CN114790474B - 一种索马鲁肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种索马鲁肽的制备方法，所述制备方法包括从发酵菌体中收集包涵体、包涵体处理制备融合蛋白、融合蛋白经过酶切及纯化处理得索马鲁肽前体、索马鲁肽前体与侧链和二肽连接得索马鲁肽的步骤。本发明制备的索马鲁肽前体融合蛋白使用一种突变EK酶进行酶切处理。本发明提供的制备方法同时结合高表达的重组工程菌和高活性、高收率的突变EK酶，不仅能够显著提升索马鲁肽的生产效率，且显著降低索马鲁肽的生产成本。

Description

一种索马鲁肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物制备领域，尤其涉及一种索马鲁肽的制备方法。
背景技术
随着社会经济的发展，人民生活水平逐步提高，人们的饮食结构发生了巨大变化，也导致肥胖发生率增加，并进一步导致糖尿病患者人数的急剧增加。据统计数据显示，我国糖尿病患者人数超过1亿，同时还有超过1.5亿的隐形糖尿病前期患者。糖尿病已经成为第三大慢性疾病。
近年来，胰高血糖素样肽-1（glucagon-likepeptide-1，GLP-1）受体激动剂（GLP-1RAs）逐渐成为治疗T2DM的研究热点。目前，市场上用于治疗糖尿病的GLP-1药物主要有艾塞那肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利拉鲁肽和索马鲁肽（又名司美鲁肽，Semaglutide）。
索马鲁肽（Semaglutide）是由丹麦诺和诺德公司研制的一种新一代GLP-1类似物，是一种长效GLP-1制剂（周制剂）。索马鲁肽与人GLP-1同源性较高，其以天然人GLP-1（7-37）分子为基础，通过替换第8位氨基酸（丙氨酸替换为α-氨基丁酸）和第34位氨基酸（赖氨酸替换为精氨酸），同时在第26位赖氨酸通过间隔基连接C18脂肪二酸侧链得到。索马鲁肽通过上述结构调整，实现了可抵抗二肽基肽酶4降解，并与白蛋白结合而延长体内半衰期，实现一周给药一次的长效效果。目前，诺和诺德也已经推出了索马鲁肽的口服制剂，并且，除了治疗糖尿病外，FDA已批准索马鲁肽用于减肥适应症。
由于索马鲁肽主链末端有二肽His-Aib（Aib为非天然氨基酸），因此，通常采用将索马鲁肽重组发酵表达其余29个氨基酸（简称索马鲁肽前体），再通过化学合成连接上述二肽His-Aib，并连接侧链进行制备。目前，对索马鲁肽的研究主要集中在其结构与制剂中，对于具有高表达潜力的表达载体、重组工程菌以及发酵方法等研究较少。
本发明申请人在前期研究中，在CN113502296A中提供了一种高表达司美格鲁肽（索马鲁肽）前体重组工程菌及其构建方法，通过利用大肠杆菌原核表达体系，设计包含索马鲁肽前体的融合蛋白结构，并将其插入表达载体中，以融合蛋白包涵体形式表达，从而实现了索马鲁肽前体的稳定高表达。同时申请人在CN113502310A提供了一种高密度发酵制备司美鲁肽前体的方法，其在得到能够稳定高表达索马鲁肽前体的重组工程菌的基础上，通过在基础发酵培养基的基础上调整，能够显著提高菌体发酵表达量，降低生产成本。
同时，在大肠杆菌（E.coli）中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了实现该目的，就需要使用工具酶，优选直接在连接处切割且在产物上不留下额外氨基酸的工具酶。由于肠激酶的底物酶切位点序列具有高度的特异性，使得其成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具酶而被广泛应用。在CN113502296A中提供的高表达司美格鲁肽（索马鲁肽）前体的重组工程菌中，使用的即是肠激酶酶切位点。
丝氨酸蛋白酶肠激酶（enterokinase）（简称肠激酶或EK酶），也被称为肠肽酶（enteropeptidase），是异源二聚体丝氨酸蛋白酶，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK），并选择性地在赖氨酸之后切割。由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，其识底物别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性，且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有作用于4个天冬酰胺相连识别序列的特征，而此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见。肠激酶由1条结构亚基（重链）和1条催化亚基（轻链）构成，两者通过1个分子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动，催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联。
本发明申请人在前期研究中，获得了一种突变的EK酶，相比于野生型EK酶和目前已商业化的EK酶，上述突变的EK酶具备与前者相似（略高）的酶活，但具备显著提高的牛肠激酶轻链蛋白收率。基于该EK酶，并结合对大肠杆菌高表达体系的研究积累（包括高表达潜力重组工程菌及高密度发酵技术研究），申请人建立了一系列使用EK酶酶切位点的重组大肠杆菌表达体系，用于多肽类产品的研发和商业化，具备显著的成本降低优势。
