CN114805544B - 一种赖脯胰岛素前体、其重组基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种赖脯胰岛素前体、其重组基因工程菌及其构建方法。本发明的赖脯胰岛素前体为引导肽、赖脯胰岛素B链、C肽和赖脯胰岛素A链依次串联所得的多肽。本发明通过对C肽的选择和对引导肽的选择优化，表达本发明赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌相比于优化前具备显著提升的目的蛋白表达量，将其用于赖脯胰岛素的生产，将显著提升生产效率，降低生产成本，应用前景广阔。

Description

一种赖脯胰岛素前体、其重组基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种赖脯胰岛素前体、其重组基因工程菌及其构建方法。

背景技术

糖尿病是当今社会高发的慢性疾病。胰岛素类产品是糖尿病市场第一大用药品种，其中又以三代重组胰岛素为主。赖脯胰岛素为第一个速效人胰岛素的类似物，属于第三代胰岛素，其结构上的特点是将人胰岛素β链28、29位的脯氨酸（Pro）、赖氨酸（Lys）次序对换，成为Lys_β28Pro_β29，这种互换改变了B链末端的空间结构，减少了二聚体内胰岛素单体间的非极性接触和β片层间的相互作用，使胰岛素的自我聚合特性发生改变，易于解离，注射后能较快分解，从而加速皮下注射后的吸收，有利于控制进餐后迅速升高的高血糖。赖脯胰岛素能很好地模拟人胰岛素的分泌模式，其药代动力学特性是常规人胰岛素的一半左右，其起效时间是10～15分钟，达峰时间为1～1.5小时，作用持续时间缩短至4～6小时，使患者在获得良好的血糖控制的同时不易与餐前或者夜间胰岛素作用发生叠加，显著减少了夜间低血糖的发生率。此外，与人胰岛素相比，赖脯胰岛素具有安全性高和患者依从性好等优点。

由于赖脯胰岛素的生产工艺具有一定的技术壁垒，所以目前国内赖脯胰岛素主要由甘李、礼来和江苏万邦生化等少数厂家获批上市。目前，各企业多采用重组大肠杆菌工程菌发酵表达包涵体，在通过变复性处理的路线生产赖脯胰岛素。

目前，可采用重组基因工程菌表达目的蛋白的方式制备胰岛素。表达系统包括原核基因表达系统、酵母表达系统和动物细胞表达系统。对于原核基因表达系统，使用最多的即为大肠杆菌Escherichiacoli来作为宿主菌，这也是目前应用最广泛的蛋白表达系统。原因是大肠杆菌表达系统遗传背景和生理特性研究清楚，已开发有多种商业化工程菌可以使用；且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单，并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。

然而，由于胰岛素结构的特殊性（双链结构、多对分子内二硫键等），目前赖脯胰岛素前体在表达过程中普遍存在表达水平低的技术缺陷。

因此，仍迫切需要开发能够高效表达赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌，以提高发酵效率，有效降低生产成本，进而得到价格低、质量高的赖脯胰岛素，进而满足国内需求，降低患者的经济负担。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种赖脯胰岛素前体，其重组基因工程菌及其构建方法。

概念：

赖脯胰岛素：其结构上的特点是将人胰岛素β链28、29位的脯氨酸（Pro）、赖氨酸（Lys）次序对换，其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使赖脯胰岛素A链、赖脯胰岛素B链连接起来，同时存在一对A链内二硫键A6(Cys)-A11(Cys)。

赖脯胰岛素多肽：是指赖脯胰岛素的单链氨基酸肽段，具体是指赖脯胰岛素B链和赖脯胰胰岛素A链通过连接肽（如C肽）相连获得的多肽。赖脯胰岛素B链氨基酸序列为：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT（SEQ ID No:15）；赖脯胰岛素A链氨基酸序列为GIVEQCCTSICSLYQLENYCN（SEQ ID No:16）。

