CN103305493B - 嗜热菌蛋白酶及其变体的生产和在液体洗涤剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含至少一种具有提高的贮存稳定性和/或催化活性的嗜热菌蛋白酶样中性蛋白酶的方法和组合物。在一些实施方案中，嗜热菌蛋白酶用于包括洗涤剂的清洁和其他用途。在一些特别优选实施方案中，本发明提供包含经配制和/或工程改造而抵抗洗涤剂诱导的失活的嗜热菌蛋白酶的方法和组合物。

Description

嗜热菌蛋白酶及其变体的生产和在液体洗涤剂中的用途

本申请是申请日为2008年10月28日的、发明名称为“嗜热菌蛋白酶及其变体的生产和在液体洗涤剂中的用途”的中国专利申请200880114268.0(PCT/US2008/012276)的分案申请。

发明领域

本发明提供包括至少一种具有改善的贮存稳定性和/或催化活性的嗜热菌蛋白酶样中性蛋白酶的方法和组合物。在一些实施方案中，该嗜热菌蛋白酶用于包括洗涤剂的清洁和其他应用中。在一些特别优选实施方案中，本发明提供包含嗜热菌蛋白酶的方法和组合物，其中该嗜热菌蛋白酶经配制和/或工程改造而抵抗洗涤剂诱导的失活。

发明背景

芽胞杆菌（Bacilli）是分泌许多工业上有用酶的革兰氏阳性细菌，所述酶可通过发酵廉价地大体积生产。分泌性芽胞杆菌酶的实例是枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶、含锌中性蛋白酶（zinc containing neutral proteases）、α-淀粉酶和纤维素酶。芽胞杆菌蛋白酶被广泛用于纺织、洗衣和家居工业(Galante,Current Organic Chemistry,7:1399-1422,2003;和Showell,Handbook of Detergents,Part D:Formulation,Hubbard(ed.),NY:Taylor and Francis Group,2006)。从洗涤的衣服上高效地去除污渍和颜色需要蛋白酶。然而，清洁剂和洗涤剂的液体制剂通常含有对大多数蛋白酶具有去稳定化作用的助洗剂、表面活性剂和金属螯合剂。

洗涤剂和其他清洁组合物通常包含复杂的活性成分组合。例如，大多数清洁产品包含表面活性剂系统、用于清洁的酶、漂白剂、助洗剂、抑泡剂、悬污剂、污垢释放剂（soil-release agent）、荧光增白剂、柔软剂、分散剂、染料转移抑制化合物、磨料、杀细菌剂和香料。尽管当前的洗涤剂很复杂，但仍然有许多难以完全去除的污渍。此外，通常有残留物积累，这导致由于不完全清洁而引起的褪色(例如,发黄)和减损的美感。这些问题可以因低清洗温度(例如，冷水)和较短的清洗周期的增加使用而增加。此外，许多污渍由复杂的纤维材料混合物组成，主要包括碳水化合物和碳水化合物衍生物、纤维和细胞壁成分(例如，植物材料、木材、基于泥/粘土的污物和水果)。此类污渍对清洁组合物的配制和使用提出了难以应对的挑战。

此外，有色衣服易于磨损和显示外观的丧失。这种颜色丢失有一部分是由于洗衣过程中，特别是在自动化清洗和干燥机中的磨损造成的。此外，织物的抗张强度的丧失看起来是使用、穿戴和/或清洗以及干燥中的机械和化学作用的不可避免的结果。因此，需要有效率和有效力地清洗有色衣服以最小化这些外观丧失的手段。

总而言之，尽管清洁组合物的能力已得到提高，但在本领域仍然存在需要能够去除污渍、保持织物颜色和外观以及防止染料转移的洗涤剂。此外，仍然需要可以向织物提供和/或恢复抗张强度、以及提供抗皱、抗起球（anti-bobbling）和/或防缩（anti-shrinkage）性质、以及提供静电控制（static control）、织物柔软性（fabric softness）、保持期望的颜色外观和织物抗磨损性质和益处的洗涤剂和/或织物护理组合物。尤其是，仍然需要包含能够去除常常保持附着在所洗涤织物上的污渍有色成分的组合物。此外，仍然需要适用于纺织品漂白的改进的方法和组合物。

发明概述

本发明提供包括至少一种具有提高的贮存稳定性和/或催化活性的嗜热菌蛋白酶样中性蛋白酶的方法和组合物。在一些实施方案中，该嗜热菌蛋白酶用于包括洗涤剂的清洁及其他应用中。在一些特别优选实施方案中，本发明提供包括嗜热菌蛋白酶的方法和组合物，其中该嗜热菌蛋白酶经配制和/或工程改造而抵抗洗涤剂诱导的失活。

本发明提供包含分离的嗜热菌蛋白酶和中性金属蛋白酶抑制剂的组合物，其中嗜热菌蛋白酶是地芽孢杆菌（Geobacillus）嗜热菌蛋白酶或芽孢杆菌嗜热菌蛋白酶。在一些实施方案中，本发明的组合物包含分离的嗜热菌蛋白酶和选自膦酰二肽(phosphoramidon)和galardin的中性金属蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，本发明组合物的嗜热菌蛋白酶是G.caldoproteolyticus或嗜热脂肪地芽孢杆菌(G.stearothermophilus)的嗜热菌蛋白酶，在其他实施方案中，本发明组合物的嗜热菌蛋白酶是嗜热溶蛋白芽孢杆菌(B.thermoproteolyticus)的嗜热菌蛋白酶。在一些特定的实施方案中，本发明的组合物包含嗜热菌蛋白酶，其与包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的嗜热菌蛋白酶具有至少50%(50至100%，优选至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的氨基酸同一性。在一些其他实施方案中，本发明的组合物包含含有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的嗜热菌蛋白酶。在其他实施方案中，本发明的组合物包含SEQ ID NO:3的嗜热菌蛋白酶。

此外，本发明还提供具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体。在一些优选实施方案中，嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌(Geobacillus)嗜热菌蛋白酶变体，其具有在如下位置包含一个或多个置换的氨基酸序列，所述位置选自与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4、或5个在选自与SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置的位置上的置换。在另外的实施方案中，本发明提供分离的地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有在选自与如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上包含一个或多个置换的氨基酸序列，并且具有提高的稳定性和/或性能。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个在选自与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上的置换。

在一些其他实施方案中，本发明提供嗜热菌蛋白酶变体，其包含一个或多个选自如下的置换：表7-1、表8-1和表8-2中所列的置换T006G、T006H、T006I、T006K、T006M、T006N、T006P、T006Q、T006R、T006V、T006W、T006Y、V007F、V007H、V007K、V007L、V007M、V007P、V007Q、V007R、V007T、V007Y、T049G、T049H、T049I、T049K、T049L、T049N、T049P、T049Q、T049W、A058I、A058P、A058R、F063I、F063L、F063P、S065K、S065Y、Y075G、Y075M、Y075T、Q128H、Q128I、Q128L、Q128M、Q128V、Q128Y、Y151D、Y151E、Y151H、Y151K、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151T、Y151V、Y151W、I156M、I156R、I156T、I156W、G196R、Q273I、Q273P、Q273Y、T278K、T278M、T278P、N280K、N280R、T006A、T006C、T049D、T049I、T049L、T049M、T049N、T049S、A056C、A056R、A056Y、A058S、S065C、S065E、S065I、S065T、S065V、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151D、Y151E、Y151H、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151S、Y151T、Y151V、Y151W、I156E、I156H、I156K、I156M、I156R、I156T、I156W、G196D、G196H、Q273A、Q273N、Q273T、Q273W、Q273Y、T278C、T278H、T278M、T278N、T278S、T278Y、N280E、N280I、N280L、N280M、N280S、T006C、T049D、T049N、T049Q、T049S、A056C、A056E、A058C、A058E、Q061E、Q061M、S065C、S065D、S065E、S065P、S065V、S065W、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151N、Y151S、Y151T和I156E，并且具有提高的稳定性和/或性能。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个选自如下置换的置换：置换T006G、T006H、T006I、T006K、T006M、T006N、T006P、T006Q、T006R、T006V、T006W、T006Y、V007F、V007H、V007K、V007L、V007M、V007P、V007Q、V007R、V007T、V007Y、T049G、T049H、T049I、T049K、T049L、T049N、T049P、T049Q、T049W、A058I、A058P、A058R、F063I、F063L、F063P、S065K、S065Y、Y075G、Y075M、Y075T、Q128H、Q128I、Q128L、Q128M、Q128V、Q128Y、Y151D、Y151E、Y151H、Y151K、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151T、Y151V、Y151W、I156M、I156R、I156T、I156W、G196R、Q273I、Q273P、Q273Y、T278K、T278M、T278P、N280K、N280R、T006A、T006C、T049D、T049I、T049L、T049M、T049N、T049S、A056C、A056R、A056Y、A058S、S065C、S065E、S065I、S065T、S065V、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151D、Y151E、Y151H、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151S、Y151T、Y151V、Y151W、I156E、I156H、I156K、I156M、I156R、I156T、I156W、G196D、G196H、Q273A、Q273N、Q273T、Q273W、Q273Y、T278C、T278H、T278M、T278N、T278S、T278Y、N280E、N280I、N280L、N280M、N280S、T006C、T049D、T049N、T049Q、T049S、A056C、A056E、A058C、A058E、Q061E、Q061M、S065C、S065D、S065E、S065P、S065V、S065W、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151N、Y151S、Y151T和I156E的置换（如表7-1、表8-1和表8-2中所列）。

此外，本发明提供分离的嗜热菌蛋白酶变体，其与野生型地芽胞杆菌属物种的嗜热菌蛋白酶(例如，包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的嗜热菌蛋白酶)相比具有提高的稳定性和/或性能。在一些实施方案中，本发明提供改善的分离的嗜热菌蛋白酶变体，所述改善包括如下之一或多个：提高的热稳定性、在较低或较高pH条件下改善的性能、和提高的自溶稳定性。

在一些实施方案中，本发明提供用编码嗜热菌蛋白酶变体的多核苷酸转化的芽胞杆菌宿主细胞，所述嗜热菌蛋白酶变体具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列50至99%(至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的氨基酸同一性。

本发明还提供用于产生具有嗜热菌蛋白酶活性的酶的方法，该方法包括：i)用包含编码嗜热菌蛋白酶变体的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，所述嗜热菌蛋白酶变体具有与包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的嗜热菌蛋白酶50至99%的同一性(至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸同一性)，和ii)在适于产生该嗜热菌蛋白酶的条件下培养转化的宿主细胞。任选地，本发明的方法还包括收获产生的嗜热菌蛋白酶。在一些实施方案中，本发明提供用于产生具有嗜热菌蛋白酶活性的酶的方法，该方法包括:i)用包含编码嗜热菌蛋白酶变体的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，所述嗜热菌蛋白酶变体具有与包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的嗜热菌蛋白酶至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸同一性，和ii)在适于产生该嗜热菌蛋白酶的条件下培养转化的宿主细胞。任选地，该方法还包括收获产生的嗜热菌蛋白酶的步骤。在一些其他实施方案中，本发明提供用于产生具有嗜热菌蛋白酶活性的酶的方法，其包括:i)用包含编码嗜热菌蛋白酶变体的多核苷酸的表达载体转化芽胞杆菌属物种（例如，枯草芽胞杆菌(B subtilis)）宿主细胞，所述嗜热菌蛋白酶变体具有与包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的嗜热菌蛋白酶50至99%的同一性(至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸同一性)，和ii)在适于产生该嗜热菌蛋白酶的条件下培养转化的宿主细胞。任选地，该方法还包括收获产生的嗜热菌蛋白酶的步骤。

在一些实施方案中，本发明提供包含至少一种获自本发明的重组芽胞杆菌宿主细胞的嗜热菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施方案中，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该组合物还包含至少一种钙离子和/或锌离子。在一些备选实施方案中，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该组合物还包含至少一种稳定剂。在这些实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定该嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。备选地，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该组合物包含至少一种钙离子和/或锌离子以及至少一种稳定剂。可将上述任一种稳定剂与该至少一种钙离子和/或锌离子组合以提供包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该组合物。在这些实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些其他实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。

在其他实施方案中，本发明提供包含至少一种获自本发明的重组芽胞杆菌宿主细胞的嗜热菌蛋白酶变体和至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶(cutinase)、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的其它酶或酶衍生物的组合物。在一些实施方案中，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体和至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的其它酶或酶衍生物的组合物，还包含至少一种稳定剂。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。备选地，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该组合物包含至少一种钙离子和/或锌离子以及至少一种稳定剂。可将上述任一种稳定剂与该至少一种钙离子和/或锌离子组合以提供包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该组合物。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些其他实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。

在一些实施方案中,本发明提供包含至少一种获自本发明的重组芽胞杆菌宿主细胞的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物。在一些实施方案中，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该清洁组合物还包含至少一种钙离子和/或锌离子。在一些备选实施方案中，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该清洁组合物还包含至少一种稳定剂。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。备选地，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该清洁组合物包含至少一种钙离子和/或锌离子与至少一种稳定剂。可将上述任一种稳定剂与该至少一种钙离子和/或锌离子组合以提供包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该组合物。在一些实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。

在其他实施方案中，本发明提供包含至少一种获自本发明的重组芽胞杆菌宿主细胞的嗜热菌蛋白酶变体和至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的其它酶或酶衍生物的清洁组合物。在一些实施方案中，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体和至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的其它酶或酶衍生物的清洁组合物还包含至少一种稳定剂。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。备选地，包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该清洁组合物包含至少一种钙离子和/或锌离子以及至少一种稳定剂。可将上述任一种稳定剂与该至少一种钙离子和/或锌离子组合以提供包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的组合物。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些其他实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。

在一些实施方案中，本发明提供包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施方案中，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的组合物还包含至少一种钙离子和/或锌离子。在一些备选实施方案中，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的组合物还包含至少一种稳定剂。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。备选地，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的组合物包含至少一种钙离子和/或离子以及至少一种稳定剂。可将上述任一种稳定剂与至少一种钙离子和/或锌离子组合以提供包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的该组合物。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些其他实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。在一些实施方案中，具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置的位置上包含一个或多个置换的氨基酸序列。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置的位置上的置换。在另外的实施方案中，本发明提供分离的地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，所述变体具有在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上包含一个或多个置换的氨基酸序列，并且具有提高的稳定性和/或性能。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上的置换。在一些其他实施方案中，具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体包括一个或多个选自如下的置换：如表7-1、表8-1和表8-2中所列的置换T006G、T006H、T006I、T006K、T006M、T006N、T006P、T006Q、T006R、T006V、T006W、T006Y、V007F、V007H、V007K、V007L、V007M、V007P、V007Q、V007R、V007T、V007Y、T049G、T049H、T049I、T049K、T049L、T049N、T049P、T049Q、T049W、A058I、A058P、A058R、F063I、F063L、F063P、S065K、S065Y、Y075G、Y075M、Y075T、Q128H、Q128I、Q128L、Q128M、Q128V、Q128Y、Y151D、Y151E、Y151H、Y151K、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151T、Y151V、Y151W、I156M、I156R、I156T、I156W、G196R、Q273I、Q273P、Q273Y、T278K、T278M、T278P、N280K、N280R、T006A、T006C、T049D、T049I、T049L、T049M、T049N、T049S、A056C、A056R、A056Y、A058S、S065C、S065E、S065I、S065T、S065V、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151D、Y151E、Y151H、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151S、Y151T、Y151V、Y151W、I156E、I156H、I156K、I156M、I156R、I156T、I156W、G196D、G196H、Q273A、Q273N、Q273T、Q273W、Q273Y、T278C、T278H、T278M、T278N、T278S、T278Y、N280E、N280I、N280L、N280M、N280S、T006C、T049D、T049N、T049Q、T049S、A056C、A056E、A058C、A058E、Q061E、Q061M、S065C、S065D、S065E、S065P、S065V、S065W、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151N、Y151S、Y151T和I156E。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括选1、2、3、4或5个选自如下的置换：如表7-1、表8-1和表8-2中所列的置换T006G、T006H、T006I、T006K、T006M、T006N、T006P、T006Q、T006R、T006V、T006W、T006Y、V007F、V007H、V007K、V007L、V007M、V007P、V007Q、V007R、V007T、V007Y、T049G、T049H、T049I、T049K、T049L、T049N、T049P、T049Q、T049W、A058I、A058P、A058R、F063I、F063L、F063P、S065K、S065Y、Y075G、Y075M、Y075T、Q128H、Q128I、Q128L、Q128M、Q128V、Q128Y、Y151D、Y151E、Y151H、Y151K、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151T、Y151V、Y151W、I156M、I156R、I156T、I156W、G196R、Q273I、Q273P、Q273Y、T278K、T278M、T278P、N280K、N280R、T006A、T006C、T049D、T049I、T049L、T049M、T049N、T049S、A056C、A056R、A056Y、A058S、S065C、S065E、S065I、S065T、S065V、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151D、Y151E、Y151H、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151S、Y151T、Y151V、Y151W、I156E、I156H、I156K、I156M、I156R、I156T、I156W、G196D、G196H、Q273A、Q273N、Q273T、Q273W、Q273Y、T278C、T278H、T278M、T278N、T278S、T278Y、N280E、N280I、N280L、N280M、N280S、T006C、T049D、T049N、T049Q、T049S、A056C、A056E、A058C、A058E、Q061E、Q061M、S065C、S065D、S065E、S065P、S065V、S065W、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151N、Y151S、Y151T和I156E的置换。

