DE60209883T2

DE60209883T2 - Übersekretierte peptide, deren herstellung, und gleichzeitige verbesserung der sekretierten form eines oder mehrerer anderer polypeptide

Info

Publication number: DE60209883T2
Application number: DE60209883T
Authority: DE
Inventors: Paul Habermann
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2022-02-09
Also published as: MXPA03007115A; EP1364030A2; NO20033671D0; ZA200305867B; NO20033671L; CA2438935C; NO331375B1; BR0207385A; KR100858008B1; PT1364030E; IL157415A0; JP2004518442A; AU2002247696B2; DE60209883D1; ES2258619T3; CA2438935A1; CY1105696T1; PE20020875A1; EP1364030B1; CN1527882A

Description

Verwendung von supersezernierbaren Peptiden in Verfahren zu ihrer Herstellung und zur parallelen Verbesserung der exportierten Formen eines oder mehrerer anderer Polypeptide von Interesse.
Im Hinblick auf die ökonomische Lebensfähigkeit müssen Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch relevanten Proteinen zu biologisch aktiven Produkten mit höchstmöglicher Reinheit führen. Die Expression von solchen relevanten Proteinen in Hefen wird hier in großem Umfang verwendet. Die Produktion von Proteinen wie z.B. Insulin, GM-CSF (Leukine^®) und Hirudin (Refludan^®) ist ein Beispiel für die erfolgreiche Entwicklung von gentechnologischen Verfahren, die auf der Synthese des bestimmten Proteins oder Vorstufen davon in Hefe basieren. Im Allgemeinen können Hefen insbesondere Hirudine mit guten Ausbeuten, die im Gramm-Maßstab liegen, wenn Hansenula polymorpha (Weydemann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:377-385, 1995) oder Pichia pastoris (Rosenfeld et al., Protein Expr. Purif.:4, 476-82, 1996) verwendet wird, direkt synthetisieren.
EP-A 0 324 712 beschreibt das Hirudinderivat (Refludan^®), dessen N-terminale Aminosäure Leucin ist, und seine konstitutive Expression im Saccharomyces cerevisae-Stamm Y79. EP-A-0 347 781 beschreibt ein Mini-Proinsulin und beispielhaft seine Expression in Bäckerhefe. Refludan^® und Insulin werden durch Durchführung von zwei getrennten Expressionen produziert.
Wir haben nun überraschender Weise gefunden, dass Hirudinderivate und Mini-Proinsulin-Derivate aus einem gemeinsamen Vorläuferprotein erhalten werden können, indem das Vorläuferprotein an eine Signal- oder Leadersequenz, die durch Hefen als Sekretionssignal erkannt wird, über ein basisches Dipeptid, vorzugsweise Lys-Arg, fusioniert wird und in gleicher Weise zwischen dem N-terminalen Hirudinderivat und dem Mini-Proinsulinderivat eine Spaltungsstelle eingeführt wird, welche durch eine Hefeendoprotease erkannt wird. Auch hier wird einem basischen Dipeptid, z.B. Lys-Arg, der Vorzug gegeben. Nach Expression werden ein Hirudinderivat, das durch Lys-Arg verlängert ist, und das Mini-Proinsulinderivat, das mit der ersten Aminosäure der Insulin B-Kette beginnt, im Überstand gefunden. Überraschender Weise haben wir festgestellt, dass die Ausbeute an Mini-Proinsulin im Vergleich zu der Ausbeute, die durch direkte Signal-Mini-Proinsulin-Expression erreichbar ist, deutlich verbessert ist, wohingegen die Ausbeute an dem Hirudinderivat nahezu die gleiche bleibt. Überraschender Weise wirkt Hirudin demnach als eine Art Enhancer-Peptid bezüglich der Ausbeute an Mini-Proinsulin.
Peptide, die als Enhancer-Proteine wirken können, sind üblicher Weise solche, die relativ klein sind und die natürlicher Weise in großen Mengen im Verlauf eines kurzen Zeitraums, z.B. aus Drüsengewebe, sezerniert werden. Peptide dieses Typs, die z.B. Schlangengift oder Eglin C oder TAP (Zecken-Antikoagulanspeptid) umfassen, zeichnen sich durch extrem gute Exportkompatibilität aus.
Ein weiterer Vorteil kann aus dem Hirudinderivat resultieren, das gleiche oder bessere pharmazeutische Eigenschaften wie Hirudin hat, welches bereits in Pharmazeutika eingesetzt wird. In diesem Fall wird es möglich, zwei oder sogar mehr Pharmazeutika aus ein und derselben Fermentation zu produzieren. Die Folge ist, dass weniger Fermentationskapazität erforderlich ist. Dies wirkt sich direkt günstig auf die Produktionskosten aus.
Allerdings ist die Produktion einer Vielzahl von Produkten optional. Die Menge, die z.B. für Refludan verwendet wird, ist geringer als die von Insulin und dies kann zu Verfahren führen, in denen eine der pharmazeutisch interessierenden Substanzen verworfen wird.
