CN107164349A - 一种嗜热中性蛋白酶基因、工程菌、酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种嗜热中性蛋白酶基因、生产该嗜热中性蛋白酶的工程菌JD‑TP(大肠埃希氏菌Escherichia coli)、利用该基因工程菌发酵生产的嗜热中性蛋白酶、自催化剪切后获得的成熟的嗜热中性蛋白酶、该嗜热中性蛋白酶及成熟的嗜热中性蛋白酶在降解蛋白质中的应用，属于生物工程技术领域。本发明通过PCR从嗜热细菌Thermus thermophilus HB8基因组中扩增得到嗜热中性蛋白酶基因，将其连入表达载体，在大肠杆菌中成功表达；嗜热中性蛋白酶的最适反应温度85℃，在85℃的半衰期为8d，成熟的嗜热中性蛋白酶的最适反应温度为75℃；嗜热中性蛋白酶的最适pH为7.5至10.0，成熟的嗜热中性蛋白酶最适反应pH为6.5；嗜热中性蛋白酶和成熟的嗜热中性蛋白酶有很高的最适反应温度、热稳定性和较宽的反应pH值，具有很好的工业应用前景。

Description

一种嗜热中性蛋白酶基因、工程菌、酶及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种嗜热中性蛋白酶基因、生产该嗜热中性蛋白酶的工程菌JD-TP(大肠埃希氏菌Escherichia coli)、利用该基因工程菌发酵生产的嗜热中性蛋白酶、自催化剪切后获得的成熟的嗜热中性蛋白酶、该嗜热中性蛋白酶及成熟的嗜热中性蛋白酶在降解蛋白质中的应用。
背景技术
蛋白酶，是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质或多肽的一类水解酶。按活性中心氨基酸残基的种类可分成丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。按反应的pH值可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
蛋白酶在工业中有广泛的应用。在医药领域中，蛋白酶是临床上使用最早、用途最广的药用酶之一，可用于治疗消化不良、消炎、活化血管及高血压的治疗。在食品工业中，蛋白酶可用于肉软化、生产乳酪、啤酒去污及制备蛋白胨等。蛋白酶是加酶洗涤剂添加的主要酶类之一，用于清除蛋白污垢。除了可添加于日用洗涤剂中，蛋白酶还可用于医用多酶洗涤剂中，用于降解手术器械上的血红蛋白等。目前国内市场的医用多酶洗涤剂中添加的蛋白酶主要依靠进口，价格较高，因此开发高活性和稳定性的蛋白酶具有重要的经济、社会和环境效益。
中性蛋白酶是最适反应pH在7.0左右的蛋白酶，已被应用于食品、洗涤剂及纺织等行业。但目前国内从事中性蛋白酶研发和销售的酶制剂企业很少，因此，中性蛋白酶的研发有较好的研究和应用前景。
中国专利CN 103667150公开了一种生产热稳定的中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，所述中性蛋白酶最适反应温度70℃，最适反应pH为7.2。酶在55℃下保温1h酶活不下降。在60℃下，30min酶活力降低了5％，1h酶活力降低15％。
酶在实际应用时条件复杂，而中性蛋白酶的缺点是稳定性差，限制了它的应用范围。嗜热酶与化学催化剂相比，具有催化效率高、底物专一性强及稳定性好等优点，是工业用酶非常有潜力的来源。所以，开发高活性、稳定性的嗜热中性蛋白酶，可为工业用蛋白酶提供优质候选酶。
发明内容
本发明的目的之一是利用PCR方法从嗜热细菌获得一种嗜热中性蛋白酶基因；
本发明的另一个目的是利用上述嗜热中性蛋白酶基因通过生物工程技术构建一种嗜热中性蛋白酶工程菌；
本发明的再一个目的是利用上述嗜热中性蛋白酶工程菌制备一种活性高、稳定性好的嗜热中性蛋白酶；
本发明利用上述嗜热中性蛋白酶经过自催化剪切获得高活性、高稳定性的成熟的嗜热中性蛋白酶。
本发明的最后一个目的是通过对嗜热中性蛋白酶及成熟的嗜热中性蛋白酶的性质研究，提供嗜热中性蛋白酶及成熟的嗜热中性蛋白酶在蛋白质降解应用领域中的应用。
嗜热细菌Thermus thermophilus HB8于1995年从日本温泉中分离，可在65～85℃生长，最适生长温度为75℃。该菌的基因组测序已经完成(NCBI基因组数据库中检索号NC_006461，Masui R.,Kurokawa K.,Nakagawa N.,Tokunaga F.,Koyama Y.,Shibata T.,Oshima T.,Yokoyama S.,Yasunaga T.and Kuramitsu S.)，我们在其基因组中发现一个可能编码嗜热丝氨酸蛋白酶的基因(TTHA0724)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含1305bp，编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO.2所示，包含434aa。经Signal P信号肽在线分析工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析确定蛋白序列中N末端第1～19位氨基酸为信号肽序列，通过质谱分析蛋白分子量(如图1所示)确定第20～109位氨基酸序列为N端前肽，第110～434位氨基酸序列为成熟的嗜热中性蛋白酶(我们通过质谱分析分子量确定切割位点在第109和110位氨基酸之间)。
丝氨酸蛋白酶一般以前体蛋白(pre-pro-protease)形式表达，包括信号肽序列、N端前肽和成熟酶区三部分。信号肽的功能是保证蛋白质从生产细胞释放到胞质或胞外培养基中，在经过细胞膜运输到细胞外时被信号肽酶从前体蛋白上切下来。去除信号肽后的蛋白被称为酶原(pro-protease)，通常是没有活性的，其经过处理后去除N端前肽，成为有活性的成熟酶，这种剪切起因于丝氨酸蛋白酶的自消化或自催化剪切。
由于嗜热细菌人工培养周期长，所含嗜热中性蛋白酶的量非常低，因此不能直接利用嗜热细菌培养物来生产嗜热中性蛋白酶。将嗜热中性蛋白酶基因克隆到可快速繁殖、易于培养的常温宿主如大肠杆菌中，可有效解决上述问题。
如前所述，TTHA0724基因共编码434aa，如序列表SEQ ID NO.2所示，其中第1～19位氨基酸序列为信号肽序列，在大肠杆菌中表达时需要去除这段序列，同时去除第20位的Cys，共去除蛋白N末端的20个氨基酸序列。因此，PCR上游引物的设计是从序列表SEQ IDNO.1所示的第61位核苷酸开始(第61～63位核苷酸编码第21位氨基酸)，共包含1245bp，其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的第21～434位氨基酸序列，共414aa，即本发明的嗜热中性蛋白酶。培养嗜热细菌Thermus thermophilus HB8，提取基因组。利用PCR扩增基因，得到本发明所述含有N端前肽的嗜热中性蛋白酶基因，我们委托上海生工生物有限公司进行基因测序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示的第61～1305位核苷酸。其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的第21～434位氨基酸，包含414aa。通过质谱分析蛋白分子量(见图1)，确定成熟的嗜热中性蛋白酶应从序列表SEQ ID NO.2所示的第110位的Leu开始，即第20～109位氨基酸序列应为N端前肽，不存在于成熟的嗜热中性蛋白酶中，因此，成熟的嗜热中性蛋白酶的序列长度预计为325个氨基酸(如序列表SEQ ID NO.3所示)，与SDS-PAGE检测的成熟的嗜热中性蛋白酶的分子大小一致(见图3)。
