DE69630524T2

DE69630524T2 - Methoden zur aufreinigung von authentischem igf aus hefewirtszellen

Info

Publication number: DE69630524T2
Application number: DE69630524T
Authority: DE
Inventors: Cynthia Cowgill; Luis Juarbe; Patricio Riquelme; Glenn Dorin; M. Christopher BUSSINEAU; D. Robert KUDRNA; G. Asuman OTZURK
Original assignee: Cephalon LLC; Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; Cephalon LLC
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: DE69630524D1; JP2005253475A; EP0832121A1; JP2008054693A; WO1996040776A1; EP0832121B1; AU6167596A; JP2002514890A; US6117983A; ATE253079T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Produktion von Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF)-Polypeptiden. Die Erfindung betrifft insbesondere die Produktion von authentischem, korrekt gefaltetem IGF aus rekombinanten Hefezellen.
Hintergrund der Erfindung
Insulin-artige Wachstumsfaktoren (IGFs) gehören zu einer Familie von Polypeptiden, die als Somatomedine bekannt sind. Es sind mindestens zwei IGFs bekannt und werden IGF-I bzw. IGF-II genannt. IGFs leiten ihren Namen von der Tatsache ab, dass sie strukturell und funktionell Insulin-ähnlich sind, sich aber von Insulin antigen unterscheiden.
IGF-I und IGF-II teilen eine Reihe von strukturellen und biologischen Eigenschaften. Beide haben Molekülmassen von etwa 7500 Dalton. IGF-I hat 70 Aminosäurereste und IGF-II hat 67 Reste. Rinderknecht, J. Biol. Chem. (1978) 253:2769; und Rinderknecht, FEBS Lett. (1978) 89:283. IGF-I und IGF-II haben eine 62%ige strukturelle Homologie zueinander. Die Moleküle sind Einzelkettenpolypeptide mit drei Disulfidbrücken zwischen den Ketten. Die IGFs umfassen vier Peptiddomänen A, B, C und D. Die Domänen A und B sind zu den entsprechenden Domänen von Proinsulin in hohem Maße homolog und werden durch die C-Domäne verknüpft. Die Domäne D existiert als Carboxy-terminale Extension und in Proinsulin wird keine entsprechende Domäne gefunden. Wie Insulin stimulieren IGFs eine Phosphorylierung von spezifischen Tyrosinresten innerhalb der cytoplasmischen Domäne der Rezeptoren, an die sie binden. (Siehe z. B. WO 93/98826).
Sowohl IGF-I als auch IGF-II wurden aus humanem Serum isoliert. Die rekombinante Produktion von IGFs in bakteriellen Wirten und Hefewirten wurde ebenfalls beschrieben. Beispielsweise beschreiben Chang und Swartz, Protein Folding: in vivo and in vitro (American Chemical Society, 1993) S. 178–188, die rekombinante Produktion von IGF-I in E. coli. Elliott et al., J. Protein Chem. (1990) 9:95–104 beschreiben die Produktion von IGF-I in Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung des α-Faktor-pre-pro-Leaders um eine Sekretion von IGF-I in das Kulturmedium zu steuern. U.S. Patent Nr. 5 324 639 beschreibt die rekombinante Produktion von IGF-I in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris, wobei die α-Paarungsfaktor-pre-pro-Sequenz von S. cerevisiae verwendet wurde um die Sekretion des Proteinprodukts zu steuern.
Allerdings waren Versuche, authentischen, korrekt gefalteten IGF aus rekombinanten Wirten zur reinigen, infolge der Tertiärstruktur des Moleküls enttäuschend. Diesbezüglich liefert eine Reinigung des rekombinant produzierten Moleküls oft ein heterogenes Gemisch, das größtenteils aus inaktiven, fehlgefalteten, unlöslichen und/oder löslichen Disulfid-verknüpften Aggregaten besteht. Abweichende Moleküle, z. B. Fragmente, geschnittene, oxidierte und glycosylierte Formen können ebenfalls vorliegen. Somit ist eine Reinigung schwierig und die Ausbeuten an authentischem Monomers sind oft niedrig. Siehe z. B. Elliott et al., J. Protein Chem. (1990), 9:95–104.
