CN103343114A - 一种制备高活力胰酶的方法 - Google Patents

Abstract

以猪胰脏或经中性乙醇提取胰岛素后所剩的胰渣为原料，加入2%氯化钙溶液作为活化，同时加入NaCl、NH₄Cl、蔗糖、淀粉、甘油及吐温80适量，4mol?L^-1的Na₂HPO₄溶液调pH5.5-7.0，30℃活化6h，分浆过滤除去残渣后放冷至4-6℃，经PEG-6000沉淀、丙酮脱脂干燥得胰酶。该实验中所设定的胰酶提取环境，使胰酶收率提高了16%，三种酶的活力有显著提高，其中胰蛋白酶活力提高13%，胰淀粉酶提高26%，胰脂肪酶活力提高43%，其中活性极易被破坏的胰脂肪酶其活性有较大限度的提高。

Description

一种制备高活力胰酶的方法

技术领域

本发明涉及一种制备高活力胰酶的方法，以保证所制备的胰酶有较高的收率和活性。

背景技术

动物胰脏素有“酶库”之称，因其含有多种酶，如蛋白水解酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶等）、胰脂肪酶、弹性蛋白酶等。胰酶是我国及国际上多国药典收载的助消化药品，用于治疗消化不良及肝脏疾病引起的消化障碍等^[1]。除此之外，胰酶还作为生物酶应用于科学研究。同时，胰酶还多应用于皮革加工、丝绸、纺织、印染等工业部门^[2]。

我国对动物胰脏中提取制备胰酶的研究在上世纪80年代及90年代较多。目前，有关胰酶的制备多采用低浓度有机溶剂（如25%乙醇、10%丙酮、7.5%异丙醇等）提取，然后用高浓度有机溶剂沉淀，各工艺所生产的胰酶中三酶（胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶）活力差异较大，还没有胰酶三酶活力都相对较高的工艺，尤其是胰脂肪酶的活力最容易受到有机溶剂及蛋白酶的破坏，因而通过采用温和的提取及沉淀方式，并添加合适的保护剂来提高各酶活力是优化胰酶生产工艺的一项重要措施。现已有使用壳聚糖替代有机溶剂作为沉淀剂的研究^[3,4]。还有研究者将胰脏用CaCl₂水溶液活化后，用PEG6000进行沉淀，所得胰酶各酶活性有所提高^[5,6]。

除了采用温和的沉淀方法来提高蛋白质产物的收率和活性外，也可以在提取过程中添加合适的保护剂来为目标蛋白提供适宜的存在环境。目前有研究者在提取胰酶的过程中加入保护剂麦芽糖、淀粉、甘油、氯化钠等^[7,8,9]。

糖类作为蛋白保护剂应用已久，其保护作用与它们的化学结构有密切关系。它们通常具有5个以上的羟基，可以与蛋白质形成氢键以取代水，保证了蛋白质的稳定性；在溶液中它们易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护的目的。常用作保护剂的糖类单糖主要有葡萄糖，双糖有蔗糖、海藻糖、乳糖，聚糖有葡聚糖。它们有一个共同的特点就是具有大量的自由羟基， 其中，葡萄糖、乳糖具有还原性，而蔗糖、海藻糖、葡聚糖没有还原性。糖的还原性越弱，对蛋白质的稳定保护作用也越强。

表面活性剂如吐温80等，在临界胶束浓度附近，对蛋白质有稳定和保护作用^[10]。

本发明在目前胰酶制备工艺基础上从生产猪胰岛素的胰渣中提取制备胰酶，由于胰酶中各有效成分是溶于水的，因此用水作为提取溶媒安全环保，成本低，制得酶活力高，提取溶媒也可多次回收利用。本发明通过避开有机溶剂的大量使用及添加适宜的保护剂等措施，制备高活力的胰酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种在胰酶生产过程中能较大限度地保存各酶的活性同时提高胰酶收率的方法。

本发明在制备胰酶的活化液中加入2%CaCl₂ 溶液，并添加NH₄Cl、NaCl、蔗糖、淀粉、甘油及吐温80，Na₂HPO₄调pH为5.5～7.0，30℃活化6h，加入沉淀剂PEG-6000搅拌30min，4℃冰箱放置1 h，离心，沉淀用两倍体积冷丙酮脱脂两次，乙醚脱脂一次，干燥得胰酶。本发明所加的NH₄Cl、NaCl 、Na₂HPO₄等盐可以使胰酶生产环境维持一定的离子强度，适于蛋白质活性的保存。NH₄Cl对胰脂肪酶的活性有一定的激动作用，可以提高其活性。蔗糖、淀粉、甘油等对酶等蛋白质都有一定的保护作用，甘油和吐温80对胰脂肪酶的保护作用比较明显，而在生产胰酶的过程中，胰脂肪酶的活性最易损失。通过加入本发明所述的上述保护剂，所制得的胰酶重量回收率为12%左右，三酶活力分别为胰蛋白酶5.40 U/mg、胰脂肪酶39.73 U/mg、胰淀粉酶76.72 U/mg，三酶活力比为1:7.4:14.2，接近天然比例。

本发明的特征是在活化液中所加的保护剂的组合为0.5%NH₄Cl、0.5%NaCl、1%蔗糖、0.2%淀粉、1%甘油及0.5%吐温80，经4molL^-1的Na₂HPO₄溶液调pH值为5.5～7.0。

