JP2011502506A - サーモリシン及びその変異体の生成及び液体洗剤での使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書において、他の意味を持つものとして規定しない限り、本明細書の全ての技術及び科学用語はこの発明が関係する技術分野の当業者により通常理解されると同じ意味を持つ。本明細書に記載のこれらの方法と同様又は同等な方法及び材料は、本発明の実施に使用することができるが、本明細書では好ましい方法及び材料が記載されている。したがって、以下に続いて定義される用語は明細書を全体として考察することにより、より完全に把握することができる。
「分離された」(isolated)又は「精製された」(purified)はその元の環境(例えば、もし天然(自然)に発生する場合は自然環境)から取出された材料を言う。例えば、材料は、それが特別の組成物中で、天然に発生する又は野生型有機体に存在する、又は天然に発生する又は野生型有機体から発現して通常存在しない組成物と組み合わされたものよりも、より高い又は低い濃度で存在する場合「精製されている」と言う。例えば、生きている動物中で天然に発生するポリヌクレオチド又はポリペプチドは分離されていないが、天然のシステム中の共存する材料の一部又は全部から分離されている同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは分離されている。その様なポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、及び/又はその様なポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であり得る、及びさらにその様なベクター又は組成物はその自然環境の一部でないと言う意味で分離されている。ある好ましい実施の態様において、例えば、もしそれが電気泳動ゲル又はブロットで本質的に一つのバンドを生成する場合は核酸又はタンパク質は精製されていると言われる。
通常低洗剤濃度系であると考えられる。その理由は日本の洗剤は洗濯水中に通常約667 ppmの洗剤成分を含むからである。
断らない限り、本明細書に記載のすべての成分又は組成物のレベルはその成分及び組成物の活性レベルに関して言い、商業的に入手可能なソースに存在する不純物、例えば、残留溶媒又は副産物を含まない。酵素成分重量は全活性タンパク質に対するものである。すべてのパーセント及び比率は断らない限り重量によるものである。代表的な洗剤組成物では酵素レベルは全組成物の重量による純粋酵素により表し、断らない限り洗剤成分は全組成物の重量によるものである。
本発明の中性金属プロテアーゼは種々の洗浄組成物を調剤するのに有用である。本発明の洗浄組成物は、例えば、入れ歯、歯、毛髪、皮膚の様な化粧での応用のみならず洗濯、硬表面洗浄、自動皿洗機で有利に用いることができる。しかし、低温溶液でより効果的に使用できるというユニークな有利な点及び優れた色彩維持特性により、本発明の酵素は織物の漂白の様な洗濯での使用に理想的に適している。さらに、本発明の酵素は顆粒状及び液体組成物の両方で使用することができる。
ある好ましい実施の態様においては、本発明の組成物は使用者により選択される任意の好適な形に調剤され及び任意のプロセスにより調剤される(例えば、米国特許第5,879,584号, 米国特許第5,691,297号, 米国特許第5,574,005号, 米国特許第 5,569,645号, 米国特許第5,565,422号, 米国特許第5,516,448号、米国特許第5,489,392号, 米国特許第5,486,303号を参照願いたいが、これらに限定されるものではない)。低いpH洗浄組成物が望まれるある実施の態様においては、その様な組成物のpHは、HCLの様な酸性材料を加えることにより調整される。
本発明の目的の実現に必須ではないが、ある実施の態様においては、本明細書に記載の補助材料は本発明の洗浄組成物での使用に好適であるが補助材料はこれらに限定されるものではない。
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つの界面活性剤又は界面活性剤系を含み、界面活性剤は非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性電解質界面活性剤、両性イオン界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物から選択される。ある低pH洗浄組成物の場合(例えば、約3から約5の純粋pHの組成物)、その様な界面活性剤は酸性組成物中で加水分解されると信じられているため、その様な組成物は通常アルカリエトキシ化硫酸塩を含まない。
ある実施の態様においては、本発明の洗剤組成物は一以上の洗剤ビルダー又はビルダー系を含む。少なくとも一つのビルダーを含むある実施の態様においては、洗剤組成物は洗浄組成物の重量の少なくとも約1%から、約3%から約60%又はさらに約5%から約40%のビルダーを含む。