在其他实施方案中，本发明提供包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体和至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的其它酶或酶衍生物的组合物。在一些实施方案中，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体和至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的其它酶或酶衍生物的组合物还包含至少一种稳定剂。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。备选地，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的组合物包含至少一种钙离子和/或锌离子以及至少一种稳定剂。可将上述任一种稳定剂与至少一种钙离子和/或锌离子组合以提供包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的组合物。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些其它实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。在一些实施方案中，具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置的位置上包含一或多个置换的氨基酸序列。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置的位置上的置换。在其它实施方案中，本发明提供分离的地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上包含一个或多个置换的氨基酸序列，并且具有提高的稳定性和/或性能。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上的置换。在一些其他实施方案中，具有提高的稳定性/或性能的嗜热菌蛋白酶变体包含一个或多个选自如下的置换：如表7-1、表8-1和表8-2中所列的置换T006G、T006H、T006I、T006K、T006M、TOO6N,TOO6P,TOO6Q,TOO6R,TOO6V,TOO6W,TOO6Y,VOO7F,VOO7H,VOO7K,VOO7L,VOO7M,VOO7P,VoO7Q,VOO7R,VOO7T,VOO7Y,TO49G,TO49H,TO49I,TO49K,To49LlTO49N,TO49P,TO49Q,TO49W,AO58I,AO58P,AOS8R,FO63I,FO63L,FO63P,SO65K,SO65Y,YO75G,YO7SM,YO75T,Q128H,Q128I@Q128L,Q128M,Q128V,Q128Y,YISID,Y15IE,Y15IH,YlSIK,Y15IM,Y15IM,Y15IQ,YISIR,YISIT,YISIV,Y15IW,II56M,I156R,l156T,I156W,G196R,Q273I,Q273P,Q273Y,T278K,T278M,T278P,N280K,N280R,TOO6A,TOO6C,TO49D,TO49I,TO49L,TO49M,TO49N,TO495,AOS6C,AO56R,AOS6Y,ADS85,SO65C,SO6SE,5065I,SO6ST,SO6SV,5065Y,Q128C,Q128I@Q128M,Q128T,Q128V,Q128Y,Y15lA,Y15IC,YlSID,YI51E,Y15lH,Y15lM,Y15lN,YlSlQ,Y15lR,Y151S,Y15lT,Y15lV,Y151W,IlS6E,1156H,IlS6K,I156M,II56R,I156T,I156W,G196D,G196H,Q273A,Q273N,Q273T,Q273W,Q273Y,T278C,T278H,T278M,T278N,T2785,T278Y,N280E,N280I,NZ80L,N280M,N2805,TOO6C,TO49D,TO49N,TO49Q,TO495,AOS6C,AO56E,AO58C,ADS8E,QO6IE,QO6IM,SO6SC,SO65D,SO6SE,SO65P,SO65V,SO6SW,SO6SY,QI28C,Q128T,Q128M,Q128T,Q128VIQ128Y,Y151A,YISIC,Yl5IN,Y151S、Y151T和I156E。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个选自如下的置换：如表7-1、表8-1和表8-2中所列的置换T006G、T006H、T006I、T006K、T006M、T006N、T006P、TOO6Q,TOO6R,TOO6V,TOO6W,TOO6Y,VOO7F,VOO7H,VOO7K,VOO7L,VOO7M,VOO7P,VOO7Q,VOO7R,VOO7T,VOO7Y,TO49G,TO49H,TO49I,TO49K,TO49L,TO49N,TO49P,TO49Q,TO49W,AOS8I,AO58P,AO58R,FO63I,FO63L,FO63P,SO65K,SO65Y,YO7SG,YO75M,YO75T,Q128H,Q128I,Q128L,Q128M,QI28V,QI28Y@YISID,Y151E,Y15lH,YIS1X,Y15IM,Y15IN,Y15IQ,YISIR,Y151T,Y15lV,YISIW,IlS6M,II56R,IlS6T,I156W,GI96R,Q273t,Q273P,Q273Y,T278K,T27SM,T278P,N280K,N280R,TOO6A,TOO6C,TO49D,TO49I,TO49L,TO49M,TO49N,TO495,AO56C,AO56R,AOS6Y,AOS85,SO65C,SO65E,5065I1SO6ST,SO65V,SO6SY,Q128C,Q128I,Q128M,Q128T,Q128V,Q128Y,YISIA,Y151C,YISID,Y15lE,YISIH,Y15lM,YISIN,Y151Q,Y1SIR,YISIS,YlSIT,Y15IV,Yl51W,I156E,11S6H,IIS6K,I156M,I156R,I156T,II56W,GI96D,GI96H,Q273A,Q273N,Q273T,Q273W,Q273Y,T278C,T278H,T278M,T278N,T2785,T27gY,N280E,N280I,Nt80L,N280M,N2805,TOO6C,TO49D,TO49N,TO49Q,TO495,AO56C,AO56E,AO58C,AOS8E,QO6IE,QO61M,SO6SC,SO65D,SO65E,SO65P,SO6SV,SO6SW,SO65Y,Q128C,Q128I,Q128M,Q128T,Q128V,QI28Y,YISIA,YISIC,YISIN,Y1515,Y151T和I156E。

在一些实施方案中，本发明提供包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物。在一些实施方案中，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物还包含至少一种钙离子和/或锌离子。在一些备选实施方案中，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物还包含至少一种稳定剂。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。备选地，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物包含至少一种钙离子和/或锌离子以及至少一种稳定剂。可将上述任一种稳定剂与至少一种钙离子和/或锌离子组合以提供包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的组合物。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些其他实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。在一些实施方案中，清洁组合物中包含的具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有在选自与SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置的位置上包含一个或多个置换的氨基酸序列。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置的位置上的置换。在其它实施方案中，清洁组合物中包含的具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上包含一个或多个置换的氨基酸序列，并且具有提高的稳定性和/或性能。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上的置换。在一些其他实施方案中，清洁组合物中包含的具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有包含一个或多个选自如下的置换的氨基酸序列：如表7-1、表8-1和表8-2中所列的置换T006G、T006H、T006I、T006K、T006M、T006N、T006P、T006Q、T006R、T006V、T006W、T006Y、V007F、V007H、V007K、V007L、V007M、V007P、V007Q、V007R、V007T、V007Y、T049G、T049H、T049I、T049K、T049L、T049N、T049P、T049Q、T049W、A058I、A058P、A058R、F063I、F063L、F063P、S065K、S065Y、Y075G、Y075M、Y075T、Q128H、Q128I、Q128L、Q128M、Q128V、Q128Y、Y151D、Y151E、Y151H、Y151K、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151T、Y151V、Y151W、I156M、I156R、I156T、I156W、G196R、Q273I、Q273P、Q273Y、T278K、T278M、T278P、N280K、N280R、T006A、T006C、T049D、T049I、T049L、T049M、T049N、T049S、A056C、A056R、A056Y、A058S、S065C、S065E、S065I、S065T、S065V、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151D、Y151E、Y151H、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151S、Y151T、Y151V、Y151W、I156E、I156H、I156K、I156M、I156R、I156T、I156W、G196D、G196H、Q273A、Q273N、Q273T、Q273W、Q273Y、T278C、T278H、T278M、T278N、T278S、T278Y、N280E、N280I、N280L、N280M、N280S、T006C、T049D、T049N、T049Q、T049S、A056C、A056E、A058C、A058E、Q061E、Q061M、S065C、S065D、S065E、S065P、S065V、S065W、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151N、Y151S、Y151T和I156E。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个选自如下的置换：如表7-1、表8-1和表8-2中所列的置换T006G、T006H、T006I、T006K、T006M、T006N、T006P、T006Q、T006R、T006V、T006W、T006Y、V007F、V007H、V007K、V007L、V007M、V007P、V007Q、V007R、V007T、V007Y、T049G、T049H、T049I、T049K、T049L、T049N、T049P、T049Q、T049W、A058I、A058P、A058R、F063I、F063L、F063P、S065K、S065Y、Y075G、Y075M、Y075T、Q128H、Q128I、Q128L、Q128M、Q128V、Q128Y、Y151D、Y151E、Y151H、Y151K、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151T、Y151V、Y151W、I156M、I156R、I156T、I156W、G196R、Q273I、Q273P、Q273Y、T278K、T278M、T278P、N280K、N280R、T006A、T006C、T049D、T049I、T049L、T049M、T049N、T049S、A056C、A056R、A056Y、A058S、S065C、S065E、S065I、S065T、S065V、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151D、Y151E、Y151H、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151S、Y151T、Y151V、Y151W、I156E、I156H、I156K、I156M、I156R、I156T、I156W、G196D、G196H、Q273A、Q273N、Q273T、Q273W、Q273Y、T278C、T278H、T278M、T278N、T278S、T278Y、N280E、N280I、N280L、N280M、N280S、T006C、T049D、T049N、T049Q、T049S、A056C、A056E、A058C、A058E、Q061E、Q061M、S065C、S065D、S065E、S065P、S065V、S065W、S065Y、Q128C、Q128I、Q128M、Q128T、Q128V、Q128Y、Y151A、Y151C、Y151N、Y151S、Y151T和I156E。

在其他实施方案中，本发明提供包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体和至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的其它酶或酶衍生物的清洁组合物。在一些实施方案中，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体和至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的其它酶或酶衍生物的清洁组合物，还包含至少一种稳定剂。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。备选地，包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物包含至少一种钙离子和/或锌离子以及至少一种稳定剂。可将上述任一种稳定剂与至少一种钙离子和/或锌离子组合以提供包含至少一种嗜热菌蛋白酶变体的组合物。在此类实施方案的一个亚组中，稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。在一些其他实施方案中，稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。在一些实施方案中，清洁组合物中包含的并且具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置的位置上包含一个或多个置换的氨基酸序列。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个在选自与SEQID NO:3所示的氨基酸序列的位置6、7、49、56、58、61、63、65、75、128、151、156、196、273、278和280等同的位置的位置上的置换。在其它实施方案中，清洁组合物中包含的并且具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上包含一个或多个置换的氨基酸序列，并且具有提高的稳定性和/或性能。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个在选自与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的位置4、6、7、36、49、53、56、58、61、63、65、75、85、108、128、129、151、156、194、195、196、261、265、273、278、280和297等同的位置的位置上的置换。在一些其他实施方案中，清洁组合物中包含的并且具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，其具有包含一个或多个选自如下的置换的氨基酸序列：如表7-1、表8-1和表8-2中所列的置换T006G,T006H,T006I,T006K,T006M,T006N,T006P,T006Q,T006R,T006V,T006W,T006Y,V007F,V007H,V007K,V007L,V007M,V007P,V007Q,V007R,V007T,V007Y,T049G,T049H,T049I,T049K,T049L,T049N,T049P,T049Q,T049W,A058I,A058P,A058R,F063I,F063L,F063P,S065K,S065Y,Y075G,Y075M,Y075T,Q128H,Q128I,Q128L,Q128M,Q128V,Q128Y,Y151D,Y151E,Y151H,Y151K,Y151M,Y151N,Y151Q,Y151R,Y151T,Y151V,Y151W,I156M,I156R,I156T,I156W,G196R,Q273I,Q273P,Q273Y,T278K,T278M,T278P,N280K,N280R,T006A,T006C,T049D,T049I,T049L,T049M,T049N,T049S,A056C,A056R,A056Y,A058S,S065C,S065E,S065I,S065T,S065V,S065Y,Q128C,Q128I,Q128M,Q128T,Q128V,Q128Y,Y151A,Y151C,Y151D,Y151E,Y151H,Y151M,Y151N,Y151Q,Y151R,Y151S,Y151T,Y151V,Y151W,I156E,I156H,I156K,I156M,I156R,I156T,I156W,G196D,G196H,Q273A,Q273N,Q273T,Q273W,Q273Y,T278C,T278H,T278M,T278N,T278S,T278Y,N280E,N280I,N280L,N280M,N280S,T006C,T049D,T049N,T049Q,T049S,A056C,A056E,A058C,A058E,Q061E,Q061M,S065C,S065D,S065E,S065P,S065V,S065W,S065Y,Q128C,Q128I,Q128M,Q128T,Q128V,Q128Y,Y151A,Y151C,Y151N,Y151S,Y151T和I156E。在此类实施方案的一个亚组中，该一个或多个置换包括1、2、3、4或5个选自如下的置换：如表7-1、表8-1和表8-2中所列的置换T006G,T006H,T006I,T006K,T006M,T006N,T006P,T006Q,T006R,T006V,T006W,T006Y,V007F,V007H,V007K,V007L,V007M,V007P,V007Q,V007R,V007T,V007Y,T049G,T049H,T049I,T049K,T049L,T049N,T049P,T049Q,T049W,A058I,A058P,A058R,F063I,F063L,F063P,S065K,S065Y,Y075G,Y075M,Y075T,Q128H,Q128I,Q128L,Q128M,Q128V,Q128Y,Y151D,Y151E,Y151H,Y151K,Y151M,Y151N,Y151Q,Y151R,Y151T,Y151V,Y151W,I156M,I156R,I156T,I156W,G196R,Q273I,Q273P,Q273Y,T278K,T278M,T278P,N280K,N280R,T006A,T006C,T049D,T049I,T049L,T049M,T049N,T049S,A056C,A056R,A056Y,A058S,S065C,S065E,S065I,S065T,S065V,S065Y,Q128C,Q128I,Q128M,Q128T,Q128V,Q128Y,Y151A,Y151C,Y151D,Y151E,Y151H,Y151M,Y151N,Y151Q,Y151R,Y151S,Y151T,Y151V,Y151W,I156E,I156H,I156K,I156M,I156R,I156T,I156W,G196D,G196H,Q273A,Q273N,Q273T,Q273W,Q273Y,T278C,T278H,T278M,T278N,T278S,T278Y,N280E,N280I,N280L,N280M,N280S,T006C,T049D,T049N,T049Q,T049S,A056C,A056E,A058C,A058E,Q061E,Q061M,S065C,S065D,S065E,S065P,S065V,S065W,S065Y,Q128C,Q128I,Q128M,Q128T,Q128V,Q128Y,Y151A,Y151C,Y151N,Y151S,Y151T和I156E。

在一些实施方案中,本文中所述的任一种包含具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物是洗涤剂。在一些实施方案中，组合物是洗涤剂组合物。在其他实施方案中，组合物是液体。

在一些实施方案中，本发明提供包含具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体的组合物，例如清洁组合物，其包含至少大约0.0001重量百分比的嗜热菌蛋白酶变体；或大约0.001至大约0.5重量百分比的相同嗜热菌蛋白酶变体。任选地，包含具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体的本发明组合物，例如清洁组合物，还包含至少一种辅助成分（adjunct ingredient）。备选地，在一些其他实施方案中，组合物例如清洁组合物还包含足够量的pH调整剂以提供具有大约3至大约5的净pH的组合物，所述组合物基本上不含有在大约pH3至大约pH5的pH水解的物质。在一些实施方案中，在大约pH3至大约pH5的pH水解的物质包括至少一种表面活性剂。在一些优选实施方案中，表面活性剂是包含环氧乙烷部分的烷基硫酸钠表面活性剂。在一些实施方案中，包含具有提高的稳定性和/或性能的嗜热菌蛋白酶变体的组合物，例如清洁组合物，是洗涤剂。

此外，本发明提供包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的动物饲料组合物。在其它实施方案中，提供包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的纺织品加工组合物。在其它实施方案中，提供包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的皮革加工组合物。

此外，本发明提供清洁方法，其包括将包含织物的表面和/或物品与包含具有提高的稳定性和/或性能的分离的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物接触的步骤。在一些实施方案中，清洁方法还包括在将表面或物质与清洁组合物接触后漂洗该表面和/或物质的步骤。

附图简述

图1提供Geobacillus caldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶样中性金属蛋白酶(在本文中也称为嗜热菌蛋白酶、蛋白酶-T或PrT)的成熟形式的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。

图2提供pHPLT质粒的图谱。

图3提供pHPLT-嗜热菌蛋白酶表达载体的图谱。.