因此，基于前期对EK酶和大肠杆菌高表达体系的研究积累，申请人构建了一种索马鲁肽的制备方法，不仅显著提升了索马鲁肽的收率，且极大降低了索马鲁肽的生产成本。
发明内容
定义
术语“索马鲁肽”为GLP-1受体激动剂N6,26-{18-[N-(17-羧基-十七碳酰基)-L-γ-谷酰胺基]-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂十八碳酰基}-[8-(2-氨基-2-丙酸)，34-L-精氨酸]人高血糖素样肽1（7-37），也可称为N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-3)。
术语“索马鲁肽前体”是指不含二肽His-Aib-的索马鲁肽多肽部分，具体其序列为EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG。
术语“索马鲁肽前体的融合蛋白”是指本申请发明人设计的一种前导肽-肠激酶酶切位点-司美鲁肽前体序列的氨基酸结构的融合蛋白；在本发明中具体是指SEQ ID NO.5或SEQ ID No.6所示的融合蛋白。
术语“包涵体”为外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。
术语“载体”是指可以将编码蛋白质或多肽的核苷酸片段可操作地插入其中以引起所述蛋白质或多肽表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒、人工染色体、噬菌体、病毒颗粒等。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。
载体可以是重组表达载体或克隆载体。本发明提供了载体（例如表达载体），其含有编码本发明提供的所述胰岛素和GLP-1缀合物的核酸序列。载体的实例包括但不限于逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒（例如SV40）、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
本发明中，术语“重组表达载体”是编码基因的核酸分子，其在宿主细胞中表达且含有控制所述基因的表达的必需元件。通常，表达载体包含转录启动子、目的基因和转录终止子。
本发明中，宿主细胞是指可将包含编码目的蛋白质或多肽的核苷酸序列片段的载体引入到其中进行克隆或基因表达的细胞。适用于克隆或表达本发明载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法。本发明提供的索马鲁肽的制备方法结合了高表达的重组工程菌和高活性和收率的EK酶，能够显著提升索马鲁肽的收率，极大降低索马鲁肽的生产成本。
第一方面，发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，所述制备方法至少包括如下步骤：
（1）从发酵菌体中收集包含索马鲁肽前体融合蛋白的包涵体，包涵体溶解变性并纯化，得到包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液，所述索马鲁肽前体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示；
（2）包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液经过酶切、纯化处理，得到索马鲁肽前体，所述酶切使用突变EK酶，所述突变EK酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
（3）索马鲁肽前体连接侧链和二肽，得到所述索马鲁肽。
对于本发明使用的发酵菌体，为本发明申请人在CN113502296A以大肠杆菌为宿主菌构建的重组工程菌，通过高密度发酵方法得到发酵菌体，本发明即从该发酵菌体到索马鲁肽的制备方法。
对于本发明所述的索马鲁肽前体，本发明申请人以DDDDK为肠激酶酶切位点设计合成包含索马鲁肽前体的融合蛋白结构，并将其插入表达载体中，重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到所述重组工程菌，重组工程菌诱导表达，收集菌体，最终以融合蛋白包涵体形式表达，通过对包涵体溶解变性、纯化，以及利用突变体EK酶进行酶切处理，得到索马鲁肽前体，其氨基酸序列为：EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG。
在本发明中，所述索马鲁肽前体的融合蛋白的氨基酸序列为FEFKFEFKDDDDKEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG（SEQ ID No.5）或FKFEFKFEDDDDKEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG（SEQ ID No.6）。
