KR20030074832A - 하나 이상의 관심있는 폴리펩티드의 분비 형태의 생산 및유사한 개량의 과정에서 과분비될 수 있는 펩티드의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, Z1Z2서열을 통해서 두 번째 단백질에 연결되고 이것이 다시 Z1Z2서열을 통해서 Y에 상응하거나 또는 Y와 상이할 수 있는 Y1단백질에 연결되어 Y 및/또는 Ym의 분비율을 향상시키는 수송 펩티드를 암호화하는, 하기식의 발현 카세트 (expression cassette), 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
PX-SX-Bn-(ZR)-수송 펩티드-(Z1Z2)-단백질(Y)-(Z1Z2)-단백질(Ym)-T
상기식에서,
PX는 관심있는 단백질의 최적의 수율을 획득할 수 있는 방법으로 선택된 임의의 프로모터 DNA서열이고; SX는, 최적 수율을 허용하는 임의의 시그날 또는 리더 서열에 상응하게 암호화하는 임의의 DNA이며; Bn은 유전적으로 암호화할 수 있는 1 내지 15 개의 아미노산 또는 화학 결합이고; Z는 Lys과 Arg을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 코돈이며; Z1는 Lys과 Arg을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 코돈이고; Z2는 Lys과 Arg을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 코돈이고; 단백질 Ym은 효모에 의해서 생산되고 분비될 수 있는 임의의 단백질을 암호화하는 DNA서열(m = 1 내지 5) 또는 화학 결합(m = 0)이며; R은 Arg 코돈이고; 수송 펩티드는 효율적으로 수송될 수 있고 막을 통과할 수 있는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열이며; 단백질 Y는 효모에 의해서 생산되고 분비되며, Ym이 화학 결합이 아닌 경우, 그 생물학적 활성이 염기성의 디펩티드의 연장으로 손상되지 않거나 또는 카르복시펩티다제에 의해 연장부분의 분해를 허용하는 임의의 단백질을 암호화하는 DNA 서열이며; T는 발현에 유리하게 해독되지 않는 DNA 서열이다.
Description
경제적인 생활력의 관점에서, 약제학적으로 관련된 단백질의 생산에 대한 방법은 최고로 가능한 순도의 생물학적으로 활성있는 생산물로 이끌어야만 한다. 효모에서 이런 관련 단백질의 발현은 여기서 널리 사용된다. 인슐린, GM-CSF (LeukineR) 및 히루딘(레플루단R: RefludanR)과 같은 단백질의 생산은 효모에서 특정 단백질 또는 이의 전구물질의 합성에 기초를 둔 유전공학 과정의 성공적인 발전의 예시이다. 일반적으로, 효모는 한젠눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)[참고 문헌 : Weydemann et al., Appl. Microbiol Biothechnol. 44:337-385, 1995] 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)[참고 문헌 : Rosenfeld et al., Protein Expr. Purif:4, 476-82, 1996]을 이용할 때 그램 단위의 좋은 수율로 특정하게 히루딘을 직접적으로 생산할 수 있다.
EP-A 0 324 712는 N-말단 아미노산이 류신인 히루딘 유도체(RefludanR) 및 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 Y79에서 이의 구조적발현을 기술하고 있다. EP-A 0 347 781은 소형 프로인슐린(mini-proinsulin) 및, 실시예를 통해서, 제빵용 효모에서의 이의 발현을 기술하고 있다. 레플루단R과 인슐린은 두 개의 분리된 발현기작을 수행하여 생산된다.
놀랍게도, 본 발명자들은 현재, 히루딘 유도체와 소형 프로인슐린 유도체가 분비 시그날로서 효모에 의해서 인지되는 시그날 또는 리더 서열을 염기성 디펩티드, 바람직하게는 Lys-Arg을 통해서 전구 물질 단백질에 융합시키고 마찬가지로 N 말단 히루딘 유도체와 소형 프로인슐린 유도체 사이에 효모 엔도프로테아제에 의해 인지되는 절단 부위를 도입함으로써, 공통의 전구물질 단백질로부터 획득될 수 있음을 발견하였다. 여기서 역시, 염기성 디펩티드, 예를 들면 Lys-Arg이 선호된다. 발현 후, Lys-Arg에 의해 연장된 히루딘 유도체 및 인슐린 B 쇄의 첫 번째 아미노산으로 시작되는 소형 프로인슐린은 상층액에서 발견된다. 놀랍게도, 소형 프로인슐린의 수율은 소형 프로인슐린 발현의 직접적인 시그날로 이룰 수 있는 수율과 비교하여 현저하게 개량된 반면, 히루딘 유도체의 수율은 거의 동일하게 남아있다. 놀랍게도, 히루딘은 이렇게 소형 프로인슐린의 수율의 측면에서 인핸서 펩티드의 일종으로 작용한다.
