg                                                            20
<210>162
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yodU基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>162
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaatgt actgatatta atgacatgc                 59
<210>163
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypqP基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>163
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat gctgtatctc ctgtgaacac aatgggtgcc                60
<210>164
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypqP基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>164
tctttcgtaa tgagcggggc                                                            20
<210>165
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yodU基因上游区和ypqP基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>165
gtgttcacag gagatacagc tactgatatt aatgacatgc                                      40
<210>166
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypqP基因下游区和yodU基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>166
gcatgtcatt aatatcagta gctgtatctc ctgtgaacac                                      40
<210>167
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于pksA基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>167
ctgcaagcgc gatggccgcg                                                            20
<210>168
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于pksA基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>168
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaaatg tccttaattc ggtccgttac                60
cttttct                                                                          67
<210>169
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ymaC基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>169
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat aaatcaagga gcatcaatat gtggtggctt                60
<210>170
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ymaC基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>170
cgataggagc agccatgctg                                                            20
<210>171
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于pksA基因上游区和ymaC基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>171
ccaccacata ttgatgctcc ccttaattcg gtccgttacc                                      40
<210>172
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ymaC基因下游区和pksA基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>172
ggtaacggac cgaattaagg ggagcatcaa tatgtggtgg                                      40
<210>173
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcL基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>173
agttctcaac catcggcccg                                                            20
<210>174
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcL基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>174
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaataa gtgggcagtt tgtgggc                   57
<210>175
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydeJ基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>175
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat accatggaat agataggatg                           50
<210>176
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydeJ基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>176
aactttcacg gcgtctgggg                                                            20
<210>177
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcL基因上游区和ydeJ基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>177
catcctatct attccatggt taagtgggca gtttgtgggc                                      40
<210>178
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydeJ基因下游区和ydcL基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>178
gcccacaaac tgcccactta accatggaat agataggatg                                      40
<210>179
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ynxB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>179
tagcgtattg cttgctgcag gattagacgg                                                 30
<210>180
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ynxB基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>180
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaaaga tttcaacgta attatggatt                60
catttgg                                                                          67
<210>181
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于dut基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>181
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat tctccatgct gtgtgattga tcaatggagg                60
<210>182
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于dut基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>182
ctatttattc cctggcgaca taccgggggc                                                 30
<210>183
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用作ynxB基因上游区和dut基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>183
cctccattga tcaatcacac agcatggaga agatttcaac gtaattatgg attcatttgg                60
<210>184
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于dut基因下游区和ynxB基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>184
ccaaatgaat ccataattac gttgaaatct tctccatgct gtgtgattga tcaatggagg                60
<210>185
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yoaV基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>185
aattcatgac atccccccgc                                                            20
<210>186
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yoaV基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>186
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaaaat cccgcagcat atcagcagtg                60
cgccgag                                                                          67
<210>187
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yobO基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>187
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat cacacacgaa tgtggcgtgt ggtgcatcgc                60
<210>188
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yobO基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>188
catcgcttcc gttctatcgg                                                            20
<210>189
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yoaV基因上游区和yobO基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>189
ggagggcgaa ggaatgcaag tgaagcccaa atgacagggg                                      40
<210>190
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yobO基因下游区和yoaV基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>190
cccctgtcat ttgggcttca cttgcattcc ttcgccctcc                                      40
<210>191
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoIVCB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>191
accacttcgg ctcattaccc                                                            20
<210>192
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoIVCB基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>192
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaagtc acctccacaa aagtatg                   57
<210>193
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoIIIC基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>193
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat cagaagaagc cggatctc                             48
<210>194
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoIIIC基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>194
tgttcaacaa agtggacagc                                                            20
<210>195
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoIVCB基因上游区和spoIIIC基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>195
gagatccggc ttcttctgca cgtcacctcc acaaaagtat g                                    41
<210>196
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoIIIC基因下游区和spoIVCB基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>196
catacttttg tggaggtgac gtgcagaaga agccggatct c                                    41
<210>197
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ppsE基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>197
catcctgccc tcgaaggcgc                                                            20
<210>198