Es wurden Versuche unternommen um diese Probleme zu korrigieren. Z. B. beschreiben Chang und Swartz, Protein Folding: in vivo and in vitro (American Chemical Society, 1993) S. 178–188, ein Verfahren zur Solubilisierung von aggregiertem IGF-I, das in E. coli produziert wurde, unter Verwendung geringer Konzentrationen an Harnstoff und Dithiothreitol (DTT) in einem alkalischen Puffer. Das U.S. Patent Nr. 5 231 178 beschreibt ein Verfahren für die Reinigung von korrekt gefaltetem, monomeren IGF-I aus P. pastoris unter Verwendung einer Kombination aus Kationenaustausch, hydrophober Wechselwirkung und Gelfiltrationschromatographie.
Allerdings wären weitere Verfahren zur Reinigung von authentischem IGF aus Hefe wünschenswert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Auffindung eines Verfahrens zur Reinigung von authentischen, korrekt gefalteten IGF-Polypeptiden aus Hefe-Transformanten. Das Verfahren sorgt für hohe Ausbeuten an IGF aus einer Vielzahl von Hefestämmen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Reinigung eines authentischen, korrekt gefalteten Insulin-artigen Wachstumsfaktor(IGF)-Polypeptids aus einem Medium, in das das IGF-Polypeptid durch Pichia sp.-Zellen sezerniert wurde, bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Durchführen einer Kationenaustauschchromatographie mit dem Medium unter Erhalt eines partiell gereinigten IGF-Gemisches;
(b) Denaturieren und Renaturieren von IGF-Spezies aus dem partiell gereinigten IGF-Gemisch;
(c) Unterwerfen renaturierter IGF-Spezies einer hydrophoben Wechselwirkungschromatograpie; und
(d) Durchführen einer reverse-phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Erhalt eines weiter gereinigten IGF-Gemisches, wobei das weiter gereinigte IGF-Gemisch eine größere Menge an authentischem, korrekt gefalteten IGF als das partiell gereinigte IGF-Gemisch hat.

In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung eines authentischen, korrekt gefalteten Insulin-artigen IGF-Polypeptids aus einem Medium bereit, in das IGF-Polypeptid durch Pichia sp.-Zellen sezerniert wurde, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Durchführen einer Kationenaustauschchromatographie mit dem Medium unter Erhalt eines ersten IGF-Gemisches;
(b) Denaturieren und Renaturieren von IGF-Spezies, die im ersten IGF-Gemisch vorhanden sind, unter Erhalt eines zweiten IGF-Gemisches;
(c) Unterwerfen des zweiten IGF-Gemisches einer hydrophoben Wechselwirkungschromatograpie unter Erhalt eines dritten IGF-Gemisches;
(d) Durchführen einer reverse-phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie an dem dritten IGF-Gemisch unter Erhalt eines vierten IGF-Gemisches, wobei das vierte IGF-Gemisch eine höhere Menge an authentischem, korrekt gefalteten IGF als das erste IGF-Gemisch hat.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines authentischen, korrekt gefalteten Insulin-artigen Wachstumsfaktor(IGF)-Polypeptids aus einem Medium, in das das IGF-Polypeptid durch Pichia pastoris-Zellen, die das IGF-Polypeptid exprimieren, sezerniert wurde, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Durchführen einer Kationenaustauschchromatograpie mit dem Medium unter Erhalt eines ersten IGF-Gemisches;
(b) Denaturieren und Renaturieren von IGF-Spezies, die in dem ersten IGF-Gemisch vorliegen, unter Verwendung eines Denaturierungspuffers, der etwa 1,5 M bis etwa 3 M Harnstoff, etwa 3 bis etwa 50 mmol Natriumborat, etwa 1 M bis 1,5 M Natriumchlorid, etwa 15% bis etwa 25% Ethanol, etwa einen äquimolaren bis 5fachen molaren Überschuss an Dithiothreitol und etwa 0,5 bis 6 μM Cu⁺⁺ umfasst, unter Bedingungen, die für die Reduktion und anschließende Oxidation von Disulfidbrücken sorgen, unter Erhalt eines zweiten IGF-Gemisches;
(c) Unterwerfen des zweiten IGF-Gemisches einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unter Erhalt eines dritten IGF-Gemisches; und
(d) Durchführen einer reverse-phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie an dem dritten IGF-Gemisch unter Erhalt eines vierten IGF-Gemisches, wobei das vierte IGF-Gemisch einen höheren Prozentgehalt an authentischem, korrekt gefalteten IGF als das erste IGF-Gemisch hat.

