CN114807205A - 表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法和应用。本发明重组工程菌表达的利拉鲁肽前体中包含EK酶水解位点和引导肽，利拉鲁肽前体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。本发明重组工程菌可显著提高的目的蛋白表达量，同时利用自主设计的高活性和收率的EK酶，两者结合，可以进一步提高利拉鲁肽的产率，降低其生产成本，更有利于进行商业化生产，具备更好的商业应用价值。

Description

表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体讲，涉及一种表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
利拉鲁肽（liraglutide，商品名victoza)，是诺和诺德公司研发的一种每日皮下注射一次的酰胺化长效GLP-1类似物，将GLP-1(7-37)的Lys34替换成Arg，在Lys26侧链上连接一条16碳棕榈脂肪酸而得到的衍生物，与天然GLP-1有97％的同源性。在生产工艺方面，利拉鲁肽目前是由诺和诺德公司利用酿酒酵母以胞外分泌方式表达利拉鲁肽前体分子Arg34GLP-1(7-37)，并在其Lys26连接脂肪酸侧链后切除多余氨基酸，获得利拉鲁肽分子，再进一步加工制备成注射液。
当前，国内研发利拉鲁肽的合成多以化学合成法为主，即以氨基酸作为原料，采用化学方法进行多肽的合成，包括液相合成法和固相合成法。相关的专利报道很多，例如，中国专利申请201810639157.7、201811066436.5、201911214264.6、202110558979.4，中国专利ZL201110271342.3、ZL201611223233.3等。但化学合成的方法不仅工艺复杂，并且会产生一些结构高度相似的杂质，难以分离除去，采用的分离柱价格昂贵，所合成得到的多肽的生物活性较低。因此，目前采用重组工程菌表达利拉鲁肽受到越来越多的关注。
对于外源基因的表达可以采用原核表达和真核表达系统进行，但真核表达系统在表达目的蛋白时存在一些缺陷。原核表达系统方面，大肠杆菌表达系统是研究最为深入，发展最迅速的表达系统，其遗传学背景、基因表达调控机理清晰，表达载体及宿主菌种类繁多，常被用于多肽和蛋白质的表达，是目前首选的外源表达系统。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。
在大肠杆菌（E.coli）中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了实现该目的，就需要有使用工具酶，优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的工具酶。由于肠激酶的底物酶切位点序列具有高度的特异性，使得其成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具酶而被广泛应用。
丝氨酸蛋白酶肠激酶（enterokinase）（简称肠激酶或EK酶），也被称为肠肽酶（enteropeptidase），是异源二聚体丝氨酸蛋白酶，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK），并选择性地在赖氨酸之后切割。由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，其识底物别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性，且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有作用于4个天冬酰胺相连识别序列的特征，而此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见。肠激酶由1条结构亚基（重链）和1条催化亚基（轻链）构成，两者通过1个分子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动，催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联。
本发明申请人在前期研究中，获得了一种突变的EK酶，相比于野生型EK酶和目前已商业化的EK酶，上述突变的EK酶具备与前者相似（略高）的酶活，但具备显著提高的牛肠激酶轻链蛋白收率。基于该EK酶，并结合对大肠杆菌高表达体系的研究积累（包括高表达潜力重组工程菌及高密度发酵技术研究），申请人建立了一系列使用EK酶酶切位点的重组大肠杆菌表达体系，用于多肽类产品的研发和商业化，具备显著的成本降低优势。