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ppsE基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>198
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaaacg gattccctcc agttctcata                60
ataagagg                                                                         68
<210>199
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ppsA基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>199
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat agcggattag cggacagagg ccattctctg                60
<210>200
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ppsA基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>200
tccggtcggg tcatctgcgg cg                                                         22
<210>201
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为uppsE基因上游区和ppsA基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>201
ggcctctgtc cgctaatccg ccagttctca taataagagg                                      40
<210>202
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ppsA基因下游区和ppsE基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>202
cctcttatta tgagaactgg cggattagcg gacagaggcc                                      40
<210>203
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yodU基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>203
gtaaataagc tgttcatatc tgtactgata ttaatgacat gc                                   42
<210>204
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypqP基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>204
cccgcttggg cttatgcccg gctgtatctc ctgtgaacac aatgggtgcc                           50
<210>205
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于扩增四环素抗性基因的正向PCR引物的寡核苷酸
<400>205
tcctaatatc ggttatgaag                                                            20
<210>206
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于扩增四环素抗性基因的反向PCR引物的寡核苷酸
<400>206
tacattcaag gtaaccagcc                                                            20
<210>207
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于pksA基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>207
gtaaataagc tgttcatatc atgtccttaa ttcggtccgt taccttttct                           50
<210>208
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ymaC基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>208
cccgcttggg cttatgcccg aaatcaagga gcatcaatat gtggtggctt                           50
<210>209
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoIVCB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>209
gtaaataagc tgttcatatc gtcacctcca caaaagtatg                                      40
<210>210
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoIIIC基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>210
cccgcttggg cttatgcccg cagaagaagc cggatctc                                        38
<210>211
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ppsE基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>211
gtaaataagc tgttcatatc acggattccc tccagttctc ataataagag g                         51
<210>212
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ppsA基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>212
cccgcttggg cttatgcccg agcggattag cggacagagg ccattctctg                           50
<210>213
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcL基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>213
gtaaataagc tgttcatatc taagtgggca gtttgtgggc                                      40
<210>214
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydeJ基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>214
cccgcttggg cttatgcccg accatggaat agataggatg                                      40
<210>215
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ynxB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>215
gtaaataagc tgttcatatc agatttcaac gtaattatgg attcatttgg                           50
<210>216
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于dut基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>216
cccgcttggg cttatgcccg tctccatgct gtgtgattga tcaatggagg                           50
<210>217
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ycxB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>217
gaaacatgcg cacgtctccc                                                            20
<210>218
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ycxB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>218
gtaaataagc tgttcatatc cagtgctgat ccttttatat                                      40
<210>219
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于sipU基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>219
cccgcttggg cttatgcccg gcaatgcaaa aagaacatgg                                      40
<210>220
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于sipU基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>220
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta actctcaaag cgaacggg                             48
<210>221
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ycxB基因上游区和sipU基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>221
ccatgttctt tttgcattgc cagtgctgat ccttttatat                                      40
<210>222
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于sipU基因下游区和ycxB基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>222
atataaaagg atcagcactg gcaatgcaaa aagaacatgg                                      40
<210>223
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcL基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>223
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta gtatctgtac gacctgcggc c                         51
<210>224
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcL基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>224
gtaaataagc tgttcatatc taagtgggca gtttgtgggc                                      40
<210>225
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydhU基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>225
cccgcttggg cttatgcccg acccgttcca cggattgccc                                      40
<210>226
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydhU基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>226
atgccggtac ctggctcgag gacctgcatc gtgcaggccc                                      40
<210>227
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcL基因上游区和ydhU基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>227
gggcaatccg tggaacgggt taagtgggca gtttgtgggc                                      40
<210>228
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydhU基因下游区和ydcL基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>228
gcccacaaac tgcccactta acccgttcca cggattgccc                                      40
<210>229
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydiM基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>229
ttttgtgttt tgctaatcgg gtattgaccc                                                 30
<210>230
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydiM基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>230
gtaaataagc tgttcatatc aattttcacc tcacatcgct                                      40
<210>231
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yebA基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>231
cccgcttggg cttatgcccg agattcttcg gcgctatgga                                      40
<210>232
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yebA基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>232
tccgcttcat catcaaacac                                                            20
<210>233
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydiM基因上游区和yebA基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>233
tccatagcgc cgaagaatct aattttcacc tcacatcgct                                      40
<210>234
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yebA基因下游区和ydiM基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>234
agcgatgtga ggtgaaaatt agattcttcg gcgctatgga                                      40
<210>235
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yeeK基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>235
aaaaagcagg ctagctcgag agatattcta aaagggagag                                      40
<210>236
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yeeK基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>236