In noch einer anderen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren der Isolierung eines authentischen, korrekt gefalteten Insulin-artigen Wachstumsfaktor(IGF)-Polypeptids aus einem Medium, in das das IGF-Polypeptid durch Pichia pastoris-Zellen, die das IGF-Polypeptid exprimieren, sezerniert wurde, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Durchführen einer Kationenaustauschchromatographie mit dem Medium unter Erhalt eines partiell gereinigten IGF-Gemisches;
(b) Denaturieren und Renaturieren von partiell gereinigter IGF-Spezies unter Verwendung eines Denaturierungspuffers, der Harnstoff, Dithiothreitol, Alkohol, Salz und ein zweiwertiges Metall oder mehrere zweiwertige Metalle umfasst, in ausreichenden Mengen und unter Bedingungen, die für die Reduktion und anschließende Oxidation von Disulfidbrücken sorgen;
(c) Unterwerfen renaturierter IGF-Spezies einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unter Erhalt eines weiter gereinigten IGF-Gemisches; und
(d) Durchführen einer reverse-phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie an dem weiter gereinigten IGF-Gemisch unter Erhalt eines IGF-Produktes mit einem höheren Prozentgehalt an authentischem, korrekt gefalteten IGF als das partiell gereinigte IGF-Gemisch.

Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden vom Fachmann auf diesem Gebiet in Anbetracht der hier gegebenen Offenbarung leicht durchführbar sein.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung wird, wenn nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Verfahren der Proteinchemie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und der DNA-Rekombinationstechniken, die dem Fachmann bekannt sind, verwenden. Solche Techniken sind in der Literatur vollständig beschrieben. Siehe z. B. Protein Purification Methods: A Practical A roach, (E. L. V. Harris und S. Angal, Herausg., 1989); Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E. L. V. Harris und S. Angal, Herausg., 1990; T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman und Company, 1993; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, 1989), Methods In Enzymology (S. Colowick und N. Kaplan, Herausg., Academic Press, Inc.); Biology and Activities of Yeast (F. A. Skinner, S. M. Passmore und R. R. Davenport, Herausg.); Biochemistry and Genetics of Yeast, (M. Bacila, B. L. Horecker und A. O. M. Stoppani, Herausg.; The Yeasts (A. H. Rose und J. S. Harrison, Herausg.; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (Strathern et al., Herausg.).
I. Definitionen
Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke verwendet und sie sollen wie nachfolgend angegeben definiert sein.
Es muss betont werden, dass in dieser Beschreibung und den angefügten Ansprüchen die Singularformen "ein", "eine" und "der, die, das" auch Pluralformen umfassen, wenn der Inhalt nicht klar etwas anderes vorgibt. So umfasst z. B. der Begriff "ein Polypeptid" ein Gemisch aus zwei oder mehr Polypeptiden und dergleichen.
