CN1446911A - 一种人工基因生产嗜热菌蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种人工基团生产嗜热菌蛋白酶的方法。它通过构建表达载体—转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶。本发明蛋白酶收率高，得到的蛋白酶活性也高，达到300－400万U/g，且生产成本低。

Description

一种人工基因生产嗜热菌蛋白酶的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人工基因生产嗜热菌蛋白酶的方法。
背景技术
嗜热菌蛋白酶(thermolysin)，最早嗜从革兰氏阳性菌Bacillusthermoproteolyticus Rokko中分离得到(Endo，1962)。由于它的高度耐热性(当有Ca2+离子存在时，可稳定存在于80度的高温下)，因此常常将其用在一些需要在较高温度下进行的蛋白质水解反应。嗜热菌蛋白酶属于锌金属蛋白酶(zinc endopeptidase)中的M4家族，是第一个被结晶的内切金属肽酶。
嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列(K.Titani，M.A.Hermodson，L.H.Ericsson，K.A.Walsh，andH.Neurath，Nature(London)New Biol.，1972，283，35)和三维空间结构(P.Mcolman，J.N.Jansonius，and B.W.Matthews，J.Mol.Biol.，1972，70，701)都已确定。嗜热菌蛋白酶的活性中心是由锌离子、Glu-143和His-231组成(W.R.Kester，andB.W.Matthews，Biochemistry，1977，16，2056)。每摩尔分子中含有1mol的Zn2+和4mol的Ca2+。Ca2+对酶的热稳定性起决定作用，而Zn2+对于酶的活性是必须的。嗜热菌蛋白酶在成熟前以酶原前体的形式存在，肽段从N端开始依次为引导肽(pre-peptide)、前导肽(pro-peptide)和成熟肽(mature-peptide)。嗜热菌蛋白酶的成熟肽本身并不能自然获得酶活性，只有在自身剪切后的前导肽的辅助下，没有活性的成熟肽才能正确折叠成为有活性的成熟肽。
嗜热菌蛋白酶具有耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等优点，具有广泛的应用价值，可用于食品、医药、制革、纺织等方面，目前应用较多的是在工业上生产二肽甜味剂(NagayasuT，Miyanaga M，Tanaka T，et al.Biotechnol Bioengineer，1994，43：1108～1117.)。
目前对嗜热菌蛋白酶的研究较多，但从天然菌株中分离得到的嗜热菌蛋白酶成本非常昂贵。也有采用基因工程的方法，通过基因重组的方式得到，但酶产量也较低，生产成本也很高。
发明内容
本发明目的在于提供一种成本低、产率高、酶活性好的生产嗜热菌蛋白酶的方法。
本发明提出的生产嗜热菌蛋白酶的方法，是通过构建表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶。其具体步骤如下：
1、蛋白酶全长基因的克隆
根据嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列，以及大肠杆菌BL21(DE3)(购自Stretagene公司)的密码子偏爱性，人工合成小的DNA片断，用PCR法，在90-98℃使双股DNA变成单股DNA，再在45-55℃，引物与互补正链同种顺序DNA组合，另一引物与负链同种顺序的DNA组合；然后，控制温度68-72℃，形成多聚酶作用，组合的引物向一方向伸长，形成2个新的双股DNA；DNA变性，克隆合成嗜热菌蛋白酶全长基因ptmthm。
2、表达载体的构建
以嗜热菌蛋白酶全长基因为模板，以pnmthm1和ptmthm3为引物对，68-72℃，PCR扩增出编码嗜热菌蛋白酶成熟肽的cDNA片断；经DNA片断回收、连接、转化与pET-30a表达质粒(购自Novagen公司)重组得到嗜热菌蛋白酶全长基因重组表达质粒pET30a-ptthm；其中pnmthm1为：AATAAAGTAGAACATACCGGTACAAGT和ptmthm3为：AGCTCTCGAGCTACTTGACTTGACTCCAACT；载体构建图见图1。
3、表达与包含体的分离纯化
所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，经接种培养至OD600为0.2-1.0时以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达3-6小时，收集一定量的表达菌体，再进行分离纯化，使蛋白变性。最后对所得蛋白进行干燥和复性处理，并对酶活性进行测定。
本发明中，分离纯化方法如下：将表达菌体洗涤后加溶菌酶4ml/ml，37℃下处理30min后用超声波破碎菌体，收集包含体沉淀，并用含1.0-3.0mol/L尿素的洗液(50mMolTris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，1.0-3.0mol/L尿素)反复多次洗涤包含体，溶于含6-10mol/L尿素的溶液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，6-10mol/L尿素)中使蛋白变性。
蛋白的干燥方法如下：将上述蛋白放入GLT-3真空冷冻干燥机于-50℃～30℃中干燥10～20小时后得到变性蛋白干燥粉。
蛋白的复性方法如下：将上述变性蛋白干燥粉以一定比例溶解并迅速稀释到复性液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，4μMZnCl2，6-10mM dTT)中，1-2小时，，使之复性，lhr后加入1/2体积的3X SDS-PAGE上样缓冲液中止反应。
酶活的测定方法如下：将嗜热菌蛋白酶用醋酸钙缓冲液配成0.1mg/mL的酶液，在试管中，加入1.9mL 0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)及1mL2％酪蛋白溶液(pH8.0)，加入0.1mL酶液，摇匀后在35℃的恒温水浴中反应10分钟，加入2mL 1.2mol/L三氯乙酸溶液，在35℃的恒温水浴中放置30分钟，过滤，于280nm处测定滤液的吸光度。
本发明首次选用嗜热蛋白酶全长基因为模板，用大肠杆菌进行表达，嗜热蛋白酶的收率高，且得到的嗜热菌蛋白酶活性高，可达300-400万U/g；成本低。
附图说明
图1为载体构建图示。
具体实施方式
下面通过实施例进一步描述本发明。实施例1：蛋白酶全长基因的克隆和表达载体的构建同前述。
1、表达与包含体的分离纯化
所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)后经接种于1000mL培养液中培养至OD600为0.4时以IPTG诱导表达3小时，收集一定量的表达菌体，洗涤后加溶菌酶4ml/ml，37℃下处理30min后用超声波破碎菌体，收集包含体沉淀，并用含1.5mol/L尿素的洗液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，1.5mol/L尿素)反复多次洗涤包含体，溶于含6mol/L尿素的溶液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，6mol/L尿素)中使蛋白变性。
2、蛋白的干燥
将上述蛋白放入GLT-3真空冷冻干燥机于-40℃～28℃中干燥18小时后得到变性蛋白干燥粉4g。
3、蛋白的复性
将上述变性蛋白溶液以一定比例迅速稀释到复性液(50mMol Tris-HCl，10mMolCa2+，pH7.4，4μMZnCl2，6mM dTT)中，1小时，使之复性，1hr后加入1/2体积的3XSDS-PAGE上样缓冲液中止反应。
4、酶活的测定
按照上述方法测定得到酶活为300万U/g.实施例2：蛋白酶全长基因的克隆和表达载体的构建同前述。
1、表达与包含体的分离纯化
所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)经接种10L培养液中培养至OD600为0.6时以IPTG诱导表达6小时，收集表达菌体，洗涤后加溶菌酶4ml/ml，37℃下处理30min后用超声波破碎菌体，收集包含体沉淀，并用含3.0mol/L尿素的洗液(50mMolTris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，3.0mol/L尿素)反复多次洗涤包含体，溶于含9mol/L尿素的溶液(50mMol Tris-HCl，10mMol Ca2+，pH7.4，9mol/L尿素)中使蛋白变性。
2、蛋白的干燥
将上述蛋白放入GLT-3真空冷冻干燥机于-50℃～25℃中干燥16小时后得到变性蛋白干燥粉50g。
3、蛋白的复性
将上述变性蛋白溶液以一定比例迅速稀释到复性液(50mMol Tris-HCl，10mMolCa2+，pH7.4，4μMZnCl2，10mM dTT)中，70分钟，使之复性，lhr后加入1/2体积的3XSDS-PAGE上样缓冲液中止反应。
4、酶活的测定
按照上述方法测定得到酶活为350万U/g。