gtaaataagc tgttcatatc atttactctc tccttcacat                                      40
<210>237
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yesX基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>237
cccgcttggg cttatgcccg gaggactaag ggataagacg                                      40
<210>238
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yesX基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>238
aagaaagctg ggtactcgag gctgtggtga tgatggcggc                                      40
<210>239
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yeeK基因上游区和yesX基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>239
cgtcttatcc cttagtcctc atttactctc tccttcacat                                      40
<210>240
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yesX基因下游区和yeeK基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>240
atgtgaagga gagagtaaat gaggactaag ggataagacg                                      40
<210>241
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于cspB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>241
aaaaagcagg ctagctcgag gagcagccga gtgaagccgc                                      40
<210>242
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于cspB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>242
gtaaataagc tgttcatatc aaattgatat gaaaaactgc                                      40
<210>243
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhcT基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>243
cccgcttggg cttatgcccg gttaaatggc tccttttcga                                      40
<210>244
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhcT基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>244
aagaaagctg ggtactcgag gtatctagaa taagcccgtc                                      40
<210>245
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于cspB基因上游区和yhcT基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>245
tcgaaaagga gccatttaac aaattgatat gaaaaactgc                                      40
<210>246
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhcT基因下游区和cspB基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>246
gcagtttttc atatcaattt gttaaatggc tccttttcga                                      40
<210>247
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用作yncM基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>247
aaaaagcagg ctagctcgag atggaatctc agacgaagag                                      40
<210>248
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yncM基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>248
gtaaataagc tgttcatatc acgaagcagc aaaaagccgc                                      40
<210>249
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于fosB基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>249
cccgcttggg cttatgcccg caaccatatt tcatataagg                                      40
<210>250
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于fosB基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>250
aagaaagctg ggtactcgag aaggcaactt gatatcctcc                                      40
<210>251
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yncM基因上游区和fosB基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>251
ccttatatga aatatggttg acgaagcagc aaaaagccgc                                      40
<210>252
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于fosB基因下游区和yncM基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>252
gcggcttttt gctgcttcgt caaccatatt tcatataagg                                      40
<210>253
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于cgeE基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>253
aaaaagcagg ctagctcgag ctcataatca cacctgaccc                                      40
<210>254
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于cgeE基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>254
gtaaataagc tgttcatatc aataggcgtt tgcacaaacc                                      40
<210>255
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypmQ基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>255
cccgcttggg cttatgcccg gacatccatc ctttccagcc                                      40
<210>256
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypmQ基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>256
aagaaagctg ggtactcgag ggccttctct ctggggtagg                                      40
<210>257
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于cgeE基因上游区和ypmQ基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>257
ggctggaaag gatggatgtc aataggcgtt tgcacaaacc                                      40
<210>258
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypmQ基因下游区和cgeE基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>258
ggtttgtgca aacgcctatt gacatccatc ctttccagcc                                      40
<210>259
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yraK基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>259
cccgcttggg cttatgcccg cggaacaatt ggaaacagaa tgggttgaat tc                        52
<210>260
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoIVCB基因上游区和yraK基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>260
gaattcaacc cattctgttt ccaattgttc cgcgtcacct ccacaaaagt atg                       53
<210>261
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yraK基因下游区和spoIVCB基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>261
catacttttg tggaggtgac gcggaacaat tggaaacaga atgggttgaa ttc                       53
<210>262
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytxK基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>262
aaaaagcagg ctagctcgag gtagcttcaa cgatgtcacg                                      40
<210>263
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytxK基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>263
gtaaataagc tgttcatatc gtgttttaaa agcagcttag                                      40
<210>264
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于braB基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>264
cccgcttggg cttatgcccg tgtcacagaa cgcctgcgtt                                      40
<210>265
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于braB基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>265
aagaaagctg ggtactcgag gaagaagaaa cagaaggcgg                                      40
<210>266
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytxK基因上游区和braB基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>266
aacgcaggcg ttctgtgaca gtgttttaaa agcagcttag                                      40
<210>267
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于braB基因下游区和ytxK基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>267
ctaagctgct tttaaaacac tgtcacagaa cgcctgcgtt                                      40
<210>268
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于sbo基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>268
aaaaagcagg ctagctcgag ccgacagccg ccccgcgcgc                                      40
<210>269
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于sbo基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>269
gtaaataagc tgttcatatc tttcataatt gaatcctccc                                      40
<210>270
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ywhH基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>270
cccgcttggg cttatgcccg aaaaacatcc agacatcgtc                                      40
<210>271
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ywhH基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>271
aagaaagctg ggtactcgag cgcagacgga caacccatgg                                      40
<210>272
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于sbo基因上游区和ywhH基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>272
gacgatgtct ggatgttttt tttcataatt gaatcctccc                                      40
<210>273
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ywhH基因下游区和sbo基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>273
gggaggattc aattatgaaa aaaaacatcc agacatcgtc                                      40
<210>274
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于pdp基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>274
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg tactggatca attgggtgg                            49
<210>275