图4A-B提供pHPLT-嗜热菌蛋白酶表达载体的核酸序列(SEQ ID NO:8)。

图5提供比较在室温于Unilever ALL Small and Mighty3X洗涤剂中温育后嗜热菌蛋白酶与NprE的蛋白酶活性的图。

图6提供比较在室温于Proctor&GambleFresh Breeze1X洗涤剂中温育后嗜热菌蛋白酶与NprE的蛋白酶活性的图。

图7提供比较在室温于Proctor&GambleFresh Breeze2X洗涤剂中温育后嗜热菌蛋白酶与NprE的蛋白酶活性的图。

图8显示在已知的金属蛋白酶抑制剂存在和不存在的情况下在Unilever ALLsmall and mighty洗涤剂中进行延长的温育后，对嗜热菌蛋白酶稳定性的SDS-PAGE分析。

图9提供嗜热菌蛋白酶(T)与NprE的氨基酸序列的比对。嗜热菌蛋白酶序列如SEQID NO:3所示，而NprE序列如SEQ ID NO:9所示。

本发明的一般性描述

本发明提供包含至少一种具有提高的贮存稳定性和/或催化活性的嗜热菌蛋白酶样中性蛋白酶的方法和组合物。在一些实施方案中，嗜热菌蛋白酶用于包括洗涤剂的清洁和其他应用。在一些特别优选实施方案中，本发明提供包括嗜热菌蛋白酶的方法和组合物，该嗜热菌蛋白酶经配制和/或工程改造而抗洗涤剂诱导的失活。

除非另外指出，否则本发明的实施涉及通常用于分子生物学、微生物学和重组DNA的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力之内。这些技术对于本领域技术人员来说是已知的，并且描述于许多教科书和参考文献(参见例如，Sambrook等人,"MolecularCloning:A Laboratory Manual,"第2版,Cold Spring Harbor,1989;和Ausubel等人,"Current Protocols in Molecular Biology,"1987)中。本文中（上文和下文中）提及的所有专利、专利申请、论文和出版物明确地通过引用合并入本文。

除非在本文中另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。例如，Singleton和Sainsbury,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第2版,John Wiley and Sons,NY(1994);以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般词典。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实施，但优选方法和材料描述于本文中。因此，通过整体上参考说明书，可更全面地描述下面即刻定义的术语。

同样地，如本文中所用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数所指物。数字范围包括界定范围的数字。除非另外指出，否则分别地，核酸以5'至3'方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。应理解，本发明不限定于描述的特定的方法学、方案和试剂，因为取决于本领域技术人员使用它们的环境，这些都可变化。

此外，本文中提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，这些方面和实施方案可以通过参照说明书整体来确定。因此，下面紧接着定义的术语将通过在整体上参考说明书获得更全面的定义。然而，为了帮助理解本发明，下面定义许多术语。

定义

除非本文中另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可用于本发明的实施，但本文中描述了优选方法和材料。因此，下面紧接着定义的术语将通过参考说明书整体获得更全面的描述。同样，如本文中所使用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数所指物。除非另外指出，否则分别地，核酸以5'至3'方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。应理解，本发明不限定于描述的特定的方法学、方案和试剂，因为取决于本领域技术人员使用它们的环境，这些都可变化。

在整个本说明书中给出的每一个最大数值界限都包括每一个较小的数值界限，就好象这样较小数值界限已经明确地在本文中写出一样。在整个本说明书中给出的每一个最小数值界限都包括每一个较大的数值界限，就好象这样的较大数值界限已经明确地在本文中写出一样。在整个本说明书中给出的每一个数值范围都包括落在该较大数值范围内的每一个较窄的数值范围，就好象这样的较窄数值范围全都明确地在本文中写出一样。

引用的所有文献在相关部分中通过引用合并入本文；任何文献的引用不被解释为承认其是本发明的现有技术。

如本文中所使用的，术语“蛋白酶”和“蛋白水解活性”是指蛋白质和肽展示水解肽或具有肽键的底物的能力。存在许多用于测量蛋白水解活性的熟知方法(Kalisz,"Microbial Proteinases,"In:Fiechter(ed.),Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,1988)。例如，可通过比较测定法（其分析相应蛋白酶水解商业底物的能力），确定蛋白水解活性。用于此类蛋白酶或蛋白水解活性分析的示例性底物包括，但不限于，二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白（Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical902111)。使用此类底物的比色测定法在本领域内是熟知的(参见例如,WO99/34011;和美国专利6,376,450,两者通过引用合并入本文)。pNA测定法(参见例如,Del Mar等人,Anal Biochem,99:316-320,1979)也可以用于测定在梯度洗脱过程中收集的级分的活性酶浓度。该测定法测量当酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基苯胺(sAAPF-pNA)时对-硝基苯胺释放的速率。在分光光度计上于410nm处测量从水解反应产生黄色的速率，其与活性酶浓度成比例。此外，可使用在280nm处的吸光度测量来确定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白比率给出酶的纯度。

如本文中所使用的，术语“NprE蛋白酶”和“NprE”是指本文中描述的中性金属蛋白酶。在一些优选实施方案中，NprE蛋白酶是在本文中称为纯化的Neutral或PMN的、获自解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶。因此，在一些实施方案中，术语“PMN蛋白酶”是指来源于解淀粉芽胞杆菌的、天然发生的成熟蛋白酶。在备选实施方案中，本发明提供NprE蛋白酶的部分。

术语“芽胞杆菌蛋白酶同源物”是指与来源于嗜热溶蛋白芽孢杆菌嗜热菌蛋白酶的成熟蛋白酶具有基本上相同的氨基酸序列的天然蛋白酶、或者编码此类天然蛋白酶的多核苷酸序列，其中由此核酸编码的蛋白酶保持中性金属蛋白酶的功能特征。

如本文中所使用的，术语“嗜热菌蛋白酶变体”用于指与野生型嗜热菌蛋白酶相似，特别地在功能上相似，但在氨基酸序列上具有突变从而在序列上与该野生型蛋白酶不同的蛋白酶。

如本文所使用的，“芽孢杆菌属”包括在“芽孢杆菌属”内的所有物种，如本领域技术人员已知的，包括但不限于，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、迟缓芽孢杆菌（B.lentus）、短芽孢杆菌（B.brevis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）、嗜碱芽孢杆菌（B.alkalophilus）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、克劳氏芽孢杆菌（B.clausii）、耐盐嗜碱芽孢杆菌（B.halodurans）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、凝结芽孢杆菌（B.coagulans）、环状芽孢杆菌（B.circulans）、灿烂芽孢杆菌（B.lautus）、和苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）。应认识到芽孢杆菌属持续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重分类的物种，包括但不限于诸如现命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）”的嗜热脂肪芽孢杆菌的生物。在氧存在下产生抗性内生孢子被视为芽孢杆菌属的定义特征，尽管这个特征也应用于近期命名的脂环酸芽孢杆菌属（Alicyclobacillus）、兼性芽孢杆菌属（Amphibacillus）、硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus）、厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、Filobacillus、Gracilibacillus、嗜盐芽孢杆菌属（Halobacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、Salibacillus、耐热芽孢杆菌属（Thermobacillus）、脲芽孢杆菌属（Ureibacillus）、和枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）。

相关(和衍生)蛋白质包括“变体蛋白质”。在一些优选实施方案中，变体蛋白质与亲本蛋白质之间以及彼此之间相异少数氨基酸残基。相异的氨基酸残基的数目可以是1个或多个，优选1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。在一些优选实施方案中，变体之间不同的氨基酸的数目是1至10个。在一些特别优选实施方案中，相关蛋白质，且尤其是变体蛋白质，包含至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。此外，如本文中所使用的相关蛋白质或变体蛋白质还指，与另一个相关蛋白质或亲本蛋白质在主要区域（prominent region）的数目上不同的蛋白质。例如，在一些实施方案中，变体蛋白质具有与亲本蛋白质不同的1、2、3、4、5或10个相应的主要区域。

在本领域已知数个适用于产生本发明酶的变体的方法，包括但不限于位置饱和诱变（site-saturation mutagenesis）、扫描诱变（scanning mutagenesis）、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化（directed-evolution）以及各种其他重组方法。

可以通过任何合适的方法或“检测”来表征野生型蛋白和突变蛋白，并且优选基于对目的特性的评估来进行。例如，在本发明的一些实施方案中测定pH和/或温度以及洗涤剂和/或氧化稳定性。事实上，预期可使用在一个或多个此类特征(pH、温度、蛋白水解稳定性、洗涤剂稳定性和/或氧化稳定性)上具有不同程度的稳定性的酶。

在本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸（核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸）聚合物形式。这些术语包括但不限于单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体、或包含嘌呤和嘧碇碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。下列是多核苷酸的非限定性实例：基因、基因片段、染色体片段、EST、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。在一些实施方案中，多核苷酸包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸、和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团例如氟代核糖和硫酯、以及核苷酸分支。在备选实施方案中，核苷酸的序列被非核苷酸组分中断。

如本文中所使用的，术语“DNA构建体”和“转化DNA”可互换使用，意指用于将序列导入宿主细胞或生物体的DNA。该DNA可通过PCR或本领域已知的任何其他合适的技术体外产生。在特别优选实施方案中，DNA构建体包含目的序列（例如，进入序列（incomingsequence）)。在一些实施方案中，序列有效地连接至其它元件例如控制元件（例如，启动子等）上。DNA构建体还可包含选择标记。其还可包含侧接同源盒的进入序列。在其它实施方案中，转化DNA包含添加至末端的非同源序列（例如，填充序列或侧翼序列）。在一些实施方案中，进入序列的末端被封闭以致转化DNA形成封闭的环。转化序列可以是野生型的、突变的或经修饰的。在一些实施方案中，DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施方案中，DNA构建体包含非同源序列。一旦在体外装配DNA构建体后，其可以用于：1)将异源序列插入宿主细胞的期望靶序列中，和/或2)诱变宿主染色体的区域(即，用异源序列替换内源序列)，3)缺失靶基因；和/或将复制型质粒导入宿主。

如本文中所使用的，术语“表达盒”和“表达载体”是指重组或合成产生的具有一系列指定的核酸元件的核酸构建体，所述核酸元件允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包含待转录的核酸序列和启动子以及其他序列。在优选实施方案中，表达载体具有将异源DNA片段掺入宿主细胞中和在宿主细胞中表达异源DNA片段的能力。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围之内。术语“表达盒”在本文中可与“DNA构建体”和它们的语法等同体互换使用。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围之内。

如本文中所使用的，术语“载体”是指设计用于将核酸导入一个或多个细胞类型的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。在一些实施方案中，多核苷酸构建物包含编码蛋白酶（例如，前体或成熟蛋白酶）的DNA序列，所述DNA序列与能够在合适的宿主中实现该DNA的表达的合适前序列（prosequence）(例如，分泌性，等)有效连接。

如本文中所使用的，术语“质粒”是指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，其在一些真核或原核生物中形成染色体外自我复制的遗传元件，或整合入宿主染色体。

在本文中，当在将核酸序列导入细胞的上下文中使用时，术语“导入”是指，适用于将核酸序列转移入细胞的任何方法。用于导入的此类方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导(参见例如,Ferrari等人,“Genetics,”in Hardwood等人,(eds.),Bacillus,Plenum Publishing Corp.,pages57-72,1989)。

本文中，术语“转化”和“稳定转化”是指细胞具有整合入其基因组中或作为附加型质粒的非天生（异源）多核苷酸序列，该多核苷酸序列在所述细胞中保持至少两代。

如本文中所使用的，术语“编码选择标记的核苷酸序列”是指，该核苷酸序列能够在宿主细胞中表达，并且该选择标记的表达赋予包含该表达的基因的细胞在相应选择剂存在的情况下或在缺乏必需营养物的情况下生长的能力。

如本文中所使用的，术语“选择标记”和“选择性标记”是指能够在宿主细胞中表达的核酸（例如，基因），其允许容易地选择包含载体的那些宿主。此类选择标记的实例包括但不限于抗微生物剂。因此，术语“选择标记”是指，用于指示宿主细胞已摄入目的进入DNA或一些其他反应已发生的基因。通常，选择标记是赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势以允许在转化过程中将含有该外源DNA的细胞与未接受任何外源序列的细胞区别开来的基因。“驻留选择标记（residing selectable marker）”是位于待转化的微生物的染色体上的选择标记。驻留选择标记编码与转化DNA构建体上的选择标记不同的基因。选择标记对于本领域技术人员来说是熟知的。如上文中所指出的，优选，该标记是抗微生物抗性标记(例如，amp^R、phleo^R、spec^R、kan^R、ery^R、tet^R、cmp^R和neo^R(参见例如，Guerot-Fleury,Gene,167:335–337,1995;Palmeros等人,Gene247:255-264,2000;和Trieu-Cuot等人,Gene,23:331-341,1983)。根据本发明的有用的其他标记包括但不限于营养缺陷型标记，例如色氨酸；和检测标记，例如β-半乳糖苷酶。

如本文中所使用的，术语“启动子”是指用于指导下游基因转录的核酸序列。在优选实施方案中，启动子对于将要表达靶基因的宿主细胞是合适的。启动子，其他转录和翻译调控核酸序列（也称为“控制序列”）一起，是表达给定基因所必需的。一般说来，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位置、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活因子序列。

当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，该核酸是“有效连接的”。例如，如果编码分泌前导序列（即，信号肽）的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与编码该多肽的DNA有效连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该编码序列有效连接；或如果核糖体结合位置被放置在利于翻译的位置上时，则其与编码序列有效连接。通常，“有效连接”意味着，处于连接的DNA序列是邻接的，并且在分沁前导序列的情况下，不仅邻接而且在阅读相中。然而，增强子不必是邻接的。连接可以通过在方便的限制性位点进行连接来实现。如果这样的位点不存在，可以根据常规操作使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

如本文中所使用的，术语“基因”是指编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域以及位于编码区段（外显子）之间的间插序列（内含子）的多核苷酸（例如，DNA区段）。

如本文中所使用的，“同源基因”是指来自不同的但通常相关的物种的一对基因，其彼此相应并且彼此相同或非常相似。该术语包括通过物种形成（即，新物种的发生）而分离的基因（例如，直系同源基因）以及通过基因复制已经分离的基因（例如，旁系同源基因）。

如本文中所使用的，“直系同源物”和“直系同源基因”是指不同物种中通过物种形成从共同祖先基因（即，同源基因）进化而来的基因。通常，直系同源物在进化过程中保持相同功能。直系同源物的鉴定可以用于在新测序的基因组中可靠地预测基因功能。

如本文中所使用的，“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指通过基因组中的复制而关联的基因。虽然直系同源物在进化过程中保持相同的功能，但旁系同源物进化出新的功能，即使一些功能通常与原始功能相关。旁系同源基因的实例包括但不限于编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，其全都是丝氨酸蛋白酶并且一起出现在相同的物种中。

如本文中所使用的，“同源性”是指序列相似性或同一性，优选同一性。可以使用本领域内已知的标准技术(参见例如，Smith和Waterman,Adv Appl Math,2:482,1981;Needleman和Wunsch,J Mol Biol,48:443,1970;Pearson和Lipman,Proc Natl Acad SciUSA,85:2444,1988;程序例如Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,Madison,WI;和Devereux等人,Nucl AcidRes,12:387-395,1984)确定同源性。

如本文中所使用的，“类似序列”是指该基因的功能与基于Geobacilluscaldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶的基因基本上相同。此外，类似基因包括与Geobacilluscaldoproteolyticus嗜热菌蛋白酶的序列至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在其它实施方案中，一个以上的上述性质适用于该序列。类似序列可以通过已知的序列比对方法来确定。常用的比对方法是BLAST，但如上文和下文中指出的，存在也可以用于比对序列的其他方法。

有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐近式成对比对，从一组相关序列产生多序列比对。还可以用其绘制显示用于产生该比对的聚类关系的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle(Feng and Doolittle,J Mol Evol,35:351-360,1987)的渐近比对法的简化方法。该方法与Higgins和Sharp(Higgins and Sharp,CABIOS5:151-153,1989)描述的方法相似。有用的PILEUP参数包括3.00的默认空位权重、0.10的默认空位长度权重和加权的末端空位。

有用算法的另一个实例是由Altschul等人,(Altschul等人,J Mol Biol,215:403-410,1990;和Karlin等人,Proc Natl Acad Sci USA,90:5873-5787,1993)描述的BLAST算法。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，Altschul等人,MethEnzymol,266:460-480,1996)。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其大部分可以设置为默认值。这些可调参数可以使用下列值设置：重叠跨度(overlap span)=1,重叠分数(overlapfraction)=0.125,字长阈值(word threshold)(T)=11。HSP S和HSP S2参数是动态值，由程序本身视特定序列的组成和正用于搜索目的序列的特定数据库的组成来建立。然而，可调整所述值以增加灵敏度。百分比氨基酸序列同一性值通过用匹配的相同残基的数目除以比对区域中“较长”序列的残基总数来确定。“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列(忽略通过WU-Blast-2导入以使比对评分最大化的缺口)。

因此，“百分比(%)核酸序列同一性”定义为候选序列中与起始序列（即目的序列）的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分数。一个优选方法使用WU-BLAST-2的BLASTN模块，设置为默认参数，其中重叠跨度和重叠分数分别设置为1和0.125。

如本文中所使用的，术语“杂交”是指本领域内已知的一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程。

一个核酸序列被认为是与参照核酸序列“可以选择性杂交的”，如果两个序列在中度至高度严格杂交和洗涤条件下彼此特异地杂交的话。杂交条件基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大严格”通常在大约Tm-5°C(比探针的Tm低5°C)；“高度严格”在低于Tm大约5-10°C；“中度严格”在低于探针的Tm大约10-20°C；以及“低严格”在低于Tm大约20-25°C。在功能上，最大严格条件可用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或几近严格的同一性的序列；而中度或低严格杂交可用于鉴定或检测多核苷酸序列同源物。

