CN115851787B

CN115851787B - 产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用

Info

Publication number: CN115851787B
Application number: CN202211129819.9A
Authority: CN
Inventors: 张海灵; 孙利芹; 朱雅清; 单守水; 安志强; 李文康
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Shanghai Shugao Mechanical & Electric Co ltd
Priority date: 2022-09-16
Filing date: 2022-09-16
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-09-16
Also published as: CN115851787A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用，本发明通过分析鉴定，筛选栖土曲霉的亮氨酸氨肽酶的基因，以pP43NMK为出发质粒成功构建pP43NMK‑lap重组质粒，通过化学转化的方法导入到枯草芽孢杆菌WB800基因组中，获得重组枯草芽孢杆菌B.subtills WB800/pP43NMK‑lap菌株，构建该酶的枯草芽孢杆菌异源表达系统，确定亮氨酸氨肽酶优化条件，为以后大规模发酵生产亮氨酸氨肽酶打下基础，提供一种安全、绿色、无污染、可用于食品加工的方法。

Description

产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用

技术领域

本发明涉及产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

亮氨酸氨肽酶(Leucine aminopeptidase，lap)是氨肽酶中的一种，属于金属氨肽酶，它也具有水解多肽链氨基末端氨基酸的功能，能够从蛋白质和多肽中切割N端残基，不过它不单单水解多肽链N末端的亮氨酸，还可以同N末端的其他氨基酸发生作用，但它特异性识别和水解效率最高的氨基酸是亮氨酸，在水解Leu底物时，lap通常具有更加广泛的特异性。

用于食品蛋白水解物的制备是氨肽酶的主要工业应用之一。源自牛奶、大豆、肉类和谷物的蛋白质水解物基本上都是通过内肽酶和外肽酶的联合作用制备的，被广泛用于生产具有营养和药理重要性的生物活性肽，这些水解物是预消化成分的丰富来源，在肠道吸收过程中很容易被利用。

蛋白质的水解产生多肽和游离氨基酸，但是往往会伴随着苦味的产生，这是由于多肽链末端的疏水性氨基酸在水解中暴露出来所导致的，苦味是食品工业的主要限制因素，限制了食品蛋白水解物的消费和利用。亮氨酸氨肽酶作为一种多肽N端外切酶，能将肽链N端的氨基酸解离出来，从而减少多肽末端疏水性氨基酸含量，增强水解程度，从而降低苦味，所以亮氨酸氨肽酶在食品工业上有巨大的应用前景。

国内对于亮氨酸氨肽酶的研究主要集中在大学实验室，部分来源的亮氨酸氨肽酶基因已经被表征。潘进权2010年从雅致放射毛霉的发酵麸曲中纯化出了亮氨酸氨肽酶，显示了其对大豆蛋白水解具有协同作用；华南理工大学黄伟谦2014年从酱油曲霉中克隆出了亮氨酸氨肽酶sLAP1，并在毕赤酵母中成功表达，发酵酶活水平达到766.9U/mL，与碱性蛋白酶复配后对大豆蛋白水解度提高了23％，在蛋白水解以及脱苦应用中有很好的前景；席宏星2015年将来源枯草芽孢杆菌Zj016的亮氨酸氨肽酶基因克隆转化到毕赤酵母GS115的染色体上，成功实现了胞外分泌表达；张秋红2016年从雅致放射毛霉中克隆了亮氨酸氨肽酶基因，检测到其在细胞内进行了转录但蛋白质没有成功表达；李慧2016年克隆了蜡样芽孢杆菌CZ的亮氨酸氨肽酶基因，探究了不同表达载体在大肠杆菌宿主表达系统中的效果，酶活达到了22.40U/mL；林晓彤2020年将来自曲霉和嗜热真菌的8个亮氨酸氨肽酶基因在宿主黑曲霉HL-1中进行表达，筛选出了高活性的亮氨酸氨肽酶基因lapA和The，并通过利用CRISPR/Cas9工具增加其基因拷贝数提高了表达量，最高酶活可达11701.2U/mL。