因此，基于前期对EK酶和大肠杆菌高表达体系的研究积累，申请人构建了一种能够高效表达利拉鲁肽前体的重组大肠杆菌，并将其用于生产制备利拉鲁肽。不仅显著提升了利拉鲁肽前体表达量，且极大降低了利拉鲁肽生产成本。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明通过大量的研究，提供了包含EK酶水解位点的表达利拉鲁肽前体的重组工程菌，并提出该重组工程菌发酵方法，获得利拉鲁肽前体后，采用本发明的重组EK酶进行水解，以高效、低成本的获得利拉鲁肽。
概念：
利拉鲁肽（liraglutide，商品名victoza)，是诺和诺德公司研发的一种每日皮下注射一次的酰胺化长效GLP-1类似物，将GLP-1(7-37)的Lys34替换成Arg，在Lys26侧链上连接一条16碳棕榈脂肪酸而得到的衍生物，与天然GLP-1有97％的同源性。
利拉鲁肽多肽，是指利拉鲁肽的氨基酸肽段，其氨基酸序列如下所示：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg - Gly-Arg-Gly。
利拉鲁肽前体，是指利拉鲁肽多肽通过酶切位点序列与引导肽等连接而成的融合蛋白，可以通过蛋白酶将引导肽等切除获得利拉鲁肽多肽。具体到本发明，利拉鲁肽前体是指SEQ ID No.5所示的融合蛋白。
本发明的第一方面提出一种表达利拉鲁肽前体的重组工程菌，该重组工程菌的构建方法包括：
（1）合成表达利拉鲁肽前体的表达框序列，利拉鲁肽前体的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示；
（2）将步骤（1）中的表达框序列插入表达质粒，构建得到重组表达载体；
（3）将重组表达载体导入到大肠杆菌中，得到表达利拉鲁肽前体的重组工程菌。
本发明通过对引导肽筛选，可使重组工程菌显著提高的目的蛋白表达量；同时通过EK酶酶切位点与引导肽连接，从而可利用EK酶进行酶切。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明设计包含引导肽的融合蛋白，合成融合蛋白的表达框序列，表达框序列如SEQ ID NO:6所示。
作为一种具体的实施方式，可以将表达框序列插入pET-28a（+）质粒的NdeI和XhoI位点之间，命名为重组质粒pLA018。将重组质粒pLA018转化大肠杆菌Escherichia coliBL21（DE3），转化液涂布LB固体培养基，利用抗性筛选得到含有目的基因重组质粒的工程菌。
本发明的第二方面提出一种利拉鲁肽的制备方法，将上述重组工程菌发酵获得利拉鲁肽前体，采用重组EK酶进行酶切，得到利拉鲁肽多肽。其中，重组EK酶优选本发明申请人前期研究中获得一种突变EK酶EKLm3，记载在专利申请CN202210697582.8中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。从而使发酵制备成本显著降低。
EKLm3是在野生型牛肠激酶轻链（EK酶）基础上，在其第101、112、177位氨基酸发生突变的突变EK酶，具体的突变为：K101P、C112T和A177K。上述突变可改善蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升。实验结果表明，突变EK酶EKLm3，其相比现有野生型和商业化酶具备更优的酶活，且活性蛋白收率提高4倍以上。
具体的，制备方法至少包括如下步骤：
（1）将上述重组工程菌进行发酵，收集获得发酵菌体；
（2）从发酵菌体中收集包含利拉鲁肽前体的包涵体，并处理包涵体，获得利拉鲁肽前体的溶液；
（3）利拉鲁肽前体的溶液经酶切、纯化获得利拉鲁肽多肽；其中，酶切使用SEQ IDNo.2所示的突变EK酶。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤（1）中，发酵包括如下步骤：
S11、将表达利拉鲁肽前体的重组工程菌活化，得到活化种子培养液；
S12、将活化种子培养液接种至发酵培养基进行发酵培养，在发酵过程中流加补料培养基；补料培养基为：质量百分比浓度为40% ~ 60%的葡萄糖；
S13、当OD 600值为80 ~ 120时，添加IPTG诱导利拉鲁肽前体的表达，至OD600值出现平台期发酵结束，离心收集菌体。
作为本发明的一种优选技术方案，在S11中，将表达利拉鲁肽前体的重组工程菌按照1：500 ~ 1：2000比例接种至活化培养基，30 ~ 37℃、150 ~ 250 rpm条件下，培养14 ~24小时，OD600达到4.0 ~ 8.0，获得活化种子培养液。
作为本发明的一种优选技术方案，在S12中，将活化种子培养液按照1：10 ~ 1：20的体积比接种至发酵培养基；发酵的条件为：温度36 ~ 38℃，pH值为6.8 ~ 7.2，转速300 ~600 rpm；并通过调整空气、氧气通气量和转速，控制溶氧为20% ~ 30%；底糖耗尽之后，开始流加补料培养基。