Der Ausdruck "Insulin-artiger Wachstumsfaktor" oder "IGF", wie er hier verwendet wird, umfasst sowohl IGF-I als auch IGF-II und beinhaltet biologisch aktive Fragmente und Analoga, einschließlich C-terminaler Deletionsmuteine und Derivate davon, die IGF-Aktivität und/oder die Fähigkeit, IGF-Rezeptoren zu binden, beibehalten, wie es z. B. in den europäischen Publikationen Nrn. 135 094, 123 228, 128 733; in den Internationalen Publikationen Nrn. WO 85/00831 und WO 92/04363; und in den U.S. Patenten Nrn. 4 738 921 und 5 158 875 beschrieben wird.
Ein Analogon von IGF oder ein Analogon des Fragments umfasst nativen IGF oder ein Fragment von nativem IGF, das durch eine oder mehrere Aminosäureinsertionen, -deletionen oder -substitutionen modifiziert wurde, welche die IGF-Aktivität nicht wesentlich beeinträchtigen. Vorzugsweise hat das Analogon mindestens dieselbe Aktivität wird das native Molekül. Ein IGF-Analogon umfasst auch Peptide, die ein oder mehrere Peptidmimiks ("Peptoide") haben, z. B. die, die in der Internationalen Publikation Nr. WO 91/04282 beschrieben sind. Darüber hinaus kann das Analogon zusätzliche Modifikationen enthalten, die die Aktivität nicht beeinträchtigen, z. B. posttranslationale Modifikationen, die z. B. eine Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung usw. einschließen, wie auch zusätzliche Aminosäuresubstitutionen-, -deletionen oder -additionen.
Mit dem Ausdruck "authentisches, korrekt gefaltetes IGF" ist ein biologisch aktives IGF-Polypeptid gemeint, das in einem Hefewirt produziert wird, und das dieselbe Tertiärstruktur wie ein ausgewähltes Referenzmolekül hat. Wenn das Referenzmolekül, das Volllängen-, Wildtyp-IGF-I ist, würde somit ein authentisches, korrekt gefaltetes, rekombinant produziertes IGF-I dieselben drei Disulfidbrücken in der Kette haben, wie sie im Wildtyp-Molekül gefunden werden. Wenn das Referenzmolekül ein Analogon von IGF ist, würde das authentische, korrekt gefaltete, rekombinant produzierte Molekül dieselben Brücken in der Kette haben, wie sie im Analogon gefunden werden. Die Aktivität kann wie oben beschrieben bestimmt werden.
Mit "Hefe" ist eine beliebige der verschiedenen Hefen gemeint, die fähig ist, ein Gen zu exprimieren, das für IGF codiert. Solche Hefen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Askosporenhefen (Endomycetales), Basidiosporenhefen und Hefen, die zur Gruppe Fungi imperfecti (Blastomycetes) gehören. Die Ascosporenhefen werden in zwei Familien, Spermophthoraceae und Saccharomycetaceae, eingeteilt. Die Letztgenannte umfasst vier Unterfamilien, Schizosaccharomycoideae, (z. B. Gattung Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae und Saccharomycoideae (z. B. Gattung Pichia, Kluyveromyces und Saccharomyces). Die Basidiosporenhefen umfassen die Gattungen Leucosporidium, Rhodospo ridium, Sporidiobolus, Filobasidium und Filobasidiella. Hefen, die zu den Fungi imperfecti gehören, werden in zwei Familien eingeteilt, Sporobolomycetaceae (z. B. Gattung Sporobolomyces und Bullera) und Cryptococcaceae (z. B. Gattung Candida).
Für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind Spezies innerhalb der Gattungen Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis und Candida von besonderem Interesse; diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa und H. polymorpha.
