CN110343689A

CN110343689A - 一种新型链霉菌胰蛋白酶gm2938及其异源表达

Info

Publication number: CN110343689A
Application number: CN201910781198.4A
Authority: CN
Inventors: 田永强; 王志宽; 龙秀锋
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2039-08-23
Also published as: CN110343689B

Abstract

本发明公开了一种链霉菌胰蛋白酶基因、异源表达载体构建及该酶酶学性质，属于生物技术领域。本发明所述的GM2938基因全长是通过挖掘内生链霉菌A249全基因数据而获得，其基因全长759 bp，编码253个氨基酸，并通过PCR体外扩展了该基因。本发明为首次实现胰蛋白酶GM2938基因在枯草芽孢杆菌SCK6中的异源克隆、表达、纯化，并进行了胰蛋白酶学性质表征。该胰蛋白酶具有很好的酶学特性，这将在皮革工艺和食品工业应用中具有广阔的前景。

Description

一种新型链霉菌胰蛋白酶GM2938及其异源表达

技术领域

本发明涉及一种链霉菌胰蛋白酶GM2938的异源表达及其应用的技术领域。

背景技术

链霉菌胰蛋白酶是微生物胰蛋白酶家族中的重要一员，因其具有较好的生物安全性、生产品质可控性、非钙离子活化、与哺乳动物牛胰蛋白酶存在同源性且酶学性质也与牛胰蛋白酶相似等优点，而被广泛的应用到制药、临床诊断、食品加工、皮革加工、生化检测等领域。

相比哺乳动物来源的胰蛋白酶，微生物发酵生产可以获得组分单一、应用相似的胰蛋白酶，但是由于链霉菌自身发酵周期较长、工业发酵不易控制、产量偏低、后期次级代谢产物影响后续酶工艺纯化等缺点，研究者们期望利用基因工程的手段，来获得链霉菌胰蛋白酶的异源表达。目前，链霉菌胰蛋白酶的研究还存在如下问题：（1）产胰蛋白酶的链霉菌开发不足，链霉菌胰蛋白酶种类较少；（2）链霉菌胰蛋白酶基因中GC含量高，难以实现有活性的异源表达；（3）酶产量较低，无法满足工业要求。当前的研究重点仍然是挖掘开发新颖胰蛋白酶基因，通过基因工程及分子生物学技术来获得高产、稳定的胞外活性链霉菌胰蛋白酶。

随着对链霉菌胰蛋白酶编码基因的深入研究，部分链霉菌胰蛋白酶已经实现了在异源宿主中的表达；其中弗氏链霉菌类胰蛋白酶SFT分别在E. coli系统中以酶原形式得到表达，在Pichia系统中以成熟酶形式得到表达；灰色链霉菌胰蛋白酶SGT，其异源表达得到较多研究，分别于大肠杆菌，链霉菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母系统中实现了异源表达，但由于链霉菌胰蛋白酶编码基因中GC含量较高，且蛋白自身含有三对二硫键，使得其在大多数表达系统中的表达效率和产量都较低；因此，选择合适的信号肽构建重组表达质粒，可为后续其他链霉菌胰蛋白酶的开发与异源表达提供指导。

发明内容

本发明首先提供了一种编码链霉菌胰蛋白酶GM2938的基因，其是以一株分离自传统药用植物响叶杨茎部组织中的内生链霉菌A249为出发菌株，通过对菌株A249基因组数据的挖掘、比对和可行性研究分析后，挑选出胰蛋白酶GM2938的基因，该基因全长759bp，编码252个氨基酸；其中1-25位氨基酸为信号肽，26-29为氨基酸为前肽，30-252位氨基酸为该胰蛋白酶的成熟肽。

本发明通过设计特异性引物、PCR获得了GM2938的基因，并经POE-PCR（prolongedoverlap extension PCR）手段构建了重组质粒pWB980-mt2938，该重组质粒转化枯草芽孢杆菌SCK6，通过牛奶平板及酶活检测，实现了链霉菌胰蛋白酶GM2938成熟肽的异源活性表达，后经丝氨酸蛋白酶专用亲核层析柱Hitrap benzamidine FF纯化得到了重组菌株胞外所产胰蛋白酶。

本发明所得到的新颖链霉菌胰蛋白酶其分子量约为28 kDa，该酶最适反应温度50^oC，最适反应pH为9.0，在25 °C、pH 5.0-9.0的范围内，该重组胰蛋白酶的稳定性较好；该酶对Cr³⁺有一定的耐受性，其耐受范围在0-15 mM之间(耐受性以相对酶活>60%记)，且从该酶催化底物BAEE和BAPAN的动力学参数看出，胰蛋白酶GM2938性质较突出，其胶原蛋白酶活力低，无弹性蛋白酶活，这将在皮革工艺上和食品工业中具有很好的应用前景。