赖脯胰岛素前体：指赖脯胰岛素多肽通过酶切位点序列与引导肽等连接而成的融合蛋白，可以通过蛋白酶将引导肽、连接肽等切除获得甘精胰岛素多肽。具体到本发明，赖脯胰岛素前体是指SEQ ID No:1~SEQ ID No:7所示的融合蛋白。

本发明的第一方面提供了一种新的赖脯胰岛素前体，赖脯胰岛素前体为引导肽、赖脯胰岛素B链、C肽和赖脯胰岛素A链依次串联所得的多肽。具体的，赖脯胰岛素前体的氨基酸序列选自SEQ ID No:1 ~ SEQ ID No:7。

在项目研发过程中，申请人针对赖脯胰岛素前体设计及其重组工程菌开展了大量研究，虽然能够获得具备一定较高表达量的表达赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌，但表达量始终未达预期。直到在同类产品甘精胰岛素前体及其重组基因工程菌研究中，获得能够显著高表达目的蛋白的重组工程菌，因此，借鉴该发明，本发明设计获得如SEQ ID No:7所示的赖脯胰岛素前体，基于该前体序列设计的重组基因工程菌能够显著提升目的蛋白的表达量。

在初期研究中，如SEQ ID No:1 ~ SEQ ID No:6所示的赖脯胰岛素前体中，C肽采用“KR”（Lys-Arg）或“TR”（Thr-Arg）。但随着研究深入开展，借鉴甘精胰岛素的序列特点，本发明通过研究发现，C肽采用“RR”（Arg-Arg，甘精胰岛素B链末端），并结合选择优化的引导肽，可以制备得到表达量显著提升的重组基因工程菌，优化后的赖脯胰岛素前体氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。

本发明的第二方面提供了一种编码如上述赖脯胰岛素前体的多核苷酸，具体的，多核苷酸的核苷酸序列选自SEQ ID No:8~SEQ ID No:14。多核苷酸与赖脯胰岛素前体氨基酸的对应关系如表2所示。本发明的编码赖脯胰岛素前体的多核苷酸优选SEQ ID No:9和SEQ ID No:14所示的核苷酸序列，并进一步优选SEQ ID No:14所示的核苷酸序列。

本发明的第三方面提供了一种用于表达赖脯胰岛素前体的重组表达载体，重组表达载体包含上述的多核苷酸。具体的，本发明实施例的表达载体优选使用表达质粒，具体可选用质粒pET-30 EK/LIC；并优选通过NdeI和XhoI酶切位点插入本发明的多核苷酸。

本发明的第四方面提供了包含上述重组表达载体的重组基因工程菌。宿主菌选自原核细胞，进一步优选大肠杆菌，具体可选自大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。重组基因工程菌按照如下方法制备：

（1）合成编码赖脯胰岛素前体的多核苷酸；

（2）将上述编码赖脯胰岛素前体的多核苷酸插入到表达载体上，构建得到重组表达载体；

（3）将上述重组表达载体导入到宿主菌中，得到表达赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌。具体的，表达载体可选自质粒pET-30 EK/LIC，宿主菌可选自大肠杆菌BL21（DE3）。

本发明的第五方面提供了一种表达赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

（1）合成编码赖脯胰岛素前体的多核苷酸；

（2）将上述编码赖脯胰岛素前体的多核苷酸插入到表达载体上，构建得到重组表达载体；

（3）将上述重组表达载体导入到宿主菌中，得到表达赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌。

优选的，多核苷酸的序列如SEQ ID No:8 ~ SEQ ID No:14所示，并优选SEQ IDNo:14或SEQ ID No:9所示的核苷酸序列。具体的，表达载体可选自质粒pET-30 EK/LIC，宿主菌可选自大肠杆菌BL21（DE3）。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明将赖脯胰岛素B链与赖脯胰岛素A链采用“RR”的短肽连接，并通过引导肽的设计优化，获得了一种表达量显著提升的赖脯胰岛素前体重组基因工程菌，极大提升了赖脯胰岛素前体的表达量，提高了生产效率，降低了生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例1中获得的8个转化子的诱导表达结果图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

