CN111434770A - 蛋白质谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌中的表达和自加工 - Google Patents

蛋白质谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌中的表达和自加工 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明方法针对枯草芽孢杆菌进行密码子优化，得到适于在枯草芽胞杆菌表达系统表达的蛋白质谷氨酰胺酶前体物(pro‑PG)基因片段，将该基因片段与表达载体pHT43连接，构建重组载体pHT43‑pp，并将其转化入枯草芽孢杆菌中形成重组枯草芽孢杆菌，经乳糖等诱导剂诱导发酵，在自身发酵体系中，不需要添加任何外源蛋白酶的条件下，生成具有活性的成熟蛋白质谷氨酰胺酶即mPG。本发明包括以下优点：开发了利用枯草芽孢杆菌表达pro‑PG的方法；开发了利用枯草芽孢杆菌表达体系对pro‑PG进行自加工的方法，而不需要外源蛋白酶的添加，可以高效快速且定向地产生mPG，且酶活性较高，适宜工业化生产。

Description

蛋白质谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌中的表达和自加工
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌自身发酵体系对pro-PG 进行自加工生成有酶活性的mPG的方法及应用。
背景技术
蛋白质谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.44，Protein-glutaminase，简称PG)可以水解蛋白质侧链的 谷氨酰胺并生成蛋白质L-谷氨酸盐和氨，其是一种新型的蛋白质脱酰胺酶，无蛋白酶活性和 谷氨酰胺转氨酶活性[1]。该酶还有一定的广泛性和特异性，它可以作用于多种蛋白质如酪蛋 白和不溶性小麦蛋白侧链的谷氨酰胺，也可以作用于多种小肽，但不能使多肽、游离谷氨酰 胺或其他肽中的天冬酰胺酰残基脱酰胺[2]。食品行业中大量涉及的是蛋白质而不是多肽，PG 通过脱酰胺作用可改善蛋白质功能特性，例如溶解性，乳化性和起泡性以及凝胶化性质，其 在一些食用蛋白质中是理想的性质[1]。
PG最早是在解朊金黄杆菌Chryseobacterium proteolyticum中发现的，2007年学者Robert J.Scheuplein等人研究了PG的安全性和其产生菌Chryseobacteriumproteolyticum 9670的非致 病性[3]，证明了PG及Chryseobacterium proteolyticum 9670可以在食品工业中应用。目前已有 文献报道了PG可以对不溶性α-玉米蛋白[4]、米谷蛋白[5][6]、小麦蛋白[7]、大豆分离蛋白[8][9]、 椰肉蛋白[10]、α-乳清蛋白[11]、脱脂牛奶[12]、酸奶[13]等植物蛋白和酪蛋白的相关食品进行脱酰 胺进而改善它们在食品中所需的性质，进一步说明了PG在食品中的应用前景。
解朊金黄杆菌来源的PG自被发现以来，国内外学者对其进行了一系列研究。首先，PG 最原始的生产方式是利用其原产菌株解朊金黄杆菌发酵获得，国内华东师范大学微生物实验 室近些年已经成功从土壤里筛选得到37株野生的解朊金黄杆菌，并对其进行了培养基的优化 [14,15]、诱变选育[16]、原生质体融合选育，得到最终酶活稳定的突变株PF-Y0448，酶活为 1.14±0.09U/mL。虽然该活性较之前有所提高，但仍不能达到工业生产的要求。且无论是传 统诱变和原生质体融合均有一定的不确定性，不能定向地提高酶活，这就造成了筛选高酶活 菌株过程工作量大、效率低。基于此，考虑到基因工程可以快速对表达元件进行改造，对表 达模式进行优化，实现高效快速且定向地提高酶活，所以将PG用基因工程的手段进行表达 是一个非常必要的研究方向。然而解朊金黄杆菌本身研究的时间比较短，并没有出现可以直 接应用解朊金黄杆菌为宿主菌的分子生物学工具，故本发明主要集中研究现有的可异源表达 的系统。
2013年汪正华使用大肠杆菌表达PG且显示活性，但大肠杆菌因其致病性及外毒素，不 能应用于食品工业当中；而使用枯草芽孢杆菌表达PG，产量极低，酶活极弱，表达并不成功 [17]。早在2008年，Kikuchi Y.等人成功在谷氨酸棒杆菌中表达pro-PG，并经SAM-P45切割后 表现出成熟酶活性，产量为183mg/L，且经SAM-P45切割后的转化率为63％，比酶活为26 U/mg，与天然PG相当，但该产量仍然不能达到工业生产水平，且又必须依靠添加外源蛋白 酶来实现对pro-PG的加工，有很大局限性[18]。这些已有的研究中PG的基因工程表达系统均 有其局限性。
枯草芽孢杆菌已经成功表达出许多外源蛋白[19,20]，且能够利用当今科技手段构建成食品 表达系统，故寻找一种合适的枯草芽孢杆菌表达方案来有效表达PG，是一个重要的研究方向， 现实意义重大。
发明内容
本发明提出了一种将PG以带前肽的方式在枯草芽孢杆菌中进行表达，且不需要外源蛋 白酶的参与，利用枯草芽孢杆菌自身发酵体系对pro-PG进行自加工，即可生成具有活性的 mPG的方法。本发明方法，通过基因工程手段，从枯草芽孢杆菌中获得具有活性的mPG的 方法，包括pro-PG的表达、外加工、制备、自加工等一系列步骤，解决了现有技术中PG在枯草芽孢杆菌中无法有效表达的问题，且成功实现了在没有外源蛋白酶介入的条件下pro-PG 自加工获得高活性的mPG。
本发明提出了一种利用枯草芽孢杆菌自身发酵体系对pro-PG进行自加工生成具有活性 的mPG的方法，其中，针对枯草芽孢杆菌进行密码子优化，得到适于枯草芽胞杆菌表达系统 的pro-PG基因片段，将该pro-PG基因片段与表达载体pHT43连接，构建重组载体pHT43-pp， 将其转化入枯草芽孢杆菌中形成重组枯草芽孢杆菌，经调节乳糖操纵功能的诱导剂诱导发酵， 在自身发酵体系中无需要添加外源蛋白酶的条件下，生成具有活性的成熟蛋白质谷氨酰胺酶 即mPG。