作为本发明的一种优选技术方案，在S13中，IPTG终浓度为0.1 ~ 2.0 mmol/L，优选为1 mmol/L；诱导条件为：温度26 ~ 32℃，pH值为6.8 ~ 7.5，转速540 ~ 660 rpm，溶氧为20% ~ 30%，诱导培养8 ~ 16小时。
作为本发明的一种优选技术方案，在上述发酵过程中，活化培养基的配方为：胰蛋白胨5 ~ 20 g/L，酵母浸粉2 ~ 6 g/L，氯化钠5 ~ 12 g/L；发酵培养基的配方为：酵母抽提粉10 ~ 18 g/L、枸橼酸0.7 ~ 2.7 g/L、硫酸铵3 ~ 9 g/L、磷酸二氢钾5.6 ~ 11.2 g/L、氯化钙0.001 ~ 0.004 g/L、硫酸亚铁0.05 ~ 0.2 g/L、葡萄糖3 ~ 10g/L、硫酸镁0.5 ~1.5g/L。
优选地，活化培养基为：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉4 g/L，氯化钠8 g/L。发酵培养基为：酵母抽提粉14 g/L、枸橼酸1.7 g/L、硫酸铵6 g/L、磷酸二氢钾8.4 g/L、氯化钙0.0025 g/L、硫酸亚铁0.125 g/L、葡萄糖6.5 g/L、硫酸镁1 g/L。补料培养基：50 %葡萄糖。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤（2）包括：
S21、将收集的发酵菌体复溶后均质、离心，收集包涵体；
S22、使用甘氨酸溶液溶解包涵体，得到包涵体溶解液；
S23、包涵体溶解液经中空纤维过滤、超滤，得到利拉鲁肽前体超滤液。
作为本发明的一种优选技术方案，在S21中，将收集的发酵菌体按照每1g使用5 ~20 mL纯化水的比例复溶，并过滤、高压均质、离心，收集包涵体；
作为本发明的一种优选技术方案，在S22中，将包涵体按10 ~ 20 g/L比例使用40~ 60 mmol/L的甘氨酸溶液溶解，并优选50 mmol/L的甘氨酸溶液；调节pH值为10.2-10.8，搅拌2 ~ 4小时，得到包涵体溶解液。
作为本发明的一种优选技术方案，在S23中，先将包涵体溶解液稀释，然后使用10KD中空纤维过滤，浓缩至包涵体溶解液体积的1/5 ~ 1/10时加入洗涤液I洗滤5 ~ 10次，收集透出液；
将透出液采用3KD的超滤管进行超滤，浓缩至包涵体溶解体积的1/5 ~ 1/10时加入洗涤液II洗滤5 ~ 10次，收集循环液用于酶切；本发明采分布过滤、浓缩的方式逐步去除溶解液中的大分子，不仅可以保证产率，还可提高目的蛋白的纯度。
其中，洗涤液I为20 mmol/L的Tris溶液；洗涤液II组成为：0.4%（W/V）Triton，20mmol/L Tris。本发明采用性质温和的中性洗涤液，可以保证目的蛋白的活性。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤（3）中，酶切的方法包括：使用洗涤液II调整利拉鲁肽前体超滤液的浓度至2 ~ 5 g/L，调节pH值为7.5 ~ 8.5，每克利拉鲁肽前体添加突变EK酶1 ~ 2 g；在该浓度下，可以保证对前体的充分溶解，并且可有效利用突变EK酶。酶切的条件为：20 ~ 24℃酶切16 ~ 24小时，获得到酶切液。
具体的，洗涤液II组成为：0.4%（w/v）Triton，20 mmol/L Tris；本发明在酶切过程中也采用性质温和的中性洗涤液，可以保证目的蛋白的活性。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤（3）中，纯化的方法包括：对酶切液采用SP离子交换柱进行离子交换层析，酶切液的pH值为2.5 ~ 3.0，以0.1 ~ 3 L/min的流速、15~ 20 mg/mL载量上样。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明提出包含EK酶水解位点的表达利拉鲁肽前体的重组工程菌，通过对引导肽筛选使其具备显著提高的目的蛋白表达量，同时利用更高产率和活性的自主突变EK酶，可以进一步的提高利拉鲁肽的生产效率，降低其生产成本。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例所用的试剂均为市售。
实施例1
本实施例用于说明构建表达利拉鲁肽前体的重组工程菌。
本实施例设计引导肽通过DDDDK连接GLP-1[7-37]，并合成相应的cDNA。本发明构建的质粒编号对应插入其中的融合蛋白如下表1所示：
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
材料：菌株和质粒：宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）是基因工程常用工具菌种，重组质粒pLA018委托宝生物公司合成。