我们将嗜热中性蛋白酶基因装载在pET系列载体上，再转入大肠杆菌宿主中，得到一株工程菌(命名为：JD-TP)，该工程菌已于2017年04月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌种中心，CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.14072，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
如本发明提供的工程菌菌株的特征如下：
1.菌体形态特征：菌体为两端钝圆的杆菌，革兰氏阴性细菌。
2.培养特征：菌落为圆形半透明，中部突起，边缘光滑。
3.菌株培养条件：平板培养在培养箱中进行，液体培养在振荡培养箱中进行，最适生长温度37℃，最适pH 7.0，培养基中加入100μg/mL的氨苄青霉素和30μg/mL的氯霉素。嗜热中性蛋白酶的诱导条件为37℃振荡培养至OD600约为0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.2mmol/L，于20℃时180rpm振荡培养过夜。
4.培养基：培养基为LB培养基(1L培养基的配制：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，蒸馏水溶解，定容至1L，1.034×105Pa高压蒸气灭菌20min)和LB固体培养基(在LB培养基配方中加入15g/L的琼脂粉)。
工程菌表达产物是细胞可溶性蛋白，通过细胞超声破碎、加热失活大肠杆菌杂蛋白，Ni-NTA亲和层析进行分离纯化得到嗜热中性蛋白酶。
纯化后的嗜热中性蛋白酶在85℃热处理30min，可进行自催化剪切去除N端前肽，经Ni-NTA亲和层析进行分离纯化得到成熟的嗜热中性蛋白酶。
应用大肠杆菌工程菌(JD-TP)表达的嗜热蛋白经蛋白酶活性实验鉴定具有蛋白酶活力；该嗜热蛋白即为本发明所述的嗜热中性蛋白酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的第21～434位氨基酸序列，包含414aa，分子量约46kDa。嗜热中性蛋白酶能在高温条件(65～90℃)下催化酪蛋白降解，最适反应温度为85℃，可在pH5.0～11.0的范围内催化反应，最适pH为7.5。嗜热中性蛋白酶有很强的耐热性，在中性及碱性条件下保持很高的催化活力及稳定性；嗜热中性蛋白酶经85℃温育，经自催化剪切去除N端前肽后得到分子量约35kDa的成熟的嗜热中性蛋白酶(其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示氨基酸序列，成熟的嗜热中性蛋白酶的最适反应温度为75℃，最适反应pH为6.5，稳定性不如嗜热中性蛋白酶，但85℃的半衰期仍达到60h；该嗜热中性蛋白酶及成熟的嗜热中性蛋白酶运用到生产中，有储运成本低、催化效率高等优点。该嗜热中性蛋白酶及成熟的嗜热中性蛋白酶可催化酪蛋白及BSA等蛋白质水解，在降解蛋白质的应用领域具有重要的应用潜力。
将本发明的嗜热中性蛋白酶基因与表达载体重组，形成重组表达载体，本发明不限于特定的表达载体，优选的表达载体采用真核或原核表达载体，进一步优选为pET22b载体。
上述重组表达载体可按常规方法导入适宜的宿主细胞，适宜的宿主细胞包括原核和真核细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。如大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS及Transetta(DE3)在优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌Transetta(DE3)菌株。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。
本发明所述的嗜热细菌Thermus thermophilus HB8(JCM10941)是一种已知菌种，购自日本Japan Collection of Microorganisms，RIKEN BioResource Center。
本发明中用到的原核表达载体pET22b和大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS是本技术领域人员常用载体和宿主菌，可购自美国Novagen公司，该公司的网址：http://www.novagen.com。可以通过公司给定的联系方式购买，或通过该公司在国内各省市的代理公司购买。
本发明使用的大肠杆菌Transetta(DE3)是一种本领域普遍使用的宿主细胞，购自北京全式金生物技术有限公司，该公司的网址是：http://transgen.com.cn，可以通过公司给定的联系方式购买，或通过该公司在国内各省市的代理公司购买。
本发明通过所构建的表达嗜热中性蛋白酶的大肠杆菌表达体系，提供大量生产具有蛋白酶活性且稳定性好的重组嗜热中性蛋白酶及利用纯化的嗜热中性蛋白酶生产成熟的嗜热中性蛋白酶的方法，包括以下几个步骤：
(1)通过NCBI GenBank搜索得到来自嗜热细菌Thermus thermophilus HB8的嗜热丝氨酸蛋白酶TTHA0724基因序列(1305bp，编码434aa)，利用在线分析工具Signal P分析蛋白序列中前19个aa为分泌信号肽序列，在大肠杆菌中表达要去除蛋白酶自身的信号肽序列，同时去除了第20位的半胱氨酸，因此设计PCR引物时，上游引物从第21位氨基酸密码子处(第61位碱基处)开始，下游引物中去除终止密码子，扩增得到嗜热中性蛋白酶基因片段，利用表达载体pET22b插入位点下游的His6标签使蛋白的C末端带有His6标签便于纯化；培养嗜热细菌Thermus thermophilus HB8，提取其基因组作为模板PCR扩增目的基因片段，并将其连接到质粒表达载体pET22b上构建重组表达质粒；
(2)将上述重组表达质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)宿主细胞中，构建重组大肠杆菌JD-TP；
(3)在上述的大肠杆菌表达系统中表达嗜热中性蛋白酶；
(4)分离纯化所述的嗜热中性蛋白酶；
(5)纯化的嗜热中性蛋白酶在85℃温育30min，经过自催化剪切去除N端前肽，经Ni-NTA纯化得到成熟的嗜热中性蛋白酶；
(6)测定嗜热中性蛋白酶及成熟的嗜热中性蛋白酶的基本酶学性质。
其中，所述步骤(1)中嗜热中性蛋白酶基因通过EcoR I和Xho I双酶切连入经同样处理的表达载体pET22b。