인핸서 단백질로 작용할 수 있는 펩티드는 일반적으로 비교적 작고, 예를 들어 선조직(glandular tissue)으로부터 짧은 기간동안 천연적으로 많은 양이 분비된다. 예를 들어 뱀독 또는 에글린 C(eglin C) 또는 TAP(진드기 항응고 펩티드)를 포함하는 이 유형의 펩티드는 극도로 좋은 외부수송 적합성을 특징으로 한다. 본 발명은 역시 이런 단백질에 관한 것이다.
다른 이점은 이미 약제에서 사용되는 히루딘과 비교하여 동등하거나 더 나은 약제학적 특성을 가진 히루딘 유도체로부터 기인한다. 이 경우, 이로부터 동일한 발효 하에 둘 이상의 약제물을 생산하는 것이 가능할 수 있다. 결과적으로 보다 작은 발효 용량이 요구된다. 이는 생산 비용에 전적으로 유용하다.
그러나, 복수의 생산물의 생산은 선택적이다. 예를 들면, 레플루단의 필요량은 인슐린의 필요량보다 적고, 이는 약제학적으로 관심있는 물질중의 하나를 포기하는 방법으로 귀착될 수 있다.
수율을 개선시키기 위해서, EP-A 0 200 655의 특허 출원에서 제시한 것처럼, 시그날 또는 리더 서열의 링커로서, 히루딘 유도체 앞에 N-말단상으로 Lys-Arg을 통해 짧은 펩티드 서열이 위치하는 것이 가능하다. 또한 시그날 또는 리더 서열의 선택이 관심있는 단백질의 수율에 직접적으로 영향을 준다는 것은 당업자에게 명백하다. 이런 서열의 선택은 추가적인 최적화의 주제이다. 발현 카세트의 3' 말단에 위치한 서열은 역시, mRNA 안정성에 영향을 줌으로써 수율에 직접적인 영향을 준다. 여기서 또, 언급된 서열은 관심있는 각각의 단백질 이 발현될 수 있도록 최적화될 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다. 또한 이는 유도적이거나 구성적으로 활성이 있을 수 있는 적절한 프로모터의 선택에 대해서도 마찬가지이다. 벡터 시스템과 숙주 시스템의 선택은 수율에 동등하게 중요하다. 따라서, 실시예의 방법에서 사용되는 제빵용 효모대신에, 각 경우에서 다른 생리 기능을 최적화시킨 벡터 또는 발현 카세트와 함께 피치아 파스토리스, 한젠눌라 폴리모르파 또는 케이 락티스(K.lactis)를 사용하는 것도 가능하다.
배지로 분비를 허용하는 방법의 또 다른 이점은 관심있는 단백질의 더 간단한 단백질-화학적 후처리이다. 놀랍게도, 본 발명자들에 의해, 소형 프로인슐린은 분자량 10kDa 이상인 분자에 대해 배출 한계가 있는 막을 통한 여과를 통하여 히루딘의 존재하에서 농축될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 분자는 농축액에서 거의 독점적으로 발견되었다. 신규한 분리 기술의 발달과 공정 단계의 새로운 조합으로 항상 정제 방법을 개선시킬 수 있다는 것은 당업자에게는 명백하다. 이는 수율에 직접적인 혜택을 주어서 생산 비용에도 도움이 된다.
그러므로 본 발명은,
Z1Z2서열을 통해서 두 번째 단백질에 연결되고 이것이 다시 Z1Z2서열을 통해서 Y에 상응하거나 또는 Y와 상이할 수 있는 Y1단백질에 연결되어 Y 및/또는 Ym의 분비율을 향상시키는 수송 펩티드를 암호화하는, 하기식의 형태의 DNA 분자(다른 용어 : 발현 카세트)에 관한 것이다 :
PX-SX-Bn-(ZR)-수송 펩티드-(Z1Z2)-단백질(Y)-(Z1Z2)-단백질(Ym)-T
상기식에서,
PX는 관심있는 단백질의 최적의 수율을 획득할 수 있는 방법으로 선택된 임의의 프로모터 DNA 서열이고;
SX는, 최적 수율을 허용하는 임의의 시그날 또는 리더 서열을 상응하게 암호화하는 임의의 DNA이며;
Bn은 유전적으로 암호화할 수 있는 1 내지 15 개의 아미노산 또는 화학 결합이고;
Z는 Lys과 Arg을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 코돈이며;
Z1는 Lys과 Arg을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 코돈이고;
Z2는 Lys과 Arg을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 코돈이고;
단백질 Ym은 효모에 의해서 생산되고 분비될 수 있는 임의의 단백질을 암호화하는 DNA서열(m = 1 내지 5) 또는 화학 결합(m = 0)이며;
R은 Arg 코돈이고;
수송 펩티드는 효율적으로 수송될 수 있고 막을 통과할 수 있는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열이며;
단백질 Y는 효모에 의해서 생산되고 분비되며, Ym이 화학 결합이 아닌 경우, 그 생물학적 활성이 염기성의 디펩티드의 연장으로 손상되지 않거나 또는 카르복시펩티다제에 의해 연장부분의 분해를 허용하는 임의의 단백질을 암호화하는 DNA 서열이며;
T는 발현에 유리하게 해독되지 않는 DNA 서열이다.