附图说明

图1为胰蛋白酶GM2938成熟肽基因的的电泳图；M，线性DNA marker；1，GM2938成熟肽基因的PCR片段；

图2为POE-PCR过程电泳及菌落PCR验证：A，pWB980质粒线性化温度梯度(M，线性DNAmarker；1-8，线性化质粒)；B，重组质粒pWB980-mt2938多聚体(9-10，质粒多聚体)；C，重组质粒pWB980-mt2938菌落PCR验证(11-14，菌落PCR)。

图3为重组菌株表达胰蛋白酶GM2938的SDS-PAGE电泳：1，发酵液；2，10倍浓缩发酵液；3，纯化液；4，2倍浓缩纯化液；M，蛋白质 marker。

图4，图5，图6分别为纯化的胰蛋白酶FM2938的温度，pH、耐Cr³⁺等性质。

图7重组酶动力学拟合：(a)，动力学参数-BAEE；(b)，动力学参数-BAPAN。

具体实施方式

实施例一：胰蛋白酶GM2938基因的获得

提取内生链霉菌菌株A249的基因组DNA，进行全基因组序列测序（由北京诺禾致源生物完成），结合得到的ORF阅读框，进行相关文献的查阅及数据库的比对、可行性研究分析后，选定了一个较新颖胰蛋白酶GM2938的基因，其编码的氨基酸序列与已知的、来源于灰色链霉菌的胰蛋白酶SGT相似性为80.85%。

实施例二：GM2938成熟肽基因的异源表达

设计特异性引物扩增GM2938的成熟肽基因,上游引物(5'-AGGAGGCGCAACTCAAGCTTTTGCAGTCGTCGGCGGCACGCGCGCCG-3'),下游引物(5'-AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTCAGAGACCGGCGG CCGCTCTGGCT-3')，设计质粒pWB980线性化引物，上游引物(5'-AGCCAGAGCGGCCGCCGGTCTCTGAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCT-3'),下游引物(5'-CGGCGCGCGTGCCGCCGACGACTGCAAAAGCTTGAGT TGCGCCTCCT -3')，分别通过PCR获得扩增后的GM2938的成熟肽基因和线性化后的质粒pWB980片段，纯化回收后的线性化质粒和目的基因片段互为引物，通过超高保真酶进行POE-PCR，所得质粒多聚体转化枯草芽孢工程菌SCK6，得到基因工程表达菌。

实施例三：重组枯草芽孢工程菌培养条件

含重组质粒pWB980-mt2938的工程菌B. subtilis SCK6接种于含有1µg/mL红霉素和50µg/mL卡那霉素的100mL LB抗性培养基中，37°C摇床过夜培养，次日取上述种子液以2%的接种量接种于带有相同抗性的发酵培养基中（培养基成分：15g/L可溶性淀粉，16 g/L胰蛋白胨，32 g/L大豆蛋白胨，72 mM K₂HPO₄，17 mM KH₂PO₄；培养基初始pH值为8.0），34 °C，200rpm摇床培养72 h；由于质粒pWB980所带启动子均为组成型启动子，不需要额外加入诱导剂诱导蛋白表达，且目的基因前均加有信号肽以促进蛋白的胞外表达，故需收集离心后所得的上清液，并测定上清液中胰蛋白酶活性。

实施例四：胰蛋白酶活性测试

胰蛋白酶能够专一水解与赖氨酸或精氨酸连接的酯键酰胺键，故本发明测试了该重组胰蛋白酶的酯酶活性和酰胺酶活性，其方法如下：

胰蛋白酶酯酶活性：本发明利用化合物N_α-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)作为胰蛋白酶酯酶测试底物；通过在253 nm波长下，合适的时间内测试胰蛋白酶催化化合物BAEE分解生成苯甲酰精氨酸的吸光度，再利用其吸光度的变化率来反映所测胰蛋白酶样品的酯酶活性大小。具体测试方法如下：配置67 mM，pH 7.6的磷酸钠缓冲液，称取化合物BAEE溶解于上述缓冲液，使其终浓度为0.25 mM，此即为酯酶测试底物；测试步骤为：将上述底物和酶液在25°C下预热3min，并于25 °C下，取3mL BAEE底物溶液于光经为1 cm的比色皿中，加入200 µL待测试酶液并迅速混匀，于紫外分光光度计，波长253 nm处，测试5 min内上述比色皿中吸光度的变化，计算ΔA_253nm/min的值；酶活定义为：于25 °C下，每分钟ΔA_253nm升高0.001为一个胰蛋白酶酯酶酶活单位；

