CN110484480B - 一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于制备枯草芽孢杆菌感受态细胞的细胞壁弱化剂，所述细胞壁弱化剂包括以下组分：甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇。本发明的细胞弱化剂能提高枯草芽孢杆菌的转化效率。本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的电击转化方法。本发明的方法制备的枯草芽孢杆菌的感受态细胞对比传统感受态细胞的制备方法转化效率上有了很大的提高，且过程操作简单，实验容易控制，重复性较好。

Description

一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法
技术领域
本发明为生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌感受态的制备及其转化方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种广泛分布在土壤中，嗜温、好氧并产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，其具有很强的抗逆性，并能分泌大量酶类和产生抗菌物质，因此，一方面作为活菌剂被广泛应用在饲料、生防、环保等领域，另一方面作为表达系统在外源蛋白和代谢产物的生产中发挥重要作用。枯草芽孢杆菌所拥有的革兰氏阳性菌表达系统，具有许多革兰氏阴性菌如大肠杆菌不具备的不同蛋白的表达能力，与我们常用的大肠杆菌表达系统相比，枯草芽孢杆菌表达系统具有以下的优势：1)具有很强的分泌表达能力，能将表达的外源蛋白直接分泌到细胞外从而避免了蛋白在细胞内的聚集，回收纯化蛋白比较简单，有利于下游操作；2)属于GRAS菌株，可安全用于生产食品、医药蛋白；3)没有明显的密码子偏爱性，避免了密码子优化。
外源基因的导入是枯草芽孢杆菌作为表达系统应用的重要一步，然而枯草芽孢杆菌的转化效率远远低于大肠杆菌，这限制了其在蛋白质工程(如定向进化、蛋白质突变体库等)以及代谢改造的应用。早在1958年，研究就发现枯草芽孢杆菌菌株具有形成自然感受态的能力，且感受态的形成是生长后期高度有序的遗传调控的结果，但是自然形成感受态细胞的枯草芽孢杆菌所占比例较小，且持续的时间较短。目前报道的提高枯草芽孢杆菌转化效率的方法主要有多聚体法、电穿孔法以及原生质法，但是多聚体法需要构建多聚体的质粒，原生质法原生质体脆弱，使得制备枯草芽孢杆菌原生质体困难且十分繁琐。电击转化方法是枯草芽孢杆菌比较常用的转化方法，其操作简单，实验容易控制，重复性较好，但是电转化的条件对感受态细胞的转化影响很大，目前电击转化的效率普遍不高，不能满足实验的需求，因此有必要建立一种枯草芽孢杆菌高效转化的方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于制备枯草芽孢杆菌感受态细胞的细胞壁弱化剂，所述细胞壁弱化剂包括以下组分：甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇(DTT)。经本发明人研究显示，在枯草芽孢杆菌培养物中加入本发明所述的细胞壁弱化剂再培养一段时间后，所获得的枯草芽孢杆菌感受态细胞能提高转化效率。
优选地，所述甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇的浓度在所述细胞壁弱化剂中的浓度为：甘氨酸为0.5～1％(W/V)，丝氨酸为0.5～1％(W/V)，二硫苏糖醇为1～10mM。
优选地，所述甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇的浓度在所述细胞壁弱化剂中的浓度为：甘氨酸为0.6～0.8％(W/V)，丝氨酸为0.7～0.9％(W/V)，二硫苏糖醇为5～7mM。
优选地，所述甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇的浓度在所述细胞壁弱化剂中的浓度为：甘氨酸为0.6％(W/V)，丝氨酸为0.9％(W/V)，二硫苏糖醇为6mM。
本发明人通过对单独加入不同浓度的甘氨酸，苏氨酸，DTT对枯草芽孢杆菌感受态细胞转化率的影响研究结果表明，当甘氨酸的浓度为0.6～0.8％，丝氨酸的浓度为0.7～0.9％，二硫苏糖醇的浓度为5～7mM范围内枯草芽孢杆菌感受态细胞转化率较高；其中又以甘氨酸为0.6％，丝氨酸为0.9％，二硫苏糖醇为6mM时转化效率最高。
本发明的第二个目的在于提供一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的电击转化方法，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤，其中，所述制备感受态细胞依次包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌接种至LB基本培养基中过夜培养，再将其接种于GM生长培养基中培养；