中度和高度严格杂交条件在本领域内是熟知的。高度严格条件的实例包括在大约42℃于50%甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt’s溶液、0.5%SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，然后在室温于2X SSC和0.5%SDS中洗2次，和在42℃于0.1X SSC和0.5%SDS中再洗2次。中度严格条件的实例包括在37°C于含有20%甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中温育过夜，然后在大约37至50°C于1x SSC中洗滤膜。本领域技术人员知道如何酌情调整温度、离子强度等以适应于例如探针长度等因素。

如本文中所使用的，“重组”包括提及细胞或载体，其已经经过引入异源核酸序列而被修饰，或者该细胞来源于已经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然（非重组）形式中不存在相同基因形式的基因，或表达原本由于有意的人工干预而异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。“重组”和产生“重组”核酸通常是指组装两个或更多个核酸片段，其中该组装导致嵌合基因。

在优选实施方案中，在至少一个密码子中使用饱和诱变，产生突变DNA序列。在另一个优选实施方案中，对两个或更多个密码子进行位点饱和诱变。在其它实施方案中，突变DNA序列与野生型序列具有50%以上，55%以上，60%以上，65%以上，70%以上，75%以上，80%以上，85%以上，90%以上，95%以上或98%以上的同源性。在备选实施方案中，可以使用任何已知的诱变方法，例如辐射、亚硝基胍等，体内产生突变DNA。然后可以分离期望的DNA序列并且将其用于本文提供的方法中。

如本文中所使用的，术语“靶序列”是指在宿主细胞中编码如下序列的的DNA序列，其中期望进入序列在所述序列处插入宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，靶序列编码功能性野生型基因或操纵子，然而在其他实施方案中，靶序列编码功能性突变基因或操纵子、或非功能性基因或操纵子。

如本文中所使用的，“侧翼序列”是指位于所讨论序列的上游或下游的任何序列(例如，对于基因A-B-C，基因B侧翼连接A和C基因序列)。在优选实施方案中，进入序列在每一侧上都侧翼连接了同源盒。在另一个实施方案中，进入序列和同源盒包含在每一侧均侧翼连接了填充序列的单位。在一些实施方案中，侧翼序列只存在于一侧(3’或5’)，但在优选实施方案中，在序列的每一侧都存在侧翼连接。

如本文中所使用的,术语“填充序列”是指位于同源盒侧翼的任何额外DNA(通常是载体序列)。然而，该术语包括任何非同源DNA序列。不受限于任何理论，填充序列可以为细胞提供非关键的靶以起始DNA摄取。

如本文所使用的，术语“扩增”和“基因扩增”指特定DNA序列不成比例地复制的过程，由此扩增后基因以比初始存在于基因组中的拷贝数要高的拷贝数存在。在某些实施方案中，通过在药物（例如，可抑制性酶的抑制剂）存在下的生长来进行的细胞选择，导致编码在药物存在下生长所必需的基因产物的内源基因的扩增、或编码此基因产物的外源（即，输入）序列的扩增，或两者的扩增。

“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的一种特殊情况。它与非特异性模板复制（即，模板依赖性但不依赖于特定模板的复制）形成对比。模板特异性在此处与复制的保真性（即，合成正确多核苷酸序列）和核苷酸（核糖或脱氧核糖-核苷酸）的特异性是不同的。模板特异性通常就“靶”特异性而言进行描述。靶序列，在寻求将其从其他核酸中挑选出来这一意义上，是“靶”。已设计了主要用于这种挑选的扩增技术。

如本文所使用的，术语“共扩增”指将可扩增标记与其他基因序列（即，包含一个或多个非选择基因，例如表达载体中包含的那些）一起引入单个细胞内，应用合适的选择压力，从而使得细胞扩增该可扩增标记和该其他非选择基因序列。可扩增标记可以与该其他基因序列进行物理连接，或备选地2个分开的DNA片段，一个包含可扩增标记并且另一个包含该非选择标记，可以引入相同细胞内。

如本文所使用的，术语“可扩增标记”、“可扩增基因”和“扩增载体”指基因或编码基因的载体，其允许该基因在合适的生长条件下扩增。

“模板特异性”可以在大多数扩增技术中通过选择酶来达到。扩增酶是在使用条件下仅加工异源核酸混合物中的特定核酸序列的酶。例如，在Qβ复制酶的情况下，MDV-1RNA是该复制酶的特定模板（参见例如，Kacian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA69：3038[1972]），其他核酸不能通过这种扩增酶复制。类似地，在T7RNA聚合酶的情况下，这种扩增酶具有针对其自身启动子的严格特异性（参见，Chamberlin等人，Nature228：227[1970））。在T4DNA连接酶的情况下，当在寡核苷酸或多核苷酸底物和模板之间在连接接头处存在错配时，该酶将无法连接这2个寡核苷酸或多核苷酸（参见，Wu和Wallace，Genomics4：560[1989]）。最后，Taq和Pfu聚合酶，由于其在高温下起作用的能力，而被发现能够对引物结合并由此规定的序列显示出高特异性；高温导致有利于引物与靶序列杂交而不利于与非靶序列杂交的热力学条件。

如本文所使用的，术语“可扩增核酸”指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。可以考虑到，“可扩增核酸”通常可以包含“样品模板”。

如本文所使用的，术语“样品模板”指源于样品的、待就“靶”（下文定义）的存在进行分析的核酸。相对地，“本底模板”用于指样品模板之外的核酸，其可以存在或不存在于样品中。本底模板最通常是无意的。它可以是遗留(carryover)引起的，或它可以由于待从样品中纯化除去的核酸杂质的存在而引起。例如，来自待检生物之外的生物的核酸可以作为本底在测试样品中存在。

如本文所使用的，术语“引物”指天然的(如以纯化的限制消化物形式)或合成产生的寡核苷酸，当被置于可以诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下（即，在核苷酸和诱导试剂例如DNA聚合酶存在下以及合适温度和pH下）时，它能够充当合成起始点。为了扩增中的最大效率，引物优选是单链的，但备选地可以是双链的。如果是双链的，那么首先处理引物，以在用于制备延伸产物前使其链分开。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导试剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度依赖于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。

如本文所使用的，术语“探针”指天然的(如以纯化的限制消化物的形式)或合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸（即，核苷酸序列），它能够与另一目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可以用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。可以考虑到，在本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”进行标记，从而使得可在任何检测系统中检测，所述检测系统包括但不限于酶（例如，ELISA以及基于酶的组织化学测定法）、荧光、放射性和发光系统。本发明不旨在限制于任何具体检测系统或标记。

如本文所使用的，当用于聚合酶链反应时，术语“靶”指用于聚合酶链反应的引物所结合的核酸区域。由此，可以寻求将“靶”从其他核酸序列中挑选出来。“区段”定义为靶序列内的核酸区域。

如本文所使用的，术语“聚合酶链反应”（“PCR”）指在此引入作为参考的美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188中的方法，其包括无需克隆或纯化用于增加基因组DNA混合物中靶序列区段的浓度的方法。用于扩增靶序列的该方法包括：将大量过量的两个寡核苷酸引物引入含有期望的靶序列的DNA混合物中，然后在DNA聚合酶存在的情况下进行精确顺序的热循环。两个引物与双链靶序列的相应链互补。为了实现扩增，将混合物变性，然后使引物与靶分子内它们的互补序列退火。在退火后，使用聚合酶延伸引物以形成新的互补链对。可重复变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤许多次（即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以存在许多“循环”）以获得高浓度的具有期望靶序列的扩增区段。引物的彼此相对位置确定了具有期望靶序列的扩增区段的长度，从而该长度是可控参数。由于该程序的重复性质，故该方法被称为“聚合酶链式反应”(在下文中称为“PCR”)。因为靶序列的期望扩增片段成为混合物中的主要序列（就浓度而言），因此其被称作是“经PCR扩增的”。

如本文所使用的，术语“扩增试剂”指除引物、核酸模板和扩增酶外，扩增所需的那些试剂（三磷酸脱氧核糖核苷酸、缓冲液等）。一般地，将扩增试剂连同其他反应组分一起置于和容纳在反应器皿（试管、微孔等）中。

用PCR，可以将基因组DNA中单拷贝的特定靶序列扩增至通过几种不同方法（例如，与标记探针杂交；掺入生物素化引物后利用抗生物素蛋白-酶缀合物检测；将32P标记的三磷酸脱氧核苷酸，例如dCTP或dATP掺入扩增区段内）可以检测的水平。除了基因组DNA外，任何寡核苷酸或多核苷酸序列也都可以用合适的引物分子对进行扩增。特别地，通过PCR过程本身产生的扩增区段自身就可以是后续PCR扩增的有效模板。

如本文所使用的，术语“PCR产物”、“PCR片段”和“扩增产物”指在变性、退火和延伸的PCR步骤的2个或更多个循环完成后得到的化合物混合物。这些术语涵盖已经扩增了一个或多个靶序列的一个或多个区段的情况。

如本文所使用的，术语“RT-PCR”指RNA序列的复制和扩增。在这种方法中，逆转录与PCR偶联，最通常使用其中采用热稳定聚合酶的一酶法，见引入本文作为参考的美国专利号5,322,770中的描述。在RT-PCR中，由于聚合酶的逆转录酶活性，RNA模板被转化成cDNA，并且随后使用聚合酶的聚合活性而被扩增（即，如在其他PCR方法中一样）。

如本文所使用的，术语“限制性核酸内切酶”和“限制酶”指各自在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA的细菌酶。

“限制位点”指被给定的限制性核酸内切酶识别和切割的核苷酸序列，其通常是用于插入DNA片段的位点。在本发明的特定实施方案中，将限制位点构建入选择标记以及DNA构建体的5'和3'端中。

如本文所使用的，术语“染色体整合”指将进入序列导入宿主细胞染色体内的过程。转化DNA的同源区与染色体的同源区进行联配(align)。随后，同源盒之间的序列在双交换中被进入序列置换（即，同源重组）。在本发明的某些实施方案中，DNA构建体的失活性染色体区段的同源部分与芽孢杆菌染色体的天生染色体区域的侧翼同源区进行序列联配。随后，天生的染色体区域在双交换中通过DNA构建体而缺失（即，同源重组）。

“同源重组”意指两个DNA分子或配对染色体之间在具有相同或几乎相同的核苷酸序列的位置处的DNA片段交换。在优选实施方案中，染色体整合是同源重组。

本文中所使用的“同源序列”意指当最佳比对以进行比较时，一个核酸或多肽序列与另一核酸或多肽序列具有100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、88%、85%、80%、75%或70%的序列同一性。在一些实施方案中，同源序列具有85%至100%的序列同一性，而在其他实施方案中，存在90%至100%的序列同一性，在更优选实施方案中，存在95%至100%的序列同一性。

如本文中所使用的，“氨基酸”是指肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。

如本文中所使用的，术语“异源蛋白质”是指在宿主细胞中非天然发生的蛋白质或多肽。异源蛋白质的实例包括酶例如水解酶（包括蛋白酶）。在一些实施方案中，编码该蛋白质的基因是天然发生的基因，然而在其他实施方案中，使用突变的和/或合成的基因。.

如本文中所使用的，“同源蛋白”是指细胞中天生的或天然存在的蛋白质或多肽。在优选实施方案中，细胞是革兰氏阳性细胞，然而在特别优选实施方案中，细胞是芽孢杆菌宿主细胞。在备选实施方案中，同源蛋白质是由其他生物，包括但不限于大肠杆菌（E.coli）、链霉菌（Streptomyces）、木霉菌（Trichoderma）和曲霉菌（Aspergillus.）产生的天然蛋白质。本发明包括通过重组DNA技术产生同源蛋白质的宿主细胞。

如本文所使用的，“操纵子区”包含一组邻近基因，其作为单个转录单位自共同启动子转录，并且由此受到共调节。在某些实施方案中，操纵子包括调节基因。在最优选的实施方案中，使用高度表达（如通过RNA水平测量）的、但具有未知或非必需功能的操纵子。

如本文所使用的，“抗微生物区”是包含至少一个编码抗微生物蛋白质的基因的区域。

如果多核苷酸，在其自然状态中或当通过本领域技术人员已知的方法操作后，可以转录和/或翻译以产生RNA、多肽或其片段，则称该多核苷酸“编码”RNA或多肽。此种核酸的反义链也被称作编码该序列。

如本领域已知的，DNA可以通过RNA聚合酶转录以产生RNA，而RNA可以通过逆转录酶进行逆转录以产生DNA。因此，DNA可以编码RNA并且反之亦然。

术语“调节区段”或“调节序列”或“表达控制序列”指，与编码多肽链的氨基酸序列的DNA多核苷酸序列有效连接以实现该编码氨基酸序列的表达的DNA多核苷酸序列。调节序列可以抑制、阻遏或促进有效连接的编码氨基酸的多核苷酸序列的表达。

“宿主菌株”或“宿主细胞”指对于包含本发明DNA的表达载体合适的宿主。

如果酶在宿主细胞中以比其在相应野生型细胞中以更高的水平表达，那么酶在该宿主细胞中“超表达”。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。本公开内容自始至终使用符合IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（JCBN）定义的氨基酸3字母代码。还应当理解由于遗传密码简并性，多肽可以由一种以上的核苷酸序列编码。

“前序列”是在信号序列和成熟蛋白酶之间的氨基酸序列，其对于蛋白酶分泌是必需的。前序列的切割将导致成熟的活性蛋白酶。

术语“信号序列”或“信号肽”指参与成熟或前体形式的蛋白质分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。信号序列的这个定义是功能定义，意欲包括由蛋白质基因的N末端部分编码的、参与实现蛋白质分泌的、所有那些氨基酸序列。它们通常但不是绝对地与蛋白质的N末端部分或前体蛋白质的N末端部分结合。信号序列可以是内源或外源的。信号序列可以是与蛋白质（例如，蛋白酶）天然结合的信号序列，或可以来自编码其它分泌蛋白质的基因。一种示例性外源信号序列包含来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前7个氨基酸残基和与之融合的、来自迟缓芽孢杆菌（ATCC21536）的枯草杆菌蛋白酶的信号序列的其余部分。

术语“杂合信号序列”是指这样的信号序列，其部分序列得自表达宿主并与待表达基因的信号序列融合。在一些实施方案中，使用合成序列。

术语“成熟”形式的蛋白质或肽指蛋白质或肽的最终功能形式。例如，一种成熟形式的嗜热菌蛋白酶包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

术语蛋白质或肽的“前体”形式指，具有与蛋白质的氨基或羧基末端有效连接的前序列的成熟形式蛋白质。前体还可以具有与前序列的氨基末端有效连接的“信号”序列。前体还可以具有参与翻译后活性的另外多核苷酸（例如，被切除以留下成熟形式的蛋白质或肽的多核苷酸）。

“天然酶”指具有与自然界中发现的氨基酸序列相同的未经修饰的氨基酸序列的酶。天然酶包括天生的酶，在特定微生物中天然表达或存在的那些酶。

术语“源自”和“得自”不仅指由所讨论的生物株产生的或可产生的蛋白酶，还指由此生物株中分离的DNA序列编码且在包含此DNA序列的宿主生物中产生的蛋白酶。此外，该术语还指由合成来源和/或cDNA来源的DNA序列编码的、具有所讨论蛋白酶的鉴定特征的蛋白酶。例如，“源自芽胞杆菌的蛋白酶”是指由芽胞杆菌属物种天然产生的具有蛋白水解活性的那些酶、以及中性金属蛋白酶，例如，由芽胞杆菌属物种源产生但是其是通过使用基因工程技术由转化了编码所述中性金属蛋白酶的核酸的非Geobacilluscaldoproteolyticus生物生产的中性金属蛋白酶。

在本定义范畴中“衍生物”一般保留在野生型、天然或亲本形式中观察到的特征性蛋白水解活性，且保留的程度使得衍生物可以与野生型、天然或亲本形式用于相似的用途。中性金属蛋白酶的功能性衍生物包括具有本发明中性金属蛋白酶的一般特征的、天然存在的或合成或重组产生的肽或肽片段。

术语“功能性衍生物”指具有编码中性金属蛋白酶的核酸的功能特征的核酸衍生物。编码本文提供的中性金属蛋白酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在、合成或重组产生的核酸或片段，其编码本发明特征性的中性金属蛋白酶。编码本发明中性金属蛋白酶的野生型核酸包括天然存在的等位基因和基于本领域已知的遗传密码简并性的同源物。

与2个核酸或多肽序列相关的术语“相同(等同、同一)”是指，当就最大对应性进行比对后，在2个序列中相同的残基，可以使用下述序列比较或分析算法之一确定。

术语“最佳比对”是指给出最高同一性百分比得分的比对。

“序列同一性百分比”、“氨基酸序列同一性百分比”、“基因序列同一性百分比”和/或“核酸/多核苷酸序列同一性百分比”，就2个氨基酸、多核苷酸和/或基因序列（合适时）而言，指当序列进行最佳比时，在2个序列中相同的残基的百分比。因此，80％氨基酸序列同一性指在2个最佳比对的多肽序列中有80％氨基酸是相同的。

因此，与2个核酸或多肽相关的短语“基本上相同(等同、同一)”是指，使用程序或算法（例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL），使用标准参数，与参考序列比较，一个多核苷酸或多肽包含至少70％序列同一性、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少97％、优选至少98％且优选至少99％序列同一性。2个多肽基本上等同的一个指标是第一多肽与第二多肽具有免疫学交叉反应性。一般地，差异在于保守氨基酸置换的多肽具有免疫学交叉反应性。因此，例如，当一个多肽与第二多肽的差异仅在于保守置换时，这2个多肽基本上等同。2个核酸序列基本上等同的另一个指标是2个分子在严格条件下（例如，在中度至高度严格范围内）彼此杂交。