胰蛋白酶酰胺酶活性：本发明利用化合物N_α-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯酰胺(BAPAN)作为胰蛋白酶酰胺酶测试底物；通过在波长410nm下，合适的时间内测试胰蛋白酶催化化合物BAPAN分解生成对硝基苯胺的吸光度，再利用其吸光度的变化率来反映所测胰蛋白酶样品的酰胺酶酶活力大小。具体测试方法如下：配置50 mM，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，称取化合物BAPAN溶解于二甲基亚砜，使其终浓度为25 mM；测试酰胺酶酶活时，将上述缓冲液和酶液在37 °C下预热3min，并于37 °C下，取2 mL Tris-HCl缓冲液于光经为1 cm的比色皿中，向其加入50µl BAPAN溶液，混匀作为底物溶液，再加入200 µL待测试酶液，迅速混匀，于紫外分光光度计，波长410 nm处，测试5 min内上述比色皿中吸光度的变化，计算ΔA_410nm/min的值；酶活定义为：于37°C下，每分钟ΔA_410nm升高0.1为一个胰蛋白酶酰胺酶酶活单位。

实施例五：胰蛋白酶GM2938的纯化

（1）样品处理：离心所得发酵上清液先经0.22μm的微孔滤膜过滤处理，再经大小为3kDa的超滤离心管离心20 min(浓缩2倍左右)；

（2）亲和柱纯化及再生：采用丝氨酸蛋白酶专用亲合层析柱Hitrap benzamidine FF进行重组胰蛋白酶GM2938的纯化，在上样之前，亲和柱首先用超纯水清洗10个柱体积；再经6M盐酸胍清洗以去除柱填料里残留的蛋白；并再次用超纯水清洗以除去盐酸胍；后经上样平衡液A适当平衡纯化柱后，方可上样用于蛋白纯化；待蛋白纯化结束后再次重复上述程序除去残留蛋白，并泵入适量的20%乙醇溶液保护纯化柱；上述所用液体均经0.22 μm的微孔滤膜过滤除杂；

（3）胰蛋白酶样品纯化：处理后的样品注入APPS 50D蛋白纯化仪，待上样完毕后，用上样平衡液A适当平衡纯化柱；后通过10%洗脱缓冲液B洗脱以除去未结合于纯化柱上的蛋白；再用洗脱缓冲液B洗脱，收集有色谱吸收峰的纯化样品，且每毫升收集液中加入1 M Tris-HCl缓冲液60 μL后^[82]，检测其胰蛋白酶活性。

实施例六：胰蛋白酶GM2938的酶学性质研究

分别在不同温度(20 ^oC，25 ^oC，30 ^oC，37 ^oC，40 ^oC，50 ^oC，60 ^oC，70 ^oC)测定该胰蛋白酶酶活；在pH 2.0-pH 12.0的pH值范围内检测重组胰蛋白酶GM2938的酯酶活性和酰胺酶活性；将重组胰蛋白酶样品与不同浓度的碱式硫酸铬(Cr(OH)SO₄)溶液均匀混合，使Cr³⁺终浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40 mM，室温放置1h后，检测胰蛋白酶酯酶和酰胺酶活性；以BAEE和BAPAN为反应底物，测定重组胰蛋白酶GM2938对酯键和酰胺键的动力学参数。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种新型链霉菌胰蛋白酶GM2938及其异源表达

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> 链霉菌胰蛋白酶(Streptomyces trypsin GM2938)