本发明中，所述枯草芽孢杆菌包括但不限于是枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌DB403、 枯草芽孢杆菌WB800N、枯草芽孢杆菌WB600。
其中，优选地，可进行自加工的枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌 DB403；，枯草芽孢杆菌168是野生枯草芽孢杆菌，其能分泌丰富的蛋白酶，如中性蛋白酶、 碱性蛋白酶、金属蛋白酶、芽孢杆菌肽酶F等。重组载体pHT43-pp分别转化至所述可进行 自加工的枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌DB403，分别形成重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/168、 重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/DB403。即，重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/168和pHT43-pp/DB403 可以表达且自加工pro-PG。
其中，枯草芽孢杆菌WB800N与重组载体pHT43形成重组枯草芽孢杆菌 pHT43-pp/WB800N，其可以表达pro-PG。
其中，所述密码子优化是指采用
Figure BDA0001942325250000031
密码子优化软件使GC含量及分布更加优化、 密码子适应指数提高、密码子的使用分布获得优化、特定限制性酶切位点和消极顺式作用元 件消除、发夹结构消除。本发明中的密码子优化包括：GC含量由预案序列的39％提高到优 化后的49％有利于DNA或RNA的稳定性；密码子适应指数较原序列提高8.97％，不同物种 的种属之间，对同义密码子的使用频率是不同的，具有一定的偏好性，用密码子适应指数表 示，密码自适应指数提高，有利于pro-PG在枯草芽孢杆菌表达体系中表达；密码子的使用通 过优化，使pro-PG基因与基因组更加贴合；通过优化避免序列中出现常用的酶切位点，如： BamH、Sma I、Xba I、Xho I)，保证在载体构建时，可利用该常见酶切位点；pro-PG原CDS 序列中含有9个小型发夹结构，3个中型发夹结构，影响其结构及翻译效率，通过优化去除 发夹结构，有利于pro-PG基因的翻译。
其中，所述枯草芽孢杆菌自身发酵体系是指：重组菌，发酵培养基如2×YT、LB、SR等， 诱导剂(包括调节乳糖操纵功能的乳糖，或其类似物IPTG以及与其用相同作用的物质)。
在一实施方式中，本发明所述方法具体包括如下步骤：
将蛋白质谷氨酰胺酶的CDS序列针对枯草芽孢杆菌系统进行密码子优化，通过基因合成 获得优化后的pro-PG基因片段，经双酶切、纯化，pro-PG基因片段与表达载体pHT43连接， 构建成重组载体pHT43-pp；将所述重组载体pHT43-pp转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组枯 草芽孢杆菌；将所述重组枯草芽孢杆菌进行IPTG诱导发酵，不需要添加外源蛋白酶，在发 酵体系上清中产生具有活性的成熟蛋白质谷氨酰胺酶即mPG。
本发明方法中，将pHT43-pp分别转化至枯草芽孢杆菌168和DB403中，获得重组枯草 芽孢杆菌pHT43-pp/168和pHT43-pp/DB403。将两株重组枯草芽孢杆菌使用2×YT培养基进 行培养，经过终浓度为1mM的IPTG诱导发酵后，均可在不需要添加外源蛋白酶的情况下使 发酵体系获得蛋白质谷氨酰胺酶活性，产生成熟的蛋白质谷氨酰胺酶即mPG。
在一具体实施方式中，本发明中，重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/168诱导发酵至32h可 产生最高酶活0.765U/mL的成熟的蛋白质谷氨酰胺酶；重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/DB403 诱导发酵至32h可产生最高酶活0.665U/mL的成熟的蛋白质谷氨酰胺酶。
酶活力单位(UI)的定义为：每min产生1μmol氨所需的酶的量。本发明使用的蛋白质谷氨酰胺酶酶活测定方法为靛酚法，参考Yamaguchi S.等人的方法步骤[1]。
其中，所述优化前的pro-PG基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述优化后 的pro-PG基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其蛋白质序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明方法中，优化后的pro-PG核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示，由核酸服务公司合 成。下划横线部分(_)为mPG编码序列，未划线部分为pro的编码序列。所述优化后的pro-PG 核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其序列通过参照枯草芽孢杆菌表达系统对氨基酸密码子 的偏爱性、碱基GC含量、mRNA二级结构等综合因素对天然PG核酸序列进行优化得到； 所述优化后的pro-PG核苷酸既不改变天然PG氨基酸序列，又能在枯草芽孢杆菌表达系统中 正常表达。
所述优化前的pro-PG核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：