본 발명의 다른 양태는 상기 DNA 분자에 의해서 암호화되는 융합 단백질이다.
본 발명의 또다른 양태는 상기 DNA 분자를 포함하는 다중복제 벡터 및 플라스미드이다.
본 발명의 부가적 양태는 상기 DNA 분자, 또는 상기 다중복제 벡터 또는 상기 플라스미드를 염색체의 일부, 소형 염색체의 일부, 또는 염색체 외로 포함하는 숙주 세포이고, 바람직하게는 상기 숙주 세포가 효모이고, 특히, 에스. 세레비지애, 케이. 락티스, 에이치. 폴리모르파 및 피. 파스토리스로 구성되는 그룹에서 선택된다.
본 발명의 또다른 양태는
(a) 상기 DNA 분자, 상기 다중복제 벡터, 또는 상기 플라스미드를 상기 숙주 세포에서 발현시키는 단계; 및
(b) 발현된 단백질을 세포 배양의 상층액으로부터 분리하는 단계를 포함하는 상기 단백질을 발효하는 방법으로,
바람직하게는 발효과정 완료 후, 원하지 않는 단백질을 침전시키기 위해서 pH를 2.5 - 3.5로 조정하고 발현된 단백질을 침전물의 상층액에서 분리한다.
본 발명의 또다른 양태는 발효 상층액을 숙주 세포로부터 분리한 후, 숙주 세포를 새로운 배지에서 반복적으로 배양하고, 방출된 융합 단백질을 배양기간 동안 수득된 각각의 상층액으로부터 분리하는 방법을 포함하는 상기의 방법이다.
본 발명의 다른 양태는 침전 후 상층액에서 발현된 단백질의 농축을 위한 단계가 미세여과, 소수성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 그룹에서 선택하는 상기의 방법이다.
본 발명의 부가적인 양태는
(a) 프로인슐린을 상기의 방법에서 상기의 발현 카세트의 단백질 (Y)로 발현시키는 단계;
(b) (a)단계에서의 프로인슐린을 분리하고, 트립신 및 카르복시펩티다제 B로 처리하는 단계; 및
(c) 인슐린을 (b)단계의 반응 혼합물로부터 분리하는 단계를 포함하는, 인슐린의 제조에 관한 방법으로, 특히 이 때, 수송 펩티드는 (a) 또는 (b)단계 후 파괴되거나 생물학적으로 불활성화되는 히루딘 또는 히루딘 유도체이다.
본 발명의 더 바람직한 양태는 C-말단 끝에 두 개의 염기성 아미노산 잔기를 가진 히루딘 유도체인 단백질이다.
예를 들면, 히루도(Hirudo)형의 거머리는 트롬빈 억제제 히루딘의 다양한 동종형(isoform)을 발달시켰다. 히루딘은, 예를 들면 N-말단 아미노산의 교환(예로 EP 0 324 712)과 같은, 분자의 인위적 변이로 약제학적인 필요에 대해 최적화되었다. 당해 발명은 히루딘의 변이체 및 히루딘의 사용을 포함한다. 본 발명의 특별한 양태는 천연의 히루딘 동종형(천연적인 동종형은 모두 "히루딘"으로 표기된다)중의 하나를 이용한다. 천연적인 동종형은, 예를 들면, Val-Val-히루딘 또는 Ile-Thr-히루딘이다. 본 발명의 다른 양태는 천연적인 히루딘 동종형의 변이체를 사용한다. 변이체는 천연적인 히루딘 동종형에서 유래되었으나, 예를 들면, 천연적인 동종형과 비교하여 부가적인 아미노산 및/또는 아미노산 결실 및/또는 아미노산 교환을 포함한다. 히루딘 변이체는 천연적인 히루딘 동종형의 교대하는 펩티드 단편 및 새로운 아미노산을 포함한다. 히루딘 변이체는 예를 들면, DE 3 430 556에서 알려지고 기술되었다. 히루딘 변이체는 단백질[참고 문헌 : 칼바이오켐 바이오케미컬즈(Calbiochem Biochemicals), cat. no. 377-859, -950, -960]의 형태로 상업적으로 이용가능하다. "히루딘 유도체"란 용어는 천연적인 히루딘과 적어도 40% 상동성인 서열을 표기한다.