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明作为用于pdp基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>275
gtaaataagc tgttcatatc ccgcggaagc gaaggcgccg                                      40
<210>276
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于rocR基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>276
cccgcttggg cttatgcccg ccggagcagg aagcctgatc                                      40
<210>277
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于rocR基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>277
ggctgggagc ggctctggcg                                                            20
<210>278
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于pdp基因上游区和rocR基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>278
gatcaggctt cctgctccgg ccgcggaagc gaaggcgccg                                      40
<210>279
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于rocR基因下游区和pdp基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>279
cggcgccttc gcttccgcgg ccggagcagg aagcctgatc                                      40
<210>280
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yybP基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>280
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tccactttcc gccaatgac                            49
<210>281
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yybP基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>281
gtaaataagc tgttcatatc gaaaaagcat cccgacgcgg                                      40
<210>282
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yyaJ基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>282
cccgcttggg cttatgcccg aaaagtcagt gcggatctgc                                      40
<210>283
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yyaJ基因下游区的PGR引物的寡核苷酸
<400>283
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta gttgaaatca taggcgaggg                           50
<210>284
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yybP基因上游区和yyaJ基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>284
gcagatccgc actgactttt gaaaaagcat cccgacgcgg                                      40
<210>285
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yyaJ基因下游区和yybP基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>285
ccgcgtcggg atgctttttc aaaagtcagt gcggatctgc                                      40
<210>286
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yisB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>286
atgccggtac ctggctcgag ctgtccagca ggatctaaag c                                    41
<210>287
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yi sB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>287
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg atccgctcct cccttacatc                           50
<210>288
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yitD基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>288
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat gcggctgcgg ggctctcgtc g                         51
<210>289
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yitD基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>289
atgccggtac ctggctcgag cggcgtcaga gcatccgccc                                      40
<210>290
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yisB基因上游区和yitD基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>290
gctgttcata tcgacctgct cgaggaattc gatccgctcc tcccttacat c                         51
<210>291
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yitD基因下游区和yisB基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>291
gggatcaact ttgggagaga gctcgagggg cggctgcggg gctctcgtcg                           50
<210>292
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykuS基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>292
ggcgagctcg ccgtaaaagt gaacgggacg gc                                              32
<210>293
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykuS基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>293
gctgttcata tcgacctgct cgaggaattc gcacctccgt ttactagagt gc                        52
<210>294
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykqB基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>294
gggatcaact ttgggagaga gctcgagggt agcagccaaa taagccgtc                            49
<210>295
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykqB基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>295
cggggtaccc cgggcttgaa tcgccatttt cac                                             33
<210>296
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykuS基因上游区和ykqB基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>296
gacggcttat ttggctgcta acctccgttt actagagtgc                                      40
<210>297
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykqB基因下游区和ykuS基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>297
gcactctagt aaacggaggt tagcagccaa ataagccgtc                                      40
<210>298
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yunA基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>298
atgccggtac ctggctcgag gcttcgttta cttgttcatc                                      40
<210>299
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yunA基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>299
gctgttcata tcgacctgct cgaggaattc gcttcccttg tcgagaaatt t                         51
<210>300
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yurT基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>300
gggatcaact ttgggagaga gctcgaggga ctgtttttcc ctccttcga                            49
<210>301
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yurT基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>301
atgccggtac ctggctcgag ctacaatcgt atcaaaatcg                                      40
<210>302
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yunA基因上游区和yurT基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>302
tcgaaggagg gaaaaacagt cttcccttgt cgagaaattt                                      40
<210>303
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yurT基因下游区和yunA基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>303
aaatttctcg acaagggaag actgtttttc cctccttcga                                      40
<210>304
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ybbU基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>304
ctgcaaacgc aatggaagct ctatgcg                                                    27
<210>305
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ybbU基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>305
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaacac ccctttagat aatcttatcc                60
<210>306
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yceK基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>306
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat actataatac ataatgggtg                           50
<210>307
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yceK基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>307
atgccggtac ctggctcgag ggaatattcg catcggacac                                      40
<210>308
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ycxB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>308
gaaacatgcg cacgtctccc                                                            20
<210>309
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ycxB基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>309
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaacag tgctgatcct tttatat                   57
<210>310
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydbP基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>310
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat atgtcacatc tccttttcaa                           50
<210>311
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydbP基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>311
ccacaagctg ttcaatcagg                                                            20
<210>312
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcL基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>312
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ataaaaataa gtgggcagtt tgtgggc                   57
<210>313
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydhU基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>313
