CN116179519B - 动性球菌来源的蛋白酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于工业酶制剂的洗涤用酶领域，具体涉及一种动性球菌来源的蛋白酶在制备洗涤产品中的应用。所述蛋白酶，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，最适作用温度60℃，最适pH为8.0；Cu2+和Mn2+对该酶的活性有促进作用，该酶能够抵制DTT、EGTA、Urea对其的抑制作；与洗涤剂中的表面活性剂具有良好的兼容性，可以作为环保型添加剂应用到洗涤行业，同时洗涤剂中添加本发明提供的蛋白酶能提高洗衣液的去污能力。

Description

动性球菌来源的蛋白酶及其应用
技术领域：
本发明属于工业酶制剂领域，具体涉及一种动性球菌来源的蛋白酶及其应用。
背景技术：
在全球节能减排的宏观经济政策之下，人们开始注意到传统洗涤剂的成分通常是一些表面活性剂，这些表面活性剂在使用过程中会随着污水的排出对环境造成一定的污染。为了达到理想的洗涤效果，洗衣液中添加酶制剂已在国际洗涤用品工业中达成共识。目前市面上的高档次产品为了保证竞争优势一般都会加入酶制剂。
蛋白酶作为一种蛋白质，属于可降解的物质，其在洗涤剂、皮革制造、纺织制造等工业中被广泛应用和研究。将酶添加到洗涤剂中不仅可以代替部分的表面活性剂，而且在降低洗涤温度、减少漂洗次数和提高去污力等方面都有很好的实际应用效果，最终达到节能节水、减少不可再生资源的使用、减少污染物排放和保护环境的作用，通过使用酶所获得的多方面的好处必然会转化为一个更绿色的世界。而在洗涤中添加的主要的酶制剂以蛋白酶为主，其年销量占世界酶制剂市场的60％以上。但国内酶制剂市场拥有自主知识产权的酶及酶制剂企业相对较少。
芽孢杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效的分泌各种蛋白质；2、许多芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，芽孢杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；
因此，本发明从南印度洋的深海沉积物中分离到一株新的动性球菌(Planococcussp.)11815，并对11815菌株进行了全基因组测序，从Planococcussp.11815的基因组中获得蛋白酶基因nprS-15615，并通过地衣芽孢杆菌2709菌株实现基因组整合异源表达，同时对该酶的酶学性质以及与表面活性剂的相互作用展开研究，为了解这个新的蛋白酶以及开发新型的酶制剂奠定基础。
发明内容：
为解决上述技术问题，本发明利用分子生物学手段，对地衣芽胞杆菌进行蛋白酶基因nprS-15615的异源表达，并对该酶的酶学性质以及与表面活性剂的相互作用展开研究，获得一株含有新的蛋白的工程菌，并将其应用于蛋白酶的生产。
本发明提供的技术方案之一，是一种动性球菌来源的蛋白酶，所述蛋白酶具有SEQID NO.1所示的氨基酸序列；
本发明还提供上述动性球菌来源的蛋白酶的编码基因nprS-15615，所述编码基因nprS-15615，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供包含上述编码基因nprS-15615的重组载体或重组菌株；
进一步地，所述重组载体采用的表达载体为质粒pKSVT；
进一步地，所述重组菌株采用的表达宿主为地衣芽孢杆菌2709。
本发明还提供上述重组载体或重组菌株在生产SEQ ID NO.1所示蛋白酶中的应用。
本发明还提供SEQ ID NO.1所示蛋白酶的应用，特别是在洗涤剂领域中的应用，或者是在皮革制造、纺织制造领域中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种动性球菌来源的蛋白酶，其最适作用温度60℃，最适pH为8.0；Cu2+和Mn2+对该酶的活性有促进作用，同时可以作为环保型添加剂添加到洗涤剂中，其能有效的提高洗衣液的去污能力。也为洗涤剂、皮革制造、纺织制造等行业提供一种新的来源的蛋白酶。
附图说明：
图1pKSVT-nprS重组质粒阳性克隆验证
其中，泳道1、2、4为阴性对照，泳道3、5为目的基因加同源臂；
图2重组菌株B.licheniformis 2709-15615验证图