以下实施例所用到原料均为市售。

实施例所用到材料包括：

（1）菌株和质粒

宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）是基因工程常用工具菌种，本发明实施例所涉及的重组质粒pLA0023 ~ pLA049均委托宝生物公司合成。

（2）培养基

LB液体培养基，配方为胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L。

LB固体培养基，配方为胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，琼脂粉（Agar）20g/L。

实施例所用到实验方法如下：

大肠杆菌转化、SDS-PAGE是基因工程领域的常规操作方法，参见[美]MichaelR.Green,JosephSambrook.分子克隆指南：第四版[M].贺福初,等,译.北京:科学出版社,2017:124-125,1325-1330.

实施例1：重组工程菌的构建及诱导表达

1.1重组工程菌的构建

设计引导肽、酶切序列、赖脯胰岛素A链、C肽及赖脯胰岛素B链，构建赖脯胰岛素表达融合蛋白，并合成包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的表达框序列，将表达框分别插入pET-30 EK/LIC质粒的NdeI和XhoI位点之间，并分别命名，具体融合蛋白序列和命名如表1所示

表1

重组质粒序号	赖脯胰岛素前体氨基酸序列	编码赖脯胰岛素前体的多核苷酸
			pLA023	SEQ ID NO:1	SEQ ID NO:8
pLA039	SEQ ID NO:2	SEQ ID NO:9
			pLA044	SEQ ID NO:3	SEQ ID NO:10
pLA049	SEQ ID NO:4	SEQ ID NO:11
			pLA046	SEQ ID NO:5	SEQ ID NO:12
pLA043	SEQ ID NO:6	SEQ ID NO:13
			pLA042	SEQ ID NO:7	SEQ ID NO:14

将重组质粒分别转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3），转化液涂布LB固体培养基（含卡那霉素30μg/mL），利用抗性筛选得到含有目的基因重组质粒的工程菌。

1.2重组工程菌的诱导表达

从重组工程菌的筛选平板上分别挑取转化子，无菌接种至含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温振荡培养过夜。按照1：100的比例转接至20mL LB液体培养基（含卡那霉素30μg/mL）中，37℃恒温振荡培养至OD600=0.6~3.0，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白。诱导6小时后离心收集菌体。SDS-PAGE（16%分离胶和4%浓缩胶）电泳再经凝胶成像，表达结果如表2所示。

本发明实施例共设计分子20个以上，现选取其中部分为例进行陈述，在本发明实施例设计的众多表达体系中，发现在表达量相对较好的pLA023重组表达质粒，将其引导肽末端的氨基酸PK优化为KR能够显著提升重组工程菌的目的蛋白表达量，优化后的重组表达质粒即为pLA039。同时，结合在同类产品中的研究结果，本发明实施例在赖脯胰岛素B链和A链之间使用两个精氨酸RR进行连接（注：表达纯化后可以经两步酶切将A链和B链切分，并将RR切除），最终获得pLA042表达质粒，使用该质粒构建的重组工程菌，其表达量也显著高于其他重组工程菌。

表2

重组工程菌所包含质粒的序号	重组工程菌的表达量
		pLA023	+
pLA039	++
		pLA044	+
pLA049	+
		pLA046	+
pLA043	+
		pLA042	+++

根据表2的结果可知，在构建的众多重组工程菌中，包含表达质粒pLA042的重组工程菌其表达量最高。表达量的检测数据也显示，其表达量是优化前pLA039表达量的约2 ~ 3倍，pLA023表达量的约5 ~ 6倍。

