CN104946573B - 一种产低温碱性蛋白酶的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明目的是提供一种产低温碱性蛋白酶的菌株，为芽孢杆菌(Bacillus sp.)WFWBac‑1，于2015年4月9日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10703。本发明筛选的菌株用于发酵生产碱性蛋白酶。本发明筛选的菌株性状优良、产蛋白酶活力高；该菌株在以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，培养基初始pH 9.0，培养温度25℃，接种量为10％的条件下150rpm振荡培养48h时，所产蛋白酶活性最高能达到995U/mL。所制备的酶用于制备洗衣液或洗洁精。

Description

一种产低温碱性蛋白酶的菌株

技术领域

本发明属于功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种产低温碱性蛋白酶的菌株。

背景技术

蛋白酶是非常重要的一种水解酶，国内外相关数据显示，在所有的工业酶制剂中，蛋白酶占据了75％，是工业用酶比例最大的，销售额约占世界年销售总额的百分之60％左右。而碱性蛋白酶是世界工业酶制剂中最重要的酶制剂之一，其用途非常广泛，受到了大家的广泛关注。目前，碱性蛋白酶主要应用在洗涤和皮革行业中，其中在洗涤剂中，99％以上的都或多或少地加入各种蛋白酶，导致了如今供不应求的需求关系。目前作为洗涤剂添加剂的碱性蛋白酶多为中温蛋白酶，最适反应温度通常在50-70℃，但在发展中国家，洗涤剂通常在室温25℃左右使用，因此添加到洗涤剂中的碱性蛋白酶的催化效率不高，许多研究者开始着手低温碱性蛋白酶的研究。但目前还没有实际应用的产低温碱性蛋白的菌株。

发明内容

本发明目的是提供一种产低温碱性蛋白酶的菌株，从而弥补现有技术不足。

本发明的产低温碱性蛋白酶的菌株，为芽孢杆菌(Bacillus sp.)WFWBac-1，于2015年4月9日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10703。

本发明筛选的菌株用于发酵生产碱性蛋白酶；

本发明还提供一种代谢生产碱性蛋白酶的方法，是以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，初始pH为9.0的培养基中接种筛选的菌株，培养温度25℃，振荡培养48h；

其中菌株的接种量优选为10％。

本发明菌株生产的碱性蛋白酶，最适作用温度为20℃，最适作用pH为9.0，Mn²⁺对该酶有较强的激活作用，Zn²⁺，EDTA和PMSF对该酶具有一定的抑制作用。

本发明筛选的菌株性状优良、产蛋白酶活力高；该菌株在以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，培养基初始pH 9.0，培养温度25℃，接种量为10％的条件下150rpm振荡培养48h时，所产蛋白酶活性最高能达到995U/mL。

附图说明

图1：碳源对菌株的发酵酶活的影响图，

图2:氮源对菌株的发酵酶活的影响图，

图3：发酵时间对WFWBac-1菌株产酶的影响图，

图4：发酵温度对WFWBac-1菌株产酶的影响图，

图5：培养基起始pH值对WFWBac-1菌株产酶影响图，

图6：接种量对WFWBac-1菌株产酶的影响图，

图7：温度对酶活的影响图。

具体实施方式

本发明所使用的培养基的信息如下：

LB营养琼脂培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂粉20g、海水1000mL，在121℃下高压灭菌15min。

酪蛋白培养基：酪蛋白10g、蛋白胨5g、酵母2.5g、KH₂PO₄0.3g、MgSO₄·7H₂O0.5g、NaCl lg、琼脂粉20g、海水1000mL，在121℃下高压灭菌15min。

LB液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，陈海水1000mL。

蛋白酶活力测定方法采用Folin-酚法测定蛋白酶的活力。酶活定义：1mL酶液在一定pH值和温度下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。计算公式如下：

蛋白酶活力(U/mL)＝(A×N×4)/10

式中：A——由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；

4——4毫升反应液取出1mL测定(即4倍)；

N——酶液稀释的倍数；

10——反应10min。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：菌株的筛选及鉴定

从青岛海域收集的裙带菜中进行内生细菌的分离，并将得到的单菌落点种于酪蛋白培养基上，观察各菌株产透明圈情况，进行菌种的初筛；然后将产透明圈的菌株接种于液体发酵培养基上，于25℃摇瓶培养3d，在4℃，10000r/min条件下离心15min，取上清液，测定其蛋白酶活力，筛选出产蛋白酶活力最高的菌株。