术语“分离的”或“纯化的”是指，物质自其最初环境（例如，如果它是天然存在的，那么天然环境）中被移出。例如，一个物质将被说成是“纯化的”，如果该物质在特定组合物中的存在浓度比其在天然或野生型生物中的存在浓度高或低、或如果该物质在特定组合物中与其自天然或野生型生物表达时通常不存在的组分组合存在。例如，在活动物中存在的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但与天然系统中共存的一些或所有物质分开的该同一多核苷酸或多肽是分离的。此种多核苷酸可以是载体的部分，和/或此种多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，并且仍是分离的，因为此种载体或组合物不是其天然环境的一部分。在优选实施方案中，核酸或蛋白质被说成是纯化的，例如，如果它在凝胶电泳或印迹中产生基本上一个条带时。

术语“分离的”，当用于DNA序列时，指这样的DNA序列，其已从其天然遗传环境中被移出并因此不含其他无关的或不希望有的编码序列，并且具有适于在遗传改造的蛋白质生产系统内使用的形式。此种分离的分子可以是从其天然环境中分离的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含通常与之相伴的其他基因，但可以包括天然存在的5'和3'非翻译区例如启动子和终止子。相关区域的鉴定对于本领域普通技术人员将是显而易见的（参见例如，Dynan和Tijan，Nature316：774-78，1985）。术语“分离的DNA序列”备选地称为“克隆的DNA序列”。

术语“分离的”，当用于蛋白质时，指存在于非其天然环境的条件下的蛋白质。在优选形式中，分离的蛋白质基本上不含其他蛋白质，特别是其他同源蛋白质。分离的蛋白质，如通过SDS-PAGE测定的，可以具有10％以上的纯度、优选20％以上的纯度、并且更加优选30％以上的纯度。本发明的进一步方面包含，如通过SDS-PAGE测定的，高度纯化形式（即，40％以上纯度、60％以上纯度、80％以上纯度、90％以上纯度、95％以上纯度、97％以上纯度、以及甚至99％以上纯度）的蛋白质。

下列盒式诱变法可用于帮助构建本发明的酶变体，但也可使用其他方法。首先，如本文中所描述的，获得编码酶的天然基因，然后进行全部或部分测序。然后，扫描序列，寻找期望在该编码酶中进行一个或多个氨基酸突变(缺失、插入或替代)的点。评估位于该点侧翼的序列，检查是否存在限制性位点可以用于以寡核苷酸库（当其表达时将编码不同的突变体）替换该基因的短区段。为了有利于基因区段的替换，此类限制性位点优选是蛋白质基因内的单酶切位点。然而，可使用酶基因中不是过度冗余的任何方便的限制性位点，只要通过限制性消化产生的基因片段可按正确的顺序重新装配即可。如果在距所选点方便距离(10至15个核苷酸)的位置上不存在限制性位点，则可以以在最终的构建体中不改变阅读框也不改变编码的氨基酸的方式置换基因中的核苷酸，由此产生此限制性位点。可以按照普遍已知的方法，通过M13引物延伸，完成基因突变，从而改变基因的序列以使其符合期望的序列。利用遗传密码的冗余性、基因的限制性酶切图谱和大量的不同限制性酶，可以常规地定位合适的侧翼区域和评估为获得两个方便的限制性位点序列所需的改变。注意：如果方便的侧翼限制性位点是可获得的，那么只需要在不包含此类位点的侧翼区域使用上述方法。

一旦克隆了天然DNA和/或合成DNA后，用关联限制性酶消化位于待突变的位置侧翼的限制性位点，将多个末端互补的寡核苷酸盒连接入基因。通过该方法简化了诱变，因为可合成所有寡核苷酸以使其具有相同的限制性位点，并且无需使用合成接头产生限制性位点。

如本文中所使用的，“相应于”是指蛋白质或肽中于枚举的位置上的残基，或与蛋白质或肽中枚举的残基类似、同源或等价的残基。

如本文中所使用的，“相应区域”通常是指，沿着相关蛋白质或亲本蛋白质的类似位置。

如本文所使用的，术语“组合诱变”是指，产生起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，变体包含选自一组预定突变的一个或几个突变。此外，该方法可以提供引入并非该组预定突变的成员的随机突变的手段。在某些实施方案中，该方法包括在美国申请号09/699,250中阐述的那些，所述美国申请于2000年10月26日提交，在此引入作为参考。在备选实施方案中，组合诱变方法包括商购可得的试剂盒（例如，Multisite，Stratagene，La Jolla，CA）。

如本文所使用的，术语“突变体文库”是指一群细胞，这些细胞在其大部分基因组上是相同的，但包括一个或多个基因的不同同源物。此种文库可以用于例如鉴定具有改良性状的基因或操纵子。

如本文所使用的，术语“起始基因”和“亲本基因”是指，编码待使用本发明改良和/或改变的目的蛋白质的目的基因。

如本文所使用的，术语“多重序列比对”和“MSA”指使用算法（例如，Clustal W）比对起始基因的多个同源物的序列。

如本文所使用的，术语“共有序列”和“规范序列”指，与特定目的蛋白质或序列的所有变体进行比较的原型(archetypical)氨基酸序列。该术语还指这样的序列，该序列陈列出在目的DNA序列中最常存在的核苷酸。对于基因的每个位置，共有序列给出在MSA中在那个位置中丰度最大的氨基酸。

如本文所使用的，术语“共有突变”指，在起始基因的序列和共有序列中的差异。共有突变可以通过比较起始基因的序列和得自MSA的共有序列进行鉴定。在某些实施方案中，将共有突变引入起始基因内，从而使得它变得与共有序列更相似。共有突变还包括如下氨基酸改变，所述改变导致起始基因的氨基酸变为在MSA中于该位置处出现频率高于起始基因的该氨基酸的出现频率的氨基酸。因此，术语共有突变包含用在MSA中比起始基因的氨基酸丰度更高的氨基酸替换起始基因的氨基酸的所有单氨基酸改变。

术语“经修饰的序列”和“经修饰的基因”在本文中可互换使用，指包括对天然核酸序列的缺失、插入或中断的序列。在某些优选实施方案中，经修饰的序列的表达产物是截短蛋白质（例如，如果修饰是序列的缺失或中断）。在某些特别优选的实施方案中，截短蛋白质保留生物活性。在备选实施方案中，经修饰的序列的表达产物是延长的蛋白质（例如，修饰包含在核酸序列内的插入）。在某些实施方案中，插入导致截短蛋白质（例如，当插入导致形成终止密码子时）。因此，插入可以导致表达产物为截短蛋白质或延长蛋白质。

如本文所使用的，术语“突变体序列”和“突变基因”可互换使用，并且指在宿主细胞的野生型序列的至少一个密码子中具有改变的序列。突变体序列的表达产物是相对于野生型具有改变的氨基酸序列的蛋白质。表达产物可以具有改变的功能能力（例如，增强的酶促活性）。

术语“诱变引物”或“诱变寡核苷酸”（在本文中可互换使用）意欲指与模板序列的一部分对应并且能够与之杂交的寡核苷酸组合物。就诱变引物而言，引物与模板核酸不精确匹配，引物中该一个或多个错配用于将期望突变引入核酸文库内。如本文所使用的，“非诱变引物”或“非诱变寡核苷酸”指与模板核酸精确匹配的寡核苷酸组合物。在本发明的一个实施方案中，仅使用诱变引物。在本发明的另一个优选实施方案中，设计引物，使得对于已包括诱变引物的至少一个区域，还存在非诱变引物包括在寡核苷酸混合物中。通过加入诱变引物和与至少一种诱变引物对应的非诱变引物的混合物，可以导致所得核酸文库呈现出各种各样的组合突变模式。例如，如果希望突变体核酸文库的某些成员在某些位置处保留其亲本序列，而其他成员在此位点处发生突变，则非诱变引物能够针对给定残基在核酸文库中获得特定水平的非突变成员。本发明的方法可以采用诱变和非诱变的寡核苷酸，其长度一般为10-50个碱基、更优选长度约15-45个碱基。然而，为获得期望诱变结果，可能需要使用短于10个碱基或长于50个碱基的引物。就相应的诱变和非诱变引物而言，相应寡核苷酸无需具有等同长度，而是仅需要在与待添加的突变对应的区域中存在重叠。

根据本发明，引物可以以预定比例加入。例如，如果希望所得到的文库具有显著水平的某种特定突变以及在相同或不同位点处较少量的不同突变，那么通过调整加入的引物量，可以产生期望的偏倚文库。备选地，通过加入更少或更多量的非诱变引物，可以调整突变体核酸文库中(一种或多种)相应突变的产生频率。

术语“野生型序列”或“野生型基因”在本文中可互换使用，指在宿主细胞中天生或天然存在的序列。在某些实施方案中，野生型序列指作为蛋白质改造计划的起始点的目的序列。野生型序列可以编码同源或异源蛋白质。同源蛋白质是宿主细胞在无干预的情况下产生的蛋白质。异源蛋白质是如果没有干预，宿主细胞将不产生的蛋白质。

如本文中所使用的，术语“等同”，当用于指嗜热菌蛋白酶蛋白质中的氨基酸残基的位置时，是指嗜热菌蛋白酶变体中与未修饰前体例如野生型嗜热菌蛋白酶的一级序列中的位置相应的氨基酸残基的位置。为了在嗜热菌蛋白酶中确立等同氨基酸位置，可以将经修饰产生嗜热菌蛋白酶变体的嗜热菌蛋白酶氨基酸序列直接与SEQ ID NO:3的嗜热菌蛋白酶相比较。在比对残基从而为了保持比对允许插入和缺失（即，通过任意的缺失或插入，避免保守残基的消除）后，确定在与SEQ ID NO:3的嗜热菌蛋白酶序列的特定氨基酸位置等同的位置上的残基。

术语“氧化稳定的”是指，在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程中占优势的条件下，例如在暴露于漂白剂或氧化剂或者与漂白剂或氧化剂接触时，经过给定时间段，本发明蛋白酶保留规定量的酶促活性。在某些实施方案中，在与漂白剂或氧化剂接触给定时间段，例如至少1分钟、3分钟、5分钟、8分钟、12分钟、16分钟、20分钟等后，蛋白酶保留至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％蛋白水解活性。

术语“螯合剂稳定的”是指，在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程中占优势的条件下，例如在暴露于螯合剂或与螯合剂接触时，经过给定时间段，本发明的蛋白酶保留规定量的酶促活性。在某些实施方案中，在与螯合剂接触给定时间段，例如至少10分钟、20分钟、40分钟、60分钟、100分钟等后，蛋白酶保留至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％蛋白水解活性。

术语“热稳定的”和“耐热的”指，在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程中占优势的条件下，在暴露于确定的温度给定时间段后，例如，在暴露于改变的温度时，本发明的蛋白酶保留规定量的酶促活性。改变的温度包括增加或减少的温度。在某些实施方案中，在暴露于改变的温度给定时间段，例如至少60分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟等后，蛋白酶保留至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％蛋白水解活性。

在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶中，术语“增强的稳定性”是指，与其他中性金属蛋白酶和/或野生型酶比较，随着时间过去保留更多的蛋白水解活性。

在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定的蛋白酶中，术语“减少的稳定性”是指，与其他中性金属蛋白酶和/或野生型酶比较，随着时间过去保留较少的蛋白水解活性。

如本文所使用的，除非另有说明，术语“清洁组合物”包括颗粒或粉末形式的通用或“重役型”洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊形式的通用洗涤剂，特别是所谓的重役型液体类型；液体精细织品洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻役型餐具洗涤剂，特别是高泡型的那些；机洗餐具洗涤剂，包括用于家用和公共机构使用的各种片剂、颗粒、液体和漂洗辅助类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手类型、清洁皂、漱口水、牙清洁剂、汽车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴凝胶和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁辅助剂例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。

除非另有说明，所有组分或组合物水平是指该组分或组合物的活性水平，排除可能存在于商购可得来源中的杂质，例如残留溶剂或副产物。

酶组分重量基于总活性蛋白质计。除非另有说明，所有百分比和比例都以重量进行计算。除非另有说明，所有百分比和比例都基于总组合物进行计算。

术语“清洁活性”是指，在本发明的蛋白水解、水解、清洁或其他过程中占优势的条件下，由蛋白酶达到的清洁性能。在某些实施方案中，清洁性能通过应用涉及酶敏感性污渍（例如草、血液、乳或卵蛋白质）的各种清洁测定法进行测定，如在对污渍实施标准洗涤条件后通过各种层析、分光光度或其他定量方法进行测定。示例性测定法包括但不限于在WO99/34011和美国专利号6,605,458中描述的那些（两者都引入本文作为参考），以及在本实施例中包括的那些方法。

术语蛋白酶的“清洁有效量”指在特定清洁组合物中达到期望酶促活性水平的上文所述蛋白酶的量。此种有效量可以由本领域普通技术人员容易地进行确定，其取决于许多因素，例如使用的具体蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成、和需要液体还是干性（例如，颗粒、条）组合物等。

如本文所使用的，术语“清洁附加材料(cleaning adjunct material)”意指针对期望的特定类型清洁组合物和产品形式（例如，液体、颗粒、粉末、条、糊、喷雾、片剂、凝胶；或泡沫组合物）选择的任何液体、固体或气态材料，所述材料还优选与在组合物中使用的蛋白酶相容。在某些实施方案中，颗粒组合物为“压型(compact)”形式，而在其他实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。

如本文所使用的，“低洗涤剂浓度”系统包括洗涤水中存在小于约800ppm洗涤剂组分的洗涤剂。日本洗涤剂一般被视为低洗涤剂浓度系统，因为它们通常具有约667ppm洗涤剂组分存在于洗涤水中。

如本文所使用的，“中等洗涤剂浓度”系统包括其中约800ppm–约2000ppm洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。北美洗涤剂一般被视为中等洗涤剂浓度系统，因为它们通常具有约975ppm洗涤剂组分存在于洗涤水中。巴西洗涤剂一般具有约1500ppm洗涤剂组分存在于洗涤水中。

如本文所使用的，“高洗涤剂浓度”系统包括其中大于约2000ppm洗涤剂组分存在于洗涤水中的洗涤剂。欧洲洗涤剂一般被视为高洗涤剂浓度系统，因为它们于洗涤水中具有约3000-8000ppm洗涤剂组分。

如本文所使用的，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于在染色的织物（例如，衣服、亚麻和其他纺织品材料）的浸泡和/或预处理中使用的组合物。

如本文所使用的，“非织物清洁组合物”包括非纺织品（即，织物）表面清洁组合物，包括但不限于餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、牙清洁组合物和个人清洁组合物。

“压型”形式的清洁组合物在本文中由密度最好地反映，并且就组合物而言，通过无机填充盐的量最佳反映。无机填充盐是粉末形式的洗涤剂组合物中的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填充盐以实质量存在，一般是总组合物的17-35重量％。相比之下，在压型组合物中，填充盐以不超过总组合物15％的量存在。在某些实施方案中，填充盐以不超过组合物的10重量％、或更优选地5重量％的量存在。在某些实施方案中，无机填充盐选自硫酸和氯化物的碱金属和碱土金属盐。优选的填充盐是硫酸钠。

发明详述

中性金属内肽酶(即，中性金属蛋白酶)(EC3.4.24.4)属于催化活性绝对需要锌离子的一类蛋白酶。此类酶在中性pH具有最佳活性并且大小范围在30至40kDa之间。中性金属蛋白酶结合2至4个钙离子，这些钙离子促成蛋白质的结构稳定性。结合在金属蛋白酶的活性位点上的金属离子是必要特征，其允许活化水分子。然后水分子作为亲核物质发挥作用，断裂肽键的羰基基团。

中性锌结合金属蛋白酶家族包括细菌酶嗜热菌蛋白酶和嗜热菌蛋白酶样蛋白酶(TLP)以及羧肽酶A（消化酶)和在组织重塑和降解中催化反应的基质金属蛋白酶。这些蛋白酶中在稳定性和功能方面唯一被良好表征的是嗜热菌蛋白酶，其水解疏水氨基酸残基的氨基端侧的蛋白质键。嗜热菌蛋白酶是最先在嗜热溶蛋白芽孢杆菌Rokko的培养肉汤中鉴定的热稳定中性锌金属蛋白酶。随后在Geobacillus caldoprotelyticus中鉴定到相似的中性金属蛋白酶，该酶在本文中也称为嗜热菌蛋白酶。天然和基因工程蛋白酶，例如嗜热菌蛋白酶，通常在枯草芽孢杆菌中表达(O’Donohue等人,Biochem J,300:599-603,1994),并且几种酶已用于洗涤剂制剂中用以除去蛋白质性质的污渍。目前，嗜热菌蛋白酶用于工业中，特别是用于N-苄氧羰基l-Asp-l-Phe甲基酯（人造甜味剂阿斯巴甜的前体）的酶促合成。然而，一般地，丝氨酸蛋白酶被更广泛地用于洗涤剂中，这至少部分是因为可相对容易地稳定此类蛋白酶。