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つのキレート剤を含む。好適なキレート剤は、銅、鉄及び/又はマンガンキレート剤及びこれらの混合物を含む。少なくとも一つのキレート剤が使用される実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は洗浄組成物の重量の約0.1% から約15% 又はさらに約3.0% から約10%キレート剤を含む。
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つの沈着助剤を含む。好適な沈着助剤は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボキシレート、ポリテレフタル酸の様な汚れ防止ポリマー、カオリナイト、モンモリナイト、アタプルガイト、イライト、ハロイサイト及びこれらの混合物を含むが、これに限定されるものではない。
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は一以上の染料移動抑制剤を含む。好適な重合染料移動抑制剤には、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンンーオキシドポリマー、ンービニルピロリドン、及びN-ビニルイミダゾール、ポリビニルオキサドリドン及びポリビニルイミダゾールのコポリマー又はこれらの混合物を含むがこれに限定されるものではない。
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つの分散剤を含む。好適な水溶性有機材料はホモー又はコポリマー酸又はそれらの塩を含み、コポリマー酸又はその塩はお互いに2つの炭素原子より多く分離されていない少なくとも2つのカルボキシルラジカルを含んでいるが、水溶性有機材料はこれに限定されるものではない。
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は一以上の洗剤用酵素を含み、これらの酵素は洗浄効果及び/又は衣類の柔軟材の持つ利点を提供する。好適な酵素の例には、ヘミセルラーゼ、ペロキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノロキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β―グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ又はこれらの混合物を含むが、これに限定されるものではない。ある実施の態様においては、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ及び/又はセルラーゼの様な従来用いられる酵素を含むがアミラーゼと組み合されて使用される(すなわち、カクテル)。
本発明のある実施の態様においては、本発明の洗剤製剤に使用される酵素は安定化される。酵素の安定化のための種々の技術が本発明において使用することが考慮されている。例えば、ある実施の態様においては、本発明で使用される酵素は最終製品組成物において水に可溶な亜鉛(II)、カルシウム(II)及び/又はマウネシウム(II)イオンの存在により安定化される。前記組成物は酵素にその様なイオン並びに他の金属イオン(例えば、バリウム(II),スカンジウム(II)、鉄(II)、マンガン(II)、アルミニウム(III)、スズ(II)、コバルト(II)、銅(II),ニッケル(II),及びオキソ バナジウム(IV)を提供する。
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は一以上の触媒金属複合体を含む。ある実施の態様においては、金属含有漂白触媒を使用することができる。ある好ましい実施の態様においては、金属漂白触媒は、規定された漂白触媒活性の遷移金属カチオン(例えば、銅、鉄、チタン、レニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンイオン)、漂白触媒活性を殆ど又は全く持たない補助金属カチオン(例えば、亜鉛、又はアルミニウムカチオン)、及び触媒性及び補助金属カチオンにおいて既定の安定度定数を持つ金属イオン封鎖を含む触媒系を含み、特にエチレンジアミンテトラ酢酸、液体ジアミンテトラ(メチレンリン酸)及びそれらの水溶性塩が使用される(例えば、米国特許第4,430,243号を参照)。
本発明の洗浄組成物は任意の好適な形に製剤され及び調剤者により選択される任意の好適なプロセスにより生成される(例えば、米国特許第5,879,584号, 米国特許第5,691,297号, 米国特許第5,574,005号, 米国特許第5,569,645号, 米国特許第5,565,422号, 米国特許第5,516,448号, 米国特許第5,489,392号, 米国特許第5,486,303号, 米国特許第4,515,705号, 米国特許第4,537,706号, 米国特許第 4,515,707号, 米国特許第. 4,550,862号, 米国特許第. 4,561,998号, 米国特許第. 4,597,898号, 米国特許第4,968,451号, 米国特許第5,565,145号, 米国特許第5,929,022号, 米国特許第6,294,514号,及び米国特許第6,376,445号を参照願いたい。これらの全ての文献は非限定的例として参照により本明細書に組み入れられる。)
