CN110724187A - 一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其应用。本发明在利拉鲁肽前体分子Arg34G LP‑1(7‑37)的N端设计信号肽和肠激酶酶切位点与之紧邻，C端连接终止密码子，三者构成目的基因，然后插入到表达载体两个酶切位点之间，构建表达利拉鲁肽前体的重组工程菌，将工程菌进行高密度发酵培养，以融合蛋白的包涵体形式表达，重组融合蛋白表达量高，重组融合蛋白约占菌体总蛋白的25％‑35％，目的蛋白包涵体表达量达15‑20g/L。包涵体杂蛋白含量低，利于分离纯化，纯化效率高，且稳定性好，极大地降低了生产成本，提高了生产效率，在糖尿病治疗药物制备领域具有良好的应用前景。

Description

一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种高效表达利拉鲁肽的重组工程菌及其应用。

背景技术

近年来科学家们依据胰高血糖素样肽1(GLP-1)具有促进胰岛素分泌，调节血糖的生理机制，基于2型糖尿病患者具有GLP-1分泌缺陷，导致高血糖的病理机制，研制出GLP-1受体激动剂。GLP-1在治疗2型糖尿病(T2DM)方面具有巨大的优势：①依赖人体血糖浓度升高情况调控机体血糖；②促进胰岛β细胞增殖分化，抑制其凋亡，促进胰岛素的分泌，提高机体胰岛素敏感性；③抑制胃肠排空、增加饱腹感，减少进食、减轻体重。但唯一的不足是GLP-1在人体很容易被二肽基肽酶降解，它的体内半衰期只有短暂的几分钟，这就限制了的临床运用，所以开发各种长效GLP-1类似物成为近20年的研究热点，利拉鲁肽则是具有这些特点的治疗2型糖尿病的药物。

利拉鲁肽(liraglutide，商品名victoza)，是诺和诺德公司研发的一种每日皮下注射一次的酰胺化长效GLP-1类似物，在结构上，它是将GLP-1(7-37)的Lys34替换成Arg，并且在Lys26侧链上连接一条16碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)而得到的衍生物，与天然GLP-1有97％的同源性。在生产工艺方面，利拉鲁肽目前是由诺和诺德公司利用酿酒酵母以胞外分泌方式表达利拉鲁肽前体分子Arg34GLP-1(7-37)，并在其Lys26连接脂肪酸侧链后切除多余氨基酸，获得利拉鲁肽分子，再进一步加工制备成注射液，并以进口药形式在中国销售，价格相当昂贵，多数患者难以承担。

目前对于外源基因的表达可以采用原核表达和真核表达系统进行，但真核表达系统在表达目的蛋白时存在一些缺陷，例如：(1)利用酵母表达目的蛋白时会造成产物蛋白的不均一降解、信号肽加工不完全、多聚体形成等问题。而且，酿酒酵母表达蛋白时会出现蛋白切割问题、蛋白分泌效率低等问题。(2)昆虫杆状病毒表达系统也存在着一定的缺陷。例如，随着感染宿主的多角体病毒的死亡，异源蛋白不能连续表达。每一轮新蛋白的合成都需要重新感染宿主细胞。此外，虽然杆状病毒表达系统能够对目的蛋白做翻译后修饰，但这种修饰存在着一定的限度；虽然其糖基化位点与在哺乳动物细胞中一样，但寡糖链的性质有所不同，无法产生复杂的糖基侧链，这可能是由于昆虫细胞不能将成熟糖链加工成哺乳动物细胞中类似的形式。(3)哺乳动物表达系统在表达外源基因时存在成本相对较高，技术复杂，表达过程中存在着潜在的动物病毒的污染等。