步骤(4)中，包括以下步骤：
a)将发酵液离心收集细胞，按1g湿菌体加入10mL缓冲液的量加入50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液超声破碎20min，12000rpm离心20min收集上清，于70℃热处理30min，12000rpm离15min，收集上清即为粗酶液；
b)将粗酶液经Ni-NTA层析分离，得到纯酶，洗脱液为含100mmol/L咪唑的20mmol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液。
通过本发明上述方法分离纯化得到的嗜热中性蛋白酶和成熟的嗜热中性蛋白酶产品，其纯度达98％以上，在最佳反应条件下，酶的比活力为5145U/mg和2230U/mg。
本发明的有益效果是：
(1)通过PCR扩增得到嗜热中性蛋白酶基因，将其连入表达载体，在大肠杆菌中成功表达；
(2)设计了简便的纯化工艺，获得较高的回收率和较好的纯化效果；
(3)嗜热中性蛋白酶和成熟的嗜热中性蛋白酶具有较高的最适反应温度，较宽的反应温度和pH范围，及极高的稳定性，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1：成熟的嗜热中性蛋白酶的质谱图。
图2：嗜热中性蛋白酶经Ni－NTA纯化的SDS-PAGE电泳图谱，其中1：超声后的上清液在70℃热处理30min的样品；2：50mmol/L咪唑洗脱液；3：100mmol/L咪唑洗脱液；4：200mmol/L咪唑洗脱液；M：标准分子量蛋白标记。
图3：成熟的嗜热中性蛋白酶的SDS-PAGE电泳图谱，其中M：标准分子量蛋白标记；1：嗜热中性蛋白酶于85℃热处理15min的样品；2：嗜热中性蛋白酶于85℃热处理30min的样品；3：经Ni-NTA纯化后的成熟的嗜热中性蛋白酶。
图4：嗜热的中性蛋白酶的温度－活力曲线；
图5：嗜热的中性蛋白酶的温度稳定性曲线；
图6：嗜热的中性蛋白酶的pH－活力曲线；
图7：嗜热的中性蛋白酶的pH稳定性曲线；
图8：成熟的嗜热中性蛋白酶的温度-活力曲线；
图9：成熟的嗜热中性蛋白酶的温度稳定性曲线；
图10：成熟的嗜热中性蛋白酶的pH－活力曲线；
图11：成熟的嗜热中性蛋白酶的pH稳定性曲线；
图12：嗜热中性蛋白酶降解酪蛋白和BSA的SDS-PAGE电泳图谱，其中M：标准分子量蛋白标记；1：嗜热中性蛋白酶在85℃降解2.5mg/mL的BSA 15min的样品；2：2.5mg/mL的BSA在85℃温育15min的样品；3：未处理的2.5mg/mL的BSA样品；4：嗜热中性蛋白酶在85℃降解5mg/mL的酪蛋白15min的样品；2：5mg/mL的酪蛋白在85℃温育15min的样品；3：未处理的5mg/mL的酪蛋白样品。
具体实施方式
实施例1：嗜热中性蛋白酶工程菌的构建及蛋白表达，包括以下步骤：
(1)嗜热细菌Thermus thermophilus HB8的培养和基因组DNA的提取
1L嗜热细菌培养基的组成是：蛋白胨4.0g、酵母抽提物2.0g、NaCl 1.0g、Castenholz盐溶液10.0mL，蒸馏水1.0L，调整pH值至7.2，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌20min。
Castenholz盐溶液：氨三乙酸1.0g、CaSO4·2H2O 0.6g、MgSO4·7H2O 1.0g、NaCl0.08g、KNO3 1.03g、NaNO3 6.89g、Na2HPO4 1.11g、FeCl3·6H2O溶液(质量分数0.03％)10.0mL、Nitsch's微量元素10.0mL、蒸馏水1.0L，调整pH至8.2，过滤除菌。
Nitsch's微量元素：H2SO4 0.5mL、MnSO4·xH2O 2.2g、ZnSO4·7H2O 0.5g、H3BO30.5g、CuSO4·5H2O 0.016g、Na2MoO4·2H2O 0.025g、CoCl2·6H2O 0.046g、蒸馏水1.0L，过滤除菌。
向购买自日本微生物菌种保藏中心的嗜热细菌Thermus thermophilus HB8的干菌体中加入0.5mL已灭菌的上述嗜热细菌培养基，重悬菌体后全部转移到已装有5mL上述嗜热细菌培养基的试管中，混匀；从中吸取0.5mL菌液转移到另装有5mL上述嗜热细菌培养基的试管，置于75℃振荡培养7天。然后将菌体转移至装有100mL上述嗜热细菌培养基的锥形瓶中75℃振荡培养7天。
离心收集3mL菌体，用Axygen基因组提取试剂盒(杭州维特洁生化技术有限公司)提取嗜热细菌Thermus thermophilus HB8基因组，-20℃保存备用。
(2)引物设计及PCR扩增酶基因制备重组载体
Thermus thermophilus HB8基因组已经测序完成，在基因组中含有一个可能的嗜热蛋白酶基因TTHA0724，如序列表SEQ ID NO.1所示，包含1305bp，编码434aa，如序列表SEQID NO.2所示。经Signal P信号肽在线分析工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析确定其中第1～19位氨基酸序列为信号肽序列，在大肠杆菌中表达时需要去除这段序列，同时去除了第20位的Cys，共去除蛋白N末端的20个氨基酸序列。因此，PCR上游引物的设计是从序列表SEQ ID NO.1所示的第61位核苷酸开始(第61～63位核苷酸编码第21位氨基酸)，下游引物中不包含终止密码子(如序列表SEQ ID NO.1所示的第1303～1305位核苷酸)，使基因的3’端融合了载体上编码6xHis标签序列(6xHis标签的核苷酸序列见pET22b的质粒图谱)，它是表达的该蛋白的纯化标签。其编码的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示的第21～434位氨基酸序列，共414aa，即本发明的嗜热中性蛋白酶。引物序列如下：
嗜热中性蛋白酶基因的上游引物：
AATCTAGGATCCCCAGACCCCACCG，横线处为限制酶BamH I识别位点；
嗜热中性蛋白酶基因的下游引物：
AGGTGTCTCGAGGGGGAAGCAGTAGGTG，横线处为限制酶Xho I识别位点。
设计好的引物委托上海生工生物工程有限公司合成。利用合成的引物，通过PCR法以步骤(1)制备的Thermus thermophilus HB8基因组为模板扩增得到嗜热中性蛋白酶基因。
PCR反应：在100μL反应体系中含2μL染色体DNA，1μL上游引物，1μL下游引物，46μL超纯水，50μL 2×Easy Taq酶混合液(北京全式金生物技术有限公司)。每个循环中95℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸80s，共30个循环。PCR反应结束后以1.0％(g/mL)琼脂糖凝胶进行电泳检测产物，分子量与预期的大小一致(1245bp)。PCR产物使用杭州维特洁生化技术有限公司生产的DNA片段凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化的嗜热中性蛋白酶基因片段。