方法：大肠杆菌转化、SDS-PAGE是基因工程领域的常规操作方法，参见[美]Michael R.Green,JosephSambrook.分子克隆指南：第四版[M].贺福初,等,译.北京:科学出版社,2017:124-125,1325-1330.
重组工程菌的构建方法：
1、按照表1的组合，设计包含引导肽的融合蛋白，并合成融合蛋白的表达框序列，将表达框插入pET-28a（+）质粒的NdeI和XhoI位点之间，命名为重组质粒pLA018。
2、测序验证后，将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3），转化液涂布LB固体培养基（含卡那霉素30 μg/mL），利用抗性筛选得到含有目的基因重组质粒的工程菌。
实施例2
本实施例用于实施例1的重组工程菌的发酵方法：
所用到的培养基配方为：
活化培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉4 g/L，氯化钠8 g/L。
发酵培养基：酵母抽提粉14 g/L、枸橼酸1.7 g/L、硫酸铵6 g/L、磷酸二氢钾8.4g/L、氯化钙0.0025 g/L、硫酸亚铁0.125 g/L、葡萄糖6.5 g/L、硫酸镁1 g/L。
补料培养基：50 %葡萄糖。
1、菌株活化
将重组工程菌株按照1：1000比例接种至活化培养基，36.0℃，200 rpm，培养20 h，OD600达到4.0 ~ 8.0，获得活化种子液。
2、发酵：
将种子液接种100L或200L发酵罐，按照1:10或1:20比例接种，按表2参数控制发酵过程，当溶氧不能维持时，可通过调整搅拌、压缩空气、罐压、纯氧进行调解，以保证发酵过程中溶氧的稳定。当初始培养基底糖耗尽之后，开始流加补料培养基至OD600=80 ~ 120。
表2：培养过程控制参数
Figure 56011DEST_PATH_IMAGE002
3、诱导：
加入终浓度1 mmol/L IPTG，诱导培养12 h，按表3参数控制诱导过程，放罐，离心收集菌体，利拉鲁肽前体以包涵体形式存在于菌体中，利拉鲁肽前体表达水平可稳定维持在12 g/L以上。
表3：诱导过程控制参数
Figure DEST_PATH_IMAGE003
实施例3：利拉鲁肽纯化制备
1、均质离心
将发酵菌体按照1g使用10 mL纯化水的比例复溶，搅拌均匀后过滤，并高压均质三次，均质样品离心收集包涵体并冻存过夜。
2、包涵体溶解
使用50 mmol/L甘氨酸按15 g/L比例进行包涵体溶解，溶解后使用4 mol/L氢氧化钠调节pH至10.6，搅拌3小时，得包涵体溶解液。
3、10KD中空纤维过滤
纯化水冲洗中空纤维系统至中性，将包涵体溶解液使用纯化水稀释一倍进行10KD中空纤维过滤，浓缩至包涵体溶解体积的1/7.5时加入剩余样品等体积的20 mmol/L的Tris溶液进行洗滤，洗滤8次收集透出液。
4、超滤
将10KD中空纤维透出样品进行3KD超滤，浓缩至包涵体溶解体积的1/7.5时加入剩余样品等体积的溶液A（20 mmol/LTris + 0.4%Triton）进行洗滤，洗滤8次收集循环液。
5、酶切
将超滤样品使用溶液A（20 mmol/LTris + 0.4%Triton）稀释至浓度2 ~ 5 g/L，使用氢氧化钠调节样品至pH值为8.1，取样检测蛋白浓度。以样品中蛋白计算，按照每克蛋白添加1.5 g本发明的重组肠激酶EKLm3添加酶，搅拌，并在22℃，酶切20 h。
6、SP离子交换层析
酶切样品用盐酸调节pH值至2.75，以不高于3 L/min的流速按照17.5 mg/mL载量开始上样，进行离子交换层析，获得层析样品。
按照本申请实施例1 ~ 3的方法构制备利拉鲁肽多肽若干批，部分批次得到实验数据如表4所示：
表4
Figure 441993DEST_PATH_IMAGE004
实施例4：重组EK酶及其工程菌制备
为了获得改善的蛋白的体外复性效率，提高蛋白本申的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升，发明人设计了一种牛肠激酶轻链突变体，其相比现有商业化酶具备更优的酶活，且活性蛋白收率提高4倍以上。具体可以参见在先专利申请CN202210697582.8，其中部分实施例和数据如本实施例所示。
突变的具体实例为：
（1）突变体EKLm1（商业化EK酶,雅心）：
鉴于野生型牛肠激酶在变复性过程中稳定性差、复性率低、不利于纯化，故目前商业化EK酶是将轻链中与重链连接的第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，以提高复性率。突变体EKLm1的氨基酸序列见SEQ ID NO:1。
（2）突变体EKLm3：
结合序列的保守型及三维空间结构分析，在牛肠激酶轻链氨基酸序列的第101位引入脯氨酸残基，预期以减少变性过程中聚集体的产生，第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，以提高复性率，在第101位氨基酸突变为脯氨酸、第177位氨基酸突变为赖氨酸。突变体EKLm3的氨基酸序列见SEQ ID No.2。