발현 카세트는 바람직하게 에스. 세레비지애, 케이. 락티스, 에이치. 폴리모르파 또는 피. 파스토리스와 같은 효모에 도입된다. 언급한 발현 카세트는 특정한 효모 게놈(genome)으로 안정하게 통합된 하나 이상의 복제물을 가질 수 있거나 또는 염색체외적으로 다중복제 벡터로 존재할 수 있다. 이 기술이 역시 동물 세포 배양 또는 식물 세포와 같은 다른 계통에서도 적용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다. 이는 역시 당해 발명의 주제이다.
발현 시스템은 실시예로써 제시되는 하기에 기술되었다. 발현 카세트를 언급된 선택된 계통에 도입하기 위해서, 적절하게 재조합된 DNA 작제물은 선택된 숙주 계통의 유형에 좌우되도록 해야 한다. 따라서, 산업적 발효는 선택된 숙주/벡터 시스템에 관하여 최대한 활용될 수 있다. 따라서, 실시예는 비제한적이다.
실시예 1 : 히루딘(레플루단)-Lys-Arg-소형 프로인슐린을 암호화하는 효모의 발현 플라스미드의 작제
시작 물질은 플라스미드 pK152(PCT/EP00/08537), pSW3(EP-A 0 347 781) 및 소의 인터류킨 2[참조문헌 : Price et al. Gene 55, 1987]을 암호화하는 재조합된 효모 플라스미드 유도체이다. 효모 플라스미드는 효모 ADH2 프로모터의 조절하에서 α인자 리더 서열을 가지고 있는 것이 특징이다. 이 서열 뒤로, Kpnl 제한 효소 인지 부위를 통해서 연결되고, 조작 후, 벡터에 유일한 해독되지 않는 3' 말단에 Ncol 제한 효소 인지 부위를 포함하는 소의 인터류킨 2 cDNA 서열이 위치한다. 따라서, cDNA 서열은 Kpnl/Ncol 절단을 통해서 즉시 플라스미드로부터 제거될 수 있다. 좋은 발현 수율이 보고된 이후로, 잔존하는 3' 인터류킨 2 서열(T로서)은 mRNA를 안정화시키는 효과를 가지고 따라서 제거되거나 효모 터미네이터 서열에 의해 대체될 필요가 없다는 것을 추측할 수 있다. 플라스미드 pK152는 Lue-히루딘(레플루단)을 암호화하는 DNA 서열을 운반하고 플라스미드 pSW3은 소형 프로인슐린에 대한 DNA 서열을 운반한다. 히루딘-LysArg-소형 프로인슐린을 암호화시키는 유전자 서열을 먼저 PCR 기술의 수단으로 제조한다. 이 목적을 위해, 4개의 프라이머는 ExpediteTmDNA 합성 시스템의 원조로 제조한다.
ⅰ. hir_insfkr (서열번호 1, 암호화된 단백질 절편 : 서열번호 2)
I P E E Y L Q K R F V N Q H L C
5'-ATCCCTGAGGAATACCTTCAGAAGCGATTTGTTAACCAACACTTGTGTGG-3'
59 60 61 62 63 64 65 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7
ⅱ. hir_insrevkr (서열번호 3)
5'-CCTCACAAGTG TTGGTTAACA AATCGCTTCT GAAGGTATTC CTCAGGGAT-3'
ⅲ. hirf1 (서열번호 4, 암호화된 단백질 절편 : 서열 번호 5)
L T Y T D C
5'-TTTTTTTGGATCCTTTGGATAAAAGACTTACGTATACTGACTGCAC
ⅳ. insnco1rev (서열번호 6)
5'- TTTTTTCCAT GGGTCGACTATCAG
프라이머 hir_insfkr는 히루딘의 말단 아미노산(59-65)와 Lys-Arg 링커를 통한 인슐린 서열 B1-B7에 대한 코돈 사이의 접합부를 기술한다. 프라이머 hir_insrevkr은 이에 대해 100% 상보적이다. 프라이머 hirf1는 EP-A 0 324 712에서 기술된 것처럼 Kpnl 절단 부위까지 연장된 히루딘 유전자의 시작부위를 암호화한다. 프라이머 insncoirev는 EP-A 0 347 781에 따라 합성된 소형 프로인슐린의 3'말단을 나타낸다. 두 개의 표준적인 중합효소 연쇄 반응을 주형으로서 플라스미드 pK152의 DNA에 대해 hirf1/hir_insrevkr와 주형으로서 플라스미드 pSW3의 DNA에 대한 hir_insfkr/insncoirev인 프라이머 쌍을 사용하여 수행한다. 반응은, 각 경우에, 프라이머 200 nmol, 중합효소 1 ㎕ 및 벡터 100 ng과 함께 PCR 완충액 100㎕에서 수행된다. 1단계는 95℃에서 2분의 항온처리를 한다. 그리고나서 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초 의 25회전이 뒤따른다. 마지막 회전은 3분 동안 72℃에서 항온처리로 이어지고, 반응은 그 직후에 정지한다.