在本发明中，在所述步骤（1）中，收集包涵体的方法为：将发酵菌体悬浮并匀浆、高压均质机破碎菌体、离心收集包涵体粗沉淀并洗涤后，获得所述包涵体。
作为本发明的一种优选技术方案，在所述步骤（1）中，收集包涵体的方法为：将发酵菌体按照1g使用6-12 mL（例如7 mL、8 mL、10mL等）纯化水的比例悬浮并匀浆，高压均质机800-1000 bar（例如850 bar、900 bar、950 bar等）破碎菌体，离心获得包涵体粗沉淀，将包涵体粗沉淀用pH2-9（例如3、4、5、6、7、8等）的缓冲液洗涤2-5次（例如3次、4次等）后获得所述包涵体。
在本发明中，在所述步骤（1）中，所述包涵体溶解变性的方法包括：使用变性液进行包涵体溶解，溶解后调节pH至7.0-12.0（例如8.0、9.0、10.0、11.0等），继续搅拌至包涵体完全溶解；溶解后的变性液经过滤澄清后，使用Tris溶液稀释进行复性，得到所述包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液。
作为本发明的一种优选技术方案，所述变性液组成为：15-25 mM（例如16 mM、18mM、20 mM、22 mM、24 mM等）Tris和2-8 M（例如4 M、5 M、6 M等）尿素。
作为本发明的一种优选技术方案，所述包涵体溶解变性的方法包括：变性液按照10-20 g/L（例如12 g/L、14 g/L、15 g/L、16 g/L、18 g/L）的比例进行包涵体溶解，溶解后加入氢氧化钠调节pH至7.0-12.0（例如8.0、9.0、10.0、11.0等），继续搅拌至包涵体完全溶解；溶解后的变性液经过滤澄清后，使用15-25 mM（例如16 mM、18 mM、20 mM、22 mM、24 mM等）的Tris溶液稀释3-5倍（例如4倍等）进行复性，得到所述包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤（2）为：将包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液调节pH至8-9，加入突变EK酶混合均匀进行酶切，酶切后的样品进行离子交换层析、酸析、复溶和反相层析纯化，得到索马鲁肽前体溶液。
作为本发明的一种优选技术方案，按照每克蛋白添加1-3 mg（例如1.5 mg、2 mg、2.5mg等）的EK酶的比例添加所述突变EK酶。
作为本发明的一种优选技术方案，所述酶切的温度为室温，优选所述酶切的时间为14-20 h，例如16 h、18 h等。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤（2）为：将包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液调节pH至8-9，按照每克蛋白添加1-3 mg的EK酶的比例加入突变EK酶混合均匀，在室温下进行酶切14-20 h，酶切后的样品进行离子交换层析、酸析、复溶，最后进行反相层析纯化，得到索马鲁肽前体溶液。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤（3）中，所述索马鲁肽前体连接侧链和二肽的方法包括：将索马鲁肽前体与tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯进行反应，反应完成后利用缓冲液稀释，并与二肽活化酯进行二肽偶联，然后脱保护，得到所述索马鲁肽。
作为本发明的一种优选技术方案，所述索马鲁肽前体与tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯的摩尔比为1:(1-2)，例如1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8等。
作为本发明的一种优选技术方案，所述索马鲁肽前体与tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯反应的pH值为8-12，例如9、10、11等。
作为本发明的一种优选技术方案，所述二肽活化酯与偶联侧链产物的摩尔比为(1-6):1，例如2:1、3:1、4:1、5:1等。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤（3）还包括进行二肽偶联后，经反相层析纯化、浓缩、酸析，再进行脱保护。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤（3）中，所述索马鲁肽前体连接侧链和二肽的方法包括：
利用有机溶剂稀释索马鲁肽前体溶液，按照索马鲁肽前体与tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯的摩尔比为1:(1-2)加入10-100 mg/mL（例如20 mg/mL、40 mg/mL、60mg/mL、80 mg/mL等）的tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯的溶液，控制反应pH值为8-12进行反应，反应完成后按照偶联侧链产物与二肽活化酯的摩尔比为1:(1-6)加入二肽活化酯完成二肽偶联，反应完成后经反相层析纯化、浓缩、酸析，再利用三氟乙酸溶解沉淀进行脱保护，得到所述索马鲁肽。