Um die Ausbeute zu verbessern, ist es, wie in der Patentanmeldung EP-A 0 200 655 vorgeschlagen wird, möglich, eine kurze Peptidsequenz durch Lys-Arg N-terminal vor dem Hirudinderivat als Linker für die Signal- oder Leadersequenz anzuordnen. Für den Fachmann ist auch offensichtlich, dass die Wahl der Signal- oder Leadersequenz die Ausbeute des interessierenden Proteins direkt beeinflusst. Die Auswahl einer solchen Sequenz ist Gegenstand weiterer Optimierungen. Die Sequenz, die sich am 3'-Ende der Expressionskassette befindet, beeinflusst ebenfalls direkt die Ausbeute, indem sie die mRNA-Stabilität beeinflusst. Auch hier ist es für den Fachmann offensichtlich, dass die Sequenz für jedes interessierende Protein, das zu exprimieren ist, optimiert werden kann. Dies gilt auch für die Wahl eines geeigneten Promotors, der induzierbar oder konstitutiv aktiv sein kann. Die Wahl des Vektorsystems und des Wirtssystems ist für die Ausbeute gleichermaßen wichtig. So ist es möglich, an Stelle der Bäckerhefe, die z.B. verwendet wurde, die Hefen Pichia pastoris, Hansenula polymorpha oder K. lactis zusammen mit Vektoren oder Expressionskassetten zu verwenden, die in jedem Fall bezüglich der unterschiedlichen Physiologie optimiert wurden.
Ein weiterer Vorteil von Verfahren, die eine Sekretion in das Medium ermöglichen, ist die einfachere proteinchemische Aufarbeitung des Proteins von Interesse. Wir haben überraschender Weise gefunden, dass Mino-Proinsulin in Gegenwart von Hirudin durch Filtration durch Membranen, die eine Ausschlussgrenze für Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 10 kDa haben, konzentriert werden kann. Die Moleküle werden fast ausschließlich im Retentat gefunden. Für den Fachmann ist klar, dass die Entwicklung neuer Trennungstechniken und neuer Kombinationen von Verfahrensschritten es immer möglich macht, Reinigungsverfahren zu verbessern. Dies wirkt sich direkt günstig auf die Ausbeute und damit auf die Produktionskosten aus.
In Thim et al. 1986: Secretion and processing of insulin precursors in yeast. PNAS, 83:6766-6770 und US 5 677 172 werden die Hefe-Paarungsfaktor-αl-Leadersequenz bzw. S. cerevisiae hsp150 als die heterologe Genexpression und -Sekretion verstärkende Peptide offenbart.
Die Erfindung bezieht sich somit auf ein DNA-Molekül (alternativer Ausdruck: Expressionskassette) der Form:
P_x-S_x-B_n-(ZR)-Transportpeptid-(Z₁Z₂)-Protein(Y)-(Z₁Z₂)-Protein(Y_m)-T;
wobei die Expressionskassette für ein Transportpeptid codiert, das über eine Sequenz Z₁Z₂ an ein zweites Protein gebunden ist, das wiederum über Z₁Z₂ an ein Protein Y₁ gebunden ist, welches entweder Y entspricht oder von Y verschieden sein kann, und das Transportpeptid die Sekretionsrate von Y und/oder Y_m verbessert, wobei:
P_x eine Promotor-DNA-Sequenz ist, die derart ausgewählt ist, dass optimale Ausbeuten des Proteins von Interesse erhältlich werden;
S_x eine DNA ist, welche entsprechend für eine Signal- oder Leadersequenz codiert, die optimale Ausbeuten erlaubt;
B_n für 1 bis 15 genetisch codierte Aminosäuren oder eine chemische Bindung steht;
Z das Codon einer Aminosäure, die aus der Lys und Arg umfassenden Gruppe ausgewählt ist, ist;
Z₁ das Codon einer Aminosäure, die aus der Lys und Arg umfassenden Gruppe ausgewählt ist, ist;
Z₂ das Codon einer Aminosäure, die aus der Lys und Arg umfassenden Gruppe ausgewählt ist, ist;
R ein Arg-Codon ist;
das Transportpeptid eine DNA-Sequenz ist, die für Hirudin oder ein Hirudinderivat codiert;
Protein Y eine DNA-Sequenz ist, die für ein Protein codiert, das durch Hefe produziert und sezerniert werden kann;
Portein Y_m eine DNA-Sequenz ist, die für ein Protein codiert, das durch Hefe produziert und sezerniert werden kann (m = 1-5), oder eine chemische Bindung ist (m=0);
T eine untranslatierte DNA-Sequenz ist, die für die Expression vorteilhaft ist.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Fusionsprotein, das durch eines der oben angegebenen DNA-Moleküle codiert wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Vektor mit hoher Kopienzahl und ein Plasmid, die das oben genannte DNA-Molekül umfassen.
Eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung ist eine Wirtszelle, die das oben genannte DNA-Molekül oder den oben genannten Vektor mit hoher Kopienzahl oder das oben genannte Plasmid als Teil ihres Chromosoms, als Teil eines Mini-Chromosoms oder extrachromosomal umfasst, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine Hefe ist, die insbesondere aus der Gruppe, bestehend aus S.cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha und P. pastoris, ausgewählt ist.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Fermentieren der oben genannten Proteine, in dem:

(a) das oben genannte DNA-Molekül, der oben genannte Vektor mit hoher Kopienzahl oder das oben genannte Plasmid in der oben genannten Wirtszelle exprimiert wird und
(b) die exprimierten Proteine aus dem Überstand der Zellkultur isoliert werden,

Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist das oben genannte Verfahren, wobei in diesem Verfahren nach Abtrennung des Fermentationsüberstands von den Wirtszellen die Wirtszellen wiederholt in frischem Medium kultiviert werden und das freigesetzte Fusionsprotein aus jedem Überstand, der während der Kultivierung erhalten wird, isoliert wird.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist das oben genannte Verfahren, wobei ein Verfahrensschritt zur Konzentrierung des exprimierten Proteins im Überstand nach Präzipitation aus der Gruppe, umfassend Mikrofiltration, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und Ionenaustauschchromatographie, ausgewählt wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Insulin, in dem:

(a) Proinsulin als Protein (Y) von der oben genannten Expressionskassette in dem oben genannten Verfahren exprimiert wird;
(b) das Proinsulin von Schritt (a) isoliert wird und mit Trypsin und Carboxypeptidase B behandelt wird; und
(c) Insulin aus dem Reaktionsgemisch von Schritt (b) isoliert wird,

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Protein, wobei das Protein ein Hirudinderivat mit zwei basischen Aminosäureresten an seinem C-terminalen Ende ist.
Blutegel des Typs Hirudo haben z.B. verschiedene Isoformen des Thrombininhibitors Hirudin entwickelt. Hirudin wurde durch künstliche Veränderung des Moleküls, z.B. Austausch der N-terminalen Aminosäure (z.B. EP 0 324 712 ), für pharmazeutische Anforderungen optimiert. Die Erfindung beinhaltet die Verwendung von Hirudin und Hirudinvarianten. Besondere Ausführungsformen der Erfindung verwenden eine der natürlichen Hirudinisoformen (die natürlichen Isoformen werden zusammen "Hirudin" genannt). Eine natürliche Isoform ist z.B. Val-Val-Hirudin oder Ile-Thr-Hirudin. Andere Ausführungsformen der Erfindung verwenden eine Variante einer natürlichen Hirudinisoform. Eine Variante ist von einer natürlichen Hirudinisoform abgeleitet, enthält aber z.B. zusätzliche Aminosäuren und/oder Aminosäure-Deletionen und/oder Aminosäureaustauscher im Vergleich zu der natürlichen Isoform. Eine Hirudinvariante kann alternierende Peptidsegmente natürlicher Hirudinisoformen und neue Aminosäuren enthalten. Hirudinvarianten sind bekannt und werden z.B. in DE 3 430 556 beschrieben. Hirudinvarianten sind im Handel in Form von Proteinen (Calbiochem Biochemicals, Kat. Nr. 377-853, -950, -960) erhältlich. Der Ausdruck "Hirudinderivat" bezeichnet Sequenzen, die wenigstens 40% zu natürlichem Hirudin homolog sind.
Die Expressionskassette wird vorzugsweise in Hefen, z.B. S. cerevisae, K. lactis, H. polymorpha oder P. pastoris, eingeführt. Die genannte Expressionskassette kann eine Kopie oder mehrere Kopien stabil integriert in das bestimmte Hefegenom haben oder kann extrasomal an einem Vektor mit hoher Kopienzahl vorliegen. Dem Fachmann ist klar, dass diese Technik auch auf andere Systeme, z.B. Tierzellkultur oder Pflanzenzellen, anwendbar ist. Dies ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Das unten beschriebene Expressionssystem dient als Beispiel. Dem Fachmann ist klar, dass die geeigneten rekombinanten DNA-Konstrukte zur Einführung der Expressionskassette in das ausgewählte System vom Typ des ausgewählten Wirtsystems abhängig gemacht werden. Folglich kann eine industrielle Fermentation bezüglich des ausgewählten Wirt/Vektor-Systems optimiert werden. Dementsprechend sind die Beispiele nicht beschränkend.
Beispiel 1: Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmids, das für Hirudin (Refludan)-Lys-Arg-Mini-Proinsulin codiert