来源不同的亮氨酸氨肽酶基因已经被各种表达系统表达，而对栖土曲霉来源的蛋白酶的表征未见报道。曲霉属以其向环境中分泌高水平酶的能力而闻名，几十年来，该属分泌的几种酶已广泛用于食品和饮料行业，但是国内外对霉菌的研究主要集中在对米曲霉、黑曲霉、大豆曲霉和毛霉等，而对能产高水解能力蛋白酶的栖土曲霉的研究较少。

枯草芽孢杆菌是一种杆状的革兰氏阳性细菌，作为一种模式生物，已被广泛用于工业用途的各种酶和生物活性化合物的生产。B.subtilis已被用作基因表达的有效系统，它的基因组序列已经发表，并对该细菌的基因调控和蛋白质功能的各个方面进行了分析(芽孢杆菌遗传储备中心，http://www.bgsc.org/)。由于相对便宜的大规模生产系统的可用性以及细菌向生长培养基中分泌高达20至25g/L的目标蛋白的能力，目前约60％的市售酶是在芽孢杆菌属物种中生产的。枯草芽孢杆菌被开发为有吸引力的宿主是因为以下几个原因：(i)它是非致病性的，并被认为是GRAS生物(通常被认为是安全的)；(ii)它在密码子使用上没有明显的偏好；(iii)它能够直接将功能性胞外蛋白直接分泌到培养基中。然而，两个障碍阻止了枯草芽孢杆菌的应用：(1)过多的细胞外蛋白酶会降解产生的外源蛋白质；(2)分离和结构的不稳定性导致基因表达降低。为了制作有效的表达宿主，破坏了几种细胞外蛋白酶基因以建立用于外源蛋白质生产的菌株，如枯草芽孢杆菌WB800，利用蛋白酶缺陷型的菌株表达外源蛋白，可以很好的解决蛋白酶水解修饰的问题。

如能获得栖土曲霉的亮氨酸氨肽酶基因，并将来自栖土曲霉的亮氨酸氨肽酶基因在枯草芽孢杆菌中进行表达，通过构建基因工程菌株以实现其大量高效表达，将为栖土曲霉在食品工业蛋白质水解物脱苦的进一步应用提供基础。

发明内容

本发明针对现有技术的上述问题，提供产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用。

本发明的目的之一在于提供产亮氨酸氨肽酶的基因，其为从栖土曲霉上提取，其碱基序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的之二在于提供产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌，该菌株提提交生物保藏。

【生物保藏材料说明】

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

保藏地址：中国武汉；

保藏日期：2022年5月3日；

保藏编号：CCTCC NO：M 2022535；

分类命名：枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK-lap Bacillus subtilis WB800/pP43NMK-lap。

本发明的目的之三在于提供产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌的构建方法，将上述产亮氨酸氨肽酶的基因转入大肠杆菌质粒E.coli JM109/pP43NMK中，得到重组质粒pP43NMK-lap，将重组质粒pP43NMK-lap转入枯草芽孢杆菌B.subtills WB800中，得到重组枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK-lap。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以作出如下的改进：

进一步，包括以下步骤：

(1)产亮氨酸氨肽酶的基因的提取和克隆；

(2)重组质粒pP43NMK-lap的构建；

(3)B.subtills WB800感受态制备；

(4)重组枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK-lap的制备。

进一步，所述步骤(1)中，从栖土曲霉中提取产亮氨酸氨肽酶的基因。

进一步，所述步骤(2)中，根据GenBank数据库中栖土曲霉基因组测序注释为putative leucine aminopeptidase 2的基因序列，设计出特异性引物，进行合成。