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat acccgttcca cggattgccc                           50
<210>314
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhxD基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>314
atgccggtac ctggctcgag cagcatggca agccgacggt                                      40
<210>315
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhxD基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>315
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg tagctttatg aaaggagctg                           50
<210>316
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhjP基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>316
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat taaaaagagg gttctttttt g                         51
<210>317
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhjP基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>317
atgccggtac ctggctcgag tgaccaatct gatctattgg                                      40
<210>318
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于基因yisB上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>318
atgccggtac ctggctcgag ctgtccagca ggatctaaag c                                    41
<210>319
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yisB基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>319
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg atccgctcct cccttacatc                           50
<210>320
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yitD基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>320
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat gcggctgcgg ggctctcgtc g                         51
<210>321
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yitD基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>321
atgccggtac ctggctcgag cggcgtcaga gcatccgccc                                      40
<210>322
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yitH基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>322
atgccggtac ctggctcgag ctgctcagta caagaacact g                                    41
<210>323
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yitH基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>323
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ccctcttttt tcccgaacag                           50
<210>324
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yitZ基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>324
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat gcggctgaaa tgcggcaccg c                         51
<210>325
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yitZ基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>325
atgccggtac ctggctcgag gggtcacggc gatatcacag                                      40
<210>326
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于oppA基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>326
caagatccgt tccgtacagc                                                            20
<210>327
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于oppA基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>327
tgccgataag ctttaatgcg ccccctaata ataattttca gctcc                                45
<210>328
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjbK基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>328
ttccggtacc ggaaatcgat gatgctcttc ctttccgccc                                      40
<210>329
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjbK基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>329
atttcatgct cttcttcccc                                                            20
<210>330
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjcM基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>330
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta ccacaccgca ataaaccccc                           50
<210>331
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjcM基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>331
tgccgataag ctttaatgcg taaattgata ctaaatcgtt                                      40
<210>332
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjgB基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>332
ttccggtacc ggaaatcgat tccctcctaa ttgatctacc                                      40
<210>333
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjgB基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>333
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta gaatccgggc caaacgcctc                           50
<210>334
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于gid基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>334
atgccggtac ctggctcgag gcccaggatg cccacgaagc                                      40
<210>335
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于gid基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>335
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg ctttcacatc tcctagttta                           50
<210>336
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ylxL基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>336
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat tgattgtcgg ataaagctgt g                         51
<210>337
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ylxL基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>337
atgccggtac ctggctcgag ccttctgctg cgatacggtc                                      40
<210>338
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoVS基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>338
gcgaattatg gtgaagccgg                                                            20
<210>339
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于spoVS基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>339
tgccgataag ctttaatgcg ttctgctccc ccttagtttt                                      40
<210>340
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ymzA基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>340
ttccggtacc ggaaatcgat gcagtttttt ttcatgttat g                                    41
<210>341
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ymzA基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>341
ttaagagaaa ccccgccacc                                                            20
<210>342
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqeD基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>342
atgccggtac ctggctcgag cgggcatcct ctgtcgtctg                                      40
<210>343
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqeD基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>343
tgccgataag ctttaatgcg taacatgtct atggtcactc cc                                   42
<210>344
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yrzL基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>344
ttccggtacc ggaaatcgat cctctttccc aaattcgc                                        38
<210>345
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yrzL基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>345
atgccggtac ctggctcgag taaacgaaaa gatctgggcg                                      40
<210>346
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yvdM基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>346
atgccggtac ctggctcgag cggctgggag aaagaccatg                                      40
<210>347
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yvdM基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>347
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg gttgatcccc cttatatgta c                         51
<210>348
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yvcP基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>348
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat gaataaggga gtcaattcct tg                        52
<210>349
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yvcP基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>349
atgccggtac ctggctcgag caggcaatgg gtagaaccgg                                      40
<210>350
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于dltA基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>350
ccatgggctt gcggcaccgg                                                            20
<210>351
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于dltA基因和氯霉素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>351