Ausgangsmaterialien sind die Plasmide pK152 (PCT/EP 00/08537), pSW3 (EP-A 0347 781) und das rekombinante Hefeplasmidderivat, das für Rinder-Interleukin-2 codiert (Price et al., Gene 55, 1987). Das Hefeplasmid zeichnet sich durch die Tatsache aus, dass es die α-Faktor-Leadersequenz unter der Kontrolle des Hefe-ADH2-Promotors trägt. Auf diese Sequenz folgt die Rinder-Interleukin-2-cDNA-Sequenz, die über eine KpnI-Restrikationsenzym-Erkennungsstelle verbunden ist und die nach Manipulation eine NcoI-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle im untranslatierten 3'-Ende enthält, die im Vektor einmal vorkommt. So kann die cDNA-Sequenz leicht über eine kpnI/NcoI-Spaltung aus dem Plasmid entfernt werden. Da gute Expressionsausbeuten beschrieben wurden, kann angenommen werden, dass die verbleibende 3'-Interleukin-2-Sequenz (als T) eine stabilisierende Wirkung auf die mRNA hat und somit nicht deletiert oder durch eine Hefeterminatorsequenz ersetzt werden muss. Das Plasmid pK152 trägt die DNA-Sequenz, die für Leu-Hirudin (Refludan) codiert, und Plasmid pSW3 trägt die DNA-Sequenz für Mino-Proinsulin. Die Gensequenz, die für Hirudin-Lys-Arg-Mini-Proinsulin codieren soll, wird zuerst durch PCR-Technologie hergestellt. Zu diesem Zweck werden 4 Primer mit Hefe des Expidite^TM-DNA-Synthese-Systems hergestellt:
Primer hir_insfkr beschreibt die Verbindung zwischen Codons für die terminalen Aminosäuren von Hirudin (59-65) und die Insulinsequenz B1-B7 über den Lys-Arg-Linker. Primer hir_insrevkr ist zu 100% komplementär dazu, Primer hirf1 codiert für den Beginn des Hirudingens, das zu der KpnI-Spaltungsstelle ausgedehnt ist, wie es in EP-A 0 324 712 beschrieben wird.
Primer insncoirev markiert das 3'-Ende des synthetischen Mini-Proinsulins gemäß EP-A 0 347 781. Es werden zwei Standard-Polymerasekettenreaktionen durchgeführt, wobei die Primerpaare hirf1/hir_insrevkr mit DNA von Plasmid pK152 als Matrize und hir_insfkr/insncoirev mit DNA von Plasmid pSW3 als Matrize durchgeführt werden. Die Reaktionen werden in 100 μl PCR-Puffer mit in jedem Fall 200 nmol Primer, 1 μl Polymerase und 100 ng Vektor durchgeführt. Schritt 1 ist eine 2-Minuten-Inkubation bei 95°C. Darauf folgen dann 25 Zyklen mit 30'' bei 95°C, 30'' bei 55°C und 30'' bei 72°C. Auf den letzten Zyklus folgt eine Inkubation bei 72°C für 3 min, und anschließend wird die Reaktion gestoppt.
Da die Primer hir_insrevkr und hir_insfkr zu 100 % komplementär sind, überlappen die zwei Produkte entsprechend der genannten Sequenz, so dass in einer dritten Reaktion unter Verwendung der Produkte der ersten zwei Reaktionen als Matrizen und der Primer hirf1 und insncoirev ein DNA-Fragment gebildet wird, welches für Hirudin und Mini-Proinsulin, getrennt durch Lys-Arg, codiert. Das PCR-Fragment wird durch die Enzyme KpnI und NcoI verdaut und dann in einer T4-Ligasereaktion in den pαADH2-Vektor, der durch Kpn1/NcoI geöffnet wurde, insertiert. In Analogie zu Beispiel 7 von EP-A 0 347 781 werden dann kompetente E. coli-Stamm-MM294-Zellen mit dem Ligationsgemisch transformiert. Plasmid-DNA wird dann zur Charakterisierung durch DNA-Sequenzanalyse aus zwei Klonen isoliert. Nach Bestätigung der insertierten DNA-Sequenz wird DNA aus einer Plasmidpräparation verwendet, um Zellen des Bäckerhefestamms Y79 nach diesem Beispiel zu transformieren. Wenn allerdings der pαADH2-Vektor verwendet wird, folgt auf die Einführung des Vektors eine Selektion zur Komplementierung der trp1-1-Mutation, was im Gegensatz zu dem genannten Beispiel steht. Für eine andere Kontrolle wird Plasmid-DNA wieder aus Hefetransformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse analysiert. Der konstruierte Expressionsvektor wird pADH2Hir_KR_Ins genannt. Eine Expression wird entsprechend Beispiel 4 durchgeführt.