原核表达系统方面，大肠杆菌表达系统是研究最为深入，发展最迅速的表达系统，其遗传学背景、基因表达调控机理清晰，表达载体及宿主菌种类繁多，常被用于多肽和蛋白质的表达，是目前首选的外源表达系统。大肠杆菌表达系统由表达载体、外源基因和宿主菌组成，表达载体是其中的核心部分，其普遍的共性是：重组质粒拷贝数高，表达量高；适用范围广；表达产物容易纯化；在菌体内稳定性好。目前已知并应用较广的大肠杆菌表达载体主要分为非融合表达载体、融合表达载体、分泌型表达载体和表面呈现表达载体等，很大程度地改善了重组外源蛋白表达量不高以及下游分离加工难度大等问题。其中融合蛋白表达技术的表达模式是：原核启动子→SD序列→起始密码子→原核结构基因片断→目的基因序列→终止密码子，是比较常用的表达载体，尤其适用于小分子多肽和蛋白的表达，并能显著提高重组蛋白的表达成功率及表达量。

对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的信号肽序列融合到目的基因上，形成重组蛋白在大肠杆菌中表达时，信号肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，例如中国专利申请201610753093.4。但是这种蛋白的表达方式所产生的目的蛋白量很少，不利于后继的工业发展需求。若能获得高效表达利拉鲁肽前体的重组基因工程菌株，将极大地提高利拉鲁肽前体的产量，降低生产成本进而降低利拉鲁肽药物价格，惠及民生。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌。

本发明的另一个目的是提供所述重组工程菌在制备利拉鲁肽药物中的应用。

为了实现以上目的，本发明在利拉鲁肽前体分子Arg34GLP-1(7-37)的N端设计信号肽和连接肽与之紧邻，C端连接终止密码子，三者构成目的基因，然后插入到表达载体两个酶切位点之间，构建表达利拉鲁肽前体的重组工程菌。所述利拉鲁肽前体分子具有A-B-C结构的氨基酸序列，其中A为信号肽，B为连接肽，C为Arg34GLP-1(7-37)的序列；所述信号肽选自MalE，PhoA，OmpF，PelB或是经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的与MalE，PhoA，OmpF，PelB具有同等功能的氨基酸序列；所述连接肽选自肠激酶、凝血酶、SUMO或Protease的酶切位点。

所述信号肽任选地在其N端或C端或N端第一或第二个氨基酸后添加纯化标签，优选地，所述标签为His标签，进一步优选地，在所述信号肽的N端第二个氨基酸后添加His标签，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5-8所示。

所述Arg34GLP-1(7-37)的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明提供了编码上述利拉鲁肽前体分子的基因，信号肽选自MalE，PhoA，OmpF，PelB的利拉鲁肽前体分子基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12或SEQ ID NO.13所示。

更进一步地，本发明提供了含有所述基因的生物材料，所述生物材料为表达载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。

本发明提供了上述含有信号肽和肠激酶序列的利拉鲁肽前体分子在制备利拉鲁肽中的应用。

本发明提供了编码上述含有信号肽和肠激酶序列的利拉鲁肽前体分子的基因在制备利拉鲁肽中的应用。

本发明提供了上述生物材料在利拉鲁肽制备中的应用。

本发明提供了一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌，通过以下方法构建得到：将编码上述含有信号肽(分别为MalE，PhoA，OmpF，PelB)和肠激酶序列的利拉鲁肽前体分子的基因(分别如SEQ ID NO.10-13或其特异性序列)连接到表达载体上，构建得到重组表达载体，再将重组表达载体转化入大肠杆菌中得到高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌。所述利拉鲁肽前体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示。

所述表达载体选自pET系列载体、pASK系列载体或pBad系列载体。优选pET系列载体。

在本发明的实施例中，选用的pET系列载体是pET-30a(+)或pET-40b(+)。本领域技术人员可以选择含有强启动子的质粒作为表达载体质粒。携带有所述基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到细胞或组织中。

在本发明的实施例中，用限制性内切酶NdeI和HindIII分别对目的基因和pET-30a(+)，pET-40b(+)进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4DNA连接酶将其连接，得到表达质粒。将其转化大肠杆菌DH5α中进行扩增，用菌落PCR的方法初步筛选正确重组工程菌，测序，结果表明目的基因序列为SEQ ID NO.10-13所示的序列，其编码SEQ ID No.14-17所示的氨基酸。

含有上述重组工程菌的菌剂也属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述重组工程菌或含有该重组工程菌的菌剂在制备利拉鲁肽中的应用。