<400> 1

gtgatcagaa gactgctcgc cgtcggcgcg gtcgcgctcg ccgccgtgtc cctccagccg 60

ctgtccgcgc tcgccgcccc cgcgcccgtc gtcggcggca cgcgcgccgc ccagggcgaa 120

ttccccttca tggtccgcct ctccatgggc tgcggcggcg ccctctacac ccagagcatc 180

gtcctgaccg ccgcccactg cgtgaacggc tccggcacca acacctccat caccgccacc 240

gccggcgtcg tggacctcca gagcagcagc gccgtcaagg tcaagtccac caaggtgctc 300

caggcgcccg gctacaacgg caagggcaag gactgggccc tcatcaagct cgcccggccc 360

atcgccctgc ccaccctgaa gatcgccacc aacaccgcct acaacaacgg cgacttcacc 420

gtcgccggct ggggcgccgc ccgggaaggc ggcggacagc agcgctacct gctcaaggcc 480

accgtcccct tcgtcgacga cgccacctgc aagcaggcgt acggcagcga cctcgtcccc 540

ggcgacgaga tctgcgccgg attcgtcgcc cagggcggcg tcgacacctg tcagggcgac 600

tccggcggac ccatgttccg caaggacgac accggcgcct acatccaggt cggcatcgtg 660

agctggggcg agggctgcgc ccggcccgga taccccggcg tgtacagcga ggtctcgacc 720

ttcgccgccg acatagccag agcggccgcc ggtctctga 759

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 链霉菌胰蛋白酶(Streptomyces trypsin GM2938)

<400> 2

Val Ile Arg Arg Leu Leu Ala Val Gly Ala Val Ala Leu Ala Ala Val

1 5 10 15

Ser Leu Gln Pro Leu Ser Ala Leu Ala Ala Pro Ala Pro Val Val Gly

20 25 30

Gly Thr Arg Ala Ala Gln Gly Glu Phe Pro Phe Met Val Arg Leu Ser

35 40 45

Met Gly Cys Gly Gly Ala Leu Tyr Thr Gln Ser Ile Val Leu Thr Ala

50 55 60

Ala His Cys Val Asn Gly Ser Gly Thr Asn Thr Ser Ile Thr Ala Thr

65 70 75 80

Ala Gly Val Val Asp Leu Gln Ser Ser Ser Ala Val Lys Val Lys Ser

85 90 95

Thr Lys Val Leu Gln Ala Pro Gly Tyr Asn Gly Lys Gly Lys Asp Trp

100 105 110

Ala Leu Ile Lys Leu Ala Arg Pro Ile Ala Leu Pro Thr Leu Lys Ile

115 120 125

Ala Thr Asn Thr Ala Tyr Asn Asn Gly Asp Phe Thr Val Ala Gly Trp

130 135 140

Gly Ala Ala Arg Glu Gly Gly Gly Gln Gln Arg Tyr Leu Leu Lys Ala

145 150 155 160

Thr Val Pro Phe Val Asp Asp Ala Thr Cys Lys Gln Ala Tyr Gly Ser

165 170 175

Asp Leu Val Pro Gly Asp Glu Ile Cys Ala Gly Phe Val Ala Gln Gly

180 185 190

Gly Val Asp Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Phe Arg Lys

195 200 205

Asp Asp Thr Gly Ala Tyr Ile Gln Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu

210 215 220

Gly Cys Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Glu Val Ser Thr

225 230 235 240

Phe Ala Ala Asp Ile Ala Arg Ala Ala Ala Gly Leu

245 250

Claims

1.一种新型链霉菌胰蛋白酶GM2938，其特征在于含有256个氨基酸，序列为：VIRRLLAVGAVALAAVSLQPLSALAAPAPVVGGTRAAQGEFPFMVRLSMGCGGALYTQSIVLTAAHCVNGSGTNTSITATAGVVDLQSSSAVKVKSTKVLQAPGYNGKGKDWALIKLARPIALPTLKIATNTAYNNGDFTVAGWGAAREGGGQQRYLLKATVPFVDDATCKQAYGSDLVPGDEICAGFVAQGGVDTCQGDSGGPMFRKDDTGAYIQVGIVSWGEGCARPGYPGVYSEVSTFAADIARAAAGL，其中1-25位氨基酸为信号肽，26-29为氨基酸为前肽，30-252位氨基酸为该胰蛋白酶的成熟肽；其与已报道的灰色链霉菌胰蛋白酶SGT氨基酸相似性为80.85%。

2.如权利要求1所述的链霉菌胰蛋白酶GM2938，编码该胰蛋白酶基因由759个核苷酸组成。

3.如权利要求1所述的链霉菌胰蛋白酶GM2938在枯草芽孢杆菌为宿主进行异源表达，通过构建重组质粒pWB980-mt2938，在枯草芽孢杆菌SCK6中实现了胞外活性表达，经纯化后的该胰蛋白酶的特征为：分子量约为28 kDa，最适反应温度50 ^oC，最适反应pH为9.0，在25^oC、pH 5.0-9.0的范围内，该重组胰蛋白酶的稳定性较好；该酶对Cr³⁺有一定的耐受性，其耐受范围在0-15mM之间(耐受性以相对酶活>60%记)；其将在皮革工艺和食品工业中有很好的应用前景。