进一步，所述引物序列如下：

上下游引物添加保护碱基和酶切位点，其中双下划线部分为保护碱基，单下划线部分为酶切位点，同时在C末端引入6×His标签。

进一步，所述步骤(3)的具体操作为：

1)接种枯草芽孢杆菌于LB培养基上划线，过夜培养；

2)取培养液于SPⅠ培养基中，培养至对数生长末期；

3)取上步骤培养液至SPⅡ培养基中培养；

4)加入EGTA培养10-12min。

进一步，所述步骤(4)的具体操作为：取所述步骤(3)的培养液分装，加入重组质粒pP43NMK-lap培养，然后取菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上过夜培养。

本发明的目的之四在于提供产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌的应用，主要用于发酵生产亮氨酸氨肽酶。

本发明的优点在于：本发明通过分析鉴定，筛选栖土曲霉的亮氨酸氨肽酶的基因，并应用现代基因工程手段，成功对产亮氨酸氨肽酶编码基因进行基因克隆并转入宿主枯草芽孢杆菌细胞中，构建该酶的枯草芽孢杆菌异源表达系统，确定亮氨酸氨肽酶优化条件，为以后大规模发酵生产亮氨酸氨肽酶打下基础，提供一种安全、绿色、无污染、可用于食品加工的方法，本发明的重组枯草芽孢杆菌产酶方式温和、绿色、环保、高效，发酵条件稳定，发酵周期短，在工业化生产方面可以节约大量成本；酶活效率较高。

附图说明

图1为重组质粒pP43NMK-lap的构建流程图；

图2为目的基因lap克隆；

图3为B.subtills WB800/pP43NMK-lap发酵菌体破碎液镍柱纯化；

图4为大肠杆菌重组质粒的单酶切验证；

图5为大肠杆菌重组质粒的PCR验证；

图6为枯草芽孢杆菌重组质粒的双酶切验证；

图7为枯草芽孢杆菌重组质粒的PCR验证；

图8为B.subtills WB800/pP43NMK-lap发酵液SDS-PAGE分析；

图9为重组亮氨酸氨肽酶送检结果；

图10为温度对重组蛋白酶的影响；

图11为pH对重组蛋白酶的影响；

图12为金属离子与抑制剂对重组蛋白酶的影响。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本实施例通过形态学分析和分子生物学鉴定了栖土曲霉(Aspergillusterricola)的种属，与NCBI数据库中Aspergillus tamarii strain CBS 117626具有98％的同源性；以Aspergillus tamarii strain CBS 117626基因组中假定的亮氨酸氨肽酶基因putative leucine aminopeptidase 2为模板设计引物，成功从栖土曲霉(Aspergillusterricola)中克隆出了亮氨酸氨肽酶基因lap，基因大小为1491bp，编码497个氨基酸，蛋白质预测分子量为53.4kDa，等电点pI为4.89，带正电荷氨基酸残基(Asp+Glu)61个，带负电荷氨基酸残基(Arg+Lys)39个，预测属于M28肽酶家族。

本实施例具体采用如下的技术方案：

(1)栖土曲霉的活化培养

1、在超净工作台中取出栖土曲霉(购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC))冻干管，用75％酒精棉对冻干管表面进行消毒，用酒精灯灼烧冻干管顶端熔封处，外焰均匀加热；

2、立即滴加2-3滴无菌水于加热部位，使管壁破裂，用镊子敲下破裂处；

3、用无菌枪头吸取0.5mL左右液体培养基加入冻干管中完全溶解冻干菌粉；

4、将溶解后的菌悬液转移到盛有4-5mL液体培养基试管中混匀，将残留在吸管中的1-2滴菌悬液划线转接至固体培养基上；

5、将液体试管和斜面在30℃培养箱中静置培养72h。

(2)栖土曲霉DNA提取

从4℃斜面保藏的栖土曲霉接种于50mLPDA液体培养基中，30℃，220rpm培养24h，取5mL种子液转接到50mL的PDA液体培养基中，30℃，220rpm培养72h，之后操作按照DNA提取试剂盒进行：

