CN115232804B - 一种重组羧肽酶g2突变体及其基因、制备方法和应用 - Google Patents

一种重组羧肽酶g2突变体及其基因、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明获得的重组羧肽酶G2突变体水解甲氨蝶呤的效果明显提升，降解效率十分可观，且筛选方法简单直观快速有效。

Description

一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物大分子技术领域，尤其是涉及一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用。
背景技术
羧肽酶G2(Carboxypeptidase G2，CPG2)是来自假单胞菌的一种42kDa的锌依赖性金属酶，能将叶酸及其类似物中的谷氨酸部分分解出来，能大量又快速地将甲氨蝶呤(MTX)水解并转化为非活性代谢产物，降低大剂量MTX在临床肿瘤化疗中导致的风险。MTX是叶酸拮抗类抗肿瘤药，正常情况下经肾排泄。但大剂量使用MTX后，其在肾脏中结晶并沉淀，导致患者肾功能严重受损乃至肾衰竭，最终使血液中积累大量MTX，进而引发肝肾损伤、严重口腔溃疡、肠内膜损伤、皮疹等。血液透析或腹膜透析都无法清除该药物。严重可引发MTX中毒反应，死亡率极高。目前临床上对MTX中毒的急救措施主要包括亚叶酸钙竞争性解毒、碱化尿液、水化等。但90％以上患者仍不能逆转MTX的肾毒性。由于羧肽酶G家族可水解叶酸及其类似物，且CPG2识别MTX能力最强，CPG2可直接将血浆中的MTX水解成谷氨酸和4-脱氧-4-氨基-N10-甲基蝶酸，二者不通过肾脏消除，且无法透过血-脑屏障(BBB)和细胞膜，因而不会抵消细胞内MTX的化疗作用。
CPG2还被用于抗体定向酶前药治疗(ADEPT)与基因导向性前药疗法(GDEPT)。ADEPT是利用抗体作为载体携带专一性活化酶，选择性地结合于肿瘤部位，使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，起到专一杀伤肿瘤的作用。而GDEPT是利用腺病毒作为载体将CPG2基因转染至肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内表达CPG2酶，使前药可以特异性地在肿瘤组织内产生细胞毒性，形成肿瘤自杀效果。
目前国内对CPG2的研究较少，主要在于对其初步进行表达载体的构建、原核表达、分离纯化及分析。而相对于国外，由于CPG2较早被研究，其产品匹谷卡酶于2012年2月获FDA批准上市。现在主要研究都是将CPG2原始序列，在大肠杆菌中表达。但近年来，随着CPG2的临床应用，发现CPG2的催化效率较低，成人单次治疗给药剂量大，且彻底解毒需要多次给药，并且单价昂贵，无法大规模推广使用，许多患者仍在经受MTX中毒的折磨。同时，因为前药疗法的多次循环治疗，导致了患者严重的免疫应答。近年来，国外许多研究者开始关注CPG2酶的性能改造。而国内因为药物还未引进，该方面的研究甚少。
酶的定向进化，同物种进化相类似，包括两个要素——突变与选择。但突变既可以随机发生，也可以定点发生，在突变的基础上，施加一个人为偏好的方向进行筛选，因此称之为“定向”。酶定向进化主要使用酶工程等手段，反复的突变编码基因，并进行蛋白表达和筛选，诱使酶的结构及功能发生定向改变，从而在实验室完成在自然界需要成千上万年的进化，最终获得性能改进酶蛋白。
易错PCR，是1989年由David W.Leung团队最先提出，随后成为体外改造筛选的经典手段，因其操作简便、突变效率高等优点成为目前应用最为广泛的进化手段之一。但该方法无法控制正负突变效率，导致负突变频率较高，筛选难度较大，所以需要建立高效快速的筛选方法，加以配合才能在庞大的文库进行有效筛选。
筛选培养基，是指根据某种微生物特殊的营养要求或对某些特殊化学、物理性质而设计的，从而可以选择性筛选这种微生物的培养基。
叶酸作为甲氨蝶呤类似物，羧肽酶G2可将其水解，并且该反应可在培养基平板上显现，所以使用叶酸培养基，并加入IPTG、卡那霉素诱导羧肽酶G2的反应，在平板可完成突变文库的初步筛选，大大减少了筛选难度。
菌株高通量筛选，使用深孔培养板单次大量培养筛选突变体，可高效配合随机突变带来的大量突变文库筛选。培养板在1951年设计生产后，主要应用于分析领域，但由于培养板可进行高通量实验，逐渐被用于细胞培养、高通量筛选、药物和酶等变体筛选等研究。近年也逐渐应用于菌株筛选与选育，但目前高通量筛选技术在蛋白质异源表达方面的应用研究得较少。高通量培养与高通量分析相结合才能使得定向进化的高通筛选得以实现，高效获得性能优化的突变体酶。
在大肠杆菌表达系统中，通过去除N端22个残基信号肽，首次实现了保持CPG2的可溶性和活性，同时实现高产(250mg/L)重组表达和易于后期纯化。所以本发明的研究，建立于无信号肽的羧肽酶G2基础上进行定向进化，继承其可溶性、活性及蛋白高产，以筛选活性进一步优化的突变羧肽酶G2。