使用方法
好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は表面及び/又は織物洗浄に使用できる。ある実施の態様においては、表面及び/又は織物の少なくとも一部は、純粋な形で又は洗濯液中で希釈させた本発明の洗浄組成物の少なくとも一つの実施の態様において接触させ、その後表面及び/又は織物は任意選択的に洗濯され及び/又は濯がれる。本発明の目的との関係では、「洗濯」の用語は手洗い及び機械的攪拌を含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、織物には、通常の消費者の使用条件で洗濯可能な織物を含む。好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は溶液中で約500 ppmから約15,000 ppmの濃度で使用される。
以下の実施例は本発明のある好ましい実施の態様及び特徴を示し及び説明するために提供するものであって本発明の範囲を限定するものと理解してはならない。
℃(摂氏度);rpm(分当り回転数);H2O(水);HCL(塩酸);aa及びAA(アミノ酸);bp(塩基ペア);kb(キロベースペア);kD(キロダルトン)gm(グラム);μg及びug(ミクログラム);mg(ミリグラム);ng(ナノグラム);μl及びυl(ミクロリットル);ml (ミリリットル); mm (ミリメータ); nm (ナノメータ); μm 及び um (ミクロメータ); M (モルの); mM (ミリモルの); μM及び uM (ミクロモルの); U (単位); V (ボルト); MW (分子量); sec (秒); min(s) (分); hr(s) (時間); MgCl2 (塩化マグネシウム); NaCl (塩化ナトリウム); OD280 (280 nmの光学濃度); OD405 (405 nmの光学濃度); OD600 (600 nmの光学濃度); PAGE (ポリアクリルアミド ゲル電気泳動法); EtOH (エタノール); PBS (リン酸緩衝生理食塩水 [150 mM NaCl, 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2]); LAS (ラウリル硫酸ナトリウム); SDS (ドデシル硫酸ナトリウム); Tris (トリ(ヒドロキシメチル)アミノメタン); TAED (N,N,N'N'-テトラアセチルエチレンジアミン); BES (スルホンポリエステル); MES (2-モルホリノエタンスルホン酸一水和物; f.w. 195.24; Sigma # M-3671); CaCl2 (無水塩化カルシウム; f.w. 110.99; Sigma # C-4901); DMF (N,N-ジメチルフォルムアミド, f.w. 73.09, d = 0.95); Abz-AGLA-Nba (2-アイノベンゾイル-L- アラニルグリシル-L-ロイシル-L-アラニノ-4-ニトロベンジルアミド, f.w. 583.65; Bachem # H-6675, VWR catalog # 100040-598); SBGl % ("Super Broth with Glucose"; 6 g Soytone [Difco], 3 g イースト抽出、6 g NaCl, 6 g グルコース);pHは、技術分野で知れらている方法を用いて殺菌前にNaOHによって7.1に調整された;
; w/v (重量対容積); v/v (容積体容積); Npr及びnpr (中性金属プロテアーゼ); SEQUEST(登録商標) (SEQUEST データベースサーチプログラム、 University of Washington); MS (質量分光法); BMI (blood, milk, ink); SRI (汚れ除去指数); Npr及びnpr (中性金属プロテアーゼ遺伝子); npr 及びNpr(中性金属プロテアーゼ酵素);nprE 及びNprE (バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ);Prt及びprt(プロテイナーゼ−T酵素)及びTLP(サーモリシン類似のプロテアーゼ)。
TIGR (ゲノム調査機構(The Institute for Genomic Research)