其中，泳道1:阴性对照，泳道2：双交换验证条带；
图3nprS-15615编码蛋白酶最适反应温度曲线；
图4nprS-15615编码蛋白酶的温度稳定性曲线；
图5nprS-15615编码蛋白酶的最适反应pH曲线；
图6nprS-15615编码蛋白酶的pH稳定性曲线；
图7金属离子对nprS-15615编码蛋白酶的影响；
图8蛋白酶抑制剂对nprS-15615编码蛋白酶的影响；
图9蛋白污布JB01的洗涤实验
其中，A+E、B+E、C+E、D+E表示A\B\C\D洗衣液分别加上酶液(发酵液上清)；A\B\C表示单独使用洗衣液，D表示单独使用标准洗衣液。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所涉及蛋白酶基因nprS-15615，是动性球菌(Planococcus sp.)11815基因组上进行测序分析获得，并通过地衣芽胞杆菌进行其异源表达。
本发明涉及的来源于动性球菌(Planococcus sp.)11815的蛋白酶，具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列：
DTLSKQATEKVHVNKDTQTPDFISGTLTEPTDQDAKEIVFTYLEENEDTYKIDKKDLSSFKVISQETDDLGFTKVKLQQKFKGVPVFGSVINAHVDQDGVLTSISGNLAPELYDKKSLKKGATLKAGAAVEKAAADLEEKIGSSPELEAEVTPELVIYFKDGQAYFAYSAEFEFLYPEPGNYQYFVDAKTGDILDSYNQIHEAKPSGGGASLTGEDSTASGKGVLGDTKSFNTLVNSNGSYLVDRTRGSGIFTYDAKNRTRTPGTLWLDSDNVYNAAYDGAAVDAHTYAGQTYDYFQDVHSRNSYDGNGAELISTVHYGRSYNNAFWSGSQMVYGDGDGTTFVPLSGALDVIAHELTHAVTDTTADLIYQNESGAINESMSDIFGTLVEYHFNNKPDWQVGEDIYTPNVAGDALRSMEDPTLSGDPDHYSKRYTGTGDYGGVHINSGISNKAAFLLANGGTHYGVTVAGIGNDKAGDIYYRTLTQYLTPNSNYSHFRVSTIQAATDLYGASSAEVASVKAAFSAVGVN*
本发明涉及的来源于动性球菌(Planococcus sp.)11815的蛋白酶编码基因nprS-15615，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：
GATACCCTATCTAAACAGGCAACAGAAAAAGTCCATGTCAATAAAGACACC
CAGACACCTGATTTCATTTCCGGAACGTTGACTGAACCGACCGATCAAGAT
GCAAAAGAAATTGTCTTTACATATTTAGAAGAAAACGAAGACACGTACAAA
ATCGATAAAAAAGACCTTTCCAGCTTCAAAGTCATCAGCCAGGAAACAGAT
GACCTCGGCTTCACCAAAGTGAAGCTTCAGCAGAAATTCAAAGGCGTGCC
TGTTTTCGGTTCCGTAATCAATGCCCACGTTGACCAAGACGGCGTGCTCAC
TTCCATCTCCGGCAATTTGGCGCCGGAATTATACGATAAGAAATCCTTGAAG
AAAGGCGCAACTTTGAAAGCCGGGGCTGCAGTCGAAAAAGCAGCGGCCG
ACCTGGAAGAAAAAATCGGCAGTTCCCCAGAGCTTGAAGCTGAAGTTACA
CCGGAATTGGTCATCTATTTCAAAGATGGGCAAGCGTATTTTGCCTACAGCG
CTGAATTCGAGTTCCTCTATCCGGAACCGGGTAATTATCAATACTTCGTGGA
CGCCAAGACGGGCGACATCCTCGATTCCTATAACCAGATCCATGAGGCGAA
ACCTTCCGGCGGCGGTGCGAGTTTGACCGGCGAAGATTCGACTGCGAGCG
GCAAAGGCGTGTTGGGCGATACGAAATCGTTCAATACTTTAGTCAACAGCA