由于羧肽酶G2用药量大，水解甲氨蝶呤活性低，本项目利用酶的定向进化原理，将羧肽酶G2基因进行随机突变，建立初筛和复筛的方法，筛选获得能高效水解甲氨蝶呤的重组羧肽酶G2大肠杆菌突变株，旨在获得比原始羧肽酶G2活性更高的突变体。目前需要解决的问题在于选取突变方法及建立高效的筛选方法，获得活性更高的重组羧肽酶G2。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的羧肽酶G2水解甲氨蝶呤活性低，进行体外改造的突变时无法控制正负突变效率，导致负突变频率较高、筛选效率低的缺陷，提供一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用。
本发明将羧肽酶G2基因进行随机突变，并建立初筛和复筛的方法，筛选获得能高效水解甲氨蝶呤的重组羧肽酶G2大肠杆菌突变株，旨在获得比原始羧肽酶G2活性更高的突变体。本发明同时将原序列以该方法进行载体构建，并将两株菌株进行同条件诱导表达，同条件酶活检测，实验证明本发明以该方式表达检测的原始序列酶与文献(Jeyaharan，etal.Soluble expression,purification and functional characterisation ofcarboxypeptidase G2 and its individual domains，Protein Expression&Purification,2016,127:44-52)所指出的酶活相一致，筛选到的突变序列以上述方式表达的酶活高于原始序列酶。
尽管现有技术中已有专利文献报道了酶活较高的羧肽酶G2，然而均非通过对酶本身性质的改进，而是通过纯化方法或者对蛋白分子进行末端修饰后提高了整体酶活。例如CN101509012B通过优化纯化方法实现了羧肽酶G2的高表达。该专利中的羧肽酶G2尽管也具有较高比活，但其与本发明在载体构建方式上有所不同，且在高表达过程中，使用了肠激酶进行融合表达，并在亲和层析后去除了载体所携带的his标签，完成了Pet-30-his-肠激酶-cpg2的载体，后期纯化过程中将肠激酶进行去除，得到的纯cpg2进行了酶活检测计算。其中的肠激酶和his均为表达过程中常用的元件，带有或者不带有两者对蛋白本身的性质(例如酶的酶活、稳定性等)有较大的影响。简言之，现有技术中对羧肽酶G2活性进行的改进均为突变之外、表达和纯化过程中的改进，操作过程中具有不可重复性。此外，需要说明的是，上述专利中的酶活值同本发明亦没有可比性。
与上述专利的方法相比较，本发明在进行突变体改造采用Pet-28a-his-cpg2形式进行构建，纯化过程中，为了提高筛选效率，进一步适合筛选，未将his标签去除。
此外，本发明与以上专利中的分析测试方法也不同，该专利中酶活检测过程中所用的底物浓度、检测仪器(其为分光光度计，本发明为酶标仪)、检测体系体积(其约为1ml，本发明为200ul)、酶活计算方法(不同实验中采取的酶活检测方法与酶活公式计算都有所不同，该专利中使用的K值计算，本发明实验中使用得meanV值计算，后续的酶活酶比活计算公式也因此不同)、检测精度(其通过多次分光光度计数据进行手动作图并计算K值，间隔时间较长，K值为手动定义数据，出现误差为正常状态，本发明使用酶标仪实时进行底物吸光度检测，并进行曲线拟合，数据准确可直接得到meanV),上述原因都会导致酶活计算结果不同，所以与自己同条件构建的原始序列，同条件诱导表达，同条件下进行酶活检测对比反而更具对比效果。
最后上述专利与本发明所实现的技术效果并不相同中，上述专利仅是将原有的羧肽酶G2序列，通过进一步的纯化方法进而提高纯度与活性。而本发明为了寻找更为优势的全新序列，扩充了羧肽酶G2的序列文库，在此基础上，本发明采用了较为简单的纯化方法，确定了在同样简单的纯化过程中，全新突变序列的酶比原序列得到酶表现出了更高的活性。
在天然羧肽酶G2筛选过程中，使用过叶酸筛选培养基，但只是使用了其出现蝶酸沉淀以确定定性结果，未经过试验证明其是否出现光斑与其最终表达出来的酶的活性的定量相关性。为了解决上述问题，提高筛选效率，本发明经过多次试验验证，初筛培养基出现的光斑大小可以相对定量酶活的活性。在后期验证平板实验中的光圈宽度比例与检测的活性增长比例的数值几乎一致，也为筛选方法的准确性提供验证。
相较其他文献(Aqa B,et al.Production of"biobetter"variants ofglucarpidase with enhanced enzyme activity[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,112)所述的实验，先将连接体系转接到Dh5α，进行筛选验证、测序，然后再转一步到BL21，再进行验证,再在叶酸平板上验证它是否可以产生黄色沉淀。若以上述方法进行筛选，第一步的筛选等于没有任何筛选地盲测，效率低，准确率也不高。