gggtaactat tgccgataag ctttaatgcg tcgttataaa tatatgaacc ggtattcgcg                60
g                                                                                61
<210>352
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于rocR基因和upp基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>352
aaggctcgag ttccggtacc ggaaatcgat acgaataatc cggagcagga agcctgatc                 59
<210>353
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于rocR基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>353
ggctgggagc ggctctggcg                                                            20
<210>354
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcD基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>354
aaaaagcagg ctagctcgag cggaaattga cttgtccgcg                                      40
<210>355
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcD基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>355
gtaaataagc tgttcatatc aaaaaacata cacctccacc                                      40
<210>356
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcK基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>356
cccgcttggg cttatgcccg aaaaggttga cgaatatggc                                      40
<210>357
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydcK基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>357
aagaaagctg ggtactcgag ttagacattc acatgatacc                                      40
<210>358
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于四环素抗性基因和氯霉素抗性基因的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>358
tgccgataag ctttaatgcg cagtttgtac tcgcaggtgg                                      40
<210>359
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于氯霉素抗性基因和四环素抗性基因的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>359
atcctaaaac ccgcttgggc cttatcgtta gcgtgctgtc                                      40
<210>360
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ydiM基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>360
gtaaataagc tgttcatatc aattttcacc tcacatcgct                                      40
<210>361
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yebA基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>361
cccgcttggg cttatgcccg agattcttcg gcgctatgga                                      40
<210>362
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yeeK基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>362
gtaaataagc tgttcatatc atttactctc tccttcacat                                      40
<210>363
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yesX基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>363
cccgcttggg cttatgcccg gaggactaag ggataagacg                                      40
<210>364
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于cspB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>364
gtaaataagc tgttcatatc aaattgatat gaaaaactgc                                      40
<210>365
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhcT基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>365
cccgcttggg cttatgcccg gttaaatggc tccttttcga                                      40
<210>366
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhdP基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>366
cggcagttta tgcagagggc                                                            20
<210>367
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhdP基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>367
gtaaataagc tgttcatatc taagaaaagc accttgtata ggg                                  43
<210>368
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhaL基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>368
cccgcttggg cttatgcccg aaaaagctgt gcggctcaat g                                    41
<210>369
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yhaL基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>369
gaaacgatta ggcgctagtg                                                            20
<210>370
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjqB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>370
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta caaacggtcc gggaaaccgc                           50
<210>371
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yjqB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>371
gtaaataagc tgttcatatc cttgaacgcc cccctttacc                                      40
<210>372
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于htrA基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>372
cccgcttggg cttatgcccg catgttcact ccgtttctct                                      40
<210>373
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于htrA基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>373
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta gtcatgataa gccgtccgcg                           50
<210>374
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykuS基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>374
ggcgagctcg ccgtaaaagt gaacgggacg gc                                              32
<210>375
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykuS基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>375
gctgttcata tcgacctgct cgaggaattc gcacctccgt ttactagagt gc                        52
<210>376
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykqB基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>376
gggatcaact ttgggagaga gctcgagggt agcagccaaa taagccgtc                            49
<210>377
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ykqB基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>377
cggggtaccc cgggcttgaa tcgccatttt cac                                             33
<210>378
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：
     寡核苷酸
<400>378
ggcgagctcg cccattgcta ctggttctcg tc                                              32
<210>379
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于slp基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>379
gctgttcata tcgacctgct cgaggaattc gcagccctcg ctcaaagcgg g                         51
<210>380
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ylaM基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>380
gggatcaact ttgggagaga gctcgagggt aatttatgtc atatgctta                            49
<210>381
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ylaM基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>381
cggggtaccc cgctcccgtt aacagatggt cg                                              32
<210>382
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ctaA基因上游区的的PCR引物的寡核苷酸
<400>382
ggcgagctcg ccggcaggag ccgattacag tc                                              32
<210>383
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ctaA基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>383
gctgttcata tcgacctgct cgaggaattc gcaagaccaa agccttaggc g                         51
<210>384
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ylbE基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>384
gggatcaact ttgggagaga gctcgagggt aaaaggcccc gaagaaggg                            49
<210>385
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ylbE基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>385
cggggtaccc cggatgttgt tgccaaccgc gg                                              32
<210>386
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yncM基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>386
gtaaataagc tgttcatatc acgaagcagc aaaaagccgc                                      40
<210>387
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于fosB基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>387
cccgcttggg cttatgcccg caaccatatt tcatataagg                                      40
<210>388
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yoxC基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>388
tctctcttgc tctgtcatcg                                                            20
<210>389
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yoxC基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>389
gtaaataagc tgttcatatc atgttcactc cttttcttat gtc                                  43
<210>390
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yocS基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>390