, Rockville, MD); AATCC (米国繊維化学者・色彩技術者協会(American Association of Textile and Coloring Chemists)); Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL); Corning (Corning International, Corning, NY); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Equest (Equest, Warwick International Group, Inc., Flintshire, UK); EMPA (スイス材料検査及び試験協会(Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt), St. Gallen, Switzerland); CFT (材料試験センター(Center for Test Materials)、Vlaardingen, The Netherlands); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ); Perkin-Elmer (Perkin-Elmer, Wellesley, MA); Rainin (Rainin Instrument, LLC, Wobura, MA); Eppendorf (Eppendorf AG, Hamburg, Germany); Waters (Waters, Inc., MiIf ord, MA); Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, MN); Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Cargill (Cargill, Inc., Minneapolis, MN); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); GIBCO BRL 又はGibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc., Edison, NJ); Thermoelectron (Thermoelectron Corp., Waltham, MA); BMG (BMG Labtech, GmbH, Offenburg, Germany); Greiner (Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austria); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI); Novex (Novex, San Diego, CA); Finnzymes (Finnzymes OY, Finland) Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); DuPont Instruments (Asheville, NY); Global Medical Instrumentation or GMI (Global Medical Instrumentation; Ramsey, MN); MJ Research (MJ Research, Waltham, MA); Infors (Infors AG, Bottmingen, Switzerland); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ); Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA); S-Matrix (S-Matrix Corp., Eureka, CA); US Testing (United States Testing Co., Hoboken, NY); West Coast Analytical Services (West Coast Analytical Services, Inc., Santa Fe Springs, CA);Ion Beam Analysis Laboratory (Ion Bean Analysis Laboratory, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford, UK); BaChem (BaChem AG, Bubendorf, Switzerland); Molecular Devices (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA); MicroCal (Microcal, Inc., Northhampton, MA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD); Argo Bioanalytica (Argo Bioanalytica. Inc, New Jersey); Vydac (Grace Vydac, Hesperia, CA); Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ); Zeiss (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY); Sloning BioTechnology GmbH (Puchheim, Germany); and Procter and Gamble (Cincinnati, OH).