按照实施例1.1的方法，构建序号pLA042所示重组工程菌，并从其筛选平板上挑取的8个转化子，按照实施例1.2所示方法进行诱导表达，诱导表达结果见图1。

由图1可知，本发明构建的包含pLA042的重组工程菌均能实现目的蛋白的高效表达，其表达量高，表达效果稳定、一致，具备良好的应用前景。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 北京惠之衡生物科技有限公司

吉林惠升生物制药有限公司

<120> 一种赖脯胰岛素前体、其重组基因工程菌及其构建方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Thr Lys Ala Ala Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln

1 5 10 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

20 25 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

35 40 45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg

50 55 60

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr Lys Arg

85 90 95

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

100 105 110

Glu Asn Tyr Cys Asn

115

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Lys Ala Ala Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln

1 5 10 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

20 25 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

35 40 45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Lys Arg

50 55 60

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr Lys Arg

85 90 95

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

100 105 110

Glu Asn Tyr Cys Asn

115

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu

1 5 10 15

Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe

20 25 30

Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn

35 40 45

Pro Leu Gly Thr Gly Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His

50 55 60

Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr

65 70 75 80

Thr Lys Pro Thr Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile

85 90 95

Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100 105

<210> 4

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Asp Asp Asp Asp Lys Arg Phe

1 5 10 15

Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu

20 25 30

Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr Arg Gly Ile

35 40 45

Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn

50 55 60

Tyr Cys Asn

65

<210> 5

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu

1 5 10 15

Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe

20 25 30

Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn

35 40 45

Pro Leu Gly Thr Gly Arg Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser

50 55 60

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe

65 70 75 80

Tyr Thr Lys Pro Thr Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser

85 90 95

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100 105

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu

1 5 10 15

Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe

20 25 30

Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn

35 40 45

Pro Leu Gly Thr Gly Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser

50 55 60

His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe

65 70 75 80

Tyr Thr Lys Pro Thr Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser

85 90 95

Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100 105

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Thr Lys Ala Ala Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln

1 5 10 15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

20 25 30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

35 40 45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Lys Arg

50 55 60

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr Arg Arg

85 90 95

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

100 105 110

Glu Asn Tyr Cys Asn

115

<210> 8

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggctacca aagctgcttc tgttctgaaa ggtgacggtc cggttcaggg tatcatcaac 60

ttcgaacaga aagaatctaa cggtccggtt aaagtttggg gttctatcaa aggtctgacc 120

gaaggtctgc acggtttcca cgttcacgaa ttcggtgaca acaccgctgg ttctacctct 180

gctggtccgc gtttcgttaa ccagcacctg tgcggttctc acctggttga agctctgtac 240

ctggtttgcg gtgaacgtgg tttcttctac accaaaccga ccaaacgtgg tatcgttgaa 300

cagtgctgca cctctatctg ctctctgtac cagctggaaa actactgcaa c 351

<210> 9

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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ttcgaacaga aagaatctaa cggtccggtt aaagtttggg gttctatcaa aggtctgacc 120

gaaggtctgc acggtttcca cgttcacgaa ttcggtgaca acaccgctgg ttctacctct 180

gctggtaaac gtttcgttaa ccagcacctg tgcggttctc acctggttga agctctgtac 240

ctggtttgcg gtgaacgtgg tttcttctac accaaaccga ccaaacgtgg tatcgttgaa 300

cagtgctgca cctctatctg ctctctgtac cagctggaaa actactgcaa c 351

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgttcccga ccatcccgct gtctcgtctg ttcgacaacg ctatgctgcg tgctcaccgt 60

ctgcaccagc tggctttcga cacctaccag gaattcgaag aagcttacat cccgaaagaa 120

cagaaatact ctttcctgca gaacccgctg ggtaccggta aattcgttaa ccagcacctg 180

tgcggttctc acctggttga agctctgtac ctggtttgcg gtgaacgtgg tttcttctac 240

accaaaccga ccaaacgtgg tatcgttgaa cagtgctgca cctctatctg ctctctgtac 300

cagctggaaa actactgcaa c 321

<210> 11

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgttcaaat tcgaattcaa attcgaagac gacgacgaca aacgtttcgt taaccagcac 60