如在其他文献(Alqahtani A,et al.Screening for and Identification ofNovel Glucarpidase Producing Bacteria:Cloning and molecular characterisationof novel enzymes involved in ADEPT for cancer treatment[J].Faseb Journal,2014,28)中呈现的，针对该酶作为底物类似物的叶酸可以与该酶产生黄色蝶酸沉淀反应，示为非常可用的筛选条件。本发明则将这一其他实验只作为定性的方法进行进一步研究细化，发现光圈的产生在菌与菌之间可以产生明显差别，同时也验证了平板检测这一方法同样适用于验证结果。
本发明中在第一步的平板上就完成了初步筛选，之后进入到菌落PCR的菌已经经历过一次筛选，再经过活性测定的复筛，基本就可以确保筛选出的菌株的活性已经比原菌株高，后续仅需确定是否是突变即可。本发明的筛选方法不仅准确率更高，而且减少了一步转接，可以省去一步转化实验，省去一步测序操作，并大大减少了阴性菌落的操作过程。节省了人力的同时，也大大减少了成本。同时高通量培养方法的引入，加以高通量破碎，高通量测活，使得整个过程可以在孔板上完成，也进一步提高了效率。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种羧肽酶G2的突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一具体实施方案中，编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的技术方案之二为：提供一种编码如技术方案之一所述突变体的分离的核酸，所述分离的核酸包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
本发明的技术方案之三为：提供一种包含如技术方案之二所述分离的核酸的表达载体。
在一具体实施方案中，所述表达载体的骨架为pET-28a。
本发明的技术方案之四为：提供一种包含如技术方案之三所述的表达载体的转化体。
本发明的技术方案之五为：提供一种制备如技术方案之一所述的突变体的方法，所述方法包括培养如技术方案之四所述的转化体，并从培养产物中提取所述突变体。
本发明的技术方案之六为：提供一种筛选重组羧肽酶G2突变体的方法，所述方法包括：随机突变文库平板初步筛选，所述随机突变文库平板初步筛选包括：
(1)使用平板分别培养转化有含有突变后羧肽酶G2基因和突变前羧肽酶G2基因的表达载体的感受态细胞；
(2)比较两种培养基上光斑大小、光圈宽度。
关于所述光圈(也可称为光环)宽度，当突变体的光环宽度大于野生型的光环宽度时，即说明突变体的活性高于野生型的浓度。在本发明一较佳实施方案中，所得突变体的光环宽度相比于野生型的光环宽度提高了至少150％。
较佳地，所述方法还包括随机突变体复筛，所述随机突变体复筛包括：高通量菌体培养与验证、高通量表达与破碎和高通量酶活筛选。
在一具体实施方案中，步骤(1)中所述平板为叶酸培养平板，所述培养的条件为37℃过夜培养、20℃过夜表达，并于4℃持续表达两天。
在一具体实施方案中，所述平板包括：酵母提取物0.5g/100ml、蛋白胨1g/100ml、NaCl 1g/100ml、琼脂粉1.5g/100ml、叶酸0.1g/100ml、IPTG 0.1mM以及卡那霉素0.005g/100ml。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明所要解决的技术问题是采取何种突变方法及如何建立高效的筛选方法，获得活性更高的重组羧肽酶G2。
本发明的积极进步效果为：
(1)序列新颖，突变株活性较高，降解效率高
本发明中筛选得到的新型羧肽酶G2，水解甲氨蝶呤的效果明显提升，酶比活约为94.2U/mg，相对于现已报道的含his标签的重组羧肽酶G2，高出了约24.8％。降解效率十分可观。
(2)筛选方法简单直观快速有效
文献中对筛选方法没有详细报道，本实验确定了具体的初筛和复筛的方法，通过黄色蝶酸效果及水解圈进行快速初筛，通过培养板进行菌的高通量表达复筛，整个方法简单快速，不需要配制摇瓶培养基，以缩小的培养板体系单次可完成批量表达，同时通过对裂解液的研究可直接采用平板进行细胞破碎收取表达蛋白，借助酶标仪可直接进行酶活批量筛选，直观证明筛选结果与原序列菌株的关系。
附图说明
图1为CPG2原始基因片段PCR梯度电泳示意图。
图2为CPG2原始基因菌落PCR电泳结果图。M：DNA Marker；1-6:平板上挑选的转化子；-：阴性克隆；+：阳性克隆。