実施例1
アッセイ
以下に記載の実施例において以下のアッセイが使用された。以下に記載の手順と異なる点は各実施例に示される。これらの実験では反応完了後に形成された製品の吸光度を測定するために分光光度計が使用された。
Bradford染料試薬(Quick Start)アッセイがマイクロタイタープレート(MTP)スケール上でサーモリシンサンプル中のタンパク質濃度を決定するために使用された。
Bradford Quick Start Dye Reagent(登録商標)(BIO-RADカタログ番号. 500-0205)
希釈緩衝液(10mM NaCl, 0.ImM CaCl2, 0.005% TWEEN(登録商標)-80)
使用された機器はBiomek FX Robot (Beckman Coulter) 及びSpectraMAX MTP Reader (タイプ340; Molecular Devices) である。MTPはCostar (タイプ9017)から入手した。
サーモリシン及びその変異体による汚れ除去効果がMTPスケール上でミクロ材料見本(EMPA 1 16)を用いて決定された。サーモリシンを含むプロテアーゼサンプルが、湿気を含む通気中で37℃、280rpmで振動させつつ3日間ミクロ材料見本で成長させた濾過培養液から得られた。
培養上澄みを含むサーモリシン(mlあたり-100 - 200 μgタンパク質)
TIDE(登録商標)2X (酵素は含まない)洗剤(P&G)
希釈緩衝液(10mM NaCl, 0.ImM CaCl2, 0.005% TWEEN(登録商標)-80)
使用された機器はBiomek FX Robot (Beckman Coulter), SpectraMAX MTP 読取機 (タイプ340; Molecular Devices)、及びiEMS 培養器/振動器 (Thermo/Labsystems)であり、 MTPはCostar (タイプ9017)から入手した。
Milli-Q水が(Ca/Mg 3:1) 硬度原液(282.3 g/L CaCl2.2H20, 130.1 g/L MgCl2.6H2O)を用いて6 gpgの水硬度に調製され、0.78 g/1洗剤TIDE(登録商標)2Xが加えられ、洗剤溶液は少なくとも15分強く攪拌された。その後5mM HEPESが加えられ、pHが8.2に調製された。
1/4インチ直径の円形ミクロ材料見本をCFT (Vlaardingen, オランダ)から入手した。材料見本を切断する前に、織物(EMPA 116)が脱イオン水中で大気温度で20分事前に洗われ、続けて空気乾燥された。2つのミクロ材料見本は全表面を露出させるために96ウエル マイクロタイタープレートの各ウエルに垂直に置かれた(すなわち、ウエルの底に水平にではなく)。
培養器の温度は20℃にされた。濾過された培養液は10 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, 0.005% TWEEN(登録商標)-80溶液の混合したものにより希釈され適当な濃度で試験された。洗剤溶液が上に述べた様に準備された。その後190μlの洗剤溶液がミクロ材料見本を含むMTPの各ウエルに加えられた。この混合物に、(各ウエルの全容量が200μl となるように)10μlの希釈酵素溶液が各ウエルに加えられた。MTPはプレートシールにより覆われ、そして1400rpm (iEMS培養器)で攪拌しつつ培養器中で20℃で30分置かれた。適当な条件下で、培養しそれに続いて各ウエルからl00μlの溶液が取られて新たなMTPに置かれた。
観測された吸光度はブランク値と対比して修正された(追加の酵素を加えることなくミクロ材料見本を培養した後に得られた)。得られた吸光度は加水分解活性の評価尺度である。各サンプル(サーモリシン又は変異体)についての効果指数(PI)が算出された。効果指数は同一のタンパク質濃度での変異体(実際の数値)と標準サーモリシン酵素(理論値)の効果との対比である。さらに、理論値が標準酵素のラングミュア等式のパラメータを用いて算出された。
サーモリシン及びその変異体の安定性が25%TIDE(登録商標)2X洗剤の存在下で既定の条件下で培養後に測定された。当初及び残留活性が決定された。
サーモリシンを含む培養上澄み(mlあたり-100 - 200 μgタンパク質)
DTPAキレート剤を含む及び含まないTIDE(登録商標)2X液体洗剤(P&G)
5.5 mM HEPES緩衝液中にDTPAを含む27.5% TIDE(登録商標)2X洗剤溶液, pH 8.2 (TIDE(登録商標)+溶液)