ACGGCTCTTACCTGGTCGACCGCACGCGCGGCAGCGGCATTTTCACGTATG
ACGCAAAAAACCGCACACGCACGCCTGGCACACTGTGGCTCGACAGCGA
CAATGTCTACAATGCCGCTTATGACGGCGCTGCAGTCGATGCCCATACTTAC
GCTGGCCAAACCTACGATTACTTCCAAGACGTCCATAGCCGCAATAGCTAC
GACGGCAACGGCGCTGAGCTGATTTCCACCGTCCATTACGGCCGCAGCTAT
AACAACGCGTTCTGGAGCGGTTCCCAAATGGTCTACGGCGACGGTGATGG
CACTACCTTCGTGCCGCTGTCAGGAGCGCTGGACGTTATTGCCCATGAATT
GACGCATGCCGTGACCGATACGACGGCCGACTTGATCTACCAAAATGAATC
CGGCGCGATCAACGAATCGATGTCCGATATTTTTGGAACGCTTGTTGAATAC
CATTTCAATAACAAGCCCGACTGGCAAGTAGGCGAAGATATCTATACGCCG
AACGTTGCGGGCGATGCACTGCGCTCGATGGAAGACCCGACATTGAGCGG
AGACCCGGATCATTATTCGAAACGCTACACCGGCACGGGTGATTACGGCGG
CGTCCATATCAACTCCGGCATCAGCAATAAAGCGGCGTTCCTACTCGCCAAT
GGCGGCACGCATTACGGCGTGACGGTCGCTGGCATCGGCAACGACAAAGC
GGGCGATATCTACTACCGCACTTTGACGCAATACTTGACGCCGAACTCCAA
CTACAGCCATTTCCGCGTTTCCACCATCCAAGCGGCAACGGATCTGTACGG
CGCATCGAGCGCTGAAGTCGCAAGCGTCAAAGCAGCGTTCTCGGCTGTCG
GGGTTAACTGA
以下结合具体实施例对本发明作进步一地解释说明。
实施例1、蛋白酶基因的获得以及基因组整合载体pKSVT-nprS的构建
将保存在甘油管中的动性球菌(Planococcus sp.)11815菌株接种于LB平板上过夜培养，挑取单菌落于5毫升LB试管中于37℃过夜培养，以2％接种量接入50毫升LB培养基中，37℃培养6-8h，以2％接种量接入100mL 2216E液体发酵培养基中，20℃培养48h后将全部菌液4000rpm离心30min收集菌体并进行液氮速冻用于全基因组测序，后寄于由广州基迪奥生物科技有限公司完成全基因组测序。通过对基因组的数据进行分析，获得一种蛋白酶的编码基因nprS-15615，并选择对nprS-15615进行异源表达。
使用特异性引物15615-F和15615-R(序列见表1)以Planococcus sp.11815基因组为模板通过聚合酶链式反应(PCR)扩增蛋白酶编码基因，回收PCR产物。使用快速限制性内切酶Spe I和Not I在10×QuickCut Green Buffer中将整合载体pKSVT在37℃条件下消化45min，获得线性化载体，使用切胶回收产物。在50℃条件下利用无缝克隆酶进行将PCR产物和线性载体pKSVT连接，将连接产物化转至E.coli JM109感受态细胞中，筛选阳性克隆，使用质粒验证引物pKSVT-F和pKSVT-R(序列见表1)进行菌落PCR验证，结果如图1所示。
实施例2地衣芽孢杆菌重组菌株的构建
实施例1测序正确的阳性转化子提取质粒，化转至E.coli 135，挑取转化子，在5mLLB试管中培养3-4h，加入80μL阿拉伯糖，在30℃条件下诱导过夜，提取质粒。将经过甲基化修饰的质粒与B.licheniformis 2709感受态混匀，混匀后转入0.2cm的预冷的电转杯中，冰上放置5min后电击(2500V，5ms)转化，电转结束后，快速加入900μL无菌复苏液(10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，5g/L氯化钠，0.5mol/L D-山梨醇，0.38mol/L D-甘露醇)，于超净台内将所有溶液转至灭菌1.5mL的离心管中，37℃振荡培养3h，4000rpm离心5min收集菌体，涂布于含有卡那霉素抗性的平板，37℃倒置培养过夜，使用质粒验证引物pKSVT-F和pKSVT-R进行菌落PCR验证，挑取正确的转化子至5mL LB试管，于45℃培养，开始进行单交换，并使用单交换验证引物V-F和pKSVT-R、V-R和pKSVT-F进行单交换验证，挑取验证正确的菌落，至5mL LB试管，37℃培养，进行基因组双交换，应用对点板的方法初步筛选质粒丢失的菌落，后使用基因组验证引物V-F和V-R(序列见表1)进行双交换验证并测序，测序正确的阳性克隆即为在基因组上整合了nprS-15615基因的重组菌株B.licheniformis 2709-15615。其验证图如图2所示。