ctgtgcggtt ctcacctggt tgaagctctg tacctggttt gcggtgaacg tggtttcttc 120

tacaccaaac cgacccgtgg tatcgttgaa cagtgctgca cctctatctg ctctctgtac 180

cagctggaaa actactgcaa c 201

<210> 12

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgttcccga ccatcccgct gtctcgtctg ttcgacaacg ctatgctgcg tgctcaccgt 60

ctgcaccagc tggctttcga cacctaccag gaattcgaag aagcttacat cccgaaagaa 120

cagaaatact ctttcctgca gaacccgctg ggtaccggtc gtcgtttcgt taaccagcac 180

ctgtgcggtt ctcacctggt tgaagctctg tacctggttt gcggtgaacg tggtttcttc 240

tacaccaaac cgaccaaacg tggtatcgtt gaacagtgct gcacctctat ctgctctctg 300

taccagctgg aaaactactg caac 324

<210> 13

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgttcccga ccatcccgct gtctcgtctg ttcgacaacg ctatgctgcg tgctcaccgt 60

ctgcaccagc tggctttcga cacctaccag gaattcgaag aagcttacat cccgaaagaa 120

cagaaatact ctttcctgca gaacccgctg ggtaccggta aacgtttcgt taaccagcac 180

ctgtgcggtt ctcacctggt tgaagctctg tacctggttt gcggtgaacg tggtttcttc 240

tacaccaaac cgaccaaacg tggtatcgtt gaacagtgct gcacctctat ctgctctctg 300

taccagctgg aaaactactg caac 324

<210> 14

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggctacca aagctgcttc tgttctgaaa ggtgacggtc cggttcaggg tatcatcaac 60

ttcgaacaga aagaatctaa cggtccggtt aaagtttggg gttctatcaa aggtctgacc 120

gaaggtctgc acggtttcca cgttcacgaa ttcggtgaca acaccgctgg ttctacctct 180

gctggtaaac gtttcgttaa ccagcacctg tgcggttctc acctggttga agctctgtac 240

ctggtttgcg gtgaacgtgg tttcttctac accaaaccga cccgtcgtgg tatcgttgaa 300

cagtgctgca cctctatctg ctctctgtac cagctggaaa actactgcaa c 351

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr

20 25 30

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

Claims (6)

1.一种赖脯胰岛素前体，其特征在于，所述赖脯胰岛素前体为引导肽、赖脯胰岛素B链、C肽和赖脯胰岛素A链依次串联所得的多肽，所述赖脯胰岛素前体的氨基酸序列为SEQ IDNo:7。

2.编码如权利要求1所述的赖脯胰岛素前体的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列为SEQ ID No:14。

3.用于表达赖脯胰岛素前体的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的多核苷酸，所述表达载体选自质粒pET-30 EK/LIC。

4.包含如权利要求3所述重组表达载体的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌由所述重组表达载体导入到宿主菌中得到，所述宿主菌选自大肠杆菌BL21（DE3）。

5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌按照如下方法制备：

（1）合成权利要求2所述的多核苷酸；

（2）将所述多核苷酸插入到表达载体上，所述表达载体选自质粒pET-30 EK/LIC，构建得到重组表达载体；

（3）将所述重组表达载体导入到宿主菌中，所述宿主菌选自大肠杆菌BL21（DE3），得到所述表达赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌。

6.一种表达赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）合成权利要求2所述的多核苷酸；

（2）将所述多核苷酸插入到表达载体上，所述表达载体选自质粒pET-30 EK/LIC，构建得到重组表达载体；

（3）将所述重组表达载体导入到宿主菌中，所述宿主菌选自大肠杆菌BL21（DE3），得到所述表达赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌。

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