参照《伯杰细菌鉴定手册》和《系统鉴定》，依据其生理生化特征对WFWBac-1菌株进行分类鉴定。

对WFWBac-1菌株进行生理生化鉴定试验，结果如表1所示，参照《伯杰细菌鉴定手册》和《细菌系统鉴定手册》，鉴定结果显示：WFWBac-1菌株能水解酪蛋白，明胶，淀粉，使硝酸盐还原，鉴定该菌为革兰氏阳性菌。

表1生理生化鉴定结果

注:“+”表示反应为阳性:“-”表示反应为阴性。

并进行16S rDNA序列分析，具体步骤如下：

(1)基因组的DNA提取

制备基因组DNA时，首先根据细菌是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌，先用Digestion Buffer，后用Proteinase K裂解细菌，对于革兰氏阳性菌，先用溶菌酶驱除细胞壁，后用Proteinase K和去污剂裂解细菌，释放出基因组DNA。

(2)PCR反应

①PCR体系建立(50μL)：

②PCR程序设定

预变性94℃4min；循环94℃45s，55℃45s，72℃1min，30个循环；修复延伸72℃8min；

③引物序列：

7F 5’CAGAGTTTGATCCTGGCT 3’18bp

1540R 5’AGGAGGTGATCCAGCCGCA 3’19bp

(3)DNA琼脂糖切胶纯化

用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，并用电泳检测纯化后DNA的纯度和含量。

(4)目的片断的TA克隆和筛选

以pEASY-T1为载体进行TA连接，目的片段与载体的比例为8:1。于42℃下转化到E.coli 110菌株。最后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中。通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定阳性克隆。

(5)质粒DNA提取

参照TransGen公司的质粒提取试剂盒进行质粒提取。

(6)DNA测序

由上海生工生物工程技术服务有限公司将提取的质粒DNA，进行测序。

(7)系统进化树的构建及分析

从NCBI的基因库中寻找与WFWBac-1的16S rDNA相关的序列，将相关性最高的菌株同WFWBac-1菌株一同构建系统进化树，并进行同源性比较，进而确定菌株的分类。鉴定WFWBac-1为芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp.WFWBac-1。

实施例2菌株的发酵条件优化

1、碳源对WFWBac-1细菌产酶的影响

在液体培养基中分别用待测碳源(葡萄糖，蔗糖，淀粉，果糖，乳糖)为唯一碳源，25℃、150r/min培养48h后测定蛋白酶活。结果如图1所示，蔗糖作为碳源时，WFWBac-1菌株的酶活最高，葡萄糖、乳糖、淀粉较低，果糖最低。可见，该菌株能充分利用蔗糖中的碳源进行生长代谢繁殖，所以，蔗糖为WFWBac-1的最佳碳源。

2、氮源对WFWBac-1细菌产酶的影响

氮源试验时以蔗糖为固定碳源；待测氮源为干酪素、硝酸钠、硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨，25℃、150r/min摇床培养48h后测定蛋白酶活。如图2所示，蛋白胨作为氮源的时候，WFWBac-1菌株的酶活最高，而牛肉膏、干酪素相对较低，而碳酸钠、胺对产酶可能有一定的抑制作用，令酶的活性极低。所以，蛋白胨作为氮源是最佳的选择。

3、发酵时间对WFWBac-1细菌产酶影响

将活化好的菌悬液接入装有150mL、pH自然的培养基的摇瓶(250mL)中，25℃、150rpm发酵3d，间隔12h取一次样，研究不同发酵时间对WFWBac-1菌株产蛋白酶的影响。如图3所示，发酵时间对菌种产酶量的大小有较显著的影响，随着发酵时间的变化，产酶量呈现先增后减的趋势。这可能是因为发酵时间的延长，培养基中菌株消耗的营养物质增多，剩下的营养物质减少，而且有毒代谢物质的增多，发酵液pH也随之发生变化，从而抑制菌株的正常生长代谢活动，导致菌体的衰亡，进而引起酶的量减少。发酵时间为48h时，产酶量达到最高水平。所以最终选择发酵时间为48h。

4、培养温度对WFWBac-1菌株产酶影响

在对发酵培养基进行优化的基础上，将WFWBac-1菌株的发酵温度分别设置为5℃，15℃，25℃，35℃，研究不同培养温度对发酵产蛋白酶的影响，在pH自然、150rpm的条件下发酵3d，发酵结束后测发酵上清液的粗酶活性。如图4所示，温度对菌的产酶量有明显的影响，其中温度为25℃和37℃时产酶量较高。在25℃时，酶活最高，且该温度在实验条件下较容易达到和控制，这有利于今后该菌株的蛋白酶开发利用，最终选择的发酵温度为25℃。