프라이머 hir_insrevkr와 hir_insfkr는 100% 상보적이기 때문에, 두 생산물의 DNA 생성물은 언급된 서열을 따라서 중복되어서 세 번째 반응에서, 주형으로서 첫 번째의 두 반응의 생성물과 프라이머 hirf1과 inscoirev을 사용하여, DNA 단편을 형성하고, 이는 Lys-Arg으로 분리되는 히루딘과 소형 프로인슐린을 암호화한다. PCR 단편은 Kpnl 과 Ncol 효소에 의해서 분해되고 난 후, T4 리가아제 반응에서, Kpnl/Ncol에 의해 벌어진 pαADH2 벡터로 삽입된다. 그리고나서 EP-A 0 347 781의 실시예 7과 유사하게, 수용적격의 이 콜라이 균주 MM294 세포는 연결 혼합물로 형질 전환된다. 그런 후 플라스미드 DNA는 DNA 서열 분석의 수단으로 특성연구를 위해 두 개의 클론(clone)으로 분리된다. 언급한 실시예에 따르면, 삽입된 DNA 서열의 확인 후, 플라스미드 제조용 DNA는 제빵용 효모 균주 Y79의 세포를 형질전환시키는데 사용된다. 그러나, 언급한 실시예와는 반대로, pαADH2 벡터를 사용시, 벡터의 도입 후 trp1-1 돌연변이의 보충을 위한 선택이 뒤따른다. 다른 대조군에서, 플라스미드 DNA는 효모 형질전환체로부터 재분리되어서 제한 효소 분석으로 분석된다. 작제된 발현 벡터는 pADH2Hir_KR_Ins로 표시된다. 발현은 실시예 4에 따라서 수행된다.
실시예 2 : 히루딘(레플루단)-Lys-Arg-인슐린 B 쇄-Lys-Arg-인슐린 A 쇄를 암호화하는 효모 발현 플라스미드의 작제
EP-A 0 195 691 특허 명세서는 디펩티드 XY를 포함하는 프로인슐린 유도체를기술하는데, 여기서 인슐린의 B 및 A 쇄 사이의 링커로서, X 및 Y 각각은 Lys 또는 Arg 어느 하나에 대응된다. 다음의 실시예는 이 종류의 프로인슐린 유도체의 발현 벡터의 제조를 기술한다. B 쇄-Lys-Arg-A 쇄 형태의 프로인슐린 유도체를 암호화하는 DNA 서열은 실시예의 방식으로 선택되고, 그에 따라서 합성된다.
유전자 절편의 합성은 실시예 1에 따라 수행된다. 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 hirf1 및 insncoirev이다. 올리고뉴클레오티드 B_KR_Af1 및 B_KR_Arev1은 새로이 합성된다.
B_KR_Af1는 5'- CTTCTACACTCCAAAGACGAAACGCGGTATCG-3'의 서열 (서열번호 7)을 갖고 B_KR_Arev1는 5'- CAACATTGTTCAACGATACCGCGTTTCGTCTTT-3'의 서열 (서열번호 8)을 갖는다.
두 프라이머의 진하게 보여지는 부분은 부분적으로 중복되는 서열을 나타낸다. 양 프라이머 쌍은 6개의 밑줄쳐진 뉴클레오티드로부터 떨어져서, EP-A 0 347 781의 소형 프로인슐린 유전자의 서열에 정확하게 짝을 이룬다. 밑줄 쳐진 부분은 Lys과 Arg 코돈에 대응한다. 실시예 1에 따라서 작제된 플라스미드 pADH2Hir_KR_Ins의 DNA는 PCR에서 주형으로 작용한다.
실시예 1에서 기술한 것처럼, 두 중합효소 연쇄 반응은 프라이머 쌍 hirf1/B_KR_Arev 및 insncoirev/B_KR_Af1를 사용하여 수행한다. 각 경우의 주형은 실시예 1에서 작제된 플라스미드 pADH2Hir_KR_Ins의 DNA이다. 양 반응의 생성물은 프라이머 쌍 hirf1 및 insnco 1을 사용하여 세 번째 PCR에서 주형으로 작용한다. PCR 3으로부터의 반응 생성물은 Ncol/Sall로 절단되어 벌어진 pαADH2 벡터에 삽입된다. 서열 및 제한효소 분석 후, 정확한 플라스미드는 pADHHirKR_B_KR_A로 언급된다.
실시예 3 : 히루딘-Lys-Arg-원숭이의 프로인슐린을 암호화하는 효모 플라스미드의 작제
EP-A 489 780 특허 명세서는 원숭이의 프로인슐린[참고문헌 : Wetekam et al., Gene 19, p.179-183, 1982]의 cDNA를 포함하는 플라스미드, pINT90d를 기술한다. 언급한 플라스미드의 DNA 및 플라스미드 pK152의 DNA가 주형으로 작용한다. 실시예 1에서 기술된 프라이머 hirf1이 사용되고 세 개의 프라이머가 더 합성된다.