cccgcttggg cttatgcccg atatgcatca aaaagggtac                                      40
<210>391
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yocS基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>391
ggtgactatg tagaacaggg tg                                                         22
<210>392
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yojO基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>392
aaaaagcagg ctagctcgag tgtgccgctc ttgtgctgcc                                      40
<210>393
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yojO基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>393
gtaaataagc tgttcatatc taatcctatg ctttttggcg                                      40
<210>394
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yozE基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>394
cccgcttggg cttatgcccg gggtttcccc tcctgatgtc                                      40
<210>395
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yozE基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>395
aagaaagctg ggtactcgag caggcggtga tgggctgctc                                      40
<210>396
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于cgeE基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>396
aaaaagcagg ctagctcgag ctcataatca cacctgaccc                                      40
<210>397
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于cgeE基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>397
gtaaataagc tgttcatatc aataggcgtt tgcacaaacc                                      40
<210>398
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypmQ基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>398
cccgcttggg cttatgcccg gacatccatc ctttccagcc                                      40
<210>399
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypmQ基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>399
aagaaagctg ggtactcgag ggccttctct ctggggtagg                                      40
<210>400
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypzC基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>400
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tcctggatgg tgtattcctc                           50
<210>401
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ypzC基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>401
gtaaataagc tgttcatatc actgcccgta acctcatgct                                      40
<210>402
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于drm基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>402
cccgcttggg cttatgcccg caggcatctt gaaagcctcc                                      40
<210>403
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于drm基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>403
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta attatgctat gatatgggtg                           50
<210>404
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqxK基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>404
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta gggcatcaaa catttcgggc                           50
<210>405
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqxK基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>405
gtaaataagc tgttcatatc gctaaagatt aactcagttc                                      40
<210>406
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqjP基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>406
cccgcttggg cttatgcccg cctttcgctc cttgtcttca                                      40
<210>407
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqjP基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>407
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta ctctctaagg cggcaccggc                           50
<210>408
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于zwf基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>408
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta gatgtaattt cggtctcccg                           50
<210>409
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明作为用于zwf基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>409
gtaaataagc tgttcatatc aaagtacctc actttattcg                                      40
<210>410
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqzF基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>410
cccgcttggg cttatgcccg cgcaatcaag tcagcccgcg                                      40
<210>411
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqzF基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>411
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta atgtgagttt cccctcggcc                           50
<210>412
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqgZ基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>412
aaaaagcagg ctagctcgag tagacacctt gggcggctgg                                      40
<210>413
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqgZ基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>413
gtaaataagc tgttcatatc tgaaaaaccg aagatccgct                                      40
<210>414
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqgN基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>414
cccgcttggg cttatgcccg ctctcatccc cctcggaata g                                    41
<210>415
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yqgN基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>415
aagaaagctg ggtactcgag ctttgatctg attcatgccc                                      40
<210>416
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yrzF基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>416
aaaaagcagg ctagctcgag tatcaatgga gtatgtaccc                                      40
<210>417
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yrzF基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>417
gtaaataagc tgttcatatc ttcattcacc ttctttgctc                                      40
<210>418
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yrxA基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>418
cccgcttggg cttatgcccg aagccctcga agaagccggc                                      40
<210>419
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yrxA基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>419
aagaaagctg ggtactcgag agatgccgtt caaaaggtcg                                      40
<210>420
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytrI基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>420
aaaaagcagg ctagctcgag ttttgcattt cttcgagtgg                                      40
<210>421
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytrI基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>421
gtaaataagc tgttcatatc gaagaaagat gctcctgggt                                      40
<210>422
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytlI基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>422
cccgcttggg cttatgcccg ctgaaaaaat aaaaaccacc                                      40
<210>423
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytlI基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>423
aagaaagctg ggtactcgag ttattcaaag cggttattcc                                      40
<210>424
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytxK基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>424
gtaaataagc tgttcatatc gtgttttaaa agcagcttag                                      40
<210>425
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于braB基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>425
cccgcttggg cttatgcccg tgtcacagaa cgcctgcgtt                                      40
<210>426
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytzH基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>426
aaaaagcagg ctagctcgag tgatgatatt gagcccatcc                                      40
<210>427
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明作为用于ytzH基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>427
gtaaataagc tgttcatatc aacggtacac atcccttcag                                      40
<210>428
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytbQ基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>428
cccgcttggg cttatgcccg cagctcctca taatttgccg                                      40
<210>429