分别构建合成表达EKLm1和EKLm3重组融合蛋白的重组表达框，表达EKLm1的重组表达框序列如SEQ ID No.3所示，表达EKLm3的重组表达框序列如SEQ ID No.4所示。
将上述构建的表达框序列分别插入到表达载体pET-30a（+）的NdeI和XhoI酶切位点之间，从而构建得到重组表达载体，测序验证后，并将上述重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）中，经过抗性筛选单克隆，挑取该阳性克隆接种到含有相关抗性的液体培养基中，37℃、220 rpm振荡培养至OD600=1 ~ 1.5，菌液在生物安全柜内加入50%甘油（菌液：50%甘油= 2：1），即每个2 mL的无菌冻存管中加菌液600 μL和50%甘油300 μL，在离心管内混合均匀（每个克隆至少保存10管），-80℃保存。经测序，得到的工程菌中的序列与所设计的序列一致。基因合成及测序服务业务均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
在相同的发酵和纯化方法得到复性的EKLm1和EKLm3，并对其分别进行检测。EKLm3活性高于EKLm1，提高约10%，但纯化并复性后的活性蛋白回收率却显著高于EKLm1，提高约4倍，具体结果如表5所示：
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE005
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 北京惠之衡生物科技有限公司
吉林惠升生物制药有限公司
<120> 表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
35 40 45
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
50 55 60
Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile
65 70 75 80
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Thr
100 105 110
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
145 150 155 160
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
225 230 235
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
35 40 45
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
50 55 60
Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile
65 70 75 80
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Glu Met Pro Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Thr
100 105 110
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
145 150 155 160
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
Lys Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
225 230 235
<210> 3
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg atgacgatga taaaattgtg 480
ggcggcagcg atagccgcga aggcgcgtgg ccgtgggtgg tggcgctgta ttttgatgat 540
cagcaagtgt gcggcgcgag cctggtgagc cgcgattggc tggtgagcgc ggcgcattgc 600
gtgtatggcc gcaacatgga accgagcaaa tggaaagcgg tgctgggcct gcacatggcg 660
agcaacctga cgagcccgca gattgaaacc cgcctgattg atcagattgt gattaacccg 720
cattataaca aacgccgcaa aaacaacgat attgcgatga tgcatctgga aatgaaagtg 780