图3为pET-28a-CPG2构建示意图。
图4为不同Mg2+浓度易错PCR电泳结果图。
图5为叶酸筛选平板结果示意图。
图6为随机突变转化子菌液PCR电泳结果图。M：DNA Marker；A1-H6:对应48孔板位置菌液。
图7为羧肽酶G2筛选突变体G-1的纯化结果图。
图8为原始羧肽酶G2的纯化结果图。
图9为突变体与原始序列菌体生长情况。
图10为CPG2突变体酶活趋势图。
图11为CPG2突变体光环宽度趋势图。
图12为突变体与原始序列菌体酶促反应曲线。
图13为突变体与原始序列菌体酶活稳定性曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例1～8以及图1～图13所示，对本发明做进一步的阐释。但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
感受态DH5α购自大连宝生物有限公司(TaKaRa,Dalian,China)；
感受态BL21/DE3购自天根生化科技(北京)有限公司；
卡那霉素、IPTG、0.45μm微孔滤膜购自上海生工生物工程技术有限公司；
引物合成以及测序服务为上海生工生物工程技术有限公司提供；
NdeI、HindⅢ、DNA连接酶、Max DNA polymerase、Ex Taq均购自大连宝日医生物技术有限公司(TaKaRa,Dalian,China)；
Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物技术股份有限公司；
T4 Fsat DNA Ligase购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
DNA胶回收试剂盒购自康宁(上海)有限公司，
BCA试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
以下为本发明相关的氨基酸序列与核苷酸序列：
G-1基因序列:
CAGAAGCGCGACAACGTGCTGTTCCAGGCAGCTACCGACGAGCAGCCGGCCGTGATCAAGACGCTGGAGAAGCTGGTCAACATCGAGACCGGCACCGGTGACGCCGAGGGCATCGCCGCTGCGGGCAACTTCCTCGAGGCCGAGCTCAAGAACCTCGGCTTCACGGTCACGCGAAGCAAGTCGGCCGGCCTGGTGGTGGGCGACAACATCGTGGGCAAGATCAAGGGCCGCGGCGGCAAGAACCTGCTGCTGATGTCGCACATGGACACCGTCTACCTCAAGGGCATTCTCGCGAAGGCCCCGTTCCGCGTCGAAGGCGACAAGGCCTACGGCCCGGGCATCGCCGACGACAAGGGCGGCAACGCGGTCATCCTGCACACGCTCAAGCTGCTGAAGGAATACGGCGTGCGCGACTACGGCACCATCACCGTGCTGTTCAACACCGACGAGGAAAAGGGTTCCTTCGGCTCGCGCGACCTGATCCAGGAAGAAGCCAAGCTGGCCGACTACGTGCTCTCCTTCGAGCCCACCAGCGCAGGCGACGAAAAACTCTCGCTGGGCACCTCGGGCATCGCCTACGTGCAGGTCAACATCACCGGCAAGGCCTCGCATGCCGGCGCCGCGCCCGAGCTGGGCGTGAACGCGCTGGTCGAGGCTTCCGACCTCGTGCTGCGCACGATGAACATCGACGACAAGGCGAAGAACCTGCGCTTCAACTGGACCATCGCCAAGGCCGGCAACGTCTCGAACATCATCCCCGCCAGCGCCACGCTGAACGCCGACGTGCGCTACGCGCGCAACGAGGACTTCGACGCCGCCATGAAGACGCTGGAAGAGCGCGCGCAGCAGAAGAAGCTGCCCGAGGCCGACGTGAAGGTGATCGTCACGCGCGGCCGCCCGGCCTTCAATGCCGGCGAAGGCGGCAAGAAGCTGGTCGACAAGGCGGTGGCCTACTACAAGGAAGCCGGCGGCACGCTGGGCGTGGAAGAGCGCACCGGCGGCGGCACCGACGCGGCCTACGCCGCGCTCTCAGGCAAGCCAGTGATCGAGAGCCTGGGCCTGCCGGGCTTCGGCTACCACAGCGACAAGGCCGAGTACGTGGACATCAGCGCGATTCCGCGCCGCCTGTACATGGCTGCGTGCCTGATCATGGATCTGGGCGCCGGCAAG(SEQ ID NO:1)(下划线处为区别于野生型的碱基)
实施例1
羧肽酶G2基因序列的扩增
采用pET-28a-SMT3-CPG2中无N端信号肽的羧肽酶G2基因序列设计引物：