利用BamH I和Xho I切割位点将纯化后的嗜热中性蛋白酶基因重组到表达载体pET22b中，连接后成为重组表达质粒，用于在大肠杆菌中产生重组嗜热中性蛋白酶。
上述重组表达质粒的构建步骤具体如下：
双酶切反应：将上述得到纯化的嗜热中性蛋白酶基因与表达载体pET22b分别用BamH I和Xho I进行酶切，反应体系如下：
反应体系50μL：
40μL样品
5μL限制性内切酶，其中BamH I和Xho I各2.5μL
5μL限制酶切缓冲液K
混合，37℃酶切6小时，酶切反应完成后，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，在紫外灯下从胶中切下目标DNA带，使用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的表达载体pET22b片段和嗜热中性蛋白酶基因片段。
酶切后的嗜热中性蛋白酶基因片段与表达载体pET22b片段的连接：取1μL上述步骤回收的酶切后的表达载体pET22b片段，加入10倍摩尔量的酶切后的嗜热中性蛋白酶基因片段，加入1μL T4DNA连接酶缓冲液，0.5μL T4DNA连接酶(购自大连宝生物工程有限公司)，无菌水补足至10μL，混匀后于16℃水浴连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中，涂布于含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB琼脂平板，于37℃倒置培养过夜。挑取单菌落接菌于含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的5mL LB液体培养基，在37℃、180rpm下振荡培养6h，提取质粒，用限制性内切酶BamH I和XhoI酶切质粒鉴定重组质粒，得到大小两个片段，其大小分别与表达载体pET22b和嗜热中性蛋白酶基因片段大小一致。质粒的提取、大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化方法参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。
(3)重组嗜热中性蛋白酶的表达与制备
上述重组表达质粒可转化大肠杆菌BL21(DE3)系列细胞中，如BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、Rosetta(DE3)及Transetta(DE3)细胞等，获得高表达的嗜热中性蛋白酶。
在本实施例中使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS及Transetta(DE3)为宿主细胞，优化为Transetta(DE3)得到可高效表达嗜热中性蛋白酶的工程菌JD-TP，具有抗氨苄青霉素和氯霉素两种抗性，表达的酶蛋白是可溶性蛋白。质粒转化方法参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。
将上述构建成功的重组表达质粒分别转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS，分别涂布含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB固体平板和含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素和30μg/mL的氯霉素的LB固体平板，于37℃倒置培养过夜。分别挑取表达宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS及Transetta(DE3)各一个单菌落分别接菌于含100μg/mL氨苄青霉素【表达宿主菌为BL21(DE3)】及100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素【表达宿主菌为BL21(DE3)pLysS及Transetta(DE3)】的5mL LB液体培养基，在37℃、180rpm下振荡培养至OD600为0.8，加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.25mmol/L，于25℃、180rpm下振荡培养过夜，诱导嗜热中性蛋白酶的表达。以6000rpm离心10分钟，收集菌体，按1g湿菌体加入10mL缓冲液的量加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬菌体，置冰水浴中超声波破碎细胞(功率约200W)3分钟，12000rpm离心20min所得上清液，按实施例2(1)中蛋白酶活力的测定方法测上清液的蛋白酶活力，分别为53.6、95.4和125.2U/mL，因此优化大肠杆菌菌株Transetta(DE3)为表达本发明嗜热中性蛋白酶的宿主菌，构建的重组工程菌命名为JD-TP。
挑取上述工程菌JD-TP单菌落，接种于5mL LB液体培养基(含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素和30μg/mL的氯霉素)中，在37℃、200rpm下振荡培养过夜。按1：100(体积比)的接种量接种于5mL LB液体培养基(含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素和30μg/mL的氯霉素)中，在37℃、200rpm下振荡培养至OD600为2.0左右。重新按1：100(体积比)的接种量接种于500mL LB培养基(含终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素和30μg/mL的氯霉素)，在37℃、180rpm振荡培养至OD600为0.8(约2～3小时)，加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.2mmol/L，于20℃、180rpm下振荡培养过夜，诱导嗜热中性蛋白酶的表达。
以6000rpm离心10分钟，收集菌体，按1g湿菌体加入10mL缓冲液的量加入50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬菌体，置冰水浴中超声波破碎细胞(功率约200W)20min，12000rpm离心20min所得上清液置于70℃水浴中热处理半小时，可以使部分大肠杆菌杂蛋白变性沉淀，12000rpm离心20min所得上清液，即为嗜热中性蛋白酶粗酶液。