作为本发明的一种优选技术方案，在进行脱保护反应后，利用稀释剂稀释三氟乙酸并沉淀、离心、复溶、过滤澄清样品，反相层析纯化得到高纯度的索马鲁肽样品。
在本发明提出的索马鲁肽的制备方法中，从上述重组工程菌发酵获得索马鲁肽前体，采用重组EK酶进行酶切。其中，重组EK酶优选本发明申请人前期研究中获得一种突变EK酶EKLm3，记载在专利CN202210697582.8中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；本发明采用突变EK酶EKLm3进行酶切，能够使发酵制备成本显著降低，市场竞争力得到有效提升。
EKLm3是在野生型牛肠激酶轻链（EK酶）基础上，在其第101、112、177位氨基酸发生突变的突变EK酶，具体的突变为：K101P、C112T和A177K。上述突变可改善蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升。实验结果表明，突变EK酶EKLm3，其相比现有野生型和商业化酶具备更优的酶活，且活性蛋白收率提高4倍以上。
作为本发明的一种优选技术方案，所述突变EK酶的制备方法包括：
（A）合成表达突变EK酶的重组表达框序列；
（B）将重组表达框序列插入表达质粒，构建得到重组表达载体；
（C）将所述重组表达载体导入到大肠杆菌中，得到表达突变EK酶的重组工程菌；
（D）所述重组工程菌发酵表达、纯化，得到所述突变EK酶。
作为本发明的一种优选技术方案，所述重组表达框序列如SEQ ID No.4所示。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
利用本发明提供的制备方法制备得到索马鲁肽，能够显著提升索马鲁肽的收率，极大降低索马鲁肽的生产成本，其中，索马鲁肽前体的收率能够达到13 g/kg菌体以上，总收率能够达到3 g API/kg菌体以上。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种索马鲁肽的制备方法。
为了获得能够稳定高表达的索马鲁肽前体，实现产业化应用价值的提升，发明人设计了一种包含索马鲁肽前体的融合蛋白结构，并将其插入表达载体中，以融合蛋白包涵体形式表达。关于合成融合多肽编码基因、构建重组表达载体、构建重组工程菌和重组工程菌的高密度发酵等具体参见在先专利申请CN113502296A和CN113502310A。
本实施例在得到的发酵液的基础上制备索马鲁肽，使用的构建体表达的融合蛋白序列如SEQ ID NO.5所示，具体方法如下：
（1）均质离心
将发酵菌体按照1 g使用9 mL纯化水的比例悬浮并匀浆，高压均质机800-1000bar经2-3次破碎菌液后，离心（离心力大于10000 g）30分钟，获得包涵体粗沉淀，将包涵体粗沉淀用pH2-9的缓冲液洗涤2次后获得包涵体；
（2）包涵体溶解变性
使用20 mMTris溶液和2-8 M尿素按10-20 g/L比例进行包涵体溶解，溶解后用氢氧化钠调节pH至7.0-12.0，搅拌至包涵体完全溶解；将溶解后的变性液进行澄清过滤并用的20 mM的Tris溶液将样品稀释3-5倍（复性）；
（3）酶切及酶切后纯化
将处理后的样品调节pH至8-9，取样检测蛋白浓度；以样品中蛋白计算，按照每克蛋白添加1-3 mg重组肠激酶EKLm3（氨基酸序列如SEQ ID No.2所示）添加酶，搅拌均匀后，室温酶切14-20 h；
酶切后的样品以不高于200 cm/h的流速按照15-20 mg/mL载量开始上样，进行离子交换层析，去除酶切肽段获得样品；将离子交换下柱样品适当稀释后加入盐酸调节pH4-5沉淀样品并过滤富集的沉淀，将收获的沉淀浆液洗涤2-5次后用氢氧化钠调节pH至7-9溶解沉淀并过滤澄清样品；澄清样品以不高于150 cm/h的流速按照3-7 mg/mL载量开始上样，进行反相层析纯化，获得高纯度层析样品（索马鲁肽前体）；
（4）偶联侧链及二肽
将索马鲁肽前体用有机溶剂稀释，有机相浓度为10-50%，tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯溶解在纯有机相中浓度为10-100 mg/mL，索马鲁肽前体与tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯摩尔比为1:(1-2)，边搅拌索马鲁肽前体料液边加入tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯控制反应pH8-12；
反应完成后将样品用缓冲液稀释后，控制偶联侧链的目的物与二肽活化酯的摩尔比1:(1-6)，边搅拌边加入二肽活化酯完成二肽偶联，偶联后的样品稀释过滤后经反相层析纯化获得高纯度样品，并超滤浓缩1-2倍；
（5）脱保护
将浓缩后的样品稀释后用盐酸调节pH至4-5离心收获沉淀，向沉淀中加入三氟乙酸溶解沉淀进行脱保护，脱保护后用稀释剂稀释三氟乙酸并沉淀样品，离心获得沉淀，将沉淀的样品加入含一定有机试剂的缓冲液溶解并用氢氧化钠调节pH至7-9，过滤澄清样品，并经反相层析纯化获得高纯度索马鲁肽样品。利用实施例1提供的制备方法进行多批次制备得到索马鲁肽，其中两批次的收率见表1：
表1
样品 起始样品量 索马鲁肽前体收率 总收率