Ein "Hefewirt" oder eine "Hefewirtszelle" bezieht sich auf eine Hefe, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-DNA verwendet werden kann oder verwendet wurde. Der Ausdruck beinhaltet die Nachkommenschaft der ursprünglichen Hefezelle, die transfiziert wurde. Es ist einzusehen, dass die Nachkommenschaft einer einzelnen Elternzelle in der Morphologie oder im genomischen oder Gesamt-DNA-Komplement mit den ursprünglichen Eltern nicht unbedingt vollständig identisch sein kann und zwar infolge einer zufälligen oder bewussten Mutation. Die Nachkommenschaft der Elternzelle, die mit der Elternzelle ausreichend ähnlich ist um durch die relevanten Eigenschaften charakterisiert zu werden, z. B. durch das Vorliegen einer Nukleotidsequenz, die für ein IGF-Polypeptid codiert, sind in der Nachkommenschaft, auf die durch die vorliegende Definition abgezielt wird, enthalten.
Eine "transformierte" Hefezelle ist eine, die ein exogenes Polynukleotid enthält, und zwar ungeachtet des zur Insertion eingesetzten Verfahrens: z. B. direkte Aufnahme, Transduktion oder f-Paarung. Das exogene Polynukleotid kann als nicht integrierter Vektor, z. B. Plasmid, aufrecht erhalten werden oder kann alternativ in das Wirtsgenom integriert werden.
Mit "Hefezellmedium" ist ein beliebiges Kulturmedium oder eine Lösung gemeint, die Hefezellen enthält oder die Hefezellinhalte enthält. Somit umfasst der Ausdruck Medien, in denen die Hefezellen gewachsen sind, z. B. Medien, in die die IGF-Polypeptide sezerniert wurden, einschließlich Medien sowohl vor oder nach einem Fermentationsschritt. Der Ausdruck umfasst auch Puffer oder Reagentien, die Hefezelllysate enthalten, z. B. in dem Fall, in dem die IGF-Polypeptide intracellulär produziert werden und die Hefezellen unter Freisetzung der IGF-Polypeptide lysiert oder aufgebrochen werden.
Eine Zusammensetzung, die A enthält, ist "im Wesentlichen frei von" B, wenn mindestens 80 Gew.-% der Summe A + B in der Zusammensetzung A sind. Vorzugsweise umfasst A mindestens etwa 85 bis 90 Gew.-% der Summe aus A + B in der Zusammensetzung.
II. Modi zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung eines Reinigungsverfahrens, das für die Isolierung von authentischen, korrekt gefalteten IGF-Polypeptiden aus transformierten Hefewirten sorgt. Die Proteinausbeuten werden dadurch infolge der Eliminierung fehlgefalteter IGF-Formen erhöht. Das Verfahren umfasst eine Reihe von Isolierungsstufen, einschließlich einer Rückfaltungsstufe, in der die Disulfidbindungen verschiedener IGF-Formen, die in einem Gemisch vorliegen, reduziert werden und dann reoxidiert werden um die Menge an vorliegenden aberrierenden IGF-Formen zu veringern. Somit hat das Endprodukt mehr authentischen IGF als das Ausgangsmaterial.