프라이머 insncorev는 pINT90d로 클로닝된 인슐린 유전자의 3' 부위에 역방향으로 결합하고 5' - TTTTTTCCATGGTCATGTTTGACAGCTTATCAT - 3' (서열번호 9)을 갖는다.
밑줄친 서열은 제한 효소 Ncol에 대한 인지 부위를 나타낸다.
프라이머 hir_insfkr은 5' - ATCCCTGAGG AATACCTTCA GAAGCGATTT GTGAACCAGC ACCTGTGCGG C -3' (서열번호 10)의 서열을 갖는다.
여기서, 진하게 보이는 부분의 뉴클레오티드는 히루딘과 프로인슐린 사이의 Lys-Arg 링커를 나타낸다.
프라이머 hir_insrevkr은 프라이머 hir_inskr과 완벽하게 상보적이고
5' - GCCGCACAGG TGCTGGTTCA CAAATCGCTTCTGAAGGTAT TCCTCAGGGA T-3' (서열번호11)의 서열을 갖는다.
실시예 1에 따르면, 두 개의 중합효소 연쇄 반응을 수행한다. 프라이머 쌍 hirf1/hir_insrevkr은 플라스미드 pK152의 DNA와 반응하고 프라이머 쌍 hir_insfkr/insncorev는 플라스미드 pINT91d의 DNA와 반응한다. 실시예 1에서 기술된 것처럼, 양쪽 반응의 생성물은 프라이머 쌍 hirf1/insncorev를 사용하여 세 번째 PCR에서 주형으로 작용한다. 이 반응의 DNA 생성물은 히루딘-Lys-Arg-프로인슐린에 대한 서열을 포함한다. 연속적으로 이는 효소 Ncol 및 Kpnl으로 절단하고, 실시예 1에 따라서, 플라스미드 pαADH2안으로 삽입한다. 따라서, 어떠한 천연적 프로인슐린 유도체에 대한 발현 벡터도 작제될 수 있다.
실시예 4 : 재조합 생성물의 발현
발현은 두 단계로 나누어진다. 첫째로, 사전배양은 효모 최소 배지에서 배양한다. 배지는 1 l당 다음의 조성을 갖는다 :
6.7 g - 효모 질소 기재 (아미노산 없이)
5.0 g - 카사미노산 (비타민 없이)
0.008 % - 아데닌
0.008 % - 우라실
2 % - 글루코스
주배양 또는 발현 배양을 사전배양의 분취량으로 접종한다.
주배양 배지는 리터 당 하기를 함유한다 :
10 g - 효모 추출물
20 g - 펩톤
0.008 % - 아데닌
0.008 % - 우라실
4 % - 글루코스
기술된 배지를 사용하여서, 발현은 다음 방식으로 진탕 플라스크에서 수행한다 : 밤새 배양한 사전배양물 0.3 ml는 예열한 배지 80 ml로 희석하고, 대략 24시간 동안 30℃에서 강한 진탕으로 항온처리한다. 각 경우에, 이 방식으로 생산된 배양물 1 ml을 흡광도(optical dencity)를 측정한 후, 원심분리하고, 세포를 제거한 후, 상층액을 동결건조하고 SDS-PAGE 수단으로 분석한다. 생물학적으로 활성있는 히루딘 양은 트롬빈 억제 검정을 수행하여 측정한다.
대안적 발효 실험 계획안은 세포를 여과 또는 신중한 원심분리로 제거하는 것을 제시한다. 배지로부터 관심있는 단백질을 분리하는 동안, 세포에 탄소원으로서 알콜 및 0.5 %이하의 글루코스가 함유된 새로이 예열된 주배양 배지를 공급하고, 따라서 발효는 중단없이 계속된다. 이 단계는 5회까지 반복할 수 있다.
실시예 5 : 트롬빈 억제 시험
히루딘 농도는 그리쓰 바흐 등[참고 : Grieβbach et al., Thrombosis Research 37, pp. 347-35, 1985]의 방법에 따라 측정된다. 이를 위해서, 수율을 mg/l로 직접 측정할 수 있는 보정 곡선을 확립하기 위해서, 레플루단 표준의 특정 양을 측정치에 포함시킨다.