实施例1-1 1 kg菌体 14.5 g/kg菌体 4.43 g API/kg菌体
实施例1-2 1.02 kg菌体 13.1 g/kg菌体 3.16 g API/kg菌体
由表1可知，利用本发明提供的方法，得到的索马鲁肽前体的收率能够达到13 g/kg菌体以上，总收率能够达到3 g API/kg菌体以上。
实施例2：重组EK酶及其工程菌制备
为了获得改善的蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升，发明人设计了一种牛肠激酶轻链突变体，其相比现有商业化酶具备更优的酶活，且活性蛋白收率提高4倍以上。具体可以参见在先专利申请CN202210697582.8，其中部分实施例和数据如本实施例所示。
突变的具体实例为：
（1）突变体EKLm1（商业化EK酶，雅心）：
鉴于野生型牛肠激酶在变复性过程中稳定性差、复性率低、不利于纯化，故目前商业化EK酶是将轻链中与重链连接的第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，以提高复性率；突变体EKLm1的氨基酸序列为：IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH（SEQ ID No:1）。
（3）突变体EKLm3：
结合序列的保守型及三维空间结构分析，在牛肠激酶轻链氨基酸序列的第101位引入脯氨酸残基，预期以减少变性过程中聚集体的产生，第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，以提高复性率，在第101位氨基酸突变为脯氨酸、第177位氨基酸突变为赖氨酸；突变体EKLm3的氨基酸序列为：
IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMPVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEKGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH（SEQ ID No.2）。
分别构建合成表达EKLm1和EKLm3重组融合蛋白的重组表达框，表达EKLm1的重组表达框序列如下：
ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGATGACGATGATAAAATTGTGGGCGGCAGCGATAGCCGCGAAGGCGCGTGGCCGTGGGTGGTGGCGCTGTATTTTGATGATCAGCAAGTGTGCGGCGCGAGCCTGGTGAGCCGCGATTGGCTGGTGAGCGCGGCGCATTGCGTGTATGGCCGCAACATGGAACCGAGCAAATGGAAAGCGGTGCTGGGCCTGCACATGGCGAGCAACCTGACGAGCCCGCAGATTGAAACCCGCCTGATTGATCAGATTGTGATTAACCCGCATTATAACAAACGCCGCAAAAACAACGATATTGCGATGATGCATCTGGAAATGAAAGTGAACTATACCGATTATATTCAGCCGATTACCCTGCCGGAAGAAAACCAAGTGTTTCCGCCGGGCCGCATTTGCAGCATTGCGGGCTGGGGCGCGCTGATTTATCAAGGCAGCACCGCGGATGTGCTGCAAGAAGCGGATGTGCCGCTGCTGAGCAACGAAAAATGTCAGCAACAGATGCCGGAATATAACATTACCGAAAACATGGTGTGCGCGGGCTATGAAGCGGGCGGCGTGGATAGCTGCCAAGGCGATAGCGGCGGCCCGCTGATGTGCCAAGAAAACAACCGCTGGCTGCTGGCGGGCGTGACGAGCTTTGGCTATCAGTGCGCGCTGCCGAACCGCCCGGGCGTGTATGCGCGCGTGCCGCGCTTTACCGAATGGATTCAGAGCTTTCTGCAT（SEQ ID No:3）。
表达EKLm3的重组表达框序列如下：
ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGATGACGATGATAAAATTGTGGGCGGCAGCGATAGCCGCGAAGGCGCGTGGCCGTGGGTGGTGGCGCTGTATTTTGATGATCAGCAAGTGTGCGGCGCGAGCCTGGTGAGCCGCGATTGGCTGGTGAGCGCGGCGCATTGCGTGTATGGCCGCAACATGGAACCGAGCAAATGGAAAGCGGTGCTGGGCCTGCATATGGCGAGCAACCTGACGAGCCCGCAGATTGAAACCCGCCTGATTGATCAGATTGTGATTAACCCGCATTATAACAAACGCCGCAAAAACAACGATATTGCGATGATGCATCTGGAAATGCCGGTGAACTATACCGATTATATTCAGCCGATTACCCTGCCGGAAGAAAACCAAGTGTTTCCGCCGGGCCGCATTTGCAGCATTGCGGGCTGGGGCGCGCTGATTTATCAAGGCAGCACCGCGGATGTGCTGCAAGAAGCGGATGTGCCGCTGCTGAGCAACGAAAAATGTCAGCAACAGATGCCGGAATATAACATTACCGAAAACATGGTGTGCGCGGGCTATGAAAAAGGCGGCGTGGATAGCTGCCAAGGCGATAGCGGCGGCCCGCTGATGTGCCAAGAAAACAACCGCTGGCTGCTGGCGGGCGTGACGAGCTTTGGCTATCAGTGCGCGCTGCCGAACCGCCCGGGCGTGTATGCGCGCGTGCCGCGCTTTACCGAATGGATTCAGAGCTTTCTGCAT（SEQ ID No:4）。