我们在构建重组表达质粒时即设计将嗜热中性蛋白酶的C末端融合了His6标签，因此可以用Ni-NTA亲和层析柱纯化得到本发明的嗜热中性蛋白酶：向上述嗜热中性蛋白酶粗酶液中滴加5mol/L NaCl至终浓度为0.4mol/L，混匀后用0.45μm微孔滤膜过滤杂质，将滤液加入到层析柱中，调低流速至0.6mL/min，使嗜热中性蛋白酶充分与Ni结合，重复上柱2次。用10倍柱体积20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗去未结合的蛋白；用5倍柱体积含20mmol/L咪唑的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗去非特异结合的杂蛋白。然后用2.5倍柱体积的含50、100、150及200mmol/L咪唑的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗脱，流速控制在0.4mL/min，收集洗脱液，应用SDS-PAGE检测，结果如图2所示，嗜热中性蛋白酶主要在含100mmol/L咪唑的洗脱液中，在46kDa处有一蛋白带，与嗜热中性蛋白酶的理论大小相符。将含嗜热中性蛋白酶的洗脱液装入透析袋中，用1L 20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)于4℃透析，每隔2h换透析液，重复透析3次。透析后的样品用聚乙二醇20000浓缩，得到纯化的嗜热中性蛋白酶。
上述纯化后的嗜热中性蛋白酶在85℃温育30min，经过自催化剪切去除N端前肽，获得成熟的嗜热中性蛋白酶，经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得成熟的嗜热中性蛋白酶，操作步骤同上，结果如图3所示，成熟的嗜热中性蛋白酶主要在含100mmol/L咪唑的洗脱液中，在35kDa处有一蛋白带。将纯化后的蛋白用浓缩管Ultracel-10k(Millipore)浓缩至1mg/mL，通过质谱分析蛋白分子量，如图1所示，确定成熟的嗜热中性蛋白酶为如序列表SEQ IDNO.2所示的第110位氨基酸开始至434位氨基酸结束，包含325aa(如序列表SEQ IN NO.3所示)，理论分子量约35kDa，与SDS-PAGE检测的结果相符。
本发明利用PCR方法获得嗜热细菌Thermus thermophilus HB8的嗜热中性蛋白酶基因，使用该基因表达出嗜热中性蛋白酶。所述的嗜热中性蛋白酶以可溶性蛋白形式表达，使用Ni-NTA亲和层析法纯化制备了本发明的嗜热中性蛋白酶。将纯化的嗜热中性蛋白酶于85℃温育30min，经自催化剪切，Ni-NTA亲和层析法纯化制备了本发明的成熟的嗜热中性蛋白酶。
实施例2：重组嗜热中性蛋白酶及成熟的嗜热中性蛋白酶的性质
(1)最适反应温度和温度稳定性
温度是影响酶催化活力的重要因素。以酪蛋白为底物，在50-90℃范围内测定本发明所述重组嗜热中性蛋白酶的活力，以酶的相对活力对温度作图，如图4所示，嗜热中性蛋白酶的最适反应温度为85℃，并且在65～90℃范围内，保持80％以上的酶活力。成熟的嗜热中性蛋白酶的活力-温度曲线见图5，其最适反应温度为75℃，并且在65-85℃范围内，酶活力都维持在较高水平，接近最高活力；在50-90℃范围内成熟的嗜热中性蛋白酶保持了70％以上的酶活力，有较宽的反应温度范围。
蛋白酶活力的检测：使用酪蛋白作为底物，用Folin酚法测定蛋白酶活性。用于该测定的酪蛋白底物的制备：将1g酪蛋白溶于100mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中配置成含1％酪蛋白的底物溶液。取0.05mL底物溶液在85℃温育5min，之后加入0.05mL的酶溶液，于85℃反应15min。之后加入0.1mL 10％三氯乙酸(TCA)溶液终止反应，室温下静置15min，于12000rpm离心10min，取0.1mL上清液，加入0.5mL的0.4mol/L碳酸钠和0.1mL的Folin酚溶液混匀，静置20min后用UV-1601分光光度计于655nm处测定吸光度值，对照为在加酶液前先加10％TCA，其余处理相同。在上述反应条件下，酶活力单位定义为1min水解酪蛋白释放1μg酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位。
将浓度为0.1mg/mL的嗜热中性蛋白酶在85℃中保温不同时间，按上述蛋白酶活力的检测方法分别测定嗜热中性蛋白酶及成熟的嗜热中性蛋白酶的残余活力。嗜热中性蛋白酶的热稳定性结果如图6所示，嗜热中性蛋白酶在85℃的半衰期为8d；在第9天时，酶依然保留约46％的酶活力。成熟的嗜热中性蛋白酶的热稳定性结果如图7所示，成熟的嗜热中性蛋白酶在85℃的半衰期为60h；在第4天时，酶依然保留约40％的酶活力。说明本发明的嗜热中性蛋白酶和成熟的嗜热中性蛋白酶具有非常好的热稳定性。
(2)最适反应pH和pH稳定性
以酪蛋白为底物，85℃下测定嗜热中性蛋白酶和成熟的嗜热中性蛋白酶在pH 4.0～12.0范围内的活力，使用的缓冲液是50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH4.0～6.0)，Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 6.0～8.0)，Tris-HCl缓冲液(pH 8.0～9.0)，甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9.0～11.0)，碳酸氢钠-NaOH缓冲液(pH 11～12)。嗜热中性蛋白酶的活力-pH曲线如图8所示，嗜热中性蛋白酶在pH 6.0至11.0之间能够有效地催化酪蛋白的水解，最适pH为7.5和11.0，在中性及碱性条件下可发挥最大催化活性。成熟的嗜热中性蛋白酶的活力-pH曲线如图9所示，成熟的嗜热中性蛋白酶在pH 5.0至10.0之间能够有效地催化酪蛋白的水解，最适pH为6.5，在中性条件下发挥最大催化活性。
将0.1mg/mL的酶液分别于上述不同的pH值的缓冲液(pH 4.0～12.0)中85℃温育1h后，测定剩余的酶活性。以处理前的酶活力定义为100％，分别计算不同pH值条件下剩余酶活性。嗜热中性蛋白酶的pH稳定性曲线如图10所示，嗜热中性蛋白酶在pH 5.0～10.0的范围内具有很强的稳定性，活力没有损失，都有一定程度的增加。成熟的嗜热中性蛋白酶的pH稳定性曲线如图11所示，成熟的嗜热中性蛋白酶在pH 6.0～11.0的范围内具有较强的稳定性，剩余酶活力保持在70％以上。相比于嗜热中性蛋白酶，成熟的嗜热中性蛋白酶的稳定性有所降低。
(3)金属离子对嗜热中性蛋白酶活力的影响
按实施例2(1)中蛋白酶的活力检测方法，在嗜热中性蛋白酶与底物酪蛋白进行反应的体系中，分别加入不同的金属离子(Cu2+，Ca2+，Ba2+，K+，Na+，Fe3+，Mg2+和Ni2+)，金属离子的终浓度为1mmol/L，以不加金属离子的反应体系中的酶活力定义为100％，分别测定加入金属离子后各反应体系中蛋白酶的相对酶活力。结果如表1所示，K+、Cu2+、Ni2+和Mg2+可一定程度地提高酶活力，Ca2+和Ba2+对酶活力没有影响。Fe3+对酶有一定抑制作用(约10％)。因此，本发明的嗜热中性蛋白酶是金属离子非依赖型酶。
表1.金属离子对酶活力的影响
实施例3：嗜热中性蛋白酶降解蛋白质的分析