(2)在步骤(1)中培养物中加入本发明的细胞壁弱化剂继续培养至OD600的值达到0.9；
(3)将步骤(2)获得的培养物冰浴，离心收集枯草芽孢杆菌细胞；
(4)使用预冷的WB电击缓冲液清洗细胞，再将获得的细胞用WB电击缓冲液重悬，放入液氮中速冻，-80℃保存；
GM生长培养基的组分为：胰蛋白胨1％(W/V)，酵母提取物0.5％(W/V)，NaCl 0.5％(W/V)，水解酪蛋白0.2％(W/V)，500mM的山梨醇，500mM的葡糖糖，50mM K2HPO4，50mMKH2PO4。
WB电击缓冲液的组分为：500mM的海藻糖，500mM的山梨醇，500mM的甘露醇，0.5mMK2HPO4，0.5mM KH2PO4，15mM MgCl2，85mM CaCl2，pH值7.2。
所述电击转化包括如下步骤：
将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，并进行电击，电击转化后于30℃热激5min；得到导入所述待转化治疗的重组枯草芽孢杆菌。
优选地，所述步骤(1)中接种于GM培养基的接种量为1:100，在GM培养基培养至OD600＝0.6。
所述电击参数为：电压20kv/cm，电容25μF，电阻200Ω，电击1次，持续时间5ms。
优选地，所述步骤电击转化还包括将电击转化后的重组枯草芽孢杆菌加入RM复苏培养基于37℃培养3-6小时后涂LB平板；
所述RM复苏培养基的组分为胰蛋白胨1％(W/V)，酵母提取物0.5％(W/V)，NaCl0.5％(W/V)，山梨糖醇500mM，350mM的甘露醇。
优选地，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ZK、枯草芽孢杆菌DB104或枯草芽孢杆菌WB600的其中一种。
优选地，所述质粒为穿梭质粒PHT01或PHT304。
本发明的有益效果：本发明在现有技术的基础上，改进了枯草芽孢杆菌电转化感受态细胞的制备与转化方法，在常规LB基本培养基培养后使用生长培养基GM进行培养，并在制备的过程中添加经浓度优化的细胞壁弱化剂，电击转化后使用复苏培养基RM进行复苏培养，制备出的枯草芽孢杆菌的感受态细胞对比传统感受态细胞的制备方法转化效率上有了很大的提高，且制备过程操作简单，实验容易控制，重复性较好。
附图说明
图1为PHT01质粒转化电泳图。
图2为PHT304质粒转化电泳图。
图3为单独加入不同浓度的甘氨酸、苏氨酸、DTT对枯草芽孢杆菌转化效率的影响示意图。
图4为不同比例甘氨酸，苏氨酸，DDT组合对枯草芽孢杆菌转化效率的影响示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1枯草芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶的转化
1、载体的构建
根据NCBI已公布的枯草芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因序列，设计引物以枯草芽孢杆菌菌种为模板对其进行扩增，所述引物序列为P1:CGGGATCCACATTGAAAGGGGAGGAGAAT，P2：GCTCTAGACGTCCTCTCTGCTCTTCTATC，所述引物的5端分别引入BamHI与XbaI酶切位点，扩增后凝胶回收备用。使用BamHI与XbaI内切酶对PHT01质粒进行双酶切，酶切后回收。本实施例选用的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ZK。
酶切条件如下：
Figure BDA0002223505080000051
将酶切体系放入37℃槽中，水浴3h
连接条件如下：
Figure BDA0002223505080000052
将连接体系放入16℃的水浴槽中，过夜连接。将连接的产物转化至大肠杆菌DH-5a，使用amp抗性的LB平板进行筛选，挑取单克隆并测序确认构建成功的载体。
2、试剂的配制
LB培养基的配制：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，1％(W/V)氯化钠，121℃灭菌15min。
GM培养基(生长培养基)的配制：胰蛋白胨1％(W/V)，酵母提取物0.5％(W/V)，NaCl0.5％(W/V)，水解酪蛋白0.2％(W/V)，500mM的山梨醇，500mM的葡糖，50mM K2HPO4，50mMKH2PO4，115℃灭菌15min。
细胞壁弱化剂(WA溶液配制10×)：5％(W/V)甘氨酸，10％(W/V)丝氨酸，5mmolDTT。甘氨酸，丝氨酸使用0.22um滤膜过滤除菌，DTT 121℃灭菌15分钟。