aactataccg attatattca gccgattacc ctgccggaag aaaaccaagt gtttccgccg 840
ggccgcattt gcagcattgc gggctggggc gcgctgattt atcaaggcag caccgcggat 900
gtgctgcaag aagcggatgt gccgctgctg agcaacgaaa aatgtcagca acagatgccg 960
gaatataaca ttaccgaaaa catggtgtgc gcgggctatg aagcgggcgg cgtggatagc 1020
tgccaaggcg atagcggcgg cccgctgatg tgccaagaaa acaaccgctg gctgctggcg 1080
ggcgtgacga gctttggcta tcagtgcgcg ctgccgaacc gcccgggcgt gtatgcgcgc 1140
gtgccgcgct ttaccgaatg gattcagagc tttctgcat 1179
<210> 4
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg atgacgatga taaaattgtg 480
ggcggcagcg atagccgcga aggcgcgtgg ccgtgggtgg tggcgctgta ttttgatgat 540
cagcaagtgt gcggcgcgag cctggtgagc cgcgattggc tggtgagcgc ggcgcattgc 600
gtgtatggcc gcaacatgga accgagcaaa tggaaagcgg tgctgggcct gcatatggcg 660
agcaacctga cgagcccgca gattgaaacc cgcctgattg atcagattgt gattaacccg 720
cattataaca aacgccgcaa aaacaacgat attgcgatga tgcatctgga aatgccggtg 780
aactataccg attatattca gccgattacc ctgccggaag aaaaccaagt gtttccgccg 840
ggccgcattt gcagcattgc gggctggggc gcgctgattt atcaaggcag caccgcggat 900
gtgctgcaag aagcggatgt gccgctgctg agcaacgaaa aatgtcagca acagatgccg 960
gaatataaca ttaccgaaaa catggtgtgc gcgggctatg aaaaaggcgg cgtggatagc 1020
tgccaaggcg atagcggcgg cccgctgatg tgccaagaaa acaaccgctg gctgctggcg 1080
ggcgtgacga gctttggcta tcagtgcgcg ctgccgaacc gcccgggcgt gtatgcgcgc 1140
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<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Asp Asp Asp Asp Lys His Ala
1 5 10 15
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
20 25 30
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
35 40 45
<210> 6
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgttcaaat tcgaattcaa attcgaagac gacgacgaca aacacgctga aggtaccttc 60
acctctgacg tttcttctta cctggaaggt caggctgcta aagaattcat cgcttggctg 120
gttcgtggtc gtggt 135

Claims (10)

1.一种表达利拉鲁肽前体的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌的按照如下方法制备：
（1）合成表达利拉鲁肽前体的表达框序列，所述利拉鲁肽前体的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示；
（2）将步骤（1）中的表达框序列插入表达质粒，构建得到重组表达载体；
（3）将所述重组表达载体导入到大肠杆菌中，得到表达利拉鲁肽前体的重组工程菌。