GATTCCAACGGGAATCAGGAAATCAACGGAAAGGAAAAACTAAGTGTAAATGATTCTAA GCTGAAAGATTTCGGAAAGACTGTACCGGTAGGGATAGACGAAGAAAACGGAATGATA AAGGTGTCATTTATGTTAACTGCGCAATTCTATGAAATTAAGCCGACCAAAGAAAATGAG CAGTATATCGGAATGCTTAGACAGGCTGTTAAGAATGAATCTCCTGTACACATTTTCTTA AAGCCTAATAGCAATGAAATAGGAAAAGTGGAGTCTGCAAGTCCGGAAGACGTAAGATA TTTTAAAACGATCCTGACAAAAGAAGTAAAAGGGCAAACCAATAAATTGGCGAGTGTAA TTCCTGATGTAGCTACATTAAATTCTTTATTCAATCAAATAAAGAATCAGTCTTGCGGTAC CTCTACGGCGTCCTCACCATGCATCACATTCAGATATCCTGAGACGGATGTTATGCAAGA GCCCATAAGATGAGACAAATCTTAATGAACAACGGCTATGACTGTGAAAAACAATTTGTA TACGGAAACCTAAAGGCATCAACAGGAACTTGCTGTGTGGCGTGGAGCTACCACGTTGC AATATTGGTAAGCTATAAAAATGCTTCCGGAGTAACGGAAAAAAGAATTATTGATCCTTC ACTATTTTCAAGCGGTCCTGTAACAGATACAGCATGGAGAAACGCTTGCGTTAACACCT CTTGCGGATCTGCATCCGTTTCCTCTTATGCTAATACTGCAGGAAATGTTTATTACAGAAG TCCTAGTAATTCTTACCTGTATGACAACAATCTGATCAATACCAACTGTGTACTGACTAAA TTTTCACTGCTTTCCGGATGTTCTCCTTCACCTGCACCGGATGTATCCAGCTGTGGATTT TAA(SEQ ID NO:1)
所述优化后的pro-PG核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：
GATAGCAACGGCAACCAGGAAATCAACGGCAAAGAGAAACTGAGCGTCAACGATAGCA AGCTGAAAGACTTTGGCAAAACGGTCCCGGTTGGCATTGACGAGGAAAACGGCATGAT CAAGGTCAGCTTCATGCTGACAGCGCAGTTTTACGAGATCAAGCCGACGAAGGAGAAC GAACAGTATATTGGCATGCTGCGCCAAGCAGTTAAGAACGAAAGCCCGGTCCATATCTT CCTGAAACCGAACAGCAACGAGATCGGCAAAGTCGAATCAGCAAGCCCGGAAGACGT CAGATATTTCAAGACGATCCTGACGAAGGAGGTCAAAGGCCAAACAAACAAACTGGCGAGCGTCATTCCGGATGTTG CAACACTGAACAGCCTGTTTAACCAGATCAAGAACCAGTCTTGCGGCACAAGCACAGCAAGCAGCCCTTGCATTAC GTTTCGTTATCCGGTTGACGGTTGTTACGCAAGAGCACATAAGATGCGCCAGATCCTGATGAACAACGGCTACGAT TGCGAGAAGCAGTTCGTTTACGGCAATCTGAAAGCGTCAACAGGCACATGTTGCGTTGCTTGGTCATATCACGTCG CAATCCTGGTCAGCTATAAAAACGCGAGCGGAGTCACAGAAAAACGCATCATCGATCCGAGCCTGTTTAGCTCAGG ACCGGTCACAGATACAGCTTGGAGAAACGCTTGCGTCAATACAAGCTGCGGATCAGCATCAGTCTCATCATACGCA AACACAGCGGGAAACGTCTATTATCGCAGCCCGTCAAACAGCTACCTGTACGACAACAACCTGATCAACACGAATT GCGTCCTGACGAAGTTTAGCCTTCTGTCAGGTTGCTCACCGTCACCAGCACCAGACGTTTCATCTTGCGGATTTTAA(SEQ ID NO:2)
所述优化后的pro-PG氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：
GSDSNGNQEINGKEKLSVNDSKLKDFGKTVPVGIDEENGMIKVSFMLTAQFYEIKPTKE NEQYIGMLRQAVKNESPVHIFLKPNSNEIGKVESASPEDVRYFKTILTKEVKGQTNKLASVIPDVATLNSLFNQIKNQSCGTST ASSPCITFRYPVDGCYARAHKMRQILMNNGYDCEKQFVYGNLKASTGTCCVAWSYHVAILVSYKNASGVTEKRIID PSLFSSGPVTDTAWRNACVNTSCGSASVSSYANTAGNVYYRSPSNSYLYDNNLINTNCVLTKFSLLSGCSPSPAPD VSSCGF*(SEQ ID NO:3)
本发明方法中，PG的表达方式，如，将pro-PG的序列扩增出来后，利用BamH I和SmaI两个酶切位点克隆至枯草芽孢杆菌表达载体pHT43中，构建重组载体pHT43-pp，先将其转化至大肠杆菌DH-5α中，获得大量重组载体后，将重组载体抽提出来，用化学转化法转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组枯草芽孢杆菌(如：用化学转化法转化至枯草芽孢杆菌WB800N、WB600、DB403、168中，获得重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/WB800N、pHT43-pp/WB600、 pHT43-pp/168、pHT43-pp/DB403)；重组枯草芽孢杆菌(如pHT43-pp/WB800N)可由LB、 2×YT、SR等培养基进行发酵培养。