Die IGFs der vorliegenden Erfindung werden rekombinant in Hefen produziert, wobei Techniken verwendet werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Siehe z. B. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, 1989); Elliott et al., J. Protein Chem. (1990) 9:95– 104; und U.S. Patente Nr. 5 231 178 und 5 324 639. Beispielsweise kann IGF in methylotrophen Hefetransformanten produziert werden, z. B. in einem Protease-defizienten P. pastoris-Stamm (siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5 324 639), wobei die IGF-codierende Sequenz an eine Signalsequenz gebunden ist, die die Sekretion und die proteolytische Prozessierung des Proteinprodukts steuert. Die vorliegende Erfindung wird anhand von P. pastoris und S. cerevisiae als Beispiele beschrieben. Die Erfindung ist allerdings nicht auf diese Hefen beschränkt.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder integrierende Vektoren, wurden zur Transformation in viele Hefewirte entwickelt. Beispielsweise wurden Expressionsvektoren unter anderem für die folgenden Hefen entwickelt: Saccharomyces cerevisia, wie beschrieben in Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153:163; Candida albicans, wie beschrieben in Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6:142; Candida maltosa, wie beschrieben in Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25:141; Hansenula polymorpha, wie beschrieben in Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459 und Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302); Kluyveromyces fragilis, wie beschrieben in Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158:1165; Kluyveromyces lactis, wie beschrieben in De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154:737 und Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8:135; Pichia guillerimondii, wie beschrieben in Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25:141; Pichia pastoris, wie beschrieben in Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376 und U.S. Patent Nr. 4 837 148, 4 929 555, 5 324 639; Schizosaccha romyces pombe, wie beschrieben in Beach und Nurse, Nature (1981) 300:706; und Yarrowia lipolytica, wie beschrieben in Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10:380 und Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10:49; Aspergillus-Wirte, wie z. B. A, nidulans, wie beschrieben in Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284–289; Tilburn et al., Gene (1983) 26:205–221 und Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1984) 81:1470–1474 und A. niger, wie beschrieben in Kelly und Hynes, EMBO J. (1985) 4:475479; Trichoderma reesia, wie beschrieben in EP 244 234 und fädige Pilze, wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, wie beschrieben in Wo 91/00357.
Die Kontrollsequenzen für Hefevektoren sind bekannt und umfassen Promotorregionen aus Genen, z. B. Alkoholdehydrogenase (ADH), wie in EP 284 044 beschrieben, Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase und Pyruvatkinase (PyK), wie in EP 329 203 beschrieben. Das Hefe-PH05-Gen, das für saure Phosphatase codiert, liefert auch nützliche Promotorsequenzen, wie dies in Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:1 beschrieben ist. Andere geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase, wie in Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:2073 beschrieben, oder andere glycolytische Enzyme, z. B. Pyruvatdecarboxylase, Triosephosphatisomerase und Phosphoglucoseisomerase, wie in Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7:149 und Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900 beschrieben. Induzierbare Hefepromotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer Transkription, die durch Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, haben, umfassen aus der obigen Liste und anderen die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus verbunden sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3- phosphat-dehydrogenase und Enzyme, die für eine Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefeexpression werden außerdem von Hitzeman, EP 073 657 beschrieben.
Hefeenhancer werden auch vorteilhafterweise mit Hefepromotoren verwendet. Außerdem fungieren synthetische Promotoren, die in der Natur nicht auftreten, als Hefepromotoren. Beispielsweise können die Transkription erhöhende Sequenzen stromaufwärts vom Promotor (UAS) eines Hefepromotors mit der die Transkription erhöhenden Sequenz eines anderen Hefepromotors verknüpft sein, wodurch ein synthetischer Hybridpromotor erzeugt wird. Beispiele für solche Hybridpromotoren umfassen die regulatorische ADH-Sequenz, die an die die Transkription erhöhende GAP-Region gebunden ist, wie sie in den U.S. Patenten Nrn. 4 876 197 und 4 880 734 beschrieben ist. Andere Beispiele für Hybridpromotoren umfassen Promotoren, die aus den regulatorischen Sequenzen aus einem der Gene ADH2, GAL4, GAL10 oder PHO5 bestehen, kombiniert mit der die Transkription erhöhenden Region eines glycolytischen Enzymgens, z. B. GAP oder PyK, wie es in EP 164 556 beschrieben ist. Darüber hinaus kann ein Hefepromotor natürlich vorkommende Promotoren Nicht-Hefe-Ursprungs umfassen, die die Fähigkeit haben, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und eine Transkription zu initiieren.