P1:5’-GGGAATTCCATATGCAGAAGCGCGACAAC-3’(SEQ ID NO:3)
P2:5’-CCCAAGCTTTTACTTGCCGGCGCCCAGATCCATG-3’(SEQ ID NO:4)
(下划线序列分别为Nde I和HindⅢ酶切位点)为上下游引物，进行PCR扩增反应，反应体系如下：
PrimeSTAR mixture:10μL
模板(pET-28a-SMT3-CPG2)：2μL
引物(P1)：1μL
引物(P2)：1μL
ddH2O：6μL
反应程序：98℃预变性10秒；98℃变性10秒，61℃退火10秒，72℃延伸20秒，进行30个循环；最后于72℃延伸10分钟结束反应。
PCR扩增产物使用琼脂糖电泳验证，大小约为1170bp左右，如图1所示，使用凝胶回收试剂盒回收产物。
实施例2
初始CPG2重组载体构建
2.1载体/基因片段酶切
使用Nde I和HindⅢ双酶切实施例1中回收的PCR产物以及pET-28a载体，酶切体系如下：
载体/基因片段：30μL
10×Kbuffer(TAKARA，TKR-SD0004):6μL
Nde I：3μL
HindⅢ：3μL
ddH2O：6μL
反应条件：将酶切体系加入1.5mL ep管，置于37℃干式恒温器，过夜完成酶切。
2.2初始载体构建
使用DNA连接酶连接两个酶切产物，将连接产物转化到DH5α感受态大肠杆菌中，在含卡那霉素的LB平板中37℃过夜培养。挑取转化子进行培养，使用上述引物，进行菌落PCR验证。菌落PCR反应体系如下(引物同实施例1)：
Taq Master Mix:10μL
转化子培养菌液：2μL
引物(P1)：1μL
引物(P2)：1μL
ddH2O：6μL
反应程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环；最后于72℃延伸5分钟结束反应。
将PCR扩增结果进行琼脂糖电泳，结果显示部分与目的片段大小相同，如图2。将菌落PCR呈阳性的转化子送往专业的测序公司测序，结果显示CPG2基因片段成功插入pET-28a质粒载体中，且无任何序列突变，pET-28a-CPG2表达载体成功构建，构建示意图如图3。
实施例3
CPG2序列引入随机突变
将实例2中的重组载体进行易错PCR，使用上述引物(同实施例1)作为上下游引物，进行易错PCR引入突变，反应体系如下：
Ex Taq:0.25μL
10x Buffer(Mg2+free):5μL
模板(pET-28a-CPG2)：2μL
dNTP Mixture：4μL
引物(P1)：1μL
引物(P2)：1μL
MgCl2(25mM):12μL
ddH2O：25μL
为了更好地引入随机突变，使用降落PCR，反应程序：98℃预变性10秒；98℃变性10秒，自64℃每个循环降低2℃进行退火20秒，72℃延伸1分钟，进行6个循环；再98℃变性10秒，保持54℃退火20秒，72℃延伸1分钟，进行24个循环，最后于72℃延伸10分钟结束反应。
将易错PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，大小约为1170bp左右，如图4所示，使用凝胶回收试剂盒回收产物。
实施例4
CPG2随机突变体初步筛选
4.1筛选培养基配制
配制叶酸培养基进行初步筛选，培养基配方如下：
LB培养基(100ml)：酵母提取物0.5g，蛋白胨1g，NaCl 1g，琼脂粉1.5g，高压灭菌后备用。加入叶酸0.1g、IPTG 0.1mM、卡那霉素50ug/mL，制备叶酸培养平板。
4.2随机突变文库平板初步筛选
使用Nde I和HindⅢ双酶切实施例3中回收的PCR产物以及pET-28a载体，置于37℃干式恒温器，过夜完成酶切，并将酶切产物回收。
使用DNA连接酶连接两个酶切产物，将连接产物转化到BL21感受态大肠杆菌中，在上述叶酸筛选LB平板中37℃过夜培养、20℃过夜表达、4℃持续表达两天，平板如图5所示。挑取阳性转化子进行下一步筛选验证。
实施例5
CPG2随机突变体复筛
5.1高通量菌体培养与验证
选择沉淀较深且光圈较明显的转化子，选择48孔板深孔板进行培养，培养体系为1.5mL LB含卡那霉素的培养基，37℃250r，过夜培养。
选取转化子菌液，使用实施例2中菌液PCR的体系与程序，琼脂糖电泳验证，其中部分呈阳性，如图6所示，继续下一步实验。
5.2高通量表达与破碎
将选取的阳性转化子菌液转入全新的48孔深孔板，使用1.5mL培养体系，37℃220r培养2.5h，加入IPTG，20℃180r诱导表达20h。次日，将深孔板置于离心机3000r 30min离心，去除上清，保留沉淀用于破碎提取蛋白。
配制裂解液体系(Tris-Cl、蔗糖、Dnase I、MgCl2、溶菌酶、NP40)，将其一次加入上述沉淀中，并进行吹匀。将深孔板置于4℃摇床上，每五分钟吹匀一次，最终将含裂解液的深孔板置于离心机3000r 30min离心，保留上清。