事实上,金属蛋白酶因为许多原因不常用于工业，特别地不常用于洗涤剂工业。由于这些酶分别因稳定性和功能的原因对钙离子和锌离子具有绝对的需要，此类酶涉及更复杂的蛋白质系统。此外，洗衣过程使用的洗涤剂溶液以及水常常含有干扰该酶结合离子或螯合这些离子的成分，从而导致该蛋白酶的蛋白水解功能的减少或丧失以及该酶的失稳定。

本发明的清洁和洗涤剂制剂的详细描述

除非另外指出，本文中提供的所有成分或组合物水平是指该成分或组合的活性水平，排除可能存在于可商购来源中的杂质，例如残留溶液或副产物。酶成分的重量基于总的活性蛋白计算。除非另外指出，否则所有百分比和比率按重量计算。除非另外指出，否则所有百分比和比率基于总组合物来计算。

在举例说明的洗涤剂组合物中，按总组合物的重量计以纯酶来表示酶的水平，除非另外指出，否则按总组合物的重量计来表示洗涤剂成分。

包含中性金属蛋白酶的清洁组合物

本发明的中性金属蛋白酶用于配制各种清洁组合物。本发明的清洁组合物可以有利地用于例如洗衣应用、硬表面清洁、自动化餐具清洗应用以及化妆品应用例如假牙、牙齿、头发和皮肤应用。然而，由于在较低温度溶液中增加的功效和优良的颜色保护性质的独特优势，本发明的酶理想地适用于洗衣应用例如织物的漂白。此外，本发明的酶可以用于颗粒和液体组合物。

本发明的酶也用于清洁添加剂产品。当期望额外的漂白功效时，包含至少一种本发明酶的清洁添加剂产品理想地适用于包括在洗涤过程中。这样的情况包括但不限于，低温溶液清洁应用。添加剂产品可以（以其最简单的形式）是本发明提供的一种或多种中性金属蛋白酶。在一些实施方案中，添加剂以适于添加到如下清洁过程中的剂型包装，在该清洁过程中使用过氧源和期望增加的漂白功效。在一些实施方案中，单个剂型包括丸、片、gelcap或其他单个剂量单位，包括预估的粉末和/或液体。在一些实施方案中，为了增加这样的组合物的体积，包含填充剂和/或载体材料。合适的填充剂或载体材料包括但不限于各种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐以及滑石、粘土等。在一些实施方案中，用于液体组合物的填充剂和/或载体材料包括水和/或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二元醇。此类醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，组合物包括大约5%至大约90%的此类材料。在其它实施方案中，酸性填充物用于减少组合物的pH。在一些备选实施方案中，清洁添加剂包括至少一种激活的下述过氧源和/或下文中更详细描述的辅助成分。

本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本发明中性金属蛋白酶。在一些实施方案中，通过加入一种或多种由本发明提供的中性金属蛋白酶来获得需要的酶水平。通常，本发明的清洁组合物包含至少0.0001重量百分比，大约0.0001至大约1，大约0.001至大约0.5或甚至大约0.01至大约0.1重量百分比的至少一种本发明中性金属蛋白酶。

在一些优选实施方案中，典型地配制本发明的清洁组合物，使得在水性清洗操作过程中使用时，洗涤水具有大约5.0至大约11.5的pH，或在备选实施方案中，甚至大约6.0至大约10.5的pH。在一些优选实施方案中，通常配制液体产品制剂以使其具有大约3.0至大约9.0的净pH，而在一些备选实施方案中，制剂具有大约3至大约5的净pH。在一些优选实施方案中，通常配制颗粒型洗衣产品以使其具有大约8至大约11的pH。用于控制pH在推荐的使用水平上的技术包括缓冲剂、碱、酸等的使用，并且对于本领域技术人员来说是熟知的。

在一些特别优选实施方案中，当在颗粒组合物或液体中使用至少一种中性金属蛋白酶时，该中性金属蛋白酶可以为包封的颗粒形式，以保护酶免受贮存过程中颗粒组合物的其他成分的损害。此外，包封也提供了一种在清洁过程中控制中性金属蛋白酶的利用率（availability）的手段，并且可增强中性金属蛋白酶的性能。可以考虑到，包封的本发明中性金属蛋白酶可以用于各种情况。也可以预期，可以使用本领域内已知的任何合适的包封材料和方法，包封中性金属蛋白酶。

在一些优选实施方案中，包封材料通常包封至少部分的中性金属蛋白酶催化剂。在一些实施方案中，包封材料是水溶性的和/或水可分散的。在一些其它实施方案中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)(关于玻璃化转变温度的更多信息，参见例如，WO97/11151,特别是第6页第25行至第7页第2行)。

在一些实施方案中，包封材料选自碳水化合物、天然或合成的树脂、壳多糖和壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡和其组合。在包封材料是碳水化合物的一些实施方案中，其选自单糖、寡糖、多糖和其组合。在一些优选实施方案中，包封材料是淀粉(关于一些示例性淀粉的描述，参见例如，EP0922499;US4,977,252、US5,354,559和US5,935,826)。

在其它实施方案中，包封材料包括由塑料(例如，热塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和其混合物；可以使用的商业微球体包括但不限于[Casco Products,Stockholm,Sweden]、PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、和[PQ Corp.,Valley Forge,PA],和[Potters Industries,Inc.,Carlstadt,NJ andValley Forge,PA])制造的微球体。

申请人的清洁组合物的制造和使用方法

在一些优选实施方案中，本发明的组合物可以配制成任何合适的形式并可以利用配制者选择的任何方法来制备(关于非限定性实例，参见例如，U.S.5,879,584、U.S.5,691,297、U.S.5,574,005、U.S.5,569,645、U.S.5,565,422、U.S.5,516,448、U.S.5,489,392和U.S.5,486,303)。在期望低pH清洁组合物的一些实施方案中，该组合物的pH可以通过加入酸性物质例如HCl来进行调整。

辅助材料

虽然对于本发明的目的不是必需的，但在一些实施方案中，本文中描述了非限定性辅助物质，其适用于本发明的清洁组合物。事实上，在一些实施方案中，将辅助物质掺入本发明的清洁组合物。在一些实施方案中，辅助物质帮助和/或增强清洁性能、处理待清洁的底物、和/或改变清洁组合物的美学性质(例如，香料、着色剂、染料等)。应理解，此类辅助材料是除了本发明的中性金属蛋白酶之外的物质。此类额外的成分的精确性质和其掺入水平取决于组合物的物理形式和其将用于的清洗操作的性质。合适的辅助材料包括但不限于表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂,其它酶和酶稳定剂、催化性物质、漂白活性剂、漂白促进剂（bleach booster）、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合分散剂、粘土清除剂/抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹性化剂（structure elasticizing agent）、衣物柔顺剂、载体、水溶助长物、加工助剂和/或色素。除了本文中明确地提供的实例以外，其它实例在本领域中是已知的(参见例如，美国专利5,576,282、6,306,812B1和6,326,348B1)。在一些实施方案中，上述辅助成分构成了本发明清洁组合物的平衡。

表面活性剂——在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂或表面活性剂系统，其中表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂和其混合物。在一些低pH清洁组合物实施方案(例如，具有大约3至大约5的净pH的组合物)中，组合物通常不包含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信这样的表面活性可在酸性组合物中水解。

在一些实施方案中,表面活性剂以大约0.1%至大约60%的水平存在，而在备选实施方案中，该水平是大约1%至大约50%，而在其它实施方案中，该水平是按清洁组合物的重量计算大约5%至大约40%。

助洗剂——在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助剂或助洗剂系统。在包含至少一种助洗剂的一些实施方案中，清洁组合物包含按清洁组合物的重量计算至少大约1%，大约3%至大约60%或甚至大约5%至大约40%的助洗剂。

助洗剂包括但不限于多磷酸的碱金属盐、铵盐和烷醇铵盐、碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐、铝硅酸盐助洗剂聚羧酸盐化合物、醚羟基聚羧酸盐、马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸、和羧甲基氧基琥珀酸、聚乙酸的各种碱金属盐、铵盐和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和氨基三乙酸、以及聚羧酸，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧甲基氧基琥珀酸和其可溶性盐。事实上，预期任何合适的助洗剂都可以用于本发明的各种实施方案。

螯合剂——在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂和其混合物。在其中使用至少一种螯合剂的实施方案中，本发明的清洁组合物包含按主题清洁组合物的重量计算大约0.1%至大约15%或甚至大约3.0%至大约10%的螯合剂。

沉积助剂——在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸、污垢释放聚合物例如聚对苯二甲酸、粘土例如高岭土、蒙脱石、atapulgite、伊利石、膨润土、多水高岭土及其混合物。

染料转移抑制剂——在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。

在使用至少一种染料转移抑制剂的实施方案中，本发明的清洁组合物包含按清洁组合物的重量计算，大约0.0001%至大约10%，大约0.01%至大约5%或甚至大约0.1%至大约3%的染料转移抑制剂。

分散剂——在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含至少一种分散剂。合适的水溶性有机材料包括但不限于同聚或共聚酸或它们的盐，其中聚羧酸包含至少两个彼此被不超过2个碳原子分开的羧基基团。

酶——在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂酶，其提供清洗性能和/或织物护理益处。合适的酶的实例包括但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶（ligninases）、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、malanases、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶或其混合物。在一些实施方案中，使用包含淀粉酶和常规可用的酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶的酶组合（即，“混合物”）。

酶稳定剂–在本发明的一些实施方案中，稳定在本发明的洗涤剂制剂中使用的酶。预期用于酶稳定化的各种技术可以用于本发明。例如，在一些实施方案中，通过存在锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子(在最终组合物中向酶提供这些离子)、以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))的可溶性来源，稳定本文中使用的酶。

催化性金属络合物——在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施方案中，使用含有金属的漂白催化剂。在一些优选实施方案中，金属漂白催化剂包括催化剂系统，所述催化剂系统含有具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有少量或无漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如，锌或铝阳离子)和对于催化和辅助金属阳离子具有确定的稳定常数的多价螯合剂，特别地使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)和其水溶性盐(参见例如，U.S.4,430,243)。

在一些实施方案中,通过锰化合物催化本发明的清洁组合物。此类化合物和使用水平在本领域内是熟知的(参见例如，U.S.5,576,282)。

在其它实施方案中，钴漂白催化剂用于本发明的清洁组合物。各种钴漂白催化剂在本领域内是已知的(参见例如，U.S.5,597,936和U.S.5,595,967)。钴催化剂可通过已知的方法容易地制备(参见例如，U.S.5,597,936和U.S.5,595,967)。

在其它实施方案中,本发明的清洁组合物包含大多环刚性配体（macropolycyclicrigid ligand）(“MRL”)的过渡金属络合物。常规地，但不是限制性地，在一些实施方案中，调整本发明提供的组合物和清洁方法以在水性洗涤介质中提供大约至少亿分之一的活性MRL物质，在一些优选实施方案中，在洗涤液中提供大约0.005ppm至大约25ppm，更优选大约0.05ppm至大约10ppm和最优选大约0.1ppm至大约5ppm的MRL。

在本发明的过渡金属漂白催化剂中优选的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。优选的MRL还包括但不限于特殊的交联超刚性配体（例如，5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。合适的过渡金属MRL可容易地通过已知的方法(参见例如，WO00/32601和U.S.6,225,464)制备。

制备和使用清洁组合物的方法

本发明的清洁组合物可以配制成任何合适的形式并通过配制者选择的任何合适的方法制备(对于一些非限定性实例，参见例如，U.S.5,879,584、U.S.5,691,297、U.S.5,574,005、U.S.5,569,645、U.S.5,565,422、U.S.5,516,448、U.S.5,489,392、U.S.5,486,303、U.S.4,515,705、U.S.4,537,706、U.S.4,515,707、U.S.4,550,862、U.S.4,561,998、U.S.4,597,898、U.S.4,968,451、U.S.5,565,145、U.S.5,929,022、U.S.6,294,514和U.S.6,376,445，将其全部通过引用合并入本文)。

使用方法

在优选实施方案中,本发明的清洁组合物用于清洁表面和/或织物。在一些实施方案中，将至少一部分表面和/或织物与至少一个本发明的清洁组合物实施方案（以纯净的形式或稀释于洗涤液中）接触，然后任选地洗涤和/或漂洗表面和/或织物。为了本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械搅动。在一些实施方案中，织物包括能够在正常消费者使用的条件下进行清洗的任何织物。在优选实施方案中，以溶液中大约500ppm至大约15,000ppm的浓度使用本发明的清洁组合物。在洗涤溶剂是水的一些实施方案中，水温通常在大约5°C至大约90°C的范围内。在用于织物清洗的一些优选实施方案中，水对织物的质量比通常为大约1:1至大约30:1。

实验

提供下述实施例以展示且进一步举例说明本发明的某些优选实施方案和方面，不应将这些实施例解释为限制本发明的范围。

在随后的实验公开内容中，应用下述缩写：℃（摄氏度）；rpm（每分钟转数）；H₂O（水）；HCl（盐酸）；aa和AA（氨基酸）；bp（碱基对）；kb（千碱基对）；kD（千道尔顿）；gm（克）；μg和ug（微克）；mg（毫克）；ng（纳克）；μl和ul（微升）；ml（毫升）；mm（毫米）；nm（纳米）；μm和um（微米）；M（摩尔）；mM（毫摩尔）；μM和uM（微摩尔）；U（单位）；V（伏特）；MW（分子量）；sec（秒）；min（s）（分钟/复数分钟）；hr（s）（小时/复数小时）；MgCl₂（氯化镁）；NaCl（氯化钠）；OD₂₈₀（在280nm处的光密度）；OD₄₀₅（在405nm处的光密度）；OD₆₀₀（在600nm处的光密度）；PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）；EtOH（乙醇）；PBS（磷酸盐缓冲盐水）[150mM NaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2]）；LAS（月桂基磺酸钠）；SDS（十二烷基硫酸钠）；Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）；TAED（N,N,N'N'-四乙酰乙二胺）；BES（polyesstersulfone）；MES（2-吗啉代乙磺酸，一水合物；f.w.195.24；Sigma#M-3671）；CaCl₂（氯化钙，无水；f.w.110.99；Sigma#C-4901）；DMF（N,N-二甲基甲酰胺，f.w.73.09，d=0.95）；Abz-AGLA-Nba（2-氨基苯甲酰基-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酸-4-硝基苄基酰胺，f.w.583.65；Bachem#H-6675，VWR目录#100040-598）；SBG1％（"Super Broth with Glucose"；6g Soytone[Difco]、3g酵母提取物、6g NaCl、6g葡萄糖）；在使用本领域已知的方法灭菌前用NaOH将pH调整至7.1；w/v（重量与体积比）；v/v（体积与体积比）；（SEQUEST数据库搜索程序，University ofWashington）；MS（质谱法）；BMI（血，乳，墨）；SRI（污渍去除指数）；Npr和npr（中性金属蛋白酶基因）；Npr和npr（中性金属蛋白酶）；nprE和NprE（解淀粉芽孢杆菌中性金属蛋白酶）；PrT和prt(蛋白酶-T酶)；和TLP(嗜热菌蛋白酶样蛋白酶)。

对产品或服务可能已在实验性实施例中提及的如下公司，应用下列缩写：TIGR（美国基因组研究所，The Institute for Genomic Research，Rockville，MD）；AATCC（美国纺织化学师与印染师协会）；Amersham（Amersham Life Science，Inc.Arlington Heights，IL）；Corning(Corning International,Corning,NY);ICN（ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA）；Pierce（Pierce Biotechnology，Rockford，IL）；Equest(Equest,WarwickInternational Group,Inc.,Flintshire,UK);EMPA（Eidgenossische Material Prufungsund Versuch Anstalt，St.Gallen，瑞士）；CFT（Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands）；Amicon（Amicon，Inc.，Beverly，MA）；ATCC（美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA）；Becton Dickinson（Becton Dickinson Labware，LincolnPark，NJ）；Perkin-Elmer（Perkin-Elmer，Wellesley，MA）；Rainin（Rainin Instrument，LLC，Woburn，MA）；Eppendorf（Eppendorf AG，Hamburg，Germany）；Waters（Waters，Inc.，Milford，MA）；Perseptive Biosystems（Perseptive Biosystems，Ramsey，MN）；MolecularProbes（Molecular Probes，Eugene，OR）；BioRad（BioRad，Richmond，CA）；Clontech（CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA）；Cargill(Cargill,Inc.,Minneapolis,MN);Difco（Difco Laboratories，Detroit，MI）；GIBCO BRL或Gibco BRL（Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD）；New Brunswick(New Brunswick Scientific Company,Inc.,Edison,NJ);Thermoelectron(Thermoelectron Corp.,Waltham,MA);BMG(BMG Labtech,GmbH,Offenburg,Germany);Greiner(Greiner Bio-One,Kremsmuenster,Austria);Novagen(Novagen,Inc.,Madison,WI);Novex(Novex,San Diego,CA);Finnzymes(Finnzymes OY,Finland)Qiagen(Qiagen,Inc.,Valencia,CA);Invitrogen(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA);Sigma(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO);DuPont Instruments(Asheville,NY);Global Medical Instrumentation或GMI(Global MedicalInstrumentation;Ramsey,MN);MJ Research(MJ Research,Waltham,MA);Infors(InforsAG,Bottmingen,Switzerland);Stratagene(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA);Roche(Hoffmann La Roche,Inc.,Nutley,NJ);Agilent(Agilent Technologies,PaloAlto,CA);S-Matrix(S-Matrix Corp.,Eureka,CA);US Testing(United States TestingCo.,Hoboken,NY);West Coast Analytical Services(West Coast AnalyticalServices,Inc.,Santa Fe Springs,CA);Ion Beam Analysis Laboratory(Ion BeanAnalysis Laboratory,The University of Surrey Ion Beam Centre(Guildford,UK);BaChem(BaChem AG,Bubendorf,Switzerland);Molecular Devices(Molecular Devices,Inc.,Sunnyvale,CA);MicroCal(Microcal,Inc.,Northhampton,MA);Chemical Computing(Chemical Computing Corp.,Montreal,Canada);NCBI(National Center forBiotechnology Information,Bethesda,MD);Argo Bioanalytica(ArgoBioanalytica.Inc,New Jersey);Vydac(Grace Vydac,Hesperia,CA);Minolta(KonicaMinolta,Ramsey,NJ);Zeiss(Carl Zeiss,Inc.,Thornwood,NY);Sloning BioTechnologyGmbH(Puchheim,Germany);和Procter and Gamble(Cincinnati,OH)。