5.5 mM HEPES緩衝液中にDTPAを含まない27.5% TIDE(登録商標)2X洗剤溶液, pH 8.2 (TIDE(登録商標)+溶液)
MESアッセイ緩衝液(55.5 mM MES/NaOH, 2.6 mM CaCl2, 0.005% TWEEN(登録商標)-80, pH 6.5)
使用された機器はBiomek FX Robot (Beckman Coulter)、蛍光分光光度計(FLUOstar Optima; BMG), iEMS培養器/攪拌機(Thermo/Labsystems)であった。MTPはCostar (タイプ9017)及びGreiner (ブラックプレート(black plate)、タイプ 655076)から入手した。
ストレスのない条件
最初に、20μlのサーモリシンを含む培養上澄みが180μl MESアッセイ緩衝液により希釈された。その後20μlの希釈上澄みがさらに180μl MESアッセイ緩衝液により希釈された。続いてl0μlのこの希釈液が事前に25℃に温められたプレート(Greiner 655076)で190μl AGLA基質溶液に移された。全ての空気の泡は取り払われプレートは以下に述べるAGLA
プロテアーゼアッセイ手順に従い測定された。
最初に、20 μlの培養上澄みが180 μl 27.5% TIDE(登録商標)+洗剤溶液により希釈され、iEMS攪拌機に置かれた。プレートシールにより覆われたプレートは32°Cで、900 rpmの状態で合計で60分培養された。さらに、20 μlの培養上澄みが180 μl 27.5% TIDE(登録商標)+洗剤溶液により希釈され、iEMS攪拌機に置かれた。プレートシールにより覆われたプレートは50°Cで、900 rpmの状態で合計で180分培養された。
蛍光測定が励起350 nm及び放射420 nmで行なわれた。分光蛍光光度計ソフトウエアが各ウエルの蛍光の増加率(傾き)を(ミリー)RFU/分の回帰直線に対して算出された。
各サンプル(サーモリシン及びその変異体)について効果指数が、変異体の残留活性をサーモリシンの残留活性により除することにより算出された。効果指数は、同じ条件で決定された変異体の安定性と標準サーモリシン酵素(例えば、野生型又は親酵素)の安定性を比較したものである。
本明細書に記載の方法は、時間及び場所を問わず再生可能なプロテアーゼアッセイデータを生み出すレベルの技術的な明細を提供する。このアッセイはある与えられた実験室条件に適合させることができるが、変形された手順を用いて得られた任意のデータは本来の方法により得られた結果と調和させる必要がある。中性金属プロテアーゼは、2-アミノベンゾイル-L-アラニル-L-グリシル-L-ロイシル-L-アラニノ-4-ニトロベンゾイルアミド (Abz-AGLA-Nba)のグリシル及びロイシルの間のペプチド結合を切断する。溶液中の遊離
2-アミノベンゾイルーL-アラニングリシン(Abz-AG)(2-Aminobenzoyl-L- alanylglycine (Abz- AG))は415 nmの最大蛍光放射と340 nmの最大蛍光励起とを持つ。
MES アッセイ緩衝液- 55.5 mM MES, 2.6 mM CaCl2, 0.005% TWEEN(登録商標)-80, pH 6.5 Abz-AGLA-Nba 原液-ジメチルフォルムアミド (28.2 mg/ml DMF)中の48 mM Abz-AGLA-Nba
使用された機器はBiomek FX Robot (Beckman Coulter)、分光蛍光光度計(FLUOstar Optima; BMG), iEMS培養器/攪拌機(Thermo/Labsystems)及びInnova 培養器 (Innova-4230; New Brunswick)である。MTPはCostar (タイプ9017)及びGreiner (ブラックプレート(black plate)、タイプ 655076)から入手した。
Abz-AGLA-Nbaアッセイ溶液は1 mlのAbz- AGLA-Nba原液を19 ml MES基質緩衝液に加えることにより準備し、そして少なくとも2分混合された。続いてサーモリシン又はその変異体を含む培養上澄みがMESアッセイ緩衝液によりmlあたり1-6 μgタンパク質濃度に希釈された。
バチルススブチリスでのサーモリシンの生成
この実施例では、バチルススブチリスでサーモリシンを生成する実験について記述する。
98℃で30秒、30x(98°Cで10秒、55℃で20秒及び72℃で45秒 (サーモリシン)又は72℃で80秒 (pHPLT)), 続いて72℃で5分。
サーモリシン部位評価ライブラリーの生成(SEL)
この実施例ではサーモリシンSELの構築で使用される方法について記述する。上で述べた様に、「サーモリシン」、「バチロリシン」、「プロティナーゼ−T」及び「PrT」の用語は本明細書を通して相互交換的に用いられ、ジオバチルス カルドプロテオリチカスの中性金属プロテアーゼを指す。pHPLT-サーモリシンベクター(図3)はサーモリシン発現カセットを含み、前記カセットは部位評価ライブラリーのためのテンプレートDNAとして働く。各サーモリシン部位評価ライブラリーはバチルススブチリスのクローンの集まりを含み、その全てが特異サーモリシン変異体を発現させる。各ライブラリーはバチルススブチリス クローンを最大20の異なる変異体を含む。