1、取菌体培养物(1×105-107cells)，12000rpm离心2min，收集菌体沉淀，尽量吸弃上清；

2、向沉淀中加入100μLDNA提取试剂盒里的溶液Ⅰ，充分振荡混匀1min，75℃恒温15min；

3、加入210μL的无水乙醇(如用95％乙醇，加入量为245μL)，振荡混匀1min后，室温静置10min，13200rpm离心5min，垂直使用移液器将上清慢慢吸弃干净；

4、加入200μLDNA提取试剂盒里的溶液Ⅱ，振荡混匀1min，12000rpm离心2min，上清液为基因组DNA，-20℃保存。

(3)分子生物学鉴定

采用通用引物ITS 1和ITS 4对提取的栖土曲霉DNA进行PCR反应扩增5.8S-ITS区域。正向引物ITS 1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和反向引物ITS 4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。

(4)栖土曲霉RNA提取

使用RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取栖土曲霉RNA，具体操作步骤如下：

1、将称重的菌体放入液氮中，用研钵和研杵彻底研磨，将菌体粉末和液氮倒入不含核糖核酸酶液氮冷却的2mL离心管中；

2、向粉末中加入450μL的缓冲液RLC(使用前添加β-ME)，大力涡旋；

3、将裂解物转移到2mL收集管中的QTAshredder旋转柱中，并全速离心2min，小心的转移上清液到新的2mL离心管中；

4、向澄清的溶胞产物中加入0.5倍体积的乙醇(96-100％)，并通过移液器立即混合，不要离心；

5、将样品(650μL)包括形成的任何沉淀物转移到置于2mL收集管中的RNeasy旋转柱中，10000rpm离心1min，弃去滤液；

6、将700μL缓冲液RW1加入RNeasy旋转柱，10000rpm离心1min，弃去滤液；

7、向RNeasy旋转柱中加入500μL缓冲液RPE(使用前添加乙醇)，1000rpm离心1min；

8、将RNeasy旋转柱放入一个新的2mL收集管中，全速离心1min；

9、将RNeasy旋转柱放入一个新的1.5mL离心管中，滴加30-50μL无核糖核酸酶的水到柱膜中，轻轻合上盖子，10000rpm离心1min洗脱RNA。

(5)亮氨酸氨肽酶基因的克隆

以栖土曲霉Aspergillus tamarii strain CBS 117626的cDNA为模板进行目的基因lap的PCR克隆，琼脂糖凝胶电泳验证PCR结果(如图2所示)，从图2中可以看出在1000-2000bp有一条明亮的条带，且没有杂条带，与预期基因大小一致，可以判定目的基因lap克隆成功，回收以后可以用于后续实验。

(6)引物设计

根据GenBank数据库中栖土曲霉Aspergillus tamarii strain CBS 117626基因组测序注释为putative leucine aminopeptidase 2的基因序列，基因编号：GenBank:ML738616.1，利用引物设计软件DNAMAN和Primer Premier 5设计出特异性引物，进行合成。引物序列如下：

上下游引物添加保护碱基和酶切位点，其中双下划线部分为保护碱基，单下划线部分为酶切位点，同时在C末端引入6×His标签，上述小写字母部分为6×His标签。

(7)重组质粒pP43NMK-lap的构建

通过引物设计在目的基因lap的5’端添加了PstⅠ酶切位点，3’端添加HindⅢ酶切位点和组氨酸标签。带有双启动子PHpaⅡ和P43的pP43NMK穿梭质粒作为载体，进行重组质粒构建，构建流程如图1所示：

将纯化后目的基因lap和质粒pP43NMK使用限制性内切酶Pst Ⅰ和HindⅢ进行双酶切，经过T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli JM109中，在添加卡那霉素抗性的平板中筛选阳性子，挑取单菌落进行质粒提取，通过单酶切和PCR验证目的基因是否成功连接到载体上。