实施例1

测定法

下述测定法在下文描述的实施例中使用。自下文提供的方案的任何偏离在实施例中指出。在这些实验中，使用分光光度计测量在反应完成后形成的产物的吸光度。

A.用于96孔板中蛋白质含量测定的Bradford测定法

Bradford染料试剂(Quick Start)测定法用于在微量滴定板(MTP)规模上测定嗜热菌蛋白酶样品中的蛋白质浓度。

在这个测定系统中，使用的化学药品和试剂溶液是：

Bradford Quick Start染料试剂^TM(BIO-RAD产品编号：500-0205)

稀释缓冲液(10mM NaCl,0.1mM CaCl₂,0.005%-80)

所使用的设备是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX MTP读数器(型号340;Molecular Devices)。MTP获自Costar(型号9017)。

在检测中，将200μl Bradford染料试剂通过移液器加入各孔，然后加入15μl稀释缓冲液。最后，向孔中加入10μl含有嗜热菌蛋白酶的经过滤培养上清液。在充分混合后，将MTP在室温温育至少10分钟。吹掉可能的气泡，在595nm处读取孔的吸光度。

为了确定蛋白质的浓度，从样品读数中减去背景读数(即，来自未接种的孔)。所得的OD₅₉₅值提供了样品中蛋白质含量的相对量度。Bradford结果在10至100μg蛋白质/ml之间的嗜热菌蛋白酶蛋白质浓度上呈线性。

B.用于检测蛋白酶的性能的微型布样测定法

在MTP规模使用微型布样(EMPA116)，确定嗜热菌蛋白酶和其变体的去污性能。含有嗜热菌蛋白酶的蛋白酶样品获自经过滤的培养物肉汤，其中所述培养物在潮湿的通气下在280rpm振荡下于37℃在微量滴定板中生长了3天。

在该测定系统中，使用的化学药品和试剂溶液是：

含有嗜热菌蛋白酶的培养上清液(大约100-200μg蛋白质/ml)

2X(无酶)洗涤剂(P&G)

稀释缓冲液(10mM NaCl,0.1mM CaCl₂,0.005%-80)

使用的设备是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)、SpectraMAX MTP读数器(型号340;Molecular Devices)和iEMS温箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。MTP获自Costar(型号9017)。

2X液体洗涤剂制备(US条件):

使用(Ca/Mg3:1)硬度的原液(282.3g/L CaCl₂.2H₂O,130.1g/LMgCl₂.6H₂O)将Milli-Q水调整至6gpg水硬度，加入0.78g/l洗涤剂2X，然后剧烈搅拌洗涤剂溶液至少15分钟。然后加入5mM HEPES，将pH调整至8.2。

微型布样：

0.25英寸圆形直径的微型布样得自CFT(Vlaardingen,The Netherlands)。在切割布样前，在环境温度在去离子水中预洗织物(EMPA116)20分钟，然后风干。

在96孔微量滴定板的每个孔中垂直放置两个微型布样，以暴露整个表面区域(即，非平放于孔的底部)。

检测方法:

将温箱设置在20℃。通过用10mM NaCl、0.1mM CaCl₂、0.005%-80溶液的混合物进行稀释，以适当的浓度检测经过滤的培养肉汤样品。如上所述制备洗涤剂溶液。然后，向装有微型布样的MTP各孔加入190μl的洗涤剂溶液。向各孔中的该混合物加入10μl稀释的酶溶液(以提供200μl/孔的总体积)。用板密封带覆盖MTP并将其置于温箱中20℃30分钟，同时伴有1400rpm振荡(iEMS温箱)。在适当的条件下温育后，自各孔取出100μl溶液，置于新的MTP中。然后在MTP-读数器中在405nm处对该含有100μl溶液/孔的MTP进行读数。也在检测中包括空白对照（含有2个微型布样/孔和洗涤剂，不添加含有嗜热菌蛋白酶的样品）。

BMI(血液/乳/墨)性能的计算:

相对于空白值(在不添加酶的情况下温育微型布样后获得)，校正观察到的吸光度。所得的吸光度是水解活性的量度。对于各样品(嗜热菌蛋白酶或变体)，计算性能指数(PI)。性能指数是在相同蛋白质浓度下变体(实际值)与标准嗜热菌蛋白酶(理论值)的性能的比较。此外，使用标准酶的Langmuir方程的参数，计算理论值。

通过大于1的性能指数(PI>1)鉴定了较好的变体(与标准[例如，野生型]相比较)，而通过等于1的PI(PI=1)鉴定了与标准具有相同性能的变体，通过小于1的PI(PI<1)鉴定了性能比标准差的变体。由此，通过PI鉴定了优胜者、以及在某些环境中不太期望使用的变体。

C.在洗涤剂存在的情况下进行的稳定性测定

在25%2X洗涤剂存在的情况下在规定的条件下温育之后，测量嗜热菌蛋白酶和其变体的稳定性。确定初始和残留活性。

在该测定系统中，所使用的化学药品和试剂溶液是：

含有嗜热菌蛋白酶的培养上清液(大约100-200μg蛋白质/ml)

含有和不含有DTPA螯合剂的2X液体洗涤剂(P&G)

在5.5mM HEPES缓冲液,pH8.2中具有DTPA的27.5%2X洗涤剂溶液(+溶液)

在5.5mM HEPES缓冲液,pH8.2中不具有DTPA的27.5%2X洗涤剂溶液(-溶液)

MES测定缓冲液(55.5mM MES/NaOH,2.6mM CaCl₂,0.005%-80,pH6.5)

所使用的设备是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)、荧光分光光度计(FLUOstar Optima;BMG)、iEMS温箱/振荡器(Thermo/Labsystems)。MTP获自Costar(型号9017)和Greiner(黑色板,型号655076).

检测方法

未加压的条件（Unstressed condition）:

首先，用180μl MES测定缓冲液稀释20μl含有嗜热菌蛋白酶的培养上清液。然后，用180μl MES测定缓冲液进一步稀释20μl稀释的上清液。随后，将10μl该稀释液转移入在25℃预温板(Greiner655076)中的190μlAGLA-底物溶液中。驱散存在的任何气泡，按照下文中描述的AGLA蛋白酶测定方案测量板。

加压的条件:

首先，用180μl27.5%+洗涤剂溶液稀释20μl的培养上清液，并且将其置于iEMS振荡器中。以900rpm将用板密封物覆盖的板在32℃温育总共60分钟。此外，用180μl27.5%-溶液稀释20μl培养上清液，并且置于iEMS振荡器中。以900rpm将用板密封物覆盖的板在50℃温育总共180分钟。

随后，在相应温育后，这些溶液各20μl用180μl MES测定缓冲液稀释，10μl该稀释液在25℃在预温的板(Greiner655076)中用190μl AGLA-底物溶液稀释。

驱散存在的任何气泡，按照下文中描述的AGLA蛋白酶测定方案测量板。

2X稳定性的计算

以350nm激发和420nm发射，进行荧光测量。荧光分光光度计软件将各孔的荧光增加的反应速率(=斜率)计算为(毫-)RFU/分钟的线性回归线。如下用残留与初始AGLA活性的比，表示25%2X的稳定性:

残留活性的百分比=[加压的斜率]*100/[未加压的斜率]。

对于每一个样品(嗜热菌蛋白酶和其变体)，通过用变体的残留活性除以嗜热菌蛋白酶的残留活性，计算性能指数。性能指数比较在相同的条件下测定的变体与标准嗜热菌蛋白酶（例如，野生型或亲本酶)的稳定性。

通过大于1(PI>1)的性能指数(PI)鉴定了较好的变体(与标准[例如，野生型]相比较)，而通过等于1的PI(PI=1)鉴定了与标准展示出相同稳定性的变体，通过小于1的PI(PI<1)鉴定了与标准相比稳定性较差的变体。因此，通过PI鉴定了优胜者、以及在某些环境中不太期望使用的变体。

D.2-氨基苯甲酰基-L-丙氨酰-L-甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酸(alanino)-4-硝基苄基酰胺(Abz-AGLA-Nba)蛋白酶测定法

在此描述的方法提供了不依赖于时间和地点产生可重现的蛋白酶测定数据的一定程度的技术细节。虽然可调整测定法以适应于给定的实验室条件，但通过改动的方法获得的任何数据必须与通过原始方法产生的结果相符。中性金属蛋白酶切割2-氨基苯甲酰基-L-丙氨酰-L-甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酸-4-硝基苄基酰胺(Abz-AGLA-Nba)的甘氨酰-和亮氨酰-之间的肽键。溶液中游离2-氨基苯甲酰基-L-丙氨酰甘氨酸(Abz-AG)在415nm处具有荧光发射最大值，在340nm处具有激发最大值。在完整的Abz-AGLA-Nba分子中Abz-AG的荧光被硝基苄基酰胺猝灭。

在这些实验中，通过荧光光谱法(Ex.350/Em.420)监控通过Abz-AGLA-Nb的蛋白酶切割而产生的Abz-AG的释放。Abz-AG的出现速率是蛋白质水解活性的量度。

在该测定系统中，使用的化学药品和试剂溶液是：

MES底物缓冲液-52.5mM MES,2.5mM CaCl₂,0.005%-80,pH6.5

MES测定缓冲液-55.5mM MES,2.6mM CaCl₂,0.005%-80,pH6.5

Abz-AGLA-Nba原液-二甲基甲酰胺中48mM的Abz-AGLA-Nba(28.2mg/ml DMF)

使用的设备是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)、荧光分光光度计(FLUOstarOptima;BMG)、iEMS温箱/振荡器(Thermo/Labsystems)和Innova温箱(Innova-4230;NewBrunswick)。MTP获自Costar(type9017)和Greiner(黑色板,型号655076)。

检测方法

通过向19ml MES底物缓冲液中加入1ml的Abz-AGLA-Nba原液，然后充分混合至少2分钟，制备Abz-AGLA-Nba测定溶液。随后，用MES测定缓冲液稀释含有嗜热菌蛋白酶或其变体的培养上清液至1-6μg蛋白/ml的浓度。

通过向各孔中加入10μl稀释的蛋白酶溶液，然后加入190μl在25℃预平衡至少15分钟的Abz-AGLA-Nba测定溶液，进行测定。剧烈地混合溶液，通过荧光光谱法在25°C以动态模式监控由Abz-AGLA-Nba的蛋白酶切割产生的Abz-AG释放，其中激发设置在350nm而发射设置在420nm。Abz-AG的出现速率是样品中蛋白水解活性的量度。蛋白酶活性表示为RFU(相对荧光单位˙分钟^-1)。

实施例2

枯草芽孢杆菌中嗜热菌蛋白酶的产生

在该实施例中，描述在枯草芽孢杆菌中产生嗜热菌蛋白酶的实验。Geobacilluscaldoproteolyticus的全长嗜热菌蛋白酶与嗜热溶蛋白芽孢杆菌Rokko的嗜热菌蛋白酶前体、以及与嗜热脂肪芽孢杆菌的bacillolysin(NprS)前体有大于99%的同一性。这样，术语“嗜热菌蛋白酶”、“bacillolysin”、“蛋白酶-T”和“PrT”在本文中可互换使用，指G.caldoproteolyticus.的中性金属蛋白酶。下面提供的DNA序列(来自Geobacilluscaldoproteolyticus的嗜热菌蛋白酶前导序列、嗜热菌蛋白酶前序列和嗜热菌蛋白酶成熟序列)，编码嗜热菌蛋白酶前体蛋白质:

ATGAAAATCAAAATCAAATTAGCATCGTTTGGTCTTGCAGCAGGACTAGCGGCCCAAGTATTTTTACCTTACAATGCGCTGGCTTCAACGGAACACCTTACATGGAACCAACAATTTCAAACCCCTCAATTCATCTCCGGTGATCTGCTGAAAG TGAATGGCACATCCCCAGAAGAACTCGTCTATCAATATGTTGAAAAAAACGAAAACAAGTTTAAATTTCATGAAAAC GCTAAGGATACTCTACAATTGAAAGAAAAGAAAAATGATAACCTTGGTTTTACGTTTATGCGCTTCCAACAAACGTA TAAAGGGATTCCTGTGTTTGGAGCAGTAGTAACTGCGCACCTGAAAGATGGCACGCTGACGGCGCTATCAGGGACAC TGATTCCGAAT7TGGACACGAAAGGATCCTTAAAAAGCGGGAAGAAATTGAGTGAGAAACAAGCGCGTGACATTGCT GAAAAAGATTTAGTGGCAAATGTAACAAAGGAAGTACCGGAATATGAACAGGGAAAAGACACCGAGTTTGTTGTTTA TGTCAATGGGGACGAGGCTTCTTTAGCGTACGTTGTCAATTTAAACTTTTTAACTCCTGAACCAGGAAACTGGCTGT ATATCATTGATGCCGTAGACGGAAAAATTTTAAATAAATTTAACCAACTTGACGCCGCAAAACCAGGTGATGTGAAG TCGATAACAGGAACATCAACTGTCGGAGTGGGAAGAGGAGTACTTGGTGATCAAAAAAATATTAATACAACCTACTCTACGTACTACTATTTACAAGATAATACGCGTGGAAATGGGATTTTCACGTATGATGCGAAATACCGTACGACATTGCCGGGAAGCTTATGGGCAGATGCAGATAACCAATTTTTTGCGAGCTATGATGCTCCAGCGGTTGATGCTCATTATTACGCTGGTGTGACATATGACTACTATAAAAATGTTCATAACCGTCTCAGTTACGACGGAAATAATGCAGCTATTAGATCATCCGTTCATTATAGCCAAGGCTATAATAACGCATTTTGGAACGGTTCGCAAATGGTGTATGGCGATGGTGATGGTCAAACATTTATTCCACTTTCTGGTGGTATTGATGTGGTCGCACATGAGTTAACGCATGCGGTAACCGATTATACAGCCGGACTCATTTATCAAAACGAATCTGGTGCAATTAATGAGGCAATATCTGATATTTTTGGAACGTTAGTCGAATTTTACGCTAACAAAAATCCAGATTGGGAAATTGGAGAGGATGTGTATACACCTGGTATTTCAGGGGATTCGCTCCGTTCGATGTCCGATCCGGCAAAGTATGGTGATCCAGATCACTATTCAAAGCGCTATACAGGCACGCAAGATAATGGCGGGGTTCATATCAAT@AGCGGAATTATCAACAAAGCCGCTTATTTGATTAGCCAAGGCGGTACGCATTACGGTGTGAGTGTTGTCGGAATCGGACGCGATAAATTGGGGAAAATTTTCTATCGTGCATTAACGCAATATTTAACACCAACGTCCAACTTTAGCCAACTTCGTGCTGCCGCTGTTCAATCAGCCACTGACTTGTACGGTTCGACAAGCCAGGAAGTCGCTTCTGTGAAGCAGGCCTTTGATGCGGTAGGGGTGAAATAA(SEQ ID NO:1)

在上述序列中，粗体标示编码成熟嗜热菌蛋白酶的DNA，标准字体标示编码前导序列(嗜热菌蛋白酶前导序列)的DNA，下划线文本标示编码前序列(嗜热菌蛋白酶前序列)的DNA。下文中提供的氨基酸序列(嗜热菌蛋白酶前导序列、嗜热菌蛋白酶前序列和嗜热菌蛋白酶成熟DNA序列)(SEQ IDNO:2), 相应于全长嗜热菌蛋白酶前体蛋白质。在该序列中，下划线标示前序列，粗体标示成熟嗜热菌蛋白酶。MKMKMKLASFGLAAGLAAQVFLPYNALASTEHVTWNQ QFQTPQFISGDLLKVNGTSPEELVYQYVEKNENKFXFHENAKDTLQLKEKKNDNLGFTFMRFQQTYKGIPVFGAVVT AHVKDGTLTALSGTLIPNLDTKGSLKSGKKLSEKQARDTAEKDLVANVTKEVPEYEQGKDTEFVVYVNGDEASLAYV VNLNFLTPEPGNWLYIIDAVDGKILNKFNQLDAAKPGDVKSITGTSTVGVGRGVLGDQkNINTTYSTYYYLQDNTRCNGIFTYDAKYRTTLPGSLWADADNQFFASYDAPAVDAHWAGVTYDYYKWVHMRLSYDCNNAAIRSSVHYSQGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFIPLSGGIDVVAHELTHAVTDYTAGLIYQNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTPGISGDSLRSMSDPAKYGDPDHYSKRYTCTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTHYGVSVVGIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVCVK(SEQ ID NO:2)