将上述构建的表达框序列分别插入到表达载体pET-30a（+）的NdeI和XhoI酶切位点之间，从而构建得到重组表达载体，测序验证后，并将上述重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）中，经过抗性筛选单克隆，挑取该阳性克隆接种到含有相关抗性的液体培养基中，37℃、220 rpm振荡培养至OD600=1-1.5，菌液在生物安全柜内加入50%甘油（菌液:50%甘油=2:1），即每个2 mL的无菌冻存管中加菌液600 μL和50%甘油300μL，在离心管内混合均匀（每个克隆至少保存10管），-80℃保存；经测序，得到的工程菌中的序列与所设计的序列一致（基因合成及测序服务业务均由苏州金唯智生物科技有限公司完成）。
在相同的发酵和纯化方法得到复性的EKLm1和EKLm3，并对其分别进行检测：EKLm3活性高于EKLm1，提高约10%，且纯化并复性后的活性蛋白回收率显著高于EKLm1，提高约4倍，具体结果如表2所示：
表2
突变体 EK<sub>L</sub>m1 EK<sub>L</sub>m3
目的蛋白收率（每克包涵体） 1% 4%
由表2可知，利用本发明提供的重组肠激酶EKLm3能够显著提高目标蛋白的收率。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 北京惠之衡生物科技有限公司
吉林惠升生物制药有限公司
<120> 一种索马鲁肽的制备方法
<130> KP2212788.2
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
35 40 45
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
50 55 60
Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile
65 70 75 80
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Thr
100 105 110
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
145 150 155 160
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
225 230 235
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
35 40 45
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
50 55 60
Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile
65 70 75 80
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Glu Met Pro Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Thr
100 105 110
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
145 150 155 160
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
Lys Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
225 230 235
<210> 3
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg atgacgatga taaaattgtg 480
ggcggcagcg atagccgcga aggcgcgtgg ccgtgggtgg tggcgctgta ttttgatgat 540
cagcaagtgt gcggcgcgag cctggtgagc cgcgattggc tggtgagcgc ggcgcattgc 600
gtgtatggcc gcaacatgga accgagcaaa tggaaagcgg tgctgggcct gcacatggcg 660
agcaacctga cgagcccgca gattgaaacc cgcctgattg atcagattgt gattaacccg 720