Beispiel 2: Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmids, das für Hirudin (Refludan)-Lys-Arg-Insulin-B-Kette-Lys-Arg-Insulin-A-Kette codiert.
Die Patentanmeldung EP-A 0 195 691 beschreibt Proinsulinderivate, die das Dipeptid XY, worin X und Y jeweils entweder Lys oder Arg entsprechen, als Linker zwischen den B- und A-Ketten von Insulin enthalten können. Das folgende Beispiel beschreibt die Herstellung eines Expressionsvektors für Proinsulinderivate dieser Art. Eine DNA-Sequenz, die für ein Proinsulinderivat der Form B-Kette-Lys-Arg-A-Kette codiert, wird z.B. ausgewählt und entsprechend synthetisiert.
Die Synthese des Gensegments wird entsprechend Beispiel 1 durchgeführt. Die verwendeten Oligonukleotidsequenzen sind hirf1 und insncoirev. Die Oligonukleotide B_KR_Af1 und B_KR_Arev1 werden de novo synthetisiert.
Der gezeigte fettgedruckte Teil der zwei Primer zeigt die partiell überlappende Sequenz an. Beide Primer lagern sich mit der Sequenz des Mini-Proinsulingens von EP-A 0 347 781 paarweise zusammen, außer den sechs unterstrichenen Nukleotiden. Der unterstrichene Teil entspricht den Codons Lys und Arg. DNA des Plasmids pADH2Hir_KR_Ins, das entsprechend Beispiel 1 konstruiert wurde, dient in der PCR als Matrize.
Wie in Beispiel 1 beschrieben wurde, werden zwei Polymerasekettenreaktionen unter Verwendung der Primerpaare hirf1_/B_KR_Arev und insncoirev/B_KR_Af1 durchgeführt. Die Matrize in jedem Fall ist DNA des Plasmids pADH2Hir_KR_Ins, das in Beispiel 1 konstruiert worden war. Die Produkte von beiden Reaktionen dienen als Matrize in einer dritten PCR, wobei das Primerpaar hirf1 und insncol verwendet wird. Das Reaktionsprodukt aus PCR 3 wird mit NcoI/SalI gespalten und in den geöffneten pαADH2-Vektor insertiert. Nach Sequenz- und Restriktionsanalyse wird das korrekte Plasmid als pADHHirKR_B_KR_A bezeichnet.
Beispiel 3: Konstruktion eines Hefeplasmids, das für Hirudin-Lys-Arg-Simian-Proinsulin codiert
Die Patentanmeldung EP-A 0 489 780 beschreibt ein Plasmid, pINT90d, das cDNA von Simian-Proinsulin enthält (Wetekam et al., Gene 19, S. 179-183, 1982). DNA dieses Plasmids und DNA von Plasmid pK152 dienen als Matrizen. Der Primer hirf1, der in Beispiel 1 beschrieben wird, wird verwendet, und es werden drei weitere Primer synthetisiert.
Der Primer insncorev bindet umgekehrt an die 3'-Region des Insulingens, das in pINT90d kloniert wird, und hat die Sequenz:
5'-TTTTTTCCATGGTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' (SEQ ID NO: 9)
Die unterstrichene Sequenz zeigt die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NcoI an.
Primer hir_insfkr hat die Sequenz:
5'-ATCCCTGAGG AATACCTTCA GAAGCGATTT GTGAACCAGC ACCTGTGCGG C-3' (SEQ ID NO: 10)
Hier geben die Nukleotide in Fettbuchstaben den Lys-Arg-Linker zwischen Hirudin und Proinsulin an.
Primer hir_insrevkr ist vollständig komplementär zu Primer hir_inskr und hat die Sequenz:
5'-GCCGCACAGG TGCTGGTTCA CAAATCGCTT CTGAAGGTAT TCCTCAGGGA T-3' (SEQ ID NO: 11)
Entsprechend Beispiel 1 werden zwei Polymerase-Kettenreaktionen durchgeführt. Das Primerpaar hirf1/hir_insrevkr wird mit DNA von Plasmid pK152 umgesetzt und das Primerpaar hir_insfkr/insncorer wird mit DNA von Plasmid pINT91d umgesetzt. Wie in Beispiel 1 beschrieben, dienen die Produkte von beiden Reaktionen als Matrize in einer dritten PCR, wobei das Primerpaar hirf1/insncorev verwendet wird. Das DNA-Produkt dieser Reaktion beinhaltet die Sequenz für Hirudin_Lys-Arg_Proinsulin. Es wird anschließend mit den Enzymen NcoI und KpnI gespalten und entsprechend Beispiel 1 in das Plasmid pαADH2 insertiert. Entsprechend kann ein Expressionsvektor für beliebige natürliche Proinsulinderivate konstruiert werden.
Beispiel 4: Expression der rekombinanten Produkte
Die Expression wird in zwei Phasen eingeteilt. Erstens, eine Vorkultur wird in Hefe-Minimalmedium kultiviert. Das Medium hat die folgende Zusammensetzung pro 1 Liter:

6,7 g – Hefestickstoffgas (ohne Aminosäuren)

5,0 g – Casaminosäuren (Vitamin-frei)

0,008% – Adenin

0,008% – Uracil

2% – Glucose
Die Haupt- oder Expressionskultur wird mit einem Aliquot der Vorkultur inokuliert.
Das Hauptkulturmedium enthält pro Liter:

10 g – Hefeextrakt

20 g – Pepton

0,008%& – Adenin

0,008% – Uracil

4% – Glucose
Unter Verwendung der oben beschriebenen Medien wird eine Expression in einer Schüttelflasche wie folgt durchgeführt: 0,3 ml einer Vorkultur, die über Nacht kultiviert worden war, wird mit 80 ml vorerwärmtem Medium verdünnt und unter kräftigem Schütteln bei 30°C für etwa 24 h inkubiert. In jedem Fall wird 1 ml der auf diese Weise produzierten Kultur dann zentrifugiert, nachdem die optische Dichte bestimmt worden war, und nach Entfernung der Zelle wird der Überstand lyophilisiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Der Gehalt an biologisch aktivem Hirudin wird bestimmt, indem ein Thrombininhibierungsassay durchgeführt wird.
Ein alternatives Fermentationsprotokoll sorgt dafür, dass die Zellen durch Filtration oder sorgfältige Zentrifugation entfernt werden. Während das Protein von Interesse aus dem Medium isoliert wird, werden die Zellen mit frischem vorerwärmtem Hauptkulturmedium, das Alkohol und nicht mehr als 0,5% Glucose als Kohlenstoffquelle enthält, versorgt, und so wird die Fermentation ohne Unterbrechung fortgesetzt. Dieser Schritt kann bis 5 Mal wiederholt werden.
Beispiel 5: Thrombininhibierungstest
Die Hirudinkonzentration wird nach dem Verfahren von Grießbach et al. (Thrombosis Research 37, S. 347-350, 1985) bestimmt. Zu diesem Zweck werden spezifische Mengen eines Refludan-Standards in die Messungen eingeschlossen, um eine Eichkurve zu erstellen, aus der die Ausbeute direkt in mg/l bestimmt werden kann.
Beispiel 6: Klonierung und Expression des Hirudin-Lys-Arg-Mini-Proinsulin-Fusionsproteins im P. pastoris-System
Invitrogen^® verkauft einen Klonierungs- und Expressionskit zur Herstellung von rekombinanten Proteinen, wobei P. pastoris als Wirtssystem verwendet wird. Dafür wird ein detailliertes technisches Protokoll bezüglich Herstellung und anschließender Expression eines P. pastoris-Systems für die Herstellung eines gewünschten rekombinanten Proteins bereitgestellt, so dass nur die Konstruktion des Expressionsvektors, der für das gewünschte Protein codiert, beschrieben werden muss, wenn diesen Protokollen gefolgt wird. Der EasySelect^TM-Pichia-Expressionskit (Katalog Nr. K1740-01) wird verwendet.
Der pPICZαA-Vektor ist Teil des Kits. Eine Öffnung des Vektors durch die Restriktionsenzyme XhoI und SacII macht es möglich, ähnlich wie in Beispiel 1 ein Protein von Interesse an die α-Faktor-Leadersequenz anzuhängen und auf Sekretion in den Überstand zu testen. Eine Klonierung erfordert zwei Primer. Primer pichia_H_lf1 (SEQ ID NO: 12) hat die folgende Sequenz:
Primer pichia_H_Irev2 (SEQ ID NO: 13) hat die Sequenz:
Die verwendete Matrize ist DNA von Plasmid pADH2Hir_KR_Ins. Eine Standard-PCR mit beiden Primern produziert ein DNA-Produkt, das die Sequenz Hirudin-Lys-Arg-Mini-Proinsulin, erweitert durch die XhoI- und SacII-Integrationsstellen, enthält. Wenn das DNA-Produkt geeignet gespalten wird und das Fragment isoliert wird, kann das Fragment in einer T4-DNA-Ligasereaktion in die geöffnete Vektor-DNA insertiert werden. In Abweichung vom Protokoll des Herstellers wird der E. coli-Stamm MM294, der in Beispiel 1 beschrieben wird, mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf Zeocin-Selektionsplatten wird auf rekombinante Kolonien durchgemustert. Plasmid-DNA wird aus Klonen reisoliert und dann durch Restriktions- und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Unter Verwendung des auf diese Weise konstruierten Plasmids wird dann ein P. pastoris-Expressionsklon zur Herstellung der Peptide hergestellt, und zwar nach den Instruktionen des Herstellers.
Beispiel 7: Reinigung von Mino-Proinsulin und Hirudin
Die Reinigung erfordert eine Trennung der zwei Proteine in einer früheren Stufe. Nach Beendigung der Expression wird das Medium mittels analytischer RP-HPLC analysiert. Im Gegensatz zu den meisten anderen Polypeptiden, die entweder infolge von spontaner Lyse von Hefezellen oder Sekretion im Überstand gefunden werden, werden die zwei Proteine Hirudin und Mini-Proinsulin bei pH 2,3 bis 3 nicht präzipitiert. Das Kulturmedium wird daher in geeigneter Weise azidifiziert und dann nach Beendigung der Präzipitation werden das Präzipitat und die Zellen durch Zentrifugation entfernt. Nach Zentrifugation wird das Medium auf pH 3,5 bis 7 eingestellt und die zwei Komponenten Hirudin und Mini-Proinsulin werden durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie z.B. durch Verwendung einer Chromatographiesäule, die mit Diaion HP20^®-Material gefüllt ist, von einander getrennt. Hirudin kann dann gemäß EP-A 0 549 915 aus den hirudinhaltigen Fraktionen isoliert werden und Insulin kann gemäß EP-A 0 347 781 aus den Mini-Proinsulin enthaltenden Fraktionen isoliert werden.
Beispiel 8: Herstellung von Insulin aus Mini-Proinsulin
Am Ende des Expressionszeitraums wird das Kulturmedium auf pH 6,8 eingestellt und Trypsin wird dann unter Rühren zugesetzt, so dass eine Endkonzentration von 4 bis 8 mg/l erreicht wird. Nach Inkubation für etwa 4 Stunden wird die Fermentationsbrühe, die in dieser Weise behandelt wurde, auf pH 2,5 bis 3 eingestellt. Nach 1 bis 6 Stunden Präzipitation wird das Präzipitat entfernt. Das gebildete mono-Arg-Insulin wird dann über Ionenaustauschchromatographie beispielsweise an S-Sepharose^® in einem Puffer aus 50 mM Milchsäure und 30% Isopropanol (pH 3,5) isoliert. Eine Elution wird mit Hilfe eines NaCl-Gradienten von 0,05 bis 0,5 M Salz durchgeführt. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen werden 1:1 mit H₂O verdünnt, und dann wird ZnCl₂ zugesetzt, so dass eine 0,1% starke ZnCl₂-Lösung gebildet wird. Mono-Arg-Insulin präzipitiert bei pH 6,8 und wird z.B. gemäß EP-A 0 324 712 in Insulin umgewandelt.
Beispiel 9: Herstellung von Insulin aus Mini-Proinsulin nach Filtration
Am Ende des Expressionszeitraums werden Zellen und Überstand-Komponenten durch Präzipitation bei pH 2,5 bis 3 entfernt. Dann wird das Medium durch Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa konzentriert. Wie das Hirudinderivat wird Mini-Proinsulin quantitativ im Retentat gefunden und kann entsprechend Beispiel 8 zu Insulin prozessiert werden. Sequenzprotokoll