其中，重组枯草芽孢杆菌包括重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/WB800N、pHT43-pp/WB600、 pHT43-pp/168、pHT43-pp/DB403。其中，pHT43-pp/WB800N、pHT43-pp/WB600由于其胞外 蛋白酶活力不足，pro-PG未在胞外进行有效加工呈现活性状态。其中，优选的宿主菌是枯草 芽孢杆菌168和DB403，二者均有较强的胞外蛋白酶活力，诱导发酵32h，表现出最高酶活， 分别为0.765U/mL和0.665U/mL。
其中，诱导发酵前还包括：向培养基中接种重组枯草芽孢杆菌，接种量为3％，37℃、200 rpm培养，将重组枯草芽孢杆菌培养至OD600为1时，添加终浓度为1mM的IPTG进行诱导发酵，表达mPG。其中，种子培养基的成分组成为：胰蛋白胨(胰酪胨)20g/L，酵母提 取物10g/L，NaCl 5g/L，初始pH为7.2。
其中，发酵培养基LB培养基成分组成为：胰蛋白胨(胰酪胨)10g/L，酵母提取物5g/L， NaCl 10g/L，初始pH为7.2-7.4。2×YT培养基成分组成为：胰蛋白胨(胰酪胨)20g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，初始pH为7.2。SR培养基成分组成为：胰蛋白胨(胰酪胨) 15g/L，K2HPO4 3g/L，酵母提取物20g/L，初始pH为7.2。
诱导发酵前还包括：向培养基中接种重组枯草芽孢杆菌，接种量为3％，37℃、200rpm 培养，重组菌培养至OD600为1左右时添加终浓度为1mM的IPTG进行诱导发酵，重组蛋 白mPG进行表达。IPTG诱导表达后PG以pro-PG的形式有效地外分泌表达，需说明的是pro-PG本身无酶活性。
本发明还提出了所述mPG的应用，所述mPG可对CBZ-Gln-Gly、小麦蛋白、玉米醇溶蛋白、明胶、脱脂奶粉、大豆分离蛋白进行脱酰胺，体现其蛋白质谷氨酰胺酶的活性和作用。
本发明还进一步提出了一种优化后的pro-PG，所述pro-PG的蛋白序列如SEQ IDNO：3 所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还进一步提出了一种重组载体pHT43-pp，所述重组载体pHT43-pp的构建方法为： 将如SEQ ID NO：2所示的pro-PG经BamH I和Sma I双酶切后，连接至枯草芽孢杆菌表达 载体pHT43中，构建重组载体pHT43-pp。
本发明还进一步提出了一种按如上所述方法构建得到的重组载体pHT43-pp。
本发明还进一步提出了一种细胞，所述细胞包括重组菌株pHT43-pp/WB800N、pHT43-pp/WB600、pHT43-pp/168、pHT43-pp/DB403。所述细胞包括枯草芽孢杆菌细胞WB800N、WB600、DB403、168。
本发明还进一步提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的重组载体pHT43-pp或 pHT43-pph。
本发明还进一步提出了如上所述的重组载体、细胞或试剂盒在用于枯草芽孢杆菌自身发 酵体系对pro-PG进行自加工生成mPG中的应用。
本发明中的基因工程菌(重组枯草芽孢杆菌)是携带含密码子优化后的蛋白质谷氨酰胺 酶(PG)基因的重组质粒的枯草芽孢杆菌WB800N、WB600、168或DB403。本发明中基因工程菌的构建方法是将含有优化后pro-PG的DNA序列构建至载体pHT43中构成重组表达载体pHT43-pp，转化至枯草芽孢杆菌中，获得可以表达pro-PG的工程菌pHT43-pp/WB800N和可以表达且自加工pro-PG的工程菌pHT43-pp/168和pHT43-pp/DB403。利用基因工程菌pHT43-pp/168和pHT43-pp/DB403，通过液体培养及自加工可产生成熟蛋白质谷氨酰胺酶mPG。
本发明的有益效果在于：1、本发明开发了利用枯草芽孢杆菌表达pro-PG的方法；2、开 发了利用枯草芽孢杆菌表达体系对pro-PG进行自加工的方法，而不需要外源蛋白酶的添加可 以高效快速且定向地产生mPG，且酶活性较高，适宜工业化生产。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方 法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制 内容。
实施例1重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/WB800N的构建及发酵
pro-PG的核酸序列的优化：参照枯草芽孢杆菌表达系统对氨基酸密码子的偏爱性、碱基 GC含量、mRNA二级结构等综合因素对天然PG核酸序列进行优化，得到既不改变天然PG 氨基酸序列，又能在枯草芽孢杆菌表达系统中正常表达的核酸序列。优化前核酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化后核酸序列如SEQ ID NO:2所示。优化后核酸序列由核酸服务公司合成， 以pUC57-PG-CDS的形式承载。
重组表达载体pHT43-pp采用酶切连接法构建质粒。以pUC57-PG-CDS为模板， BS-21/BS-22为引物对进行PCR，获取pro-PG的片段，预计大小为900bp。BS-21/BS-22序列 如下所示，上游接BamH I酶切位点，下游接Sma I酶切位点。
Figure BDA0001942325250000071
PCR反应体系如下：
Figure BDA0001942325250000072
Figure BDA0001942325250000081
PCR反应程序如下：