WB缓冲液(电击缓冲液)的配制：500mM的海藻糖，500mM的山梨醇，500mM的甘露醇，15mM MgCl2，0.5mM K2HPO4，0.5mM KH2PO4，10％甘油，调节PH至7.2，121℃灭菌15min。
RM培养基(复苏培养基)的配制：胰蛋白胨1％(W/V)，酵母提取物0.5％(W/V)，NaCl0.5％(W/V)，山梨糖醇500mM，350mM的甘露醇，121℃灭菌15min。
3、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备
(1)挑取枯草芽孢杆菌单克隆于2ml LB培养基中过夜培养12-14小时，培养温度为32℃，转速200rpm；
(2)取400ul的上述步骤(1)的培养物接种于40ml GM培养基中，32℃，200rpm培养至OD600＝0.6；
(3)加入细胞壁弱化剂，其中甘氨酸、丝氨酸、DTT的终浓度分别为0.5％(W/V)、1％(W/V)、0.5mmol，37℃，200rpm继续培养至OD600的值达到0.9；
(4)冰浴10min，离心收集枯草芽孢杆菌细胞(10000g，4℃)，使用预冷的WB缓冲液清洗3次，最后使用100ul的WB缓冲液重悬，放入液氮中速冻，-80℃保存；
4、电击转化
(1)取-80℃保存的枯草芽孢杆菌菌种于冰上自然融化，融化后加入100ng待转化的质粒，冰浴5分钟后进行电击；
(2)将步骤(1)的体系转移至0℃预冷的电击杯(1mm)中，用电转仪进行电击(电压20kv/cm，电容25μF，电阻200Ω，电击1次，持续时间5ms)；
(3)电击转化后于30℃热激5min；
(4)加入1ml的RM培养基于37℃培养3-6小时后涂在含有相应抗生素的LB平板。
(5)计数菌落，计算转化率，转化率为每μg质粒DNA产生的转化子数。
转化效率的计算公式为：
转化效率＝转化子总数/质粒DNA加入量
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积。
按照上述公式计算得到的转化率为7.8×107cfu/μg，根据琼脂糖凝胶电泳结果显示如图1中泳道1,2,3所示，DNA条带清晰。
实施例2
本实施例与实施例1的唯一区别在于：本实施例选用的穿梭质粒为PHT304，选用的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌DB104。
按照上述公式计算得到的转化率为5.9×107cfu/μg，根据琼脂糖凝胶电泳结果显示如图2中泳道1，2，3所示，DNA条带清晰。
实施例3
本实施例通过单独加入不同终浓度的甘氨酸，苏氨酸和DTT研究WA溶液中3种组分对枯草芽孢杆菌转化率影响，本实施例选用的穿梭质粒为PHT01，选用的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB600。具体如下：
1、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备：
(1)挑取枯草芽孢杆菌单克隆于2ml LB培养基中过夜培养12-14小时，培养温度为32℃，转速200rpm；
(2)取400ul的上述培养物接种于40ml GM培养基中，32℃，200rpm培养至OD600＝0.6；
(3)单独加入不同浓度的甘氨酸，苏氨酸，DTT(二硫苏糖醇)，使其终浓度分别为：甘氨酸(0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％)，丝氨酸(0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％)，DTT(1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM)溶液，37℃，200rpm继续培养至OD600的值达到0.9；
(4)冰浴10min，离心收集枯草芽孢杆菌细胞(10000g，4℃)，使用预冷的WB缓冲液清洗3次，最后使用100ul的WB缓冲液重悬，放入液氮中速冻，-80℃保存；
本实施例的LB培养基、GM培养基、WB缓冲液、RM培养基均与实施例1相同。
2、电击转化
(1)取-80℃保存的枯草芽孢杆菌菌种于冰上自然融化，融化后加入100ng待转化的质粒，冰浴5分钟后进行电击；
(2)将步骤(1)的体系转移至0℃预冷的电击杯(1mm)中，用电转仪进行电击(电压20kv/cm，电容25μF，电阻200Ω，电击1次，持续时间5ms)；
(3)电击转化后于30℃热激5min；
(4)加入1ml的RM培养基于37℃培养3-6小时后涂在含有相应抗生素的LB平板。
(5)计数菌落，计算转化率，转化率为每μg质粒DNA产生的转化子数。
单独加入不同浓度的甘氨酸，苏氨酸，DTT对枯草芽孢杆菌转化率影响，结果如图3所示。由图3可知，甘氨酸的终浓度范围在0.6～0.8％，苏氨酸的终浓度范围在0.7～0.9％时，DTT的终浓度范围在5～7mM时，转化效率较好。
实施例4