Claims (4)

1、一种嗜热菌蛋白酶的生产方法，其特征在于是通过构建表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶，具体步骤如下：
(1)蛋白酶全长基因的克隆
根据嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列，以及大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏爱性，人工合成小的DNA片断，用PCR法，在90-98℃使双股DNA变成单股DNA，再在45-55℃，引物与互补正链同种顺序DNA组合，另一引物与负链同种顺序的DNA组合；然后，控制温度68-72℃，形成多聚酶作用，组合的引物向一方向伸长，形成2个新的双股DNA；DNA变性，克隆合成嗜热菌蛋白酶全长基因ptmthm；
(2)表达载体的构建
以嗜热菌蛋白酶全长基因为模板，以pnmthm1和ptmthm3为引物对，68-72℃，PCR扩增出编码嗜热菌蛋白酶成熟肽的cDNA片断；经DNA片断回收、连接、转化与pET-30a表达质粒重组得到嗜热菌蛋白酶全长基因重组表达质粒pET30a-ptthm；
其中pnmthm 1为：AATAAAGTAGAACATACCGGTACAAGT，
ptmthm3为：AGCTCTCGAGCTACTTGACTTGACTCCAACT；
(3)表达与包含体的分离纯化
所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，经接种培养至OD600为0.2-1.0时以异丙基硫代半乳糖苷诱导表达3-6小时，收集一定量的表达菌体，再进行分离纯化，使蛋白变性。
2、根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于分离纯化的步骤如下：将表达菌体洗涤后加溶菌酶4ml/ml，37℃下处理30min后用超声波破碎菌体，收集包含体沉淀，并用含1.0-3.0mol/L尿素的洗液反复多次洗涤包含体，溶于含6-10mol/L尿素的溶液中使蛋白变性。
3、根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于还对所得蛋白进行干燥，具体步骤如下：将上述蛋白放入GLT-3真空冷冻干燥机于-50℃～30℃中干燥10～20小时后得到变性蛋白干燥粉。
4、根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于对所得蛋白还进行复性，具体步骤如下：将上述变性蛋白干燥粉以一定比例溶解并迅速稀释到复性液中，1-2小时，使之复性，1小时后加入1/2体积的3X SDS-PAGE上样缓冲液中止反应。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101868538B (zh) * 2007-11-01 2013-07-10 丹尼斯科美国公司 嗜热菌蛋白酶及其变体的生产和在液体洗涤剂中的用途
CN107164349A (zh) * 2017-05-24 2017-09-15 吉林大学 一种嗜热中性蛋白酶基因、工程菌、酶及其应用

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