参见图4-5，其中图4为大肠杆菌重组质粒的单酶切验证，图中，M：DL10K DNAmarker；1-3：重组质粒PstⅠ酶切；4：空质粒对照组PstⅠ酶切；图5为大肠杆菌重组质粒的PCR验证，图中，M：DL 5K DNAmarker；1：目的基因lap；2-6：重组质粒PCR产物。

目的基因lap的大小为1491bp，质粒pP43NMK的大小为7680bp，重组质粒大小为8298bp，由图4可以看出4泳道为空质粒对照组单酶切条带低于8000bp，1-3泳道为重组质粒PstⅠ酶切，条带在8000-10000bp之间，符合预测结果；由图5可以看出重组质粒为模板的PCR产物与目的基因lap大小一致，基本可以证明目的基因与质粒连接成功，表达载体构建初步完成。

(8)E.coli JM109感受态细胞的制备及转化

1、取出-20℃保藏的E.coli JM109在LB培养基上划线，37℃过夜培养；

2、挑取单菌落接种于5mL液体LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养；

3、以初始OD₆₀₀＝0.02的接种量接种到50mL/250mL摇瓶LB培养基中，37℃，200rpm培养2-3h，测得OD₆₀₀为0.4-0.6，取1mL培养基于离心管中，冰浴放置10min；

4、4℃，4000rpm离心10min，收集菌体，彻底去上清；

5、小心加入1mL预冷的0.1M氯化钙溶液悬浮菌体，轻轻混匀，冰浴放置15min；

6、4℃，4000rpm离心15min，收集菌体，彻底去上清；

7、加入0.5mL氯化钙-甘油溶液(含有10％甘油)悬浮菌体，轻轻混匀，-80℃保藏；

8、从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰中5min，加入10μL连接产物(酶切后的目的基因和质粒在溶液中连接的产物)，轻微混匀，冰浴30min；

9、42℃热激1.5min后迅速冰浴5min；

10、加入1mL灭菌LB液体培养基，37℃，100rpm培养1h；

11、离心收集菌体，去除部分上清后混匀，100μL浓缩菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养8-10h。

(9)B.subtills WB800感受态制备及转化

1、接种枯草芽孢杆菌于5mL LB培养基中，37℃、250rpm培养过夜；

2、取100μL(接种量2％)培养液于5mL SPⅠ培养基中，37℃，250rpm培养至对数生长末期(4-5h)；

3、取上步骤培养液0.2mL至2mL SPⅡ培养基中，于37℃，100rpm培养90min；

4、加入20μL 10mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，再于37℃，100rpm培养10min；

5、分装成每管0.5mL，加入10μL重组质粒pP43NMK-lap，37℃，100rpm培养90min，取菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上过夜培养。

(10)重组枯草芽孢杆菌的验证

挑取平板上的单菌落进行菌落PCR验证和电泳分析，选取有目的条带的菌落进行液体扩大培养，然后提取质粒和酶切验证，验证成功的菌株进行保藏。

将构建好的重组表达载体转化到宿主枯草芽孢杆菌中，转化到含有卡那霉素(50μg/mL)抗性的平板生长，挑取单菌落转接至液体LB培养基中扩大培养，提取重组菌株质粒进行双酶切验证和质粒PCR验证，参见图6-7，其中，图6为枯草芽孢杆菌重组质粒的双酶切验证，图中，左M：DL2000 DNAmarker、泳道1：目的基因lap、泳道2-5：Pst Ⅰ和HindⅢ双酶切、右M：DL10000 DNAmarker；图7为枯草芽孢杆菌重组质粒的PCR验证，图中，M：DL 2000DNAmarker、泳道1：目的基因lap、泳道2-10：重组质粒PCR产物。

由图6可以看出重组质粒经过Pst Ⅰ和HindⅢ双酶切后出现了两个条带(泳道2-5)，一条条带的大小在7000-10000bp，另一条条带大小为1000-2000bp，泳道1为目的基因lap，小的条带与目的基因大小相同；由图7可以看出重组质粒PCR产物的大小也与目的基因大小相同，表明重组质粒成功转化到宿主菌体内，重组表达宿主构建完成。