成熟嗜热菌蛋白酶序列如 SEQ ID NO:3所示和示于图1中。该序列用作制备本文中描述的变体文库的基础。

ITGTSTVGVGRGVLGDQKMINTTYSTYYYLQDNTRGNGIFTYDAKYRTTLPGSLWADADNQFFASYDAPAVDAHYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDCNNAAIRSSVHYSQGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFZPLSGGIDVVAHELTHAVTDYTAGLJYQNESGA]NEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTPGISGDSLRSMSDPAKYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTNYGVSVVGIGRDKLGKIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVGVK(SEQ ID NO:3)

从pHPLT质粒DNA(van Solingen等人,Extremophiles,5:333-341,2001)，以及从Geobacillus caldoproteolyticus的基因组DNA(Chen等人,Extremophiles,8:489-498,2004)扩增嗜热菌蛋白酶基因，构建pHPLT-嗜热菌蛋白酶表达载体。在图2中提供了pHPLT质粒的图谱。该质粒包含地衣芽孢杆菌的热稳定淀粉酶LAT启动子(P_LAT)以驱动嗜热菌蛋白酶表达。使用Finnzymes(Finnzymes OY,Espoo,Finland)Phusion高保真DNA聚合酶(产品编号F-530L)和下列引物从基因组DNA扩增嗜热菌蛋白酶基因:

pHPLT-ProT-FW:

GAGACCGTAAAGAATGAAAATGAAAATGAAATTAGCATC

(SEQ ID NO:4)

proT-EcoRI-RV

GTTAACCTGCAGGAATTCTTATTTCACCCCTACCGCATCAAAGGCC

(SEQ ID NO:5)

使用Finnzymes Phusion 高保真DNA聚合酶和下列引物从质粒pHPLT扩增pHPLT片段：

pHPLT-ProT-RV

CATTTTCATTTTCATTCTTTACCCTCTCCTTTTTGCTAGAC

(SEQ ID NO:6)

proT-EcoRI-FW

CCATAAGAATTCCTGCAGGTTAACAGAGGACGGATTTCCTGAAGG

(SEQ ID NO:7)

使用下列PCR条件扩增两个片段:

在98°C进行30秒，30x(在98°C进行10秒,在55°C进行20秒,和在72°C进行45秒(嗜热菌蛋白酶)或在72°C进行80秒(pHPLT)),然后在72°C进行5分钟。将所得的PCR产物在E-gel(Invitrogen)上电泳，切出，然后用凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。此外，通过使用下列引物，利用高保真platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)，通过PCR重叠延伸融合(Ho,Gene,15:51-59,1989)，融合上述基因片段:

proT-EcoRI-FW

CCATAAGAATTCCTGCAGCTTAACAGAGGACGGATTTCCTGAAGG

(SEQ ID MO：7)

proT-EcoRI-RV

GTTAACCTGCAGGAATTCTTATTTCACCCCTACCGCATCAAAGGCC

(SEQ ID NO:5)

下列条件用于这些反应：

在94°C进行2分钟，25X(在94°C进行30秒,在55°C进行30秒和在68°C进行5分钟)，然后在68°C进行5分钟。将所得的PCR融合产物在E-gel(Invitrogen)上电泳，然后切出，用凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。切割(PstI)纯化的融合产物，然后自连接(T4DNA连接酶,Invitrogen)。在图3中提供了pHPLT-嗜热菌蛋白酶表达载体的图谱，而pHPLT-嗜热菌蛋白酶表达载体的DNA序列(SEQ ID NO:8)提供于图4中。

用连接混合物转化枯草芽孢杆菌SC6.1(表型:ΔaprE,ΔnprE,oppA,ΔspoIIE,degUHy32,ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)。如WO02/14490（通过引用合并入本文）中所述进行枯草芽孢杆菌SC6.1株的转化。在装有25mlMBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基)和20mg/L新霉素的摇瓶中，选择性生长含有pHPLT-嗜热菌蛋白酶载体的枯草芽孢杆菌转化体。培养导致具有蛋白水解活性的分泌型成熟嗜热菌蛋白酶的产生。使用NuPage Novex10%Bis-Tris凝胶(Invitrogen,Catalog No.NP0301BOX)进行凝胶分析。为了制备用于分析的样品，将2体积的上清液与1体积的1M HCl、1体积的4X LDS样品缓冲液(Invitrogen,Catalog No.NP0007)和1%PMSF(20mg/ml)混合，然后在70°C加热10分钟。然后，将25μL的各样品装载至凝胶上，与10μL的SeeBlue plus2预染蛋白质标准(Invitrogen,CatalogNo.LC5925)相邻。结果清楚地显示本实施例中描述的嗜热菌蛋白酶克隆策略适用于在枯草芽孢杆菌中产生活性重组嗜热菌蛋白酶。

实施例3

嗜热菌蛋白酶位点评估文库(SEL)的产生

在本实施例中，描述了用于构建嗜热菌蛋白酶SEL的方法。如之前所指出的，术语“嗜热菌蛋白酶”、“bacillolysin”、“蛋白酶-T”和“PrT”在整个说明书可以互换使用，表示G.caldoproteolyticus的中性金属蛋白酶。pHPLT-嗜热菌蛋白酶载体(图3)包含嗜热菌蛋白酶表达盒，其用作位点评估文库的模板DNA。每一个嗜热菌蛋白酶位点评估文库包含一个枯草芽孢杆菌克隆集合，其全都表达特定的嗜热菌蛋白酶变体。每个文库包含枯草芽孢杆菌克隆，最大包括20种不同的变体。例如，嗜热菌蛋白酶SEL27包含如下变体，在该变体中编码成熟嗜热菌蛋白酶位置27上的酪氨酸的DNA三联体被编码如下氨基酸的另一DNA三联体置换:丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。

简而言之，成熟嗜热菌蛋白酶的DNA编码链中的特定位置的DNA三联体被替换。然后将突变的嗜热菌蛋白酶片段连接至pHPLT。将pHPLT-嗜热菌蛋白酶变体质粒用于转化枯草芽孢杆菌SC6.1。使用Sloning BioTechnology GmbH(Puchheim,Germany)的基因合成产品和服务进行prt变体的产生。通过DNA测序验证各变体的具体突变。

实施例4

制备粗嗜热菌蛋白酶样品

通过在96孔MTP中在含有10mg/L新霉素的MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基)中于37℃培养枯草芽孢杆菌转化体68小时，产生嗜热菌蛋白酶(也称为蛋白酶-T或PrT)变体蛋白质。基本如本领域中已知的(参见,Neidhardt等人,J Bacteriol,119:736-747,1974)制备MBD培养基，但是从该基础培养基中省去NH₄Cl、FeSO₄和CaCl₂，使用3mMK₂HPO₄，并向该基础培养基补充60mM尿素、75g/L葡萄糖和1%soytone。此外，微量营养物配制为100X贮存液：在1升中包含400mgFeSO₄.7H₂O,100mg MnSO₄.H₂O、100mg ZnSO₄.7H₂O、50mgCuCl₂.2H₂O、100mg CoCl₂.6H₂O、100mg NaMoO₄.2H₂O、100mgNa₂B₄O₇.10H₂O、10ml的1M CaCl₂和10ml的0.5M柠檬酸钠。

实施例5

嗜热菌蛋白酶在重役型液体(HDL)洗涤剂中的稳定性

Unilever洗涤剂ALL Small and Mighty,P&GFresh Breeze,P&G2X Fresh Breeze购自Walmart。将这些商购洗涤剂在90℃加热1小时，然后冷却至室温，以使这些清洁组合物中的蛋白酶失活。嗜热菌蛋白酶(也称为蛋白酶-T或PrT)的冻干粉末购自Sigma,将其以20mg/ml溶解于100mM Tris pH7和50%丙二醇中。通过离子交换层析从芽胞杆菌属物种上清液纯化NprE。向eppendorf中的1ml热处理的洗涤剂中加入800μg嗜热菌蛋白酶或NprE。将管在室温在振荡器上充分混合15分钟，然后在25℃或32℃温育。在不同的时间点，使用如实施例1中描述的AGLA测定法测量剩余的蛋白酶活性。简而言之，将10μl样品在AGLA缓冲液(50mM MES,pH6.5,0.005%Tween80,2.5mM CaCl2)中稀释441倍，然后将10μl稀释的样品加入200μl AGLA底物(2.4mM在AGLA缓冲液中的Abz-AGLA-Nba)中。在前100秒，监控350nm处的激发和415nm处的发射，然后将初始斜率记录为酶活性。将酶活性相对于时间进行作图，以指数衰减进行曲线拟合。

如图5中所示的，在室温在Unilever All Small&Mighty中嗜热菌蛋白酶比NprE稳定140倍。类似地，如图6中所示，在32℃在P&G中嗜热菌蛋白酶比NprE稳定68倍，而图7显示在32℃在P&G2X中嗜热菌蛋白酶比NprE稳定98倍。因此，在Unilever洗涤剂ALL(3X)、P&G1X Fresh Breeze和P&G2X Fresh Breeze中嗜热菌蛋白酶比NprE要稳定得多。

实施例6

金属蛋白酶抑制剂可提高嗜热菌蛋白酶在重役型液体(HDL)洗涤剂中的稳定性

氯化锌、膦酰二肽、galardin是已知的金属蛋白酶抑制剂。它们购自Sigma，将其溶解于水或DMSO中。将不同浓度的抑制剂与嗜热菌蛋白酶(也称为蛋白酶-T或PrT)在室温预混合10分钟。然后将抑制剂加入Unilever洗涤剂ALL Small and Mighty以使在1ml的总体积中嗜热菌蛋白酶的终浓度为800μg/ml。在不同的时间点，采集样品，然后用TCA沉淀。简而言之，向冰上500μl的0.2N HCl中加入10μl含酶的洗涤剂样品，然后加入500μl20%TCA。混合试管，然后在冰上温育20分钟。收集沉淀，用90%冰冷的丙酮清洗。将沉淀溶解在样品上样缓冲液(Invitrogen)中以进行SDS-PAGE分析。如图8中所示，500μM膦酰二肽和1mM galardin显著稳定洗涤剂中的嗜热菌蛋白酶。

实施例7

嗜热菌蛋白酶变体在2X微型布样测定试验中的去污性能

在本实施例中，进行实验以测定各种单置换的嗜热菌蛋白酶(在本文中也称为蛋白酶-T或PrT)变体的去污性能。如实施例1中所描述的，使用血/乳/墨(BMI)微型布样测定法，测定嗜热菌蛋白酶变体的污渍清洁性能。简而言之，在2X微型布样测定法中评价所选的单置换嗜热菌蛋白酶变体的清洁性能。表7-1提供了受试变体的性能指数(例如，与野生型嗜热菌蛋白酶相比较显示提高的性能)。具有大于1的性能指数(PI>1)的变体具有提高的性能。如由这些结果所显示的，许多具有单个氨基酸置换的变体在本测定系统中表现比野生型酶更好的性能。

实施例8

嗜热菌蛋白酶变体在2X液体洗涤剂中的稳定性

在本实施例中，进行实验以评价在液体洗涤剂存在的情况下各种单置换的嗜热菌蛋白酶(在本文中也称为蛋白酶-T或PrT)变体的稳定性。如实施例1中所述，在升高的温度在2X重役型液体(HDL)洗涤剂存在的情况下进行温育之前和之后，测量AGLA活性，由此确定嗜热菌蛋白酶变体的稳定性。表中包括了与野生型嗜热菌蛋白酶相比较的相对稳定性值，其为变体残留活性除以野生型残留活性的商。大于1的值指示在洗涤剂存在的情况下更高的稳定性。在表8-1和表8-2中，提供的数据显示在DTPA存在和不存在的情况下在HDL洗涤剂中嗜热菌蛋白酶的单置换变体相对于野生型嗜热菌蛋白酶的相对稳定性。

上述说明书中提及的所有出版物和专利通过引用合并入本文。本发明的所述方法和系统的各种修饰和变型对于本领域技术人员来说是显然的，并且不背离本发明的范围和精神。虽然已结合特定的优选实施方案描述了本发明，但应当理解所述发明不应当被不适当地限定于这些特定的实施方案。事实上，已经描述的用于实施本发明的模式的各种修饰对于相关领域的技术人员来说是显而易见的，并旨在落入下列权利要求的范围内。

Claims (21)

1.分离的嗜热菌蛋白酶变体，其中所述嗜热菌蛋白酶变体是地芽胞杆菌嗜热菌蛋白酶变体，所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:3相差一个氨基酸置换，其中所述置换选自置换T006G、T006H、T006I、T006K、T006M、T006N、T006P、T006Q、T006R、T006V、T006W、T006Y、V007F、V007H、V007K、V007L、V007M、V007P、V007Q、V007R、V007T、V007Y、T049G、T049H、T049I、T049K、T049L、T049N、T049P、T049Q、T049W、A058I、A058P、A058R、F063I、F063L、F063P、S065K、S065Y、Y075G、Y075M、Y075T、Q128H、Q128I、Q128L、Q128M、Q128V、Q128Y、Y151D、Y151E、Y151H、Y151K、Y151M、Y151N、Y151Q、Y151R、Y151T、Y151V、Y151W、I156M、I156R、I156T、I156W、G196R、Q273I、Q273P、Q273Y、T278K、T278M、T278P、N280K、N280R、T006A、T006C、T049M、A056C、A056R、A056Y、A058S、S065C、S065E、S065I、S065T、Y151A、Y151C、Y151S、I156H、I156K、G196D、G196H、Q273A、Q273N、Q273T、Q273W、T278C、T278H、T278N、T278S、T278Y、N280E、N280I、N280L、N280M、N280S、T049D、T049S、A056E、A058C、A058E、Q061E、Q061M、S065D、S065P、S065V、S065W、Q128C、Q128T和I156E，其中所述嗜热菌蛋白酶变体与SEQ ID NO:3的嗜热菌蛋白酶相比具有提高的稳定性和/或性能，并且其中所述提高的稳定性提供了在洗涤剂存在情况下在稳定性测定法中大于1.0的性能指数(PI)，和/或其中所述提高的性能提供了在血液/乳/墨(BMI)微型布样测定法中大于1.0的性能指数(PI)。

2.用于产生具有嗜热菌蛋白酶活性的酶的方法，其包括:

i)用包含编码根据权利要求1的嗜热菌蛋白酶变体的多核苷酸的表达载体转化细胞；和

ii)在适于产生所述嗜热菌蛋白酶的条件下培养所述转化的宿主细胞。

3.权利要求2的方法，其中所述方法还包括收获产生的嗜热菌蛋白酶的步骤。

4.权利要求2的方法，其中所述宿主细胞是芽胞杆菌属物种。

5.包含至少一种获自权利要求4的重组芽胞杆菌属物种宿主细胞的嗜热菌蛋白酶变体的组合物。

6.权利要求5的组合物，其中所述组合物还包含至少一种钙离子和/或锌离子。

7.权利要求5的组合物，其中所述组合物还包含至少一种稳定剂。

8.权利要求7的组合物，其中所述稳定剂选自硼砂、甘油、锌离子、钙离子和甲酸钙。

9.权利要求7的组合物，其中所述稳定剂是至少一种在阴离子表面活性剂存在的情况下稳定该至少一种嗜热菌蛋白酶的竞争性抑制剂。

10.权利要求5的组合物，其中所述组合物是清洁组合物。

11.权利要求10的组合物，其中所述清洁组合物是洗涤剂。

12.权利要求5的组合物，其还包含至少一种选自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的酶。

13.权利要求5的组合物，其中所述组合物包含至少0.0001重量百分比的所述嗜热菌蛋白酶变体。

14.权利要求5的组合物，其中所述组合物包含0.001至0.5重量百分比的所述嗜热菌蛋白酶变体。

15.权利要求5的组合物，其还包含至少一种辅助成分。

16.权利要求5的组合物，其还包含足够量的pH调整剂以提供具有3至5的净pH的组合物，所述组合物不含有在pH3至pH5的pH水解的物质。

17.权利要求16的组合物，其中所述在pH 3至pH 5的pH水解的物质包含至少一种表面活性剂。

18.权利要求17的组合物，其中所述表面活性剂是包含环氧乙烷部分的烷基硫酸钠表面活性剂。

19.权利要求5的组合物，其中所述组合物是液体。

20.一种清洁方法，其包括将包含织物的物品和/或表面与包含权利要求1的分离的嗜热菌蛋白酶变体的清洁组合物接触的步骤。

21.权利要求20的方法，其还包括在将所述物品或表面与所述清洁组合物接触后漂洗表面和/或物品的步骤。