cattataaca aacgccgcaa aaacaacgat attgcgatga tgcatctgga aatgaaagtg 780
aactataccg attatattca gccgattacc ctgccggaag aaaaccaagt gtttccgccg 840
ggccgcattt gcagcattgc gggctggggc gcgctgattt atcaaggcag caccgcggat 900
gtgctgcaag aagcggatgt gccgctgctg agcaacgaaa aatgtcagca acagatgccg 960
gaatataaca ttaccgaaaa catggtgtgc gcgggctatg aagcgggcgg cgtggatagc 1020
tgccaaggcg atagcggcgg cccgctgatg tgccaagaaa acaaccgctg gctgctggcg 1080
ggcgtgacga gctttggcta tcagtgcgcg ctgccgaacc gcccgggcgt gtatgcgcgc 1140
gtgccgcgct ttaccgaatg gattcagagc tttctgcat 1179
<210> 4
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg atgacgatga taaaattgtg 480
ggcggcagcg atagccgcga aggcgcgtgg ccgtgggtgg tggcgctgta ttttgatgat 540
cagcaagtgt gcggcgcgag cctggtgagc cgcgattggc tggtgagcgc ggcgcattgc 600
gtgtatggcc gcaacatgga accgagcaaa tggaaagcgg tgctgggcct gcatatggcg 660
agcaacctga cgagcccgca gattgaaacc cgcctgattg atcagattgt gattaacccg 720
cattataaca aacgccgcaa aaacaacgat attgcgatga tgcatctgga aatgccggtg 780
aactataccg attatattca gccgattacc ctgccggaag aaaaccaagt gtttccgccg 840
ggccgcattt gcagcattgc gggctggggc gcgctgattt atcaaggcag caccgcggat 900
gtgctgcaag aagcggatgt gccgctgctg agcaacgaaa aatgtcagca acagatgccg 960
gaatataaca ttaccgaaaa catggtgtgc gcgggctatg aaaaaggcgg cgtggatagc 1020
tgccaaggcg atagcggcgg cccgctgatg tgccaagaaa acaaccgctg gctgctggcg 1080
ggcgtgacga gctttggcta tcagtgcgcg ctgccgaacc gcccgggcgt gtatgcgcgc 1140
gtgccgcgct ttaccgaatg gattcagagc tttctgcat 1179
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Phe Glu Phe Lys Phe Glu Phe Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Gly Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
20 25 30
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
35 40
<210> 6
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Asp Asp Asp Asp Lys Glu Gly Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
20 25 30
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
35 40

Claims (10)

1.一种索马鲁肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括如下步骤：
（1）从发酵菌体中收集包含索马鲁肽前体融合蛋白的包涵体，包涵体溶解变性并纯化，得到包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液，所述索马鲁肽前体融合蛋白的氨基酸序列如SEQID No.5或SEQ ID No.6所示；
（2）包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液经过酶切、纯化处理，得到索马鲁肽前体，所述酶切使用突变EK酶，所述突变EK酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