(11)重组B.subtills WB800/pP43NMK-lap的表达

将重组菌B.subtills WB800在添加卡那霉素的50mL/250mL摇瓶LB培养基中活化培养，37℃，200rpm培养12h，作为活化的种子液，以1％的接种量转接到100mL液体TB培养基中(添加卡那霉素)发酵培养，37℃，200rpm的条件下发酵24h后验证亮氨酸氨肽酶酶活，通过SDS－PAGE鉴定目的蛋白是否表达。

参见图8-9，其中图8为B.subtills WB800/pP43NMK-lap发酵液SDS-PAGE分析，图中，M：Marker、泳道1：B.subtills WB800发酵液、泳道2：B.subtills WB800/pP43NMK发酵液、泳道3：B.subtills WB800/pP43NMK-lap发酵液，图9为重组亮氨酸氨肽酶鉴定，图中，下划线部分表示肽段匹配位置；由图8可知，在泳道3上53KDa附近出现新的条带，根据目的基因lap蛋白质分子量预测大小为53.4KDa，符合预测蛋白大小结果；重组亮氨酸氨肽酶送检结果如图9所示，蛋白肽段匹配度为24％，证明所表达的蛋白酶为亮氨酸氨肽酶，表明亮氨酸氨肽酶基因在B.subtills WB800中成功表达

(12)重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化

1、胞内lap的超声破碎：将发酵完成的菌液4℃、10000rpm离心10min收集菌体沉淀，按照每克细菌沉淀湿重加入5mL非变性裂解液的比例加入裂解液，充分悬浮菌体，洗涤2次。冰上超声裂解菌体，功率400W，每次超声处理3s，间歇3s，超声30min。将超声破碎后的菌体4℃、10000rpm离心10min，收集上清液即为细胞裂解液，过0.45μm的滤膜防止镍柱纯化时堵塞层析柱；

2、胞外lap的硫酸铵沉淀：将发酵完成的菌液4℃、10000rpm离心10min收集菌体上清液，配制100％的饱和硫酸铵溶液，缓慢添加上清液，混合配制30％-70％的梯度浓度硫酸铵溶液，4℃缓慢搅拌盐析2h，析出的蛋白质沉淀用非变性裂解液重悬，然后将重悬液置于非变性裂解液缓冲液中4℃充分透析，3-6h更换透析缓冲液，透析液过0.45μm滤膜准备上镍柱；

3、镍柱纯化

1)取混合均匀的50％BeyoGoldTM His-tag Purification Resin(耐还原螯合剂)，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液；

2)向凝胶中加入一个柱体积的非变性裂解液平衡凝胶，重复平衡1-2次，弃去液体；

3)按照每0.5mL凝胶中加入4ml细菌裂解液上清的比例(1：8)，加入裂解液，重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白，收集20μL穿流液作后续分析应用；

4)洗柱5次，每次加入1体积的非变形洗涤液，每次收集20μL穿柱的洗涤液用于后续分析检测；

5)洗脱目的蛋白6-10次，每次用一个柱体积的非变性洗脱液；将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中，收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。

B.subtills WB800/pP43NMK-lap发酵菌体破碎液镍柱纯化结果参见图3。图中，M：Marker；泳道1：B.subtilis WB800/pP43NMK-lap全细胞蛋白破碎上清液；泳道2：B.subtilis WB800/pP43NMK-lap全细胞蛋白破碎沉淀；泳道3-5：非变性洗涤液洗涤组分；泳道6-8：非变性洗脱液洗脱组分。