表1
实施例3重组菌株的表达及酶活力测定
将测序正确的菌株B.licheniformis 2709-15615接种于5mL LB试管于37℃、220r/min过夜培养，以2％接种量接入50mL LB培养基中，37℃、220r/min培养6-8h，以2％接种量接入100mL发酵培养基中(6.4％玉米粉，4％豆饼粉，0.4％ Na2HPO4、0.03％ KH2PO4、0.07％高峰氏α-淀粉酶，其余为水)，37℃、220r/min振荡培养，48h取样发酵液，以离心后获得的发酵上清液为粗酶液，检测蛋白酶的活力，其蛋白酶酶活为613.63U/ml。
本发明依据GB/T 23527-2009附录B福林酚法，测定中性蛋白酶酶活力。1个酶活力单位(U/mL)：指1mL酶液在40℃和pH 7.5的条件下反应1min，水解酪蛋白产生1μg的酪氨酸所需要的酶量。
实施例4酶学性质分析
1、最适反应温度
在pH 7.5条件下，分别测定粗酶液(实施例3获得的粗酶液)在20、30、40、50、60℃条件下的酶活，每个反应设3个平行，以最高酶活为100％，计算其他不同温度下的相对酶活，确定酶的最适反应温度。
如图3所示，通过测定不同温度下粗酶液的酶活，nprS-15615蛋白酶的最适作用温度为60℃。
2、温度稳定性
将粗酶液(实施例3获得的粗酶液)分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃水浴锅中，保温15min、30min、45min、60min后取出酶液，测定残余酶活力，每个反应设3个平行，以未经水浴处理的原始酶活为100％，计算各个温度条件下的相对酶活，考察不同温度下的热稳定性。
结果如图4所示，该酶在20-50℃下的稳定性较强，在保温60min后，20-40℃下的剩余酶活力仍然保持在100％左右，50℃条件下的残余酶活力保持在95％左右，而在60℃保温15min，该酶即可快速失活，保温60min后完全失活。
3、最适反应pH
在最适温度60℃，将粗酶液(实施例3获得的粗酶液)置于不同的pH下(pH5.0-9.0)测定酶活，以最高酶活为100％，计算其他不同pH下的相对酶活，每个反应设3个平行，探讨不同pH值对酶活力的影响。结果如图5所示，通过测定不同pH条件下粗酶液的酶活，确定其最适pH为8.0。
4、pH稳定性
将粗酶液(实施例3获得的粗酶液)分别置于pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液中，2h后取出酶液，测定残余酶活力，每个反应设3个平行，以未经处理的原始酶活为100％，计算各个pH条件下的相对酶活，确定酶的pH值稳定性。
结果如图6所示，该酶在pH 6.0-9.0下放置120min后，相对酶活仍然可以达到75％以上，而在pH 10.0下放置2h后，相对酶活力降到20％左右。
5、金属离子和抑制剂对酶活力的影响
为分析金属离子和蛋白酶抑制剂对该蛋白酶的影响，将不同的金属离子(Fe3+、Mn2 +、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+)和蛋白酶抑制剂(二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、尿素(Urea)、苯甲基磺酰氟(PMSF))分别添加到酶液中使金属离子和蛋白酶抑制剂的终浓度分别为5mmol/L，孵育1h后测定酶活，以不加金属离子和蛋白酶抑制剂的样品酶活为100％，每个反应设3个平行，计算不同金属离子和蛋白酶抑制剂存在下的相对酶活，考察金属离子对酶活力的影响。