（3）索马鲁肽前体连接侧链和二肽，得到所述索马鲁肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，收集包涵体的方法为：将发酵菌体悬浮并匀浆，高压均质机破碎菌体，离心收集包涵体粗沉淀并洗涤后，获得所述包涵体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，收集包涵体的方法为：将发酵菌体按照1g使用6-12 mL纯化水的比例悬浮并匀浆，高压均质机800-1000 bar破碎菌体，离心获得包涵体粗沉淀，将包涵体粗沉淀用pH2-9的缓冲液洗涤2-5次后获得所述包涵体。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，所述包涵体溶解变性的方法包括：使用变性液进行包涵体溶解，溶解后调节pH至7.0-12.0，继续搅拌至包涵体完全溶解；溶解后的变性液经过滤澄清后，使用Tris溶液稀释进行复性，得到所述包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液；
所述变性液组成为：15-25mM Tris和2-8 M尿素。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）为：将包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液调节pH至8-9，按照每克蛋白添加1-3 mg的EK酶的比例添加所述突变EK酶进行酶切，酶切后的样品进行离子交换层析、酸析、复溶和反相层析纯化，得到索马鲁肽前体溶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）为：将包含索马鲁肽前体融合蛋白的溶液调节pH至8-9，按照每克蛋白添加1-3 mg的EK酶的比例加入突变EK酶混合均匀，在室温下进行酶切14-20 h，酶切后的样品进行离子交换层析、酸析、复溶、反相层析纯化，得到索马鲁肽前体溶液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述索马鲁肽前体连接侧链和二肽的方法包括：将索马鲁肽前体与tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯进行反应，反应完成后利用缓冲液稀释，并将偶联侧链产物与二肽活化酯进行二肽偶联，然后脱保护，得到所述索马鲁肽。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述索马鲁肽前体与tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯的摩尔比为1:(1-2)；活化酯反应的pH值为8-12。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述二肽活化酯与偶联侧链产物的摩尔比为(1-6):1，两者偶联后，经反相层析纯化、浓缩、酸析，再进行脱保护。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述索马鲁肽前体连接侧链和二肽的方法包括：
利用有机溶剂稀释索马鲁肽前体溶液，按照索马鲁肽前体与tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯的摩尔比为1:(1-2)加入10-100 mg/mL的tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯的溶液，控制反应pH值为8-12进行反应，反应完成后按照偶联侧链产物与二肽活化酯的摩尔比为1:(1-6)加入二肽活化酯完成二肽偶联，反应完成后经反相层析纯化、浓缩、酸析，再利用三氟乙酸溶解沉淀进行脱保护，得到所述索马鲁肽。
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Address after: 100025 21 floor, 2 building, 2000 business center, Eight Mile Village, Chaoyang District, Beijing.

Patentee after: Beijing huizhiheng Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee after: Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 100025 21 floor, 2 building, 2000 business center, Eight Mile Village, Chaoyang District, Beijing.

Patentee before: Beijing huizhiheng Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee before: Jilin Huisheng biopharmaceutical Co.,Ltd.