本发明中胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的活力测定方法参照欧洲药典6.0版。

经本发明的提取液在30℃活化6h，分浆过滤除去残渣后放冷至4-6℃，经PEG-6000沉淀、丙酮脱脂干燥即得胰酶。

附图说明

图1不同pH调节剂对胰酶中三酶活力的影响

其中条形图从左到右依次表示用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH、4mol/L碳酸氢钠溶液调节pH、4mol/L磷酸氢二钠溶液调节pH，各组编号依次表示 1. 胰蛋白酶 2.胰脂肪酶3.胰淀粉酶

图2 不同pH调节剂对胰酶收率的影响

其中条形图从左到右依次代表不同pH调节剂，1. 2mol/L氢氧化钠溶液、2. 4mol/L碳酸氢钠溶液、3. 4mol/L磷酸氢二钠溶液

图3 吐温80添加量对胰酶收率和胰脂肪酶活力的影响

其中两条曲线分别表示吐温80添加量对胰酶收率和胰脂肪酶活力的影响

具体实施方式

实例1

本实例考察该配方组成的提取液提取胰酶的效果。50g胰渣中加入2%CaCl₂ 溶液100ml，搅匀，并添加0.5% NH₄Cl、0.5%NaCl、1%蔗糖、1%淀粉、1%甘油及0.5%吐温80，同时用4molL^-1的Na₂HPO₄调pH6.5-7.0。放冷至4℃后加入30%PEG260mL，搅拌30min，4℃冰箱放置1h，虹吸上清液，3500r.pm离心10min，沉淀用两倍体积冷丙酮脱脂两次，乙醚脱脂一次，干燥得胰酶。采用中国药典2010版的方法测定胰酶中胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶的活力。与未添加NH₄Cl、蔗糖、淀粉、甘油及吐温80的提取液提取所得的胰酶进行比较。对比结果见表1，胰酶收率提高了16%，三种酶的活力有显著提高，其中胰蛋白酶活力提高13%，胰淀粉酶提高26%，胰脂肪酶活力提高43%，三酶比例也接近天然组成。

实例2

本实例考察NH₄Cl的加入对胰脂肪酶酶活力的激动作用。对照组除不加NH₄Cl外，其余均同前面所述操作。结果除去NH₄Cl后，胰酶收率、胰蛋白酶、胰淀粉酶几乎没有变化，胰脂肪酶活力降低2.6%。结果见表2。

实例3

本实例考察蔗糖对胰酶的保护作用，从组合保护剂中除去1%的蔗糖，所得胰酶中三种酶的活力均有降低，胰蛋白酶降低3.7%，胰淀粉酶降低5.3%，胰脂肪酶降低5.6%，胰酶收率变化不明显（表3）。

实例4

本实例考察甘油对胰酶的保护作用，组合保护剂中除去1%的甘油，所得胰酶中三种酶的活力均有降低。其中胰蛋白酶活力降低3.7%，胰淀粉酶活力降低5.6%，胰脂肪酶活力降低8.4%，对胰酶收率影响不大，降低了1%（表4）。

实例5

本实例考察吐温80对胰酶的保护作用，从组合保护剂中除去0.5%的吐温80，所得胰酶中三种酶的活力也均有降低，其中胰脂肪酶的活力降低尤其明显，约为12.3%，胰蛋白酶降低约3.4%，胰淀粉酶降低约5.1%；吐温80对其它两种酶活力的影响相对较小，但吐温的添加会使得胰酶的收率有所下降，下降约4%（表5）。

实例5

本实例考察Na₂HPO₄在调节pH方面中的作用，分别使用2molL^-1氨水溶液、4molL^-1碳酸氢钠溶液、4molL^-1磷酸氢二钠，比较胰酶收率及酶活力大小。结果显示（图1、图2），通过4molL^-1 Na₂HPO₄溶液调节pH值，胰酶收率及三酶活力均有较好的效果。

实例6

本实例考察吐温添加量对胰酶收率及活力的影响。吐温80的添加量依次为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%，比较所得胰酶的收率和胰脂肪酶活力。结果如图3所示，可见在加入吐温80的量为0.5%时胰脂肪酶活力最高，随着吐温添加量的增加，胰酶收率有所下降，综合考虑之下，可选择0.5%的吐温添加量。

Claims (2)

1.一种制备高活力胰酶的方法，以猪胰脏或生产胰岛素后所剩的胰渣为原料，以200mL/100g的比例加入提取液，用磷酸盐溶液调pH 5.5-7.0，30℃活化6h，分浆过滤除去残渣后放冷至4-6℃，经PEG-6000沉淀和丙酮脱脂干燥后得胰酶，其中，提取液由重量含量分别为2%的CaCl₂，0.5%的NaCl，0.5%~0.8%的NH₄Cl，0.5%~1%的糖，1%的淀粉，1%的甘油和0.1%~1.0%的吐温80组成，所说的糖为蔗糖、海藻糖、葡聚糖中的一种，所说的磷酸盐为Na₂HPO₄、Na₃PO₄、K₂HPO₄中的一种。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于在提取液中加入NH₄Cl、Na₂HPO₄、蔗糖、及吐温80等成分作为保护剂。

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