실시예 6 : 피. 파스토리스 계통에서 히루딘-Lys-Arg-소형 프로인슐린 융합 단백질의 클로닝 및 발현
인비트로겐R(InvitrogenR)은 숙주 계통으로 피. 파스토리스를 사용하여 재조합 단백질을 제조하기 위한 클로닝 및 발현 키트를 판매한다. 이를 위해서, 목적하는 재조합 단백질의 생산을 위해서 피. 파스토리스 계통의 제조 및 이후의 발현에 관하여 자세한 기술적 실험 계획서를 제공하여서 목적하는 단백질을 암호화하는 발현 벡터의 작제만을 언급된 실험 계획서를 따를 때 기술해야만 한다. 이지셀렉트TM(EasySelectTM) 피치아 발현 키트(카타로그 no. K1740-01)가 사용된다.
pPICZαA 벡터는 키트의 구성물이다. 제한 효소 Xhol 및 Sacll로 벡터를 개환하는 것은, 실시예 1에서와 유사하게, 관심있는 단백질을 알파 인자 리더 서열에 부가하여 상층액으로 분비하는 것을 실험하는 것을 가능하게 한다. 클로닝은 두 개의 프라이머가 필요하다. 프라이머 pichia_H_If1 (서열번호 12)는
5' - TTTTTTTCTCGAGAAAAGA CTTACGTATACTGAC - 3'
Xhol Hir1Hir2 등.
의 서열을 갖는다.
프라이머 pichia_H_Irev2 (서열번호 13)는
5' - TTTTTGGCGCCGAATTCACTATTAGTTACAGTAGTTTTCC - 3'
SacⅡ EcoRⅠ A21
의 서열을 갖는다.
사용된 주형은 플라스미드 pADH2Hir_KR_Ins의 DNA이다. 쌍방의 프라이머를 가진 표준적인 PCR은 Xhol 및 Sacll 삽입 부위에 의해 연장된 히루딘-Lys-Arg-소형 프로인슐린 서열을 포함하는 DNA 생성물을 생산한다. 만일 DNA 생성물이 적절하게 절단되어 단편들이 분리된다면, 언급된 단편은 T4 DNA 리가아제 반응에서 개환된 벡터 DNA안으로 삽입할 수 있다. 제조사의 실험 계획서로부터 벗어나서, 실시예 1에서 기술된, 이 콜라이 균주 MM294는 연결 혼합물로 형질 전환되고, 재조합된 콜로니는 제오신 선별 플레이트에서 선별된다. 플라스미드 DNA는 클론으로부터 재분리된 후 제한 효소 및 DNA 서열 분석으로 특징지워진다. 그리고나서 이 방식으로 작제된 플라스미드를 사용하여, 펩티드의 생산에 사용되는 피. 파스토리스 발현 클론은, 제조사의 지시사항에 따라 제조된다.
실시예 7 : 소형 프로인슐린 및 히루딘의 정제
정제는 초기 단계에서 두 단백질의 분리를 필요로 한다. 발현의 완료 후, 분석적인 RP-HPLC의 수단으로 배지가 분석된다. 효모 세포의 자발적인 용해 또는 분비의 어느 한 편에 기인하는 상층액에서 발견되는 대부분의 다른 폴리펩티드와는 반대로, 두 단백질, 즉 히루딘과 소형 프로인슐린은 pH 2.5 - 3에서 침전되지 않는다. 그러므로 배양 배지는 적절하게 산성화되고 나서, 침전이 완료된 후, 침전물과 세포는 원심 분리로 제거된다. 원심 분리 후, 배지는 pH 3.5 - 7로 조정되고 히루딘과 소형 프로인슐린의 두 성분은, 예를 들면 디아이온(Diaion) HP20R물질로 채운 크로마토그래피 컬럼을 사용하여, 소수성 크로마토그래피로 서로로부터 분리시킨다. 그런 후 히루딘은 EP-A 0 549 915에 따라 히루딘을 포함하는 분획물로부터 분리할 수 있고 인슐린은 EP-A 0 347 781에 따라 소형 프로인슐린을 포함하는 분획물에서 분리할 수 있다.
실시예 8 : 소형 프로인슐린으로부터 인슐린의 제조
발현기의 끝에서, 배양 배지는 pH 6.8로 조정된 후, 트립신은 교반과 함께 부가되어서 리터 당 4 -8 mg의 최종 농도가 확립된다. 대략 4시간정도의 항온처리 후, 이 방식으로 처리한 발효 브로쓰는 pH 2.5 - 3으로 조정된다. 1 - 6시간 침전후, 침전물은 제거된다. 그리고나서 형성된 모노-Arg-인슐린은 50mM 젖산 및 30% 이소프로판올(pH 3.5)의 완충액에서 예를 들면 S -세파로즈R를 통해서 이온 교환 크로마토그래피를 통해서 분리한다. 용출은 0.05 - 0.5 M 염의 NaCl 구배를 수단으로 수행된다. 생성물을 포함한 분획물은 H2O로 1 : 1로 희석된 후, ZnCl2가 첨가되면, 0.1 %강도의 ZnCl2용액이 형성된다. 모노-Arg-인슐린은 pH 6.8에서 침전되고, EP-A 0 324 712의 실시예에 따라 인슐린으로 전환시킨다.