为了检测嗜热中性蛋白酶对不同蛋白底物的降解能力，将50μL 0.1mg/mL嗜热中性蛋白酶分别与5mg/mL的酪蛋白和2.5mg/mL的BSA等体积混合于85℃温育15min后利用SDS-PAGE观察底物降解情况(图12)。电泳显示酪蛋白和BSA在15min内全部降解，说明嗜热中性蛋白酶具有很强的蛋白水解能力，在降解蛋白质的应用领域中具有很高的应用潜力。
本发明所公开的内容，相信本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限定本发明的范围。本领域研究人员在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
<110> 吉林大学
<120> 一种嗜热中性蛋白酶基因、工程菌、酶及其应用
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 1305
<212> DNA
<213> Thermus thermophilus HB8
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1305)
<220>
<221> mature
<222> (328)..(1305)
<400> 1
atg aag cgc ctg ctc ttt ggg gcc ctt ttc ctc tcc acg gcc ctc ctc 48
Met Lys Arg Leu Leu Phe Gly Ala Leu Phe Leu Ser Thr Ala Leu Leu
1 5 10 15
ctc acg gcc tgt ccc cag acc cca ccg ccg ccc gtg aac ccc gcc gag 96
Leu Thr Ala Cys Pro Gln Thr Pro Pro Pro Pro Val Asn Pro Ala Glu
20 25 30
tgc ccg gta ggt ccc ctg cgg gtg cag agc ctg gat gct cct tct aag 144
Cys Pro Val Gly Pro Leu Arg Val Gln Ser Leu Asp Ala Pro Ser Lys
35 40 45
ctg cac ggt ttg gga agc ttt aaa ggg gag ttc gtt ccg gga gaa ctc 192
Leu His Gly Leu Gly Ser Phe Lys Gly Glu Phe Val Pro Gly Glu Leu
50 55 60
att gta gtg ccc aaa cca ggt ctt tcc ctt cag agc ttg cgg gcc tca 240
Ile Val Val Pro Lys Pro Gly Leu Ser Leu Gln Ser Leu Arg Ala Ser
65 70 75 80
gga gta gag ccc cag gcc cag ctc gcc ctg gac gta atc aag gtg aag 288
Gly Val Glu Pro Gln Ala Gln Leu Ala Leu Asp Val Ile Lys Val Lys
85 90 95
gtt ccc cat ggg gag gag aaa gtc cga gcg gaa gct ctt ttg cgg gcg 336
Val Pro His Gly Glu Glu Lys Val Arg Ala Glu Ala Leu Leu Arg Ala
100 105 110
ggt gct cag tat gtc cag ccc aac tac gtt tac cgg cct ttg cgg gct 384
Gly Ala Gln Tyr Val Gln Pro Asn Tyr Val Tyr Arg Pro Leu Arg Ala
115 120 125
ccg aat gac ctc tat tac ccc gat caa agc gcc tac ttg aat cgg ttg 432
Pro Asn Asp Leu Tyr Tyr Pro Asp Gln Ser Ala Tyr Leu Asn Arg Leu
130 135 140
gtg cgc tta gaa agc gct tgg gac ttc agc aca ggc agg gga tgc ccg 480
Val Arg Leu Glu Ser Ala Trp Asp Phe Ser Thr Gly Arg Gly Cys Pro
145 150 155 160
ccc ctt gtg gcc gtg cta gac acg gga gtt ctt gcc cac gag gac ttt 528
Pro Leu Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Leu Ala His Glu Asp Phe
165 170 175
cag gcc agc aag tac ctc ccc gcc ggg gtt aac ctg gac gtg gct gac 576
Gln Ala Ser Lys Tyr Leu Pro Ala Gly Val Asn Leu Asp Val Ala Asp
180 185 190
gga gat gcc aat ccc acg gac gac tcg gct ccc aac aat tgg ggg cat 624
Gly Asp Ala Asn Pro Thr Asp Asp Ser Ala Pro Asn Asn Trp Gly His
195 200 205
ggt tta gag gtg gcc tcg gtc ttg ggg gcg gat acc aac aac tct aag 672
Gly Leu Glu Val Ala Ser Val Leu Gly Ala Asp Thr Asn Asn Ser Lys
210 215 220
gga ata gca gga act acc tgg ggt gga tac gtt gtt cca atc aag gtt 720
Gly Ile Ala Gly Thr Thr Trp Gly Gly Tyr Val Val Pro Ile Lys Val
225 230 235 240
ttc tac cgg ggt ggt gga gcc acg tat gaa acc ctt ttc aag ggg gtt 768
Phe Tyr Arg Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Phe Lys Gly Val
245 250 255
cgg tta gcc cgc caa ctg ggg gcc cag gtc atc aac att tcg ctg ggg 816
Arg Leu Ala Arg Gln Leu Gly Ala Gln Val Ile Asn Ile Ser Leu Gly
260 265 270
ggt aac gac tat gac gag gtt ctg gat gag gag ctg gcc cgg gct cgg 864