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytbQ基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>429
aagaaagctg ggtactcgag tcaggacctt tcacatgtgc                                      40
<210>430
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytvB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>430
aaaaagcagg ctagctcgag atgcgtgttc cggggcaagg                                      40
<210>431
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytvB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>431
gtaaataagc tgttcatatc ttgtcctcaa tctccgcccg                                      40
<210>432
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytoA基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>432
cccgcttggg cttatgcccg gacctgcttc gtcttacttt acc                                  43
<210>433
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ytoA基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>433
aagaaagctg ggtactcgag tggatttggg cgttatcggc                                      40
<210>434
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于pckA基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>434
atgccggtac ctggctcgag gccgtcaggg cgaaggtacg                                      40
<210>435
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于pckA基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>435
gtaaataagc tgttcatatc atgaaacctt cctttatcgt                                      40
<210>436
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于mntA基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>436
cccgcttggg cttatgcccg atttctcctc ctctttgcca                                      40
<210>437
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于mntA基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>437
atgccggtac ctggctcgag ggcattgggc ggaacaagag                                      40
<210>438
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yueJ基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>438
atgccggtac ctggctcgag gcaacgagtt tataaactgc                                      40
<210>439
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yueJ基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>439
gtaaataagc tgttcatatc taaggaaggg gaaaaacagt g                                    41
<210>440
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yukJ基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>440
cccgcttggg cttatgcccg taagatagaa aaagagactg                                      40
<210>441
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yukJ基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>441
atgccggtac ctggctcgag ctgtgttcat ccggcggggg                                      40
<210>442
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yunA基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>442
gtaaataagc tgttcatatc cttcccttgt cgagaaattt                                      40
<210>443
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yurT基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>443
cccgcttggg cttatgcccg actgtttttc cctccttcga                                      40
<210>444
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yurZ基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>444
aaaaagcagg ctagctcgag ccggatttta caacgcggcc                                      40
<210>445
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yurZ基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>445
gtaaataagc tgttcatatc gagaaggaat attccgaaaa acc                                  43
<210>446
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yuxN基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>446
cccgcttggg cttatgcccg cgccaaagat gcggaacagc                                      40
<210>447
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yuxN基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>447
aagaaagctg ggtactcgag gtacgatgac aacttcccgc                                      40
<210>448
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于smpB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>448
aaaaagcagg ctagctcgag ggaaatggac agctgcatcg                                      40
<210>449
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于smpB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>449
gtaaataagc tgttcatatc aaggcatagt gcttgattcg                                      40
<210>450
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yvbK基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>450
cccgcttggg cttatgcccg aaagcataaa aaagccgccg                                      40
<210>451
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yvbK基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>451
aagaaagctg ggtactcgag ggttgagctt cgtgacggcg                                      40
<210>452
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于sbo基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>452
gtaaataagc tgttcatatc tttcataatt gaatcctccc                                      40
<210>453
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ywhH基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>453
cccgcttggg cttatgcccg aaaaacatcc agacatcgtc                                      40
<210>454
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ywcB基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>454
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta atttcactga ctcccgctcc                           50
<210>455
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ywcB基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>455
gtaaataagc tgttcatatc ggctttcctc cttttattcg                                      40
<210>456
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ywaE基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>456
cccgcttggg cttatgcccg gctttgacgg gaatccagta                                      40
<210>457
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于ywaE基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>457
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta cttctgctgc tttctctccg                           50
<210>458
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于dltA基因上游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>458
ccatgggctt gcggcaccgg                                                            20
<210>459
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于dltA基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>459
gtaaataagc tgttcatatc atatgaaccg gtattcgcgg                                      40
<210>460
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于hutM基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>460
cccgcttggg cttatgcccg gcacaccccg ctcagcatgg                                      40
<210>461
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于hutM基因下游区的PCR引物的寡核苷酸
<400>461
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggcc aggatatgag tgaccgtg                             48
<210>462
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yybP基因和四环素抗性基因上游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>462
gtaaataagc tgttcatatc gaaaaagcat cccgacgcgg                                      40
<210>463
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：作为用于yyaJ基因和四环素抗性基因下游区的SOE-PCR引物的寡核苷酸
<400>463
cccgcttggg cttatgcccg aaaagtcagt gcggatctgc                                      40

Claims (6)

1.一种枯草杆菌(Bacillus subtilis)突变株，其以枯草杆菌168株作为野生株，并且具有通过使表1所示的缺失区域栏中列举的区域缺失而制备的基因组结构；当其中导入有编码蛋白酶的基因使得所述基因得以表达时，与相同基因导入所述野生株的情况相比，蛋白酶的分泌生产率显著提高；
表1
Figure FSB00000702379900021
Figure FSB00000702379900031
Figure FSB00000702379900041
2.根据权利要求1所述的枯草杆菌突变株，其选自表1所示的MGB653株、MGB683株、MGB781株、MGB723株、MGB773株、MGB822株、MGB834株、MGB846株、MGB872株、MGB885株、MGB913株、MGB860株、MGB874株、MGB887株，其中导入有编码纤维素酶的基因使得所述基因得以表达时，与相同基因导入所述野生株的情况相比，纤维素酶的分泌生产率显著提高；
3.根据权利要求1或2所述的枯草杆菌突变株，其为MGB653株，其中导入有编码淀粉酶的基因使得所述基因得以表达时，与相同基因导入所述野生株的情况相比，淀粉酶的分泌生产率显著提高；
4.根据权利要求1所述的枯草杆菌突变株，其中导入有编码蛋白酶的基因，使得所述基因得以表达。
5.根据权利要求1所述的枯草杆菌突变株，其中所述编码蛋白酶的基因含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列，或者所述基因适当地连接在含有编码对应于分泌信号的区域的核苷酸序列的DNA上游。
6.根据权利要求1所述的枯草杆菌突变株，其中表1所示的缺失区域为位于表2中的寡核苷酸组之间的区域。
Figure FSB00000702379900061
Figure FSB00000702379900071
CN200680045245XA 2005-10-13 2006-09-25 新型枯草杆菌突变株 Active CN101321866B (zh)

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