Claims

DNA-Molekül der Form P_x-S_x-B_n-(ZR)-Transportpeptid-(Z₁Z₂)-Protein(Y)-(Z₁Z₂)-Protein(Y_m)-T; wobei das DNA-Molekül für ein Transportpeptid codiert, das über eine Sequenz Z₁Z₂ an ein zweites Protein gebunden ist, das wiederum über Z₁Z₂ an ein Protein Y₁ gebunden ist, welches entweder Y entspricht oder von Y verschieden sein kann, und das Transportpeptid die Sekretionsrate von Y und/oder Y_m verbessert, wobei P_x eine Promotor-DNA-Sequenz ist, die derart ausgewählt ist, dass optimale Ausbeuten des Proteins von Interesse erhältlich werden; S_x eine DNA ist, welche entsprechend für eine Signal- oder Leadersequenz codiert, die optimale Ausbeuten erlaubt; B_n für 1 bis 15 genetisch codierbare Aminosäuren oder eine chemische Bindung steht; Z das Codon einer Aminosäure, die aus der Lys und Arg umfassenden Gruppe ausgewählt ist, ist; Z₁ das Codon einer Aminosäure, die aus der Lys und Arg umfassenden Gruppe ausgewählt ist, ist; Z₂ das Codon einer Aminosäure, die aus der Lys und Arg umfassenden Gruppe ausgewählt ist, ist; Protein Y_m eine DNA-Sequenz, die für ein Protein codiert, das durch Hefe produziert und sezerniert werden kann (m=1-5), oder eine chemische Bindung ist (m=0); R ein Arginincodon ist; das Transportpeptid eine DNA-Sequenz ist, die für Hirudin oder ein Hirudinderivat codiert; Protein Y eine DNA-Sequenz ist, die für ein Protein codiert, das durch Hefe produziert und sezerniert werden kann und dessen biologische Aktivität, wenn Y_m keine chemische Bindung ist, durch eine basische Dipeptidextension nicht beeinträchtigt wird oder einen Abbau der Extension durch Carboxypeptidasen erlaubt; T eine untranslatierte DNA-Sequenz ist, die für die Expression vorteilhaft ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei (Y) ein pharmazeutisch relevantes Protein ist, das aus einer Gruppe, umfassend Proinsulin und Derivate davon, Interleukine, Lymphokine, Interferone und Faktoren, die aus Blutgerinnungssystem stammen, ausgewählt ist.
Proteine, die durch eines der DNA-Moleküle nach Anspruch 1 oder 2 codiert werden.
Vektor mit hoher Kopienzahl, der das DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Plasmid, das das DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Wirtszelle, die ein DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, einen Vektor mit hoher Kopienzahl nach Anspruch 4 und/oder ein Plasmid nach Anspruch 5 als Teil ihres Chromosoms, als Teil eines Mini-Chromosoms oder extrachromosomal umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die Wirtszelle eine Hefe ist.
Wirtszelle nach Anspruch 7, ausgewählt aus der Gruppe umfassend S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha und P. pastoris.
Verfahren zum Fermentieren von Proteinen nach Anspruch 3, in dem (a) ein DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, ein Vektor mit hoher Kopienzahl nach Anspruch 4 oder ein Plasmid nach Anspruch 6 in einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6 bis 8 exprimiert wird; und (b) die exprimierten Proteine aus dem Überstand der Zellkultur isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei nach Beendigung der Fermentation der pH auf 2,5 bis 3,5 eingestellt wird, um nicht erwünschte Proteine zu präzipitieren, und die exprimierten Proteine aus dem Überstand der Präzipitation isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei in diesem Verfahren nach Abtrennung des Fermentationsüberstandes von den Wirtszellen die Wirtszellen wiederholt in frischem Medium kultiviert werden und das freigesetzte Fusionsprotein aus jedem Überstand, der während der Kultivierung erhalten wird, isoliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei ein Verfahrensschritt zur Konzentrierung des exprimierten Proteins im Überstand nach Präzipitation aus der Gruppe, umfassend Mikrofiltration, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und Ionenaustauschchromatographie, ausgewählt wird.
Verfahren zur Herstellung von Insulin, in dem (a) Proinsulin als Protein (Y) der Expressionskassette von Anspruch 1 in einem Verfahren nach Anspruch 9 oder 10 exprimiert wird; (b) das Proinsulin von Schritt (a) isoliert wird und mit Trypsin und Carboxypeptidase B behandelt wird; und (c) Insulin aus dem Reaktionsgemisch von Schritt (b) isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Transportpeptid Hirudin oder ein Hirudinderivat, das nach Schritt (a) oder (b) zerstört oder biologisch inaktiviert wird, ist.
Protein nach Anspruch 3, wobei das Protein ein Hirudinderivat mit zwei basischen Aminosäureresten an seinem C-terminalen Ende ist.