Gly Asn Asp Tyr Asp Glu Val Leu Asp Glu Glu Leu Ala Arg Ala Arg
275 280 285
aac gag ggg agg gtt att gta gct gcg gcg gga aac tac gag acc ggg 912
Asn Glu Gly Arg Val Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Tyr Glu Thr Gly
290 295 300
aat ggg gga ccg gtt atg ttc cct gcc agc agc ccc aac act ctc gct 960
Asn Gly Gly Pro Val Met Phe Pro Ala Ser Ser Pro Asn Thr Leu Ala
305 310 315 320
gtg ggt gcg gta gat ctc ctt aaa agg cgg gcg aat ttt tcg gcc tat 1008
Val Gly Ala Val Asp Leu Leu Lys Arg Arg Ala Asn Phe Ser Ala Tyr
325 330 335
ggc ccc gag ctt gac cta atg gct cca ggg gtg gag gtt ttg gcg gca 1056
Gly Pro Glu Leu Asp Leu Met Ala Pro Gly Val Glu Val Leu Ala Ala
340 345 350
ggc cct tca ggc aac tat cgc ttt gtg agc ggc acc tct ttg gct agc 1104
Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Arg Phe Val Ser Gly Thr Ser Leu Ala Ser
355 360 365
ccc atc gtg gcc ggg gtg gtg gcc ctc tac atg agc aag tac gcc agc 1152
Pro Ile Val Ala Gly Val Val Ala Leu Tyr Met Ser Lys Tyr Ala Ser
370 375 380
gag cgg aag gcg tgg cct agc ccg gac cag gtc tac caa tgc ctc atc 1200
Glu Arg Lys Ala Trp Pro Ser Pro Asp Gln Val Tyr Gln Cys Leu Ile
385 390 395 400
aac acc gcc gag gac cta ggg cct tcc ggt tgg gac ccg gaa tac ggc 1248
Asn Thr Ala Glu Asp Leu Gly Pro Ser Gly Trp Asp Pro Glu Tyr Gly
405 410 415
ttc ggc ctg gtc cgg gcc gac cgg gcg atg acg gac acc acc tac tgc 1296
Phe Gly Leu Val Arg Ala Asp Arg Ala Met Thr Asp Thr Thr Tyr Cys
420 425 430
ttc ccc taa 1305
Phe Pro *
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<212> PRT
<213> Thermus thermophilus HB8
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Met Lys Arg Leu Leu Phe Gly Ala Leu Phe Leu Ser Thr Ala Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Pro Gln Thr Pro Pro Pro Pro Val Asn Pro Ala Glu
20 25 30
Cys Pro Val Gly Pro Leu Arg Val Gln Ser Leu Asp Ala Pro Ser Lys
35 40 45
Leu His Gly Leu Gly Ser Phe Lys Gly Glu Phe Val Pro Gly Glu Leu
50 55 60
Ile Val Val Pro Lys Pro Gly Leu Ser Leu Gln Ser Leu Arg Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Glu Pro Gln Ala Gln Leu Ala Leu Asp Val Ile Lys Val Lys
85 90 95
Val Pro His Gly Glu Glu Lys Val Arg Ala Glu Ala Leu Leu Arg Ala
100 105 110
Gly Ala Gln Tyr Val Gln Pro Asn Tyr Val Tyr Arg Pro Leu Arg Ala
115 120 125
Pro Asn Asp Leu Tyr Tyr Pro Asp Gln Ser Ala Tyr Leu Asn Arg Leu
130 135 140
Val Arg Leu Glu Ser Ala Trp Asp Phe Ser Thr Gly Arg Gly Cys Pro
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Pro Leu Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Leu Ala His Glu Asp Phe
165 170 175
Gln Ala Ser Lys Tyr Leu Pro Ala Gly Val Asn Leu Asp Val Ala Asp
180 185 190
Gly Asp Ala Asn Pro Thr Asp Asp Ser Ala Pro Asn Asn Trp Gly His
195 200 205
Gly Leu Glu Val Ala Ser Val Leu Gly Ala Asp Thr Asn Asn Ser Lys
210 215 220
Gly Ile Ala Gly Thr Thr Trp Gly Gly Tyr Val Val Pro Ile Lys Val
225 230 235 240
Phe Tyr Arg Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Phe Lys Gly Val
245 250 255
Arg Leu Ala Arg Gln Leu Gly Ala Gln Val Ile Asn Ile Ser Leu Gly
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Gly Asn Asp Tyr Asp Glu Val Leu Asp Glu Glu Leu Ala Arg Ala Arg