Figure BDA0001942325250000082
将基因pp和质粒pHT43分别用BamH I和Sma I双酶切后电泳回收，连接后转化至大肠 杆菌DH-5α中。挑取12个单克隆进行菌液PCR验证。pHT43-pp/DH-5α使用pHT43通用引 物V1839-F/V1839-R进行PCR验证，预计大小为1100bp。验证为阳性的克隆送测序公司测 序，符合预期序列，pHT43-pp构建成功。V1839-F/V1839-R序列如下：
Figure BDA0001942325250000083
pHT43-pp/DH-5α克隆PCR鉴定体系如下：
Figure BDA0001942325250000084
pHT43-pp/DH-5α克隆PCR鉴定程序如下：
Figure BDA0001942325250000085
Figure BDA0001942325250000091
将重组载体pHT43-pp从pHT43-pp/DH-5α中抽提出来，使用化学转化方法转化至枯草芽 孢杆菌WB800N中，转化出来的克隆抽提质粒，使用pHT43通用引物V1839-F/V1839-R进行PCR验证，预计大小为1100bp。鉴定成功后保存以备发酵。使用LB培养基进行培养，接 种量为3％，37℃、200rpm培养，培养至OD600为1左右时添加终浓度1mM的IPTG诱导 发酵，发酵上清中pro-PG成功表达。
具体培养过程中pHT43系列的质粒在枯草芽孢杆菌中是抗氯霉素，相应枯草芽孢杆菌的 工程菌培养体系需添加5μg/mL的氯霉素。
实施例2胰蛋白酶(酶解)对pro-PG的加工 含pro-PG的发酵上清蛋白液的获得
将200μL重组菌pHT43-pp/WB800N的甘油冻存菌接到10mL(50mL三角瓶)LB液体 培养基中进行活化，37℃、200rpm摇床培养10h，以3％的接种量接种至两瓶50mL(250mL 三角瓶)的2×YT培养基中，37℃、200rpm培养3h后，一瓶加IPTG诱导，另一瓶不加IPTG， 继续培养15h，收集发酵液。将发酵液置于冷冻离心机离心，4℃、10000rpm离心5min， 弃沉淀收上清。
胰蛋白酶对pro-PG的消化作用
称取30mg胰蛋白酶固体粉末于10ml pH7.4的PBS缓冲液中，配成3mg/mL的胰蛋白酶母液。分别吸取1.2mL的发酵液于5个2mL离心管，向每个离心管分别添加0、75、150、 225、300μL的胰蛋白酶母液并混匀，分别使每个反应体系中的胰蛋白酶含量为0、0.15、0.3、0.45、0.60mg/mL；吸取1.2mL的PPN(含pro-PG发酵上清)于2mL离心管，向其中添加 150μL的胰蛋白酶母液并混匀，使该反应体系中的胰蛋白酶含量为0.3mg/mL。各反应液分 别用pH7.4的PBS补足至1.5mL。未加胰蛋白酶的PPI(未经诱导发酵上清)作为加胰蛋白 酶的PPI的对照。
六管反应液均置于37℃水浴锅中，分别吸取反应0.5、1、1.5、2、2.5、3h的各管反应液200μL，用于酶活测定。结果如表1所示：
表1不同浓度胰蛋白酶对工程菌pHT43-pp/WB800N产生的含有pro-PG的发酵上清蛋白 液进行不同时间处理释放出PG酶活力(U/mL)
Figure BDA0001942325250000101
将工程菌pHT43-pp/WB800N产生的含有pro-PG的发酵上清蛋白液及不含pro-PG的发 酵上清蛋白液用胰蛋白酶消化0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3h，如表1所示，结果为0.15、0.3、0.45、0.60mg/mL的胰蛋白酶消化后均可使反应液获得活性，且最高可获得1.14U/mL的活性，。 未加胰蛋白酶的含有pro-PG的发酵上清蛋白液孵育后无酶活。
实施例3枯草芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶和中性蛋白酶对pro-PG的加工
将实施例2中获得的工程菌pHT43-pp/WB800N产生的含有pro-PG的发酵上清蛋白液用 碱性蛋白酶和中性蛋白酶分别消化0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3h。反应体系和实施例2中添 加胰蛋白酶的反应体系相同，仅把胰蛋白酶替换为碱性蛋白酶或中性蛋白酶，碱性蛋白酶的 反应pH调为碱性9，中性蛋白酶的反应pH调为接近中性7.2。不同浓度碱性/中性蛋白酶对 工程菌pHT43-pp/WB800N产生的含有pro-PG的发酵上清蛋白液进行不同时间处理释放出PG 酶活力结果如表2和表3所示：
表2不同浓度碱性蛋白酶对工程菌pHT43-pp/WB800N产生的含有pro-PG的发酵上清蛋 白液进行不同时间处理释放出PG酶活力(U/mL)
Figure BDA0001942325250000102
Figure BDA0001942325250000111
表3不同浓度中性蛋白酶对工程菌pHT43-pp/WB800N产生的含有pro-PG的发酵上清蛋 白液进行不同时间处理释放出PG酶活力(U/mL)
Figure BDA0001942325250000112
结果表明：0.15、0.3、0.45、0.60mg/mL的碱性蛋白酶消化后均可使反应液获得活性， 且最高可获得0.81U/mL的活性；0.15、0.3、0.45、0.60mg/mL的中性蛋白酶消化后均可使 反应液获得活性，且最高可获得0.80U/mL的活性。未加碱性蛋白酶或中性蛋白酶的含有pro-PG的发酵上清蛋白液孵育后无酶活。
实施例4利用枯草芽孢杆菌自身分泌的蛋白酶对pro-PG的自加工