粗サーモリシンサンプルの生成
サーモリシン(またプロテイナーセーT、又はPrTと言う)変異体が、10 mg/Lネオマイシンを含むMBD媒体(MOPSベースの規定された媒体)中で、96 ウエルMTPで37℃で68時間バチルススブチリス形質転換細胞を培養することにより生成された。MBD媒体は本質的に技術分野で知られている方法で生成された(Neidhardt 他, J Bacteriol, 1 19: 736-747, 1974を参照)が、以下の点のみが異なっている。すなわち、ベース媒体からNH4Cl, FeSO4,及びCaCl2が除かれ、3 mM K2HPO4 が使用され、そしてベース媒体は60 mM 尿素、75 g/Lグルコース及び1% のソイトン(soytone)で補充された。また微量栄養素は1リットル中に以下を含む100X量の原料として作られた:400 mg FeSO4.7H2O, 100 mg MnSO4.H2O, 100 mg ZnSO4.7H2O, 50 mg CuCl2 .2H2O, 100 mg CoCl2.6H2O, 100 mg NaMoO4.2H2O, 100 mg Na2B4O7.10H2O, 10 mlの1M CaCl2,及び10 mlの0.5 Mクエン酸ナトリウム。
重質液体洗剤(Heavy Duty Liquid (HDL) Detergent)中のサーモリシンの安定性
Unileverの洗剤ALL Small and Mighty, P&G TIDE(登録商標) Fresh Breeze, P&G TIDE(登録商標)2X Fresh BreezeをWalmartで購入した。この市場で入手可能な洗剤が90℃で1時間加熱され、その後室温に冷やされ、この洗浄組成物のプロテアーゼを不活性化した。凍結乾燥された粉末中のサーモリシン(またプロテイナーセーT、又はPrTと言う)をSigmaから購入し、100mM Tris pH 7及び20mg/mlの 50%プロピレングリコールで溶解した。
金属プロティナーゼ抑制剤は重質液体(HDL)洗剤中でサーモリシンの安定性を向上させることができる。塩化亜鉛(Zinc Chloride), フォスフォラミドン(Phosphoramidon), ガラルジン(Galardin)は知られた金属プロテイナーゼ抑制剤である。これらはSigmaから購入し水又はDMSOで溶解した。異なる濃度の抑制剤が室温で10分サーモリシン(またプロテイナーセーT、又はPrTと言う)と事前混合された。その後抑制剤はUnilever 洗剤ALL Small and Mightyに加えられサーモリシンの最終濃度は、1mlの全容量中で800μg/mlであった。異なる時間に、サンプルが採取されTCAで沈殿された。端的に言うと、酵素を含む10μlの洗剤のサンプルが冷やされた500μlの0.2N HCLに加えられ、その後500μlの20%TCAが加えられた。試験管は混合され氷上で20分培養された。ペレットが回収され良く冷やした90%アセトンで洗われた。SDS-PAGE分析のため、ペレットがサンプルを含む緩衝液(Invitrogen)中で溶解された。図8に示す様に、500μDMのフォスフォラミドン(Phosphoramidon)及び1mMのガラルジン(Galardin)は共に洗剤中でサーモリシンを大きく安定化させる。
TIDE(登録商標)2Xミクロ材料見本アッセイでのサーモリシン変異体の汚れ除去効果
この実験では、種々の単一置換されたサーモリシン(またプロテイナーセーT、又はPrTと言う)変異体の汚れ除去効果を決定することが行われた。
TIDE(登録商標)2X液体洗剤中のサーモリシン変異体の安定性
この実施例では、液体洗剤の存在する中で、種々の単一置換されたサーモリシン(またプロテイナーセーT、又はPrTと言う)変異体の安定性を評価する実験が行われた。
Claims (38)
- 単離されたサーモリシンがジオバチルスサーモリシン又はバチルスサーモリシンである前記サーモリシン及び中性金属プロテアーゼ抑制剤を含む組成物。
- 前記中性金属プロテアーゼ抑制剤がフォスフォラミドン及びガラルジンである、請求項1の組成物。
- 前記ジオバチルスがG.カルドプロテオリチカス又はG.ステアロサーモフィルスである、請求項1の組成物。
- 前記バチルスがB.サーモプロテオリチカスである、請求項1の組成物。
- 前記サーモリシンが配列番号3に示すアミノ酸配列と少なくとも50%のアミノ酸の同一性を持つ、請求項1の組成物。
- 前記サーモリシンは配列番号3に示すアミノ酸配列を含む、請求項1の組成物。
- 改良された安定性及び/又は効果を持つ単離されたサーモリシン変異体。
- 前記サーモリシン変異体は、配列番号3に示すアミノ酸配列の6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278, 及び280の位置と同等の位置から選択された位置に一以上の置換を持つアミノ酸配列を持つジオバチルスサーモリシン変異体である、請求項7の単離されたサーモリシン変異体。