5.3高通量酶活筛选
将上述上清液稀释后转至96孔培养板，使用BCA法进行蛋白浓度测定。将BCA试剂盒中A液与B液以50:1的比例加入板中，37℃反应30min，使用酶标仪设置波长为562nm，进行检测计算。
测活缓冲液(0.1M Tris-Cl、0.2mM Zn2+,pH7.3)，加入80mM甲氨蝶呤，37℃温浴。同时将酶标仪也在37℃温浴后，将稀释后的上清液加入培养板中，避光送入酶标仪反应，检测到其meanV值，筛选得到编号G-1的菌株，上清酶比活约为27.77U/mg，高于原始菌株的上清酶比活24.53U/mg，将优化菌株送至上海生工测序。
测序结果如SEQ ID NO:1所示，野生型序列的NCBI登录号：M12599,羧肽酶G2的1141位基因由C胞嘧啶突变成为了T胸腺嘧啶，381位蛋白质由原先的精氨酸R(密码子：CGC)突变成为了半胱氨酸C(密码子：TGC)。
实施例6
优势突变体的摇瓶表达
将上述实施实例5中优选的突变体，进行摇瓶表达。将过夜培养的菌体接种入50ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃220r培养2.5h，至OD值为0.4-0.6之间。加入0.1mM IPTG进行诱导表达，180r 20h后，将菌液置于离心机8000r离心10分钟，沉淀置于-4℃保存。
实施例7
突变酶蛋白纯化
离心后的沉淀，加入7mL破碎缓冲液(含20mM Tris、137mM NaCl pH7.3)，重悬沉淀。将离心管置于冰上，以超声破碎仪300Hz 15min两次，进行细胞破碎。将混悬液于离心机，10000r，离心45min，保留上清。
将重力柱中装填Ni-NTA填料形成镍柱，使用蒸馏水洗涤镍柱，使用洗涤缓冲液(含20mM Tris、100mM NaCl、5％甘油、0.2mM Zn2+、20mM咪唑，pH8.0)活化树脂，将上述上清中包含的总可溶性蛋白与活化的树脂放在4℃冰柜中，每5min轻轻搅拌一次，保持20min使其完全结合。用重力分离树脂，收集流穿液，使用洗涤缓冲液洗涤镍柱三次。使用预冷的洗脱缓冲液(20mM Tris-Cl、100mM NaCl、5％甘油、0.2mM Zn2+、200mM咪唑，pH8.0)进行洗脱，收集洗脱液。
将沉淀、上清、流穿、洗脱液收集，进行SDS-PAGE验证，结果如图7所示，通过ImageJ软件分析得到的洗脱结果的纯度为97.99％。
实施例8
突变体性能验证
8.1突变体与原始序列的平板验证
配制叶酸培养基，将突变体与原始菌体37℃过夜培养后，吸取菌体10μL，三次重复滴在叶酸平板上，置于37℃过夜培养，20℃过夜表达，4℃放置两日，并记录其菌体生长状态，如图9所示。
图10与图11为其余突变实验中，同一批不同突变体酶菌体在叶酸培养基上呈现的光环宽度趋势与该批次不同突变体酶在纯化后的酶活趋势，可见两者呈现明显的正相关的关系，同时应证了使用叶酸平板光环来进行酶活筛选的科学性及可靠性。
使用Digimizer软件进行图像分析后可知，原始菌体光环宽度约为1.05mm，而突变体光环宽度约为2.62mm，光环宽度提升约150.88％。光环宽度可作为活性的观察指标，所以基本可以认定确实活性有所提升。
8.2突变体与原始序列的活性验证
原始序列使用相同的方法纯化得到洗脱样品，纯化结果如图8所示。
使用上述酶活测定方法，将原始序列与突变体进行酶活测定，通过底物消耗量得到酶活性。一个活力单位定义为，37℃下，单位时间内CPG2水解1微摩尔MTX所需要的酶量。实验将5ul稀释到一定倍数的酶，加入195μl的底物缓冲液体系。使用酶标仪温控在37℃下，避光，320nm下进行甲氨蝶呤检测，酶促反应曲线如图12所示，并得到单位时间酶促反应速率meanV。
通过以下公式，进行酶活计算。
meanV(OD/min)——位时间酶促反应速率meanV；
ε——摩尔吸光系数(L/mol·cm)，8300L/mol·cm＝8.3mL/μmol·cm；
Vt——反应总体积(200μL)Vs——反应样品总体积(5μL)；
df——样品稀释倍数；
通过所得酶活与样品中的蛋白浓度，通过以下公式进一步计算其酶比活。
C——样品浓度(mg/ml)
df——样品稀释倍数
同时，由上述公式可见，摩尔吸光系数为常数，若本发明保持反应体系、比例、样品浓度及稀释倍数一致，则酶比活正比于meanV，可直接反应样品比活力。
检测筛选得到的优化突变体G-1的meanV值为517.039，原序列酶的meanV值为403.938，突变体较原序列酶比活力提高了28.0％，活性有了明显提升。
在纯化后多个时间段进行活性检测，得到相应实验MeanV值，并进行稳定性测定，结果如图13所示，验证其稳定性与原序列酶序列相类似，保持了其稳定性，为了保持其稳定性，需要在6h内选择更为稳定的储存形式。