将pHT43-pp分别化学转化至枯草芽孢杆菌WB600、168和DB403中，经转化子质粒的抽提和PCR鉴定后，获得重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/WB600、pHT43-pp/168和 pHT43-pp/DB403。将三株重组枯草芽孢杆菌使用2×YT培养基进行培养，经终浓度为1mM 的IPTG诱导发酵后，均可在不需要添加外源蛋白酶的情况下使pHT43-pp/168和 pHT43-pp/DB403的发酵体系获得蛋白质谷氨酰胺酶活性，产生成熟的蛋白质谷氨酰胺酶， pHT43-pp/WB600的发酵体系没有明显酶活。重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/168和重组枯草芽 孢杆菌pHT43-pp/DB403诱导发酵过程中产生有活性mPG结果对比如表2所示：
表2.重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/168和重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/DB403诱导发酵 过程中产生有活性mPG(U/mL)结果对比
Figure BDA0001942325250000121
结果表明，重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/168诱导发酵至32h可产生最高酶活0.765U/mL； 重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/DB403诱导发酵至32h可产生最高酶活0.665U/mL。
实施例5实施例4发酵制备的mPG对不同底物的特异性
本实施例探究了实施例4中枯草芽孢杆菌工程菌产的mPG对不同底物的特异性，除了常 用于测酶活的底物CBZ-Gln-Gly，另外选取了其他五种底物，分别为小麦蛋白、玉米醇溶蛋 白、明胶、脱脂奶粉、大豆分离蛋白，所有底物的浓度均为10mg/mL。本试验的酶活测定方 法参考试管法酶活测定方法。mPG对于不同底物的特异性如下表所示，CBZ-Gln-Gly最佳， 脱脂奶粉次之，小麦蛋白和大豆分离蛋白再次之，而对玉米醇溶蛋白和明胶作用相对其他底 物则差很多。总的来说，实施例5制备的纯化的mPG样品对这6种底物均体现了脱酰胺的作 用。
Figure BDA0001942325250000122
Figure BDA0001942325250000131
实施例6枯草芽孢杆菌重组菌构建及表达
按照实施例1中方法采用多株枯草芽孢杆菌菌株及多种质粒构建重组菌株，从而表达PG， 构建结果及PG表达结果如表1所示。
Figure BDA0001942325250000132
结果表明，B.Subtilis WB 800N作为宿主菌，构建的pHT43-pp、pHT43-pph可有效表达， 但由于B.Subtilis WB 800N菌株胞外蛋白酶少，需外源蛋白酶加工才能释放PG活性，因此， 这两套均不能完成自加工；B.Subtilis DB403、B.subtilis 168两株菌分泌保外蛋白酶能力较强， 分别与pHT43-pp构建的表达系统均可有效表达PG，且可完成自加工，表现出PG活性。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技 术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
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SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学，泰兴市东圣生物科技有限公司
<120> 蛋白质谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌中的表达和自加工
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 899
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gattccaacg ggaatcagga aatcaacgga aaggaaaaac taagtgtaaa tgattctaag 60
ctgaaagatt tcggaaagac tgtaccggta gggatagacg aagaaaacgg aatgataaag 120
gtgtcattta tgttaactgc gcaattctat gaaattaagc cgaccaaaga aaatgagcag 180
tatatcggaa tgcttagaca ggctgttaag aatgaatctc ctgtacacat tttcttaaag 240
cctaatagca atgaaatagg aaaagtggag tctgcaagtc cggaagacgt aagatatttt 300
aaaacgatcc tgacaaaaga agtaaaaggg caaaccaata aattggcgag tgtaattcct 360
gatgtagcta cattaaattc tttattcaat caaataaaga atcagtcttg cggtacctct 420
acggcgtcct caccatgcat cacattcaga tatcctgaga cggatgttat gcaagagccc 480
ataagatgag acaaatctta atgaacaacg gctatgactg tgaaaaacaa tttgtatacg 540
gaaacctaaa ggcatcaaca ggaacttgct gtgtggcgtg gagctaccac gttgcaatat 600
tggtaagcta taaaaatgct tccggagtaa cggaaaaaag aattattgat ccttcactat 660
tttcaagcgg tcctgtaaca gatacagcat ggagaaacgc ttgcgttaac acctcttgcg 720