실시예 9 : 여과 후 소형 프로인슐린으로부터 인슐린의 제조
발현기의 끝에, 세포와 상층액 성분은 pH 2.5 내지 3에서 침전에 의해서 제거된다. 그런 후 배지는 10 kDa의 배출 한계를 가진 막을 통한 여과를 통해서 농축된다. 히루딘 유도체처럼, 소형 프로인슐린은 농축액에서 정량적으로 발견되고 실시예 8에 따라서 인슐린으로 가공될 수 있다.
Claims (16)
- Z1Z2서열을 통해서 두 번째 단백질에 연결되고 이것이 다시 Z1Z2서열을 통해서 Y에 상응하거나 또는 Y와 상이할 수 있는 Y1 단백질에 연결되어 Y 및/또는 Ym의 분비율을 향상시키는 수송 펩티드를 암호화하는, 하기식의 DNA 분자 :PX-SX-Bn-(ZR)-수송 펩티드-(Z1Z2)-단백질(Y)-(Z1Z2)-단백질(Ym)-T상기식에서,PX는 관심있는 단백질의 최적의 수율을 획득할 수 있는 방법으로 선택된 임의의 프로모터 DNA 서열이고;SX는, 최적 수율을 허용하는 임의의 시그날 또는 리더 서열을 상응하게 암호화하는 임의의 DNA이며;Bn은 유전적으로 암호화할 수 있는 1 내지 15 개의 아미노산 또는 화학 결합이고;Z는 Lys과 Arg을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 코돈이며;Z1는 Lys과 Arg을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 코돈이고;Z2는 Lys과 Arg을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산의 코돈이고;단백질 Ym은 효모에 의해서 생산되고 분비될 수 있는 임의의 단백질을 암호화하는 DNA서열(m = 1 내지 5) 또는 화학 결합(m = 0)이며;R은 Arg 코돈이고;수송 펩티드는 효율적으로 수송될 수 있고 막을 통과할 수 있는 펩티드를 암호화하는 DNA 서열이며;단백질 Y는 효모에 의해서 생산되고 분비되며, Ym이 화학 결합이 아닌 경우, 그 생물학적 활성이 염기성의 디펩티드의 연장으로 손상되지 않거나 또는 카르복시펩티다제에 의해 연장부분의 분해를 허용하는 임의의 단백질을 암호화하는 DNA 서열이며;T는 발현에 유리하게 해독되지 않는 DNA 서열이다.
- 제1항에 있어서, 수송 펩티드가 히루딘 또는 히루딘 유도체인 DNA 분자.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, (Y)가 프로인슐린 및 이의 유도체, 인터류킨, 림포카인, 인터페론 및 혈액 응고계로부터 유래하는 인자를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 약제학적으로 관련있는 단백질인 DNA 분자.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자로 암호화된 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 다중복제 벡터(multicopy vector).
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 플라스미드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자, 제5항의 다중복제 벡터 및/또는 제6항의 플라스미드를 염색체의 일부, 소형 염색체의 일부 또는 염색체 외로 포함하는 숙주 세포.
- 제7항에 있어서, 효모인 숙주 세포.
- 제8항에 있어서, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae), 케이. 락티스(K. lactis), 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha) 및 피. 파스토리스(P. pastoris)로 구성되는 그룹에서 선택된 숙주 세포.
- (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DNA 분자, 제5항의 다중복제 벡터, 또는 제6항의 플라스미드를 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포에서 발현시키는 단계; 및(b) 발현된 단백질을 세포 배양의 상층액으로부터 분리하는 단계를 포함하는, 제4항에 따른 단백질을 발효하는 방법.
- 제10항에 있어서, 발효과정 완료후, 원하지 않는 단백질을 침전시키기 위해서 pH를 2.5 내지 3.5로 조정하고, 발현된 단백질을 침전물의 상층액에서 분리하는방법.
- 제11항에 있어서, 발효 상층액을 숙주 세포로부터 분리한 후, 숙주 세포를 새로운 배지에서 반복적으로 배양하고, 배양기간 동안 수득된 각각의 상층액으로부터 방출된 융합 단백질을 분리하는 방법.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 침전 후 상층액에서 발현된 단백질의 농축단계를 미세여과, 소수성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 그룹에서 선택하는 방법.
- (a) 프로인슐린을 제10항 또는 제11항에 따른 방법에서 제1항의 발현 카세트의 단백질(Y)로 발현시키는 단계;(b) (a)단계에서의 프로인슐린을 분리하고, 트립신 및 카르복시펩티다제 B로 처리하는 단계; 및(c) 인슐린을 (b)단계의 반응 혼합물로부터 분리하는 단계를 포함하는, 인슐린의 제조 방법.
- 제14항에 있어서, 수송 펩티드가 (a) 또는 (b)단계 후 파괴되거나 또는 생물학적으로 불활성화되는 히루딘 또는 히루딘 유도체인 방법.
- 제4항에 있어서, C-말단 끝에 두 개의 염기성 아미노산 잔기를 가진 히루딘 유도체인 단백질.
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