本发明提供一种制备利拉鲁肽前体的制备方法，包括以下步骤：

(1)种子活化：挑取本发明所述的重组工程菌接种至培养基；

(2)液体种子活化：从步骤(1)的培养基上挑取菌苔至液体种子培养基中，活化培养；

(3)发酵培养：步骤(2)的液体种子接种至液体发酵培养基，培养；

(4)收集菌体，破碎，洗涤包涵体；

(5)变性复性，酶切纯化。

本发明利用大肠杆菌原核表达系统，在利拉鲁肽前体分子Arg34GLP-1(7-37)的N端前设计信号肽和肠激酶酶切位点与之紧邻，C端连接终止密码子，三者构成构建体，然后插入到表达载体的两个酶切位点之间，以融合蛋白MalE-Arg34GLP-1(7-37)、PhoA-Arg34GLP-1(7-37)、OmpF-Arg34GLP-1(7-37)或PelB-Arg34GLP-1(7-37)的包涵体形式表达，从而实现重组融合蛋白的高效表达，重组融合蛋白约占菌体总蛋白的25％-35％，目的蛋白包涵体表达量(包涵体表达量＝包涵体收集总质量/菌体收集总质量×100％)达13.12％-17.49％，目的蛋白包涵体表达量(包涵体表达量＝包涵体收集总质量/菌体收集总体积)达到15-20g/L。

后期再用高特异性的肠激酶切割融合蛋白，就可获得大小正确的利拉鲁肽前体分子Arg34GLP-1(7-37)。本发明具有操作简单、蛋白表达所经历的周期短、生产所需成本低等优点，使工业生产费用降低并能在较短的时间内达到所需的目的。进一步的，(1)快速方便的分离纯化方式；(2)蛋白质稳定性高；(3)有效防止被细胞内蛋白酶的降解；(4)包涵体内目标蛋白的纯度高，甚至高达90％以至于可以减少后续处理步骤。

附图说明

图1A-图1D分别为利用不同信号肽的利拉鲁肽前体分子编码基因构建得到的重组表达载体图谱。图1A:MalE信号肽，载体pET-40b(+)，图1B:PhoA信号肽，载体pET-40b(+)，图1C:OmpF信号肽，载体pET-30a(+)，图1D:PelB信号肽，载体pET-30a(+)。

图2为除MalE，PhoA，OmpF，PelB外的其他信号肽构建的重组融合蛋白表达图，其中泳道1：未诱导的菌体蛋白，泳道2：LamB，泳道3：Lpp，泳道4：OmpA。

图3为菌体的SDS-PAGE纯度检测图谱，泳道1：Marker，泳道2：MalE信号肽，载体pET-40b(+)，泳道3：PhoA信号肽，载体pET-40b(+)，泳道4：OmpF信号肽，载体pET-30a(+)，泳道5：PelB信号肽，载体pET-30a(+)。

图4为HPLC检测复性液图谱，图4A:MalE信号肽，载体pET-40b(+)，图4B:PhoA信号肽，载体pET-40b(+)，图4C:OmpF信号肽，载体pET-30a(+)，图4D:PelB信号肽，载体pET-30a(+)。

图5为酶切的SDS-PAGE检测图谱，泳道1：Marker，泳道2：MalE信号肽，载体pET-40b(+)，泳道3：PhoA信号肽，载体pET-40b(+)，泳道4：OmpF信号肽，载体pET-30a(+)，泳道5：PelB信号肽，载体pET-30a(+)。

图6为HPCL检测纯化后图谱，图6A:MalE信号肽，载体pET-40b(+)，图6B:PhoA信号肽，载体pET-40b(+)，图6C:OmpF信号肽，载体pET-30a(+)，图6D:PelB信号肽，载体pET-30a(+)。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若无特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1含有信号肽和肠激酶序列的利拉鲁肽前体分子的设计及该基因表达质粒的构建

1、利拉鲁肽前体分子的构建

本发明的利拉鲁肽前体分子，其具有A-B-C结构，其中A为信号肽，B为连接肽，C为Arg34GLP-1(7-37)的序列；所述信号肽为MalE，PhoA，OmpF，PelB，LamB，Lpp或OmpA；所述连接肽为肠激酶、凝血酶、SUMO或Protease。