- 前記一以上の置換は配列番号3に示すアミノ酸配列の6, 7, 49, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 128, 151, 156, 196, 273, 278, 及び280の位置と同等の位置から選択された位置に1、2、3、4又は5の置換を含む、請求項8の単離されたサーモリシン変異体。
- 前記サーモリシン変異体は配列番号3に示すアミノ酸配列の4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280 及び297の位置と同等の位置から選択された位置に一以上の置換を含むアミノ酸配列を持つジオバチルスサーモリシン変異体である、請求項7の単離されたサーモリシン変異体。
- 前記一以上の置換は配列番号3に示すアミノ酸配列の4, 6, 7, 36, 49, 53, 56, 58, 61, 63, 65, 75, 85, 108, 128, 129, 151, 156, 194, 195, 196, 261, 265, 273, 278, 280及び297の位置と同等の位置から選択された位置に1、2、3、4又は5の置換を含む、請求項10の単離されたサーモリシン変異体。
- 野生型ジオバチルス属サーモリシン(例えば、配列番号3に示すアミノ酸配列を含むサーモリシン)と比較して改良された安定性及び/又は効果を持つ単離されたサーモリシン変異体。
- 前記改良は改良された熱安定性、より低い又はより高いpH条件下で改良された効果、及び改良された自己分解安定性の内の一以上の改良を含む、請求項14の単離されたサーモリシン変異体。
- サーモリシン活性を持つ酵素を生成する方法であって、
i) 配列番号3に示すアミノ酸配列と50から99%のアミノ酸の同一性を持つサーモリシン変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換すること、及び
ii) 前記サーモリシンの生成に適した条件下で前記形質転換された宿主細胞を培養すること
を含む、前記方法。 - さらに生成されたサーモリシンを収穫することを含む、請求項16の方法。
- 前記宿主細胞がバチルス属(例えば、バチルススブチリス)である、請求項16の方法。
- 請求項18の組み換えバチルス属宿主細胞から得られた少なくとも一つのサーモリシン変異体を含む組成物。
- 前記組成物がさらに少なくとも一つのカルシウムイオン及び/又は亜鉛イオンを含む、請求項7の組成物。
- 前記組成物はさらに少なくとも一つの安定剤を含む、請求項7の組成物。
- 前記安定剤はホウ砂、グリセロール、亜鉛イオン、カルシウムイオン、及びギ酸カルシウムから選択される、請求項21の組成物。
- 前記安定剤は陰イオン界面活性剤の存在下で少なくとも一つのサーモリシンを安定化する少なくとも一つの競合的抑制剤である、請求項21の組成物。
- 前記組成物は洗浄組成物である、請求項7の組成物。
- 前記洗浄組成物は洗剤である、請求項24の組成物。
- プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンアーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ及びセルラーゼから選択される少なくとも一つの追加の酵素又は酵素誘導体をさらに含む、請求項7の組成物。
- 前記組成物が少なくとも約0.0001重量%の前記サーモリシン変異体を含む、請求項7の組成物。
- 前記組成物は約0.001から約0.5重量%の前記サーモリシン変異体を含む、請求項7の組成物。
- さらに少なくとも一つの付加成分を含む、請求項7の組成物。
- 請求項7の組成物であり、前記組成物に約3から約5の純粋のpHを提供するのに十分な量のpH調整剤をさらに含み、前記組成物は約3から約5のpHで加水分解する材料を実質的に含まない、前記組成物。
- 約3から約5のpHで加水分解する前記材料は少なくとも一つの界面活性剤を含む、請求項30の組成物。
- 前記界面活性剤はエチレンオキシド部分を含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤である、請求項31の組成物。
- 前記組成物は液体である、請求項7の組成物。
- 請求項7の単離サーモリシン変異体を含む動物の飼料用組成物。
- 請求項7の単離サーモリシン変異体を含む繊維加工用組成物。
- 請求項7の単離サーモリシン変異体を含む皮革加工用組成物。
- 表面及び/又は織物を含む商品を請求項7の単離サーモリシン変異体を含む洗浄組成物に接触させるステップを含む、洗浄方法。
- さらに前記表面又は材料を洗浄組成物に接触させた後に前記表面及び/又は材料を濯ぐステップを含む、請求項37の洗浄方法。
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