5、培养基起始pH值对WFWBac-1菌株产酶影响

在对发酵培养基进行优化的基础上，将培养基pH值分别调至1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5和11.5，在25℃、150rpm的条件下发酵3d，发酵结束后测发酵上清液的粗酶活性。试验不同pH值对WFWBac-1菌株产蛋白酶的影响。如图5所示，培养基的pH对菌种产酶量的影响明显，初始pH值对菌株的生长和代谢有直接影响，初始pH值应使菌株快速生长并且有利于代谢产物的产生在pH为9.0时产酶量最高。所以最终选择在pH9.0时为最佳培养pH。

6、接种量对WFWBac-1菌株产酶影响

将种子液分辨按照2％，5％，10％，15％，20％的接种量接入基础发酵培养基，其余条件相同，3d后测定酶活，每个样品测定三个平行结果取平均值。接种量会影响菌株发酵过程中菌株的生长速率和生长代谢产物的产量大小。由图6可见，接种量从2.5％到10％，随着接种量的增大，当接种量达到10％时，酶活达到最大。当接种量继续增大时，酶活的大小出现下降的趋势。原因可能是接种量过大，引入的有害物质相应增多，对产物的合成不利，或者在发酵的前期生长由于过于旺盛，空间和资源相对匮乏，培养基中的营养成分被大量消耗，进而影响发酵后期代谢产物的形成和分泌。所以，最终确定WFWBac-1菌株液体发酵的最佳接种量为10％。

实施例3菌株粗酶液性质的研究

1、酶的最适反应温度的确定

将筛选得到的菌株WFWBac-1发酵产生的粗酶液分别放于0，20，40，和80℃的条件下，保温1h，取出粗酶液，加入底物偶氮酪蛋白放于37℃下，利用Folin-酚法进行酶活性的测定，确定酶的最适反应温度。如图7所示，粗酶液中蛋白酶的最适温度为20℃，此时酶活为1078U/mL，这是多种蛋白酶综合作用的结果，说明该菌产生的蛋白酶属于低温蛋白酶。

2、酶的最适作用pH值的确定

将筛选得到的菌株WFWBac-1发酵产生的粗酶液分别与pH1，3，5，7，9，11和13的Britton-Robsion缓冲液以1:1的比例混合，在4℃放置1h，分别在相应的pH1，3，5，7，9，11和13条件下，用Folin-酚法测定混合液的酶活性，以未与缓冲液混合的作为对照。结果可知，WFWBac-1菌株产生的蛋白酶在pH9.0时具有最高活性，说明WFWBac-1菌株产生的蛋白酶是碱性蛋白酶，在碱性较高条件下，仍具有较高的酶活，酶活大小为1027U/mL。

3、蛋白酶抑制剂及金属离子对粗酶的影响

将筛选得到的菌株WFWBac-1发酵产生的粗酶液分别与蛋白酶抑制剂EDTA(金属蛋白酶抑制剂，5mM)，PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂，2.5mM)及浓度为5mM的金属离子Ba²⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，Na⁺以1:1的比例混合，在4℃放置30min后，用Folin-酚法进行酶活性的测定，以未处理的粗酶液为对照，计算其剩余酶活。

表2蛋白酶抑制剂及金属离子对粗酶的影响

由表2可知，Zn²⁺对该粗酶有抑制力，剩余酶活力为87.48％，其次是Cu²⁺(剩余酶活力为98.63％)。而5mM的Mn²⁺可以明显增强酶活力。可知，该酶为一种Mn²⁺激活酶。EDTA的抑制率为15％左右，PMSF的抑制率为20％左右。在已报道的酶中，约有三分之一的酶是金属酶或金属激活酶，需要有金属离子的存在，酶才能充分表现活性。

实施例4菌株粗酶液性质的研究

该蛋白酶酶解豆粕及干酪素的水解度如表3所示，该蛋白酶酶解干酪素的水解度为70.83％，而酶解豆粕的水解度高达92.90％。说明该蛋白酶几乎可酶解豆粕中的大部分蛋白质。该蛋白酶酶活的最适pH为9，最适温度为40℃，即为碱性中温蛋白酶，而且耐受较宽的碱性环境，因此可作为洗衣液，洗洁精的主要材料。

表3豆粕及干酪素的水解度

Claims (6)

1.一种菌株，其特征在于，所述的菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)WFWBac-1株，其保藏编号为CGMCC NO.10703。

2.权利要求1所述的菌株在发酵生产碱性蛋白酶中的应用。

3.一种代谢生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的方法是以权利要求1所述的菌株接种到培养基中进行发酵培养来生产碱性蛋白酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养基以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，初始pH为9.0。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养，其温度25℃，振荡培养48h。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的权利要求1所述的菌株的接种量为10％。