分别在信号肽MalE，PhoA，OmpF，PelB的N端第二个氨基酸后添加His标签，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示，基因序列分别如SEQ ID NO.5-8所示。

Arg34GLP-1(7-37)的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明信号肽和肠激酶序列的利拉鲁肽前体分子的基因序列如SEQ ID NO.10-13任一所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.14-17任一所示。

2、目的基因分别连接到表达载体pET-30a(+)，pET-40b(+)。

利用分别以MalE，PhoA，OmpF，PelB，LamB，Lpp，OmpA为信号肽的本发明的利拉鲁肽前体分子编码基因构建得到的含目的基因的重组表达载体图谱见图1A-图1D。

实施例2高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌的构建

将构建成功的重组表达载体通过化学法转化到BL21(DE3)宿主中进行扩增，用菌落PCR的方法初步筛选正确重组工程菌，再提取质粒进行酶切鉴定。鉴定结果获得正确的重组工程菌。

实施例3利用高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌制备利拉鲁肽前体的方法

1、发酵及包涵体收集

取实施例2中构建好的重组工程菌，进行高密度发酵，离心后获得菌体，10L发酵液可得到800g湿菌。发酵过程中，以不同信号肽进行重组融合蛋白表达，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过观察条带强度来确定目的蛋白的含量，其中以LamB，Lpp，OmpA为信号肽的重组融合蛋白表达的效果均不好，表达出的重组蛋白条带很窄或者没有，见图2；以MalE，PhoA，OmpF，PelB为信号肽的重组融合蛋白表达效果较好，见图3，在此条件下表达的融合蛋白约占菌体总蛋白25％-35％。菌体按照1:10重悬于20mM Tris，pH7.5的缓冲液中，匀浆破碎收集沉淀。目的蛋白包涵体表达量见表1。

表1

2、变性复性

将沉淀按照1:10比例溶解于8M urea中，使用Tris调节pH8.6，室温搅拌1h，缓慢加入纯化水中，将尿素浓度稀释至2M，调节pH8.5，变性液通过HPLC检测，纯度约为90％。见图4A-4D。

3、酶切纯化

经变性复性后得到的蛋白，加入1mM CaCl₂，0.1％TWEEN-20，然后加入肠激酶进行酶切。酶切温度16-37℃，酶切时间2-16h，通过观察条带强度来确定酶切效率大于90％，见图5。

酶切结束后调节pH4.5，收集上清，上清用SP离子交换层析纯化出蛋白，纯化出的蛋白约为8g/10L发酵液，HPLC检测纯度大于90％。见图6A-6D。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 甘李药业股份有限公司

<120> 一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其应用

<130> KHP171116816.2

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys His His His His His His Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ser Ala Leu Thr Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala

20 25 30

<210> 2

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys His His His His His His Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala

20 25

<210> 3

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Met His His His His His His Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile

1 5 10 15

Val Pro Ala Leu Leu Val Ala Gly Thr Ala Asn Ala

20 25

<210> 4

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys His His His His His His Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala

20 25

<210> 5

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaaacatc accatcacca tcacattaaa acgggcgcac gcattctggc tctgtccgct 60

ctgaccacga tgatgttctc ggcttcggca ctggct 96

<210> 6

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaaacatc accatcacca tcaccaatca accatcgcac tggctctgct gccgctgctg 60

ttcacgccgg tcaccaaagc t 81

<210> 7

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgatgcatc accatcacca tcacaaacgc aacattctgg ctgtgattgt cccggcactg 60

ctggtcgctg gcacggcaaa cgca 84

<210> 8

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaaacatc accatcacca tcactatctg ctgccgaccg ctgctgctgg cctgctgctg 60

ctggctgctc aaccggctat ggcg 84

<210> 9

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 10

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgaaacatc accatcacca tcacattaaa acgggcgcac gcattctggc tctgtccgct 60