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Asn Gly Gly Pro Val Met Phe Pro Ala Ser Ser Pro Asn Thr Leu Ala
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Val Gly Ala Val Asp Leu Leu Lys Arg Arg Ala Asn Phe Ser Ala Tyr
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Glu Arg Lys Ala Trp Pro Ser Pro Asp Gln Val Tyr Gln Cys Leu Ile
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Asn Arg Leu Val Arg Leu Glu Ser Ala Trp Asp Phe Ser Thr Gly Arg
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Gly Cys Pro Pro Leu Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Leu Ala His
50 55 60
Glu Asp Phe Gln Ala Ser Lys Tyr Leu Pro Ala Gly Val Asn Leu Asp
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Val Ala Asp Gly Asp Ala Asn Pro Thr Asp Asp Ser Ala Pro Asn Asn
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Ile Lys Val Phe Tyr Arg Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Phe
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Lys Gly Val Arg Leu Ala Arg Gln Leu Gly Ala Gln Val Ile Asn Ile
145 150 155 160
Ser Leu Gly Gly Asn Asp Tyr Asp Glu Val Leu Asp Glu Glu Leu Ala
165 170 175
Arg Ala Arg Asn Glu Gly Arg Val Ile Val Ala Ala Ala Gly Asn Tyr
180 185 190
Glu Thr Gly Asn Gly Gly Pro Val Met Phe Pro Ala Ser Ser Pro Asn
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Leu Ala Ala Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Arg Phe Val Ser Gly Thr Ser
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Leu Ala Ser Pro Ile Val Ala Gly Val Val Ala Leu Tyr Met Ser Lys
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Tyr Ala Ser Glu Arg Lys Ala Trp Pro Ser Pro Asp Gln Val Tyr Gln
275 280 285
Cys Leu Ile Asn Thr Ala Glu Asp Leu Gly Pro Ser Gly Trp Asp Pro
290 295 300
Glu Tyr Gly Phe Gly Leu Val Arg Ala Asp Arg Ala Met Thr Asp Thr
305 310 315 320
Thr Tyr Cys Phe Pro
325

Claims (9)

1.一种嗜热中性蛋白酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
2.一种嗜热中性蛋白酶，其氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的第21～434位氨基酸序列。
3.一种成熟的嗜热中性蛋白酶，其氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。
4.一种制备权利要求2所述的嗜热中性蛋白酶的工程菌JD-TP，其于2017年4月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.14072，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
5.一种权利要求2所述的嗜热中性蛋白酶的制备方法，其步骤如下：
(1)根据通过NCBI GenBank检索得到的来自嗜热细菌的嗜热中性蛋白酶基因TTHA0724设计引物；培养嗜热菌Thermus thermophilus HB8，提取其基因组作为嗜热中性蛋白酶基因的模板PCR扩增目的基因片段，并将其连接到质粒表达载体pET22b上；
(2)将嗜热中性蛋白酶基因连接到表达载体pET22b上，构建含有所述嗜热中性蛋白酶基因的重组表达质粒；
(3)将所述重组表达质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)宿主细胞中，构建重组大肠杆菌JD-TP；
(4)在所述的重组大肠杆菌表达系统中表达嗜热中性蛋白酶；
(5)分离纯化所述的嗜热中性蛋白酶。
6.如权利要求5所述的嗜热中性蛋白酶的制备方法，其特征在于：步骤(5)的分离纯化是将发酵液离心收集细胞，加入缓冲液超声破碎20min，12000rpm离心20min，收集到上清于70℃热处理半小时，12000rpm离心20min，收集到的上清即为粗酶液；然后将粗酶液经Ni-NTA层析分离，得到纯的嗜热中性蛋白酶，洗脱液为含100mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液。
7.一种权利要求3所述的成熟的嗜热中性蛋白酶的制备方法，其特征在于：是将权利要求6得到的纯的嗜热中性蛋白酶于85℃温育30min，经自催化剪切后得到成熟的嗜热中性蛋白酶，经Ni-NTA层析分离得到纯化的成熟的嗜热中性蛋白酶。
8.权利要求2所述的嗜热中性蛋白酶在降解蛋白质应用领域的应用。
9.权利要求3所述的成熟的嗜热中性蛋白酶在降解蛋白质应用领域的应用。
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