粗酶液在含有不同金属离子中孵育1h后，以没有添加金属离子孵育的酶活视为100％，结果如图7显示，Zn2+和Ca2+对该蛋白酶有轻微的抑制作用，Fe3+和Fe2+对该蛋白酶表现出明显的抑制作用，Cu2+和Mn2+对该酶的活性有促进作用。如图8所示，粗酶液在含有不同蛋白酶抑制剂中孵育1h后测酶活，以没有添加蛋白酶抑制剂孵育的酶活视为100％，发现该酶能够抵制DTT、EGTA、Urea对其的抑制作。
实施例5、重组酶的洗涤应用实验
1、蛋白酶与表面活性剂的相互作用
将实施例3培养48h的发酵液12000rpm离心30min收集，去除沉淀，使用发酵液的上清液0.2mL与表面活性剂(购买于中国日化工业研究院)1.4mL混合，并加入自来水使溶液终体积为10mL，振荡混匀，取出100μL点在双层琼脂牛奶平板上(下层为2％素琼脂，上层为2％素琼脂和1.5％的脱脂牛奶)，放置过夜，观察水解圈的产生情况。具体编号及20种市售表面活性剂与nprS-15615编码的蛋白酶的作用如表2所示。
编号1-20分别为醇醚羧酸AEC-9H、聚乙氧基化脂肪醇AEO9、脂肪烷基三甲基卤化胺、异构十三醇聚氧乙烯醚、异构十醇聚氧乙烯醚、脂肪烷基二甲基氧化胺、SNS-80、脂胺酰胺丙基二甲基甜菜碱、乙氧基化烷基硫酸钠、脂肪酸甲酯磺酸钠、脂肪烷基二甲基甜菜碱、双烷基(C8-G0)二甲基卤化胺、脂肪烷基二甲基共基卤化胺(1227)、十二烷基硫酸钠、SOE-N-60、SOE-C-60、烷基糖苷(APG1214)、工业直链烷基苯磺酸、α-烯基磺酸钠、工业烷基磺酸钠(SAS-60)。
如表所示，其中编号1、3、9、10、12、13、14、18、19、20的表面活性剂对本发明蛋白酶的活性没有抑制作用，且均为洗涤剂中常用的表面活性剂。该结果表明nprS-15615蛋白酶与洗涤剂中的表面活性剂具有良好的兼容性，可以作为环保型添加剂应用到洗涤行业。
表2
2、nprS-15615编码蛋白酶的洗涤应用实验
为了证明该酶在洗衣液中的洗涤效果，对该酶按照GB/T13174-2021《衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定》标准中7.3去污洗涤实验方法，进行标准蛋白污布的洗涤实验。采用编号为样品A、样品B、样品C，以及样品D的实验组，其中样品A、样品B、样品C为市购买了三款不同品牌含酶制剂的洗衣液，样品D为标准洗衣液购买于中国日化工业研究院。蛋白污布(JB01)购买于中国日化工业研究院。
分别做单独洗衣液，以及发酵液上清与洗衣液混合的洗涤实验，其中发酵液上清(实施例3制备)用量是0.1％，洗衣液和标准洗衣液加入量是0.2％。其余条件不变，使用荧光白度计对清洗前后的标准蛋白污布JB01进行白度测定。
结果如图9所示，图9中，A+E、B+E、C+E、D+E表示0.2％A\B\C\D洗衣+0.1％发酵液上清的洗涤效果；A\B\C表示单独使用0.2％洗衣液的洗涤效果，D表示单独使用0.2％标准洗衣液的洗涤效果。从图9中可以看出国标污布JB01在3种市售洗衣液中洗涤后白度值由18.71提高到平均值28.83，白度值增加了10.12；在添加了0.1％发酵液上清的洗涤配方溶液中白度值较洗涤前平均增加了17.60，较未添加发酵液上清的洗衣液洗涤效果明显上升。
由此可知，洗涤剂中添加本发明提供的蛋白酶能提高洗衣液对国标蛋白污布JB01的去污力。从洗涤白度差中去污比值P>1.0可以得出，在相同的洗涤条件下，添加该酶的洗涤配方溶液对国标蛋白污布的去污效果明显优于未添加该酶的洗涤溶液对国标蛋白污布的去污效果。

Claims (7)

1.一种动性球菌来源的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述蛋白酶的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在在于，所述蛋白酶的编码基因nprS-15615的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.包含上述编码基因nprS-15615的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，重组菌株采用的表达宿主为地衣芽孢杆菌2709。
6.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白酶中的应用。
7.权利要求1所述蛋白酶的应用，其特征在于，是在洗涤剂领域中的应用。
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