ctgaccacga tgatgttctc ggcttcggca ctggctgtgg atgatgacga taaacacgca 120

gaaggaacct ttacgagtga tgtgtcgagt tatctggagg ggcaggcagc caaagagttc 180

atcgcttggt tggttcgcgg tcgtggttaa 210

<210> 11

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgaaacatc accatcacca tcaccaatca accatcgcac tggctctgct gccgctgctg 60

ttcacgccgg tcaccaaagc tgtggatgat gacgataaac acgcagaagg aacctttacg 120

agtgatgtgt cgagttatct ggaggggcag gcagccaaag agttcatcgc ttggttggtt 180

cgcggtcgtg gttaa 195

<210> 12

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgatgcatc accatcacca tcacaaacgc aacattctgg ctgtgattgt cccggcactg 60

ctggtcgctg gcacggcaaa cgcagtggat gatgacgata aacacgcaga aggaaccttt 120

acgagtgatg tgtcgagtta tctggagggg caggcagcca aagagttcat cgcttggttg 180

gttcgcggtc gtggttaa 198

<210> 13

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgaaacatc accatcacca tcactatctg ctgccgaccg ctgctgctgg cctgctgctg 60

ctggctgctc aaccggctat ggcggtggat gatgacgata aacacgcaga aggaaccttt 120

acgagtgatg tgtcgagtta tctggagggg caggcagcca aagagttcat cgcttggttg 180

gttcgcggtc gtggttaa 198

<210> 14

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Lys His His His His His His Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ser Ala Leu Thr Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala

20 25 30

Val Asp Asp Asp Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val

35 40 45

Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu

50 55 60

Val Arg Gly Arg Gly

65

<210> 15

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Lys His His His His His His Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys Ala Val Asp Asp Asp Asp

20 25 30

Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

35 40 45

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

50 55 60

<210> 16

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Met His His His His His His Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile

1 5 10 15

Val Pro Ala Leu Leu Val Ala Gly Thr Ala Asn Ala Val Asp Asp Asp

20 25 30

Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu

35 40 45

Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg

50 55 60

Gly

65

<210> 17

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Lys His His His His His His Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Val Asp Asp Asp

20 25 30

Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu

35 40 45

Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg

50 55 60

Gly

65

Claims (10)

1.一种利拉鲁肽前体分子，其包括A-B-C的结构，其中A为信号肽，B为连接肽，C为Arg34GLP-1(7-37)的序列；所述信号肽选自MalE，PhoA，OmpF，PelB或是经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的与MalE，PhoA，OmpF，PelB具有同等功能的氨基酸序列；所述连接肽选自肠激酶、凝血酶、SUMO或Protease的酶切位点。

2.如权利要求1所述的利拉鲁肽前体分子，其特征在于，所述信号肽任选地在其N端或C端或N端第一或第二个氨基酸后添加纯化标签，优选地，所述标签为His标签，进一步优选地，在所述信号肽的N端第二个氨基酸后添加His标签；

所述Arg34GLP-1(7-37)的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.权利要求1或2所述利拉鲁肽前体分子的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

4.含有权利要求1或2所述利拉鲁肽前体分子的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达载体、表达盒、重组菌或转基因细胞系。

5.权利要求1或2所述的利拉鲁肽前体分子或其编码基因或权利要求4所述的生物材料在利拉鲁肽的制备中的应用。

6.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌通过以下方法构建得到：将权利要求1或2所述利拉鲁肽前体分子的编码基因连接到表达载体上，构建得到重组表达载体，再将重组表达载体转化入大肠杆菌中。

7.如权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述表达载体选自pET系列载体、pASK系列载体或pBad系列载体。

8.含有权利要求6或7所述的重组工程菌的菌剂。

9.权利要求6或7所述的重组工程菌或权利要求8所述的菌剂在利拉鲁肽的制备中的应用。

10.一种制备利拉鲁肽前体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)种子活化：挑取权利要求6或7所述的重组工程菌接种至培养基；

(2)液体种子活化：从步骤(1)的培养基上挑取菌苔至液体种子培养基中，活化培养；

(3)发酵培养：步骤(2)的液体种子接种至液体发酵培养基，培养；

(4)收集菌体，破碎，洗涤包涵体；

(5)变性复性，酶切纯化。

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