在筛选出转化效率较好的甘氨酸，苏氨酸，DTT的终浓度范围的基础上，将其进行组合，进一步筛选出3中组分的最佳配比，具体配比如下表1，其余操作条件与实施例1相同。
表1.不同浓度的甘氨酸、苏氨酸、DDT组合分组
Figure BDA0002223505080000091
结果如图4所示，组别3、6、10～18均有较高的转化率。并且，转化效率并非随着组分浓度的增加而提高，转化效率与甘氨酸，苏氨酸，DTT的浓度不是简单的呈正相关性，三者之间通过复配具有一定的协同作用。因此，通过上述实验筛选，组别12的转化效果最好，即甘氨酸，苏氨酸，DTT的终浓度分别为0.6％(W/V)、0.9％(W/V)、6mmol时枯草芽孢杆菌的转化效果好，是本发明的最佳方案。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种用于制备枯草芽孢杆菌感受态细胞的细胞壁弱化剂，其特征在于，所述细胞壁弱化剂的组分由甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇组成；所述甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇在所述细胞壁弱化剂中的浓度为：甘氨酸为0.6～0.8％(W/V)，丝氨酸为0.7～0.9％(W/V)，二硫苏糖醇为5～6mmol。
2.如权利要求1所述的用于制备枯草芽孢杆菌感受态细胞的细胞壁弱化剂，其特征在于，所述甘氨酸、丝氨酸和二硫苏糖醇在所述细胞壁弱化剂中的浓度为：甘氨酸为0.6％(W/V)、丝氨酸为0.9％(W/V)、二硫苏糖醇为6mmol。
3.一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的电击转化方法，其特征在于，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤，其中，所述制备感受态细胞依次包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌接种至LB培养基中过夜培养，再将其接种于GM培养基中培养；
(2)在步骤(1)中培养物中加入权利要求1所述的细胞壁弱化剂继续培养至OD600的值达到0.9；
(3)将步骤(2)获得的培养物冰浴，离心收集枯草芽孢杆菌细胞；
(4)使用预冷的WB缓冲液清洗细胞，再将获得的细胞用WB缓冲液重悬，放入液氮中速冻保存；
GM培养基的组分为：胰蛋白胨1％(W/V)，酵母提取物0.5％(W/V)，NaCl 0.5％(W/V)，水解酪蛋白0.2％(W/V)，500mM的山梨醇，500mM的葡糖糖，50mM K2HPO4，50mM KH2PO4；
WB缓冲液的组分为：500mM的海藻糖，500mM的山梨醇，500mM的甘露醇，0.5mM K2HPO4，0.5mM KH2PO4，15mM MgCl2，85mM CaCl2，pH值7.2；
所述电击转化包括如下步骤：
将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，并进行电击，电击转化后于30℃热激5min；得到导入所述待转化治疗的重组枯草芽孢杆菌。
4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌感受态细胞的电击转化方法，其特征在于，所述步骤(1)中接种于GM培养基的接种量为1:100，在GM培养基培养至OD600＝0.6。
5.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌感受态细胞的电击转化方法，其特征在于，所述电击参数为：电压20kv/cm，电容25μF，电阻200Ω，电击1次，持续时间5ms。
6.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌感受态细胞的电击转化方法，其特征在于，所述步骤电击转化还包括将电击转化后的重组枯草芽孢杆菌加入RM培养基于37℃培养3-6小时后涂LB平板；
所述RM培养基的组分为胰蛋白胨1％(W/V)，酵母提取物0.5％(W/V)，NaCl 0.5％(W/V)，山梨糖醇500mM，350mM的甘露醇。
7.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌感受态细胞的电击转化方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ZK、枯草芽孢杆菌DB104或枯草芽孢杆菌WB600的其中一种。
8.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌感受态细胞的电击转化方法，其特征在于，所述质粒为穿梭质粒PHT01或PHT304。
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