Andere Kontrollelemente, die in den Hefe-Expressionsvektoren enthalten sein können, sind Terminatoren, z. B. aus dem GAPDH- und aus dem Enolase-Gen, wie es z. B. in Holland et al., J. Biol. Chem. (1981) 256:1385 beschrieben ist, sowie Leadersequenzen, die für Signalsequenzen zur Sekrektion codieren. DNA, die für geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte Hefeproteine, z. B. das Hefeinvertasegen, wie es in EP 012 873 und JP 62 096 086 beschrieben ist, und das α-Faktor-Gen, wie es in den U. S. Patenten Nr. 4 588 684, 4 546 083 und 4 870 008, EP 324 274 und WO 89/02463 beschrieben ist, wie auch von Phosphataseleadern abgeleitet werden. Alternativ sorgen auch Leader aus Nicht-Hefe-Ursprung, z. B. Interferon-Leader, für eine Sekretion in Hefe, wie es in EP 060 057 beschrieben ist.
Der Replikationsursprung aus dem 2 μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trpl-Gen, das in dem Hefeplasmid vorliegt, das in Kingsman et al., Gene (1979) 7:141 oder Tschemper et al., Gene (1980) 10:157 beschrieben ist. Das trpl-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Mutanten-Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit, in Tryptophan zu wachsen, fehlt. Entsprechend sind Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20 622 oder 38 626) durch bekannte Plasmide, die das Leu2-Gen tragen, komplementiert.
Verfahren zur Einführung exogener DNA in Hefewirte sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umfassen typischerweise entweder die Transformation von Sphäroplasten oder von intakten Hefezellen, die mit Alkalikationen behandelt wurdne. Beispielsweise können Transformationen in Hefe nach dem Verfahren durchgeführt werden, das in Van Solingen et al., J. Bact. (1977) 130:946 und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:3829 beschrieben ist. Allerdings können auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, z. B. durch Kerninjektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion, angewendet werden, wie es allgemein von Sambrook et al., oben zitiert, beschrieben wird. Hefezellen werden dann unter Verwendung von Standardtechniken kultiviert.
Der IGF wird entweder sezerniert, wenn geeignete Leadersequenzen verwendet werden, oder intracellulär produziert und die Zellen werden so manipuliert, dass sie eine geeignete Isolierung eines IGF-enthaltenden Produktes ermöglichen.
Zur optimalen Produktion von rekombinantem IGF wird zur Zellamplifikation im Allgemeinen eine Fermentationsstufe verwendet. Diesbezüglich können die transformierten Hefestämme zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung während der Amplifikationsstufe in Fermentoren wachsen gelassen werden, wobei Standard-Chargen-Zuführungs-Fermentationsverfahren eingesetzt werden. Diese Verfahren werden einige allgemeine Merkmale haben, die vom verwendeten Hefestamm unabhängig sind, z. B. ein Fermentationsmedium, das so konzipiert ist, dass es adäquate Mengen an Kohlenstoff, Stickstoff, Basissalzen, Phosphor und anderen Mikronährstoffen (Vitamine, Spurenmineralien und Salze usw.) enthält. Außerdem ein das Wachstum begrenzender Nährstoff, typischerweise Kohlenstoff, dem Fermentor während der Amplifikationsphase zugesetzt um ein maximales Wachstum zu ermöglichen.
Solche Verfahren können infolge von Unterschieden in ihrem Kohlenstoff-Verwertungsweg oder des Modus der Expressionskontrolle an einen besonderen Hefestamm angepasst werden. So kann z. B. eine Saccharomyces-Hefefermentation eine einfache Glucosezufuhr, eine komplexe Stickstoffquelle (z. B. Caseinhydrolysate) und eine Ergänzung mit mehreren Vitaminen erfordern. Dies steht im Gegensatz zu der methylotrophen Hefe Pichia pastoris, die für optimales Wachstum und Expression die Zufuhr von Glycerin, Methanol und Spurenmineralien verlangt, aber nur einfache Ammonium(Stickstoff)-Salze benötigt. Siehe z. B. Elliott et al., J. Protein Chem. (1990) 9:95–104, U.S. Patent Nr. 5 324 639 und Fieschko et al., Biotechnol. Bioeng. (1987) 29:1113–1121.