gatctgcatc cgtttcctct tatgctaata ctgcaggaaa tgtttattac agaagtccta 780
gtaattctta cctgtatgac aacaatctga tcaataccaa ctgtgtactg actaaatttt 840
cactgctttc cggatgttct ccttcacctg caccggatgt atccagctgt ggattttaa 899
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<210> 3
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Ser Asp Ser Asn Gly Asn Gln Glu Ile Asn Gly Lys Glu Lys Leu
1 5 10 15
Ser Val Asn Asp Ser Lys Leu Lys Asp Phe Gly Lys Thr Val Pro Val
20 25 30
Gly Ile Asp Glu Glu Asn Gly Met Ile Lys Val Ser Phe Met Leu Thr
35 40 45
Ala Gln Phe Tyr Glu Ile Lys Pro Thr Lys Glu Asn Glu Gln Tyr Ile
50 55 60
Gly Met Leu Arg Gln Ala Val Lys Asn Glu Ser Pro Val His Ile Phe
65 70 75 80
Leu Lys Pro Asn Ser Asn Glu Ile Gly Lys Val Glu Ser Ala Ser Pro
85 90 95
Glu Asp Val Arg Tyr Phe Lys Thr Ile Leu Thr Lys Glu Val Lys Gly
100 105 110
Gln Thr Asn Lys Leu Ala Ser Val Ile Pro Asp Val Ala Thr Leu Asn
115 120 125
Ser Leu Phe Asn Gln Ile Lys Asn Gln Ser Cys Gly Thr Ser Thr Ala
130 135 140
Ser Ser Pro Cys Ile Thr Phe Arg Tyr Pro Val Asp Gly Cys Tyr Ala
145 150 155 160
Arg Ala His Lys Met Arg Gln Ile Leu Met Asn Asn Gly Tyr Asp Cys
165 170 175
Glu Lys Gln Phe Val Tyr Gly Asn Leu Lys Ala Ser Thr Gly Thr Cys
180 185 190
Cys Val Ala Trp Ser Tyr His Val Ala Ile Leu Val Ser Tyr Lys Asn
195 200 205
Ala Ser Gly Val Thr Glu Lys Arg Ile Ile Asp Pro Ser Leu Phe Ser
210 215 220
Ser Gly Pro Val Thr Asp Thr Ala Trp Arg Asn Ala Cys Val Asn Thr
225 230 235 240
Ser Cys Gly Ser Ala Ser Val Ser Ser Tyr Ala Asn Thr Ala Gly Asn
245 250 255
Val Tyr Tyr Arg Ser Pro Ser Asn Ser Tyr Leu Tyr Asp Asn Asn Leu
260 265 270
Ile Asn Thr Asn Cys Val Leu Thr Lys Phe Ser Leu Leu Ser Gly Cys
275 280 285
Ser Pro Ser Pro Ala Pro Asp Val Ser Ser Cys Gly Phe
290 295 300
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcggatccg atagcaacgg caaccagg 28
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcccccgggt taaaatccgc aagatgaaac 30
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aagcggacag tttcgttc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccatttgttc caggtaaggt 20

Claims (19)

1.一种利用枯草芽孢杆菌自身发酵体系对pro-PG进行自加工生成mPG的方法，其特征在于，
(1)针对枯草芽孢杆菌进行密码子优化，得到适于在枯草芽胞杆菌表达体系中表达的pro-PG基因片段；
(2)将所述蛋白质谷氨酰胺酶前提物pro-PG基因片段与表达载体pHT43连接，或将所述pro-PG基因片段的C端添加8个组氨酸标签后，与表达载体pHT43连接，构建重组载体pHT43-pp或pHT43-pph；