序列表
<110> 上海医药工业研究院
中国医药工业研究总院
<120> 一种重组羧肽酶G2突变体及其基因、制备方法和应用
<130> P21012659C
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1170
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-1基因序列
<400> 1
cagaagcgcg acaacgtgct gttccaggca gctaccgacg agcagccggc cgtgatcaag 60
acgctggaga agctggtcaa catcgagacc ggcaccggtg acgccgaggg catcgccgct 120
gcgggcaact tcctcgaggc cgagctcaag aacctcggct tcacggtcac gcgaagcaag 180
tcggccggcc tggtggtggg cgacaacatc gtgggcaaga tcaagggccg cggcggcaag 240
aacctgctgc tgatgtcgca catggacacc gtctacctca agggcattct cgcgaaggcc 300
ccgttccgcg tcgaaggcga caaggcctac ggcccgggca tcgccgacga caagggcggc 360
aacgcggtca tcctgcacac gctcaagctg ctgaaggaat acggcgtgcg cgactacggc 420
accatcaccg tgctgttcaa caccgacgag gaaaagggtt ccttcggctc gcgcgacctg 480
atccaggaag aagccaagct ggccgactac gtgctctcct tcgagcccac cagcgcaggc 540
gacgaaaaac tctcgctggg cacctcgggc atcgcctacg tgcaggtcaa catcaccggc 600
aaggcctcgc atgccggcgc cgcgcccgag ctgggcgtga acgcgctggt cgaggcttcc 660
gacctcgtgc tgcgcacgat gaacatcgac gacaaggcga agaacctgcg cttcaactgg 720
accatcgcca aggccggcaa cgtctcgaac atcatccccg ccagcgccac gctgaacgcc 780
gacgtgcgct acgcgcgcaa cgaggacttc gacgccgcca tgaagacgct ggaagagcgc 840
gcgcagcaga agaagctgcc cgaggccgac gtgaaggtga tcgtcacgcg cggccgcccg 900
gccttcaatg ccggcgaagg cggcaagaag ctggtcgaca aggcggtggc ctactacaag 960
gaagccggcg gcacgctggg cgtggaagag cgcaccggcg gcggcaccga cgcggcctac 1020
gccgcgctct caggcaagcc agtgatcgag agcctgggcc tgccgggctt cggctaccac 1080
agcgacaagg ccgagtacgt ggacatcagc gcgattccgc gccgcctgta catggctgcg 1140
tgcctgatca tggatctggg cgccggcaag 1170
<210> 2
<211> 390
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G-1氨基酸序列
<400> 2
Gln Lys Arg Asp Asn Val Leu Phe Gln Ala Ala Thr Asp Glu Gln Pro
1 5 10 15
Ala Val Ile Lys Thr Leu Glu Lys Leu Val Asn Ile Glu Thr Gly Thr
20 25 30
Gly Asp Ala Glu Gly Ile Ala Ala Ala Gly Asn Phe Leu Glu Ala Glu
35 40 45
Leu Lys Asn Leu Gly Phe Thr Val Thr Arg Ser Lys Ser Ala Gly Leu
50 55 60
Val Val Gly Asp Asn Ile Val Gly Lys Ile Lys Gly Arg Gly Gly Lys
65 70 75 80
Asn Leu Leu Leu Met Ser His Met Asp Thr Val Tyr Leu Lys Gly Ile