2.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述表达框序列如SEQ ID NO:6所示。
3.一种利拉鲁肽多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括如下步骤：
（1）将权利要求1或2所述的重组工程菌进行发酵，收集获得发酵菌体；
（2）从发酵菌体中收集包含利拉鲁肽前体的包涵体，并处理所述包涵体，获得利拉鲁肽前体的溶液；
（3）所述利拉鲁肽前体的溶液经酶切、纯化获得利拉鲁肽多肽；其中，所述酶切使用SEQID No.2所示的突变EK酶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述发酵包括如下步骤：
S11、将表达利拉鲁肽前体的重组工程菌活化，得到活化种子培养液；
S12、将所述活化种子培养液接种至发酵培养基进行发酵培养，在发酵过程中流加补料培养基；所述补料培养基为：质量百分比浓度为40% ~ 60%的葡萄糖；
S13、当OD 600值为80 ~ 120时，添加IPTG诱导利拉鲁肽前体的表达，至OD600值出现平台期发酵结束，离心收集菌体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
在S11中，将所述表达利拉鲁肽前体的重组工程菌按照1：500 ~ 1：2000比例接种至活化培养基，30 ~ 37℃、150 ~ 250 rpm条件下，培养14 ~ 24小时，至OD600达到4.0 ~ 8.0，获得活化种子培养液；
在S12中，将所述活化种子培养液按照1：10 ~ 1：20的体积比接种至发酵培养基；发酵的条件为：温度36 ~ 38℃，pH值为6.8 ~ 7.2，转速300 ~ 600 rpm；并通过调整空气、氧气通气量和转速，控制溶氧为20% ~ 30%；底糖耗尽之后，开始流加补料培养基；
在S13中，IPTG终浓度为0.1 ~ 2.0 mmol/L，诱导条件为：温度26 ~ 32℃，pH值为6.8~7.5，转速540 ~ 660 rpm，溶氧为20% ~ 30%，诱导培养8 ~ 16小时。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨5~ 20 g/L，酵母浸粉2 ~ 6 g/L，氯化钠5 ~ 12 g/L；所述发酵培养基的配方为：酵母抽提粉10 ~ 18 g/L、枸橼酸0.7 ~ 2.7 g/L、硫酸铵3 ~ 9 g/L、磷酸二氢钾5.6 ~ 11.2 g/L、氯化钙0.001 ~ 0.004 g/L、硫酸亚铁0.05 ~ 0.2 g/L、葡萄糖3 ~ 10g/L、硫酸镁0.5 ~ 1.5g/L。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）包括：
S21、将收集的发酵菌体复溶后均质、离心，收集包涵体；
S22、使用甘氨酸溶液溶解所述包涵体，得到包涵体溶解液；
S23、所述包涵体溶解液经中空纤维过滤、超滤，得到利拉鲁肽前体超滤液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
在S21中，将收集的发酵菌体按照每1g使用5 ~ 20 mL纯化水的比例复溶，并过滤、高压均质、离心，收集包涵体；
在S22中，将所述包涵体按10 ~ 20 g/L比例使用40 ~ 60 mmol/L的甘氨酸溶液溶解，调节pH值为10.2-10.8，搅拌2 ~ 4小时，得所述包涵体溶解液；
在S23中，先将所述包涵体溶解液稀释，然后使用10 KD中空纤维过滤，浓缩至所述包涵体溶解液体积的1/5 ~ 1/10时加入洗涤液I洗滤5 ~ 10次，收集透出液；将所述透出液采用3KD的超滤管进行超滤，浓缩至包涵体溶解体积的1/5 ~ 1/10时加入洗涤液II洗滤5 ~ 10次，收集循环液用于酶切；
所述洗涤液I为20 mmol/L的Tris溶液；所述洗涤液II组成为：0.4%（W/V）Triton，20mmol/L Tris。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述酶切的方法包括：使用洗涤液II调整所述利拉鲁肽前体超滤液的浓度至2 ~ 5 g/L，调节pH值为7.5 ~ 8.5，每克利拉鲁肽前体添加所述突变EK酶1 ~ 2 g；20 ~ 24℃酶切16 ~ 24小时，获得到酶切液；所述洗涤液II组成为：0.4%（W/V）Triton，20 mmol/L Tris。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述纯化的方法包括：对所述酶切液采用SP离子交换柱进行离子交换层析，所述酶切液的pH值为2.5 ~ 3.0，以0.1 ~ 3 L/min的流速、15 ~ 20 mg/mL载量上样。
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