(3)将其转化入枯草芽孢杆菌中形成重组枯草芽孢杆菌，经乳糖诱导发酵，在自身发酵体系中且不需要添加外源蛋白酶的条件下，生成具有活性的成熟蛋白质谷氨酰胺酶即mPG。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述适于在枯草芽胞杆菌表达体系中表达的pro-PG的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO：3所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168、DB403、WB800N和WB600。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括权利要求3所述枯草芽孢杆菌系列改造菌株。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌包括重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/WB800N、pHT43-pp/WB600、pHT43-pp/168、pHT43-pp/DB403、pHT43-pph/WB800N。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述密码子优化是指：GC含量及分布优化、密码子适应指数提高、密码子的使用分布优化、特定限制性酶切位点和消极顺式作用元件的消除、发夹结构的消除。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌自身发酵体系是指：重组枯草芽孢杆菌，发酵培养基，调节乳糖操纵功能的诱导剂。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组载体的构建方法为：将所述pro-PG基因片段经BamH I和Sma I双酶切后，连接至本身含有SamyQ信号肽的枯草芽孢杆菌表达载体pHT43中，构建重组载体pHT43-pp；或将所述pro-PG基因片段的C端添加8个组氨酸标签，经BamH I和Sma I双酶切后，连接至本身含有SamyQ信号肽的枯草芽孢杆菌表达载体pHT43中，构建重组载体pHT43-pph。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)诱导发酵过程包括：向培养基中接种重组枯草芽孢杆菌，接种量为2％，37℃、200rpm培养，将重组枯草芽孢杆菌培养至OD600为0.8时，添加终浓度为1mM的诱导剂进行诱导发酵，表达mPG。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将蛋白质谷氨酰胺酶的CDS序列针对枯草芽孢杆菌进行密码子优化，通过PCR技术获得适于在枯草芽胞杆菌表达体系中表达的pro-PG基因片段，经BamH I和Sma I双酶切，pro-PG基因片段经纯化后与本身含有SamyQ信号肽的枯草芽孢杆菌表达载体pHT43连接，构建重组载体pHT43-pp；或通过PCR技术获得适于在枯草芽胞杆菌表达体系中表达的pro-PG基因片段后，在其C端添加8个组氨酸标签，经BamH I和Sma I双酶切，pro-PG基因片段经纯化后与本身含有SamyQ信号肽的枯草芽孢杆菌表达载体表达载体pHT43连接，构建重组载体pHT43-pph；然后，将所述重组载体pHT43-pp或pHT43-pph分别转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组枯草芽孢杆菌；将所述重组枯草芽孢杆菌经乳糖操纵功能的诱导剂诱导发酵，无需添加外源蛋白酶，在发酵体系中产生具有活性的成熟蛋白质谷氨酰胺酶即mPG；
其中，所述枯草芽孢杆菌包括可进行自加工的枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌DB403，分别形成重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/168、重组枯草芽孢杆菌pHT43-pp/DB403。
11.一种按如权利要求1～10之任一项所述方法获得的mPG，其特征在于，所述mPG最适催化温度是55℃，最适催化pH是5.5；且在pH 3.5-pH 7.5条件下存放24h时间后，酶活和稳定性均保留80％以上。
12.如权利要求11所述的mPG在脱酰胺中的应用，其特征在于，所述应用包括对CBZ-Gln-Gly、小麦蛋白、玉米醇溶蛋白、明胶、脱脂奶粉、大豆分离蛋白以及其他富含谷氨酰胺的植物蛋白进行脱酰胺。
13.一种适于在枯草芽胞杆菌表达体系中表达的pro-PG，其特征在于，所述pro-PG的蛋白序列如SEQ ID NO：3示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
14.一种带前肽蛋白质谷氨酰胺酶融合芽孢杆菌信号肽SamyQ的融合蛋白SamyQ-pro-PG，其特征在于，所述融合蛋白SamyQ-pro-PG，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
15.一种重组载体pHT43-pp或pHT43-pph，其特征在于，
所述重组载体的构建方法为：将如SEQ ID NO：2所示的pro-PG经BamH I和Sma I双酶切后，连接至本身含有SamyQ信号肽的枯草芽孢杆菌表达载体pHT43中，构建重组载体pHT43-pp；或将如SEQ ID NO：2所示的pro-PG的C端添加8个组氨酸标签，经BamH I和Sma I双酶切后，连接至本身含有SamyQ信号肽的枯草芽孢杆菌表达载体pHT43中，构建重组载体pHT43-pph。
16.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体为按如权利要求15所述方法构建得到的重组载体pHT43-pp或pHT43-pph。
17.一种细胞，其特征在于，所述细胞含有如权利要求16所述的重组载体pHT43-pp或pHT43-pph。
18.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求16所述的重组载体pHT43-pp或pHT43-pph。
19.如权利要求16所述的重组载体或如权利要求17所述的细胞或如权利要求18所述的试剂盒在用于枯草芽孢杆菌自身发酵体系对pro-PG进行自加工生成mPG中的应用。
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