85 90 95
Leu Ala Lys Ala Pro Phe Arg Val Glu Gly Asp Lys Ala Tyr Gly Pro
100 105 110
Gly Ile Ala Asp Asp Lys Gly Gly Asn Ala Val Ile Leu His Thr Leu
115 120 125
Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Val Arg Asp Tyr Gly Thr Ile Thr Val
130 135 140
Leu Phe Asn Thr Asp Glu Glu Lys Gly Ser Phe Gly Ser Arg Asp Leu
145 150 155 160
Ile Gln Glu Glu Ala Lys Leu Ala Asp Tyr Val Leu Ser Phe Glu Pro
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Asp Glu Lys Leu Ser Leu Gly Thr Ser Gly Ile Ala
180 185 190
Tyr Val Gln Val Asn Ile Thr Gly Lys Ala Ser His Ala Gly Ala Ala
195 200 205
Pro Glu Leu Gly Val Asn Ala Leu Val Glu Ala Ser Asp Leu Val Leu
210 215 220
Arg Thr Met Asn Ile Asp Asp Lys Ala Lys Asn Leu Arg Phe Asn Trp
225 230 235 240
Thr Ile Ala Lys Ala Gly Asn Val Ser Asn Ile Ile Pro Ala Ser Ala
245 250 255
Thr Leu Asn Ala Asp Val Arg Tyr Ala Arg Asn Glu Asp Phe Asp Ala
260 265 270
Ala Met Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ala Gln Gln Lys Lys Leu Pro Glu
275 280 285
Ala Asp Val Lys Val Ile Val Thr Arg Gly Arg Pro Ala Phe Asn Ala
290 295 300
Gly Glu Gly Gly Lys Lys Leu Val Asp Lys Ala Val Ala Tyr Tyr Lys
305 310 315 320
Glu Ala Gly Gly Thr Leu Gly Val Glu Glu Arg Thr Gly Gly Gly Thr
325 330 335
Asp Ala Ala Tyr Ala Ala Leu Ser Gly Lys Pro Val Ile Glu Ser Leu
340 345 350
Gly Leu Pro Gly Phe Gly Tyr His Ser Asp Lys Ala Glu Tyr Val Asp
355 360 365
Ile Ser Ala Ile Pro Arg Arg Leu Tyr Met Ala Ala Cys Leu Ile Met
370 375 380
Asp Leu Gly Ala Gly Lys
385 390
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P1
<400> 3
gggaattcca tatgcagaag cgcgacaac 29
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2
<400> 4
cccaagcttt tacttgccgg cgcccagatc catg 34

Claims (7)

1.一种羧肽酶G2的突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
3.一种编码如权利要求1所述突变体的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种包含如权利要求3所述分离的核酸的表达载体。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的骨架为pET-28a。
6.一种包含如权利要求4或5所述的表达载体的转化体。
7.一种制备如权利要求1或2所述的突变体的方法，其特征在于，所述方法包括培养如权利要求6所述的转化体，并从培养产物中提取所述突变体。
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