泳道1是B.subtilis WB800/pP43NMK-lap全细胞蛋白破碎上清液，蛋白在胞内进行了大量表达，泳道2是B.subtilis WB800/pP43NMK-lap全细胞蛋白破碎沉淀悬浮液，说明菌体沉淀中依然有可溶性蛋白存在，泳道3-5是非变性洗涤液(2mM咪唑)洗涤，杂蛋白被洗脱下来，泳道6-8是非变性洗脱液(250mM咪唑)洗脱，可以看到出现一条单一的条带，符合预测蛋白大小，证明目的蛋白被成功纯化出来。纯化后的酶经过酶活测定达到了122.72U/mL，与粗酶液酶活15.34U/mL相比，纯化了8倍。

(13)重组亮氨酸氨肽酶酶活测定

酶活定义：在40℃、pH8.0条件下，每分钟分解L-亮氨酸-4-硝基苯胺生成1μmoL对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活单位。

酶活检测方法：LNA法，将酶液稀释后分成两份，一份沸水浴灭活15min冷却至室温，作为空白。取0.4mL稀释好的酶液，加入到6mL pH 8.0的0.5M Tris-HCl缓冲液中，40℃水浴预热5min，加0.4mL，26mM L-亮氨酸-4-硝基苯胺(分子量251.28g/mol)的乙醇(95％乙醇)溶液，40℃准确反应10min，立即放冰浴中，5min后于405nm处检测吸光度。

V1：反应总体积

V2：酶液体积

D：酶液稀释倍数

k：消光系数

t：恒温时间

(14)蛋白质浓度测定

考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量，以牛血清蛋白(BSA)为标蛋白测定标准曲线，测定蛋白质浓度范围为0.01-1.0mg/mL。

本发明以pP43NMK为出发质粒成功构建pP43NMK-lap质粒，通过化学转化的方法导入到枯草芽孢杆菌WB800基因组中，获得重组枯草芽孢杆菌B.subtills WB800/pP43NMK-lap菌株。

本发明对重组菌进行发酵实验验证了栖土曲霉亮氨酸氨肽酶基因的表达，成功克隆出了亮氨酸氨肽酶基因，并表现出了亮氨酸氨肽酶的活性。发酵后胞外的酶活性为1.58U/mL，胞内的酶活性为15.34U/mL。

参见图10，测定了不同温度下以及不同温度下保持1小时，重组B.subtillsWB800/pP43NMK-lap菌株所产的重组亮氨酸氨肽酶的相对酶活，从图10(a)可看到，在50℃时酶活力最高；从图10(b)可看到，在25-55℃时酶活力较稳定，可以保持50％以上的相对酶活力，反应温度较温和，属于低温酶类。

参见图11，测定了不同pH下以及不同pH下保持1小时，重组B.subtills WB800/pP43NMK-lap菌株所产的重组亮氨酸氨肽酶的相对酶活；参见图11(a)，pH 5.0时酶活力最高，参见图11(b)，在3.0-11.0时酶活力较稳定，可以保持50％以上的相对酶活力。

参见图12，考察不同金属离子和抑制剂对重组酶的影响，可以看到，Co²⁺对重组酶具有明显的促进作用，能够提高50％的酶活性，Al³⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺等离子对于重组酶有30％-50％的抑制作用。对于蛋白质抑制剂，EDTA是金属蛋白水解酶抑制剂，表现出明显的抑制作用，说明重组酶蛋白是金属蛋白酶，这与先前的预测一致，PMSF是丝氨酸蛋白酶抑制剂，表现出50％的抑制酶活性，属于丝氨酸蛋白酶家族。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.产亮氨酸氨肽酶的基因，其特征在于，其碱基序列为SEQ ID NO.1所示。

2.产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022535；分类命名为：枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK-lap Bacillus subtilis WB800/pP43NMK-lap。

3.产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因转入大肠杆菌质粒E.coliJM109/pP43NMK中，得到重组质粒pP43NMK-lap，将重组质粒pP43NMK-lap转入枯草芽孢杆菌B.subtills WB800中，得到重组枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK-lap。

4.如权利要求2所述的产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，用于发酵生产亮氨酸氨肽酶。