Z. B. werden geeignete Fermentationsmedien zur Verwendung mit Saccharomyces in den Tabellen 1 und 2 der Beispiele beschrieben. Geeignete Medien zur Verwendung mit Pichia sind in den U.S. Patenten Nr. 5 231 178 und 5 324 639 und in der folgenden Tabelle beschrieben.

Salze können während der Fermentation vorhanden sein oder können vorzugsweise als Einzeldosis zu Beginn des Fermentationsverfahrens zugesetzt werden. Besonders bevorzugte Basissalz- und Spurensalz-Medien für die Pichia-Fermentation sind unten angegeben. Wenn diese Formulierung verwendet wird, kann eine Einzeldosis der Salze gegeben werden; im Allgemeinen werden etwa 1 bis 5 ml Basissalzformulierung pro Liter Ausgangsvolumen des Fermentationsmediums zugesetzt, bevorzugter werden etwa 1 bis 3 ml pro Liter Medium und am bevorzugtesten werden 2 ml pro Liter zu Beginn der Fermentation zugesetzt. BASISSALZE

Chemikalie	Gramm/Liter
Phosphorsäure, 85%	47,7 ml
Calicumsulfat·2H₂O	0, 96
Kaliumsulfat	18,2
Magnesiumsulfat·7H₂O	14, 9
Kaliumhydroxid	4,13

SPURENSALZE

Kupfer(II)-sulfat·5H₂O	6, 0
Natriumiodid	0,08
Mangansulfat·H₂O	3, 0
Natriummolybdat·2H₂O	0, 2
Borsäure	0,02
Kobaltchlorid	0,5
Zinkchlorid	20,0
Eisen(II)-sulfat·7H₂O	65, 0
Biotin	0,20
Schwefelsäure	5,0 ml

Während der Fermentation werden eine Vielzahl von IGF-Formen in das Medium sezerniert, einschließlich Analoga, abgebaute oder geschnittene monomere Formen, oxidierte und glycosylierte Monomere, zahlreiche multimere Formen, z. B. Dimere, Trimere usw., wie auch eine fehlgefaltete Hauptspezies, die eine Disulfid-gebundene Isoform von IGF ist. Der authentische, korrekt gefaltete, monomere IGF liegt ebenfalls vor. Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute an gereinigten, authentischen IGF-Polypeptiden aus diesem Gemisch kann das folgende Verfahren durchgeführt werden.
Der Fermentor wird geerntet und Zellen werden unter Anwendung von Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, aus den fermentierten Medien entfernt, z. B. durch Zentrifugation oder Mikrofiltration oder eine Kombination dieser beiden. Beispielsweise wird eine Mikrofiltration unter Verwendung eines geeigneten Filters ausreichen um unerwünschten cellulären Debris zu entfernen.
Vor einer Zellentfernung kann es wünschenswert sein, einen Schritt der alkalischen Schockbehandlung durchzuführen. Die alkalische Schockbehandlung beinhaltet Zusatz eines Alkalis, z. B. eines Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-Hydroxids oder anderer geeigneter Hydroxide, die für die Ausbeute des rekombinanten Proteins nicht schädlich sind. Die zugesetzte Menge des Alkalis ist ausreichend um den End-pH des Kulturmediums auf zwischen etwa pH 8 und 12, vorzugsweise etwa pH 10 und 11, einzustellen. Die Zellen werden dem alkalischen Schock über einen Zeitraum, der zwischen etwa 30 Minuten und etwa 10 Stunden liegt, vorzugsweise zwischen etwa 1 Stunde und etwa 8 Stunden und bevorzugt zwischen etwa 2 und 4 Stunden liegt, ausgesetzt. Die Kulturtemperatur kann in einem Bereich von etwa 25°C bis etwa 35°C gehalten werden. Zusätze von Thiolen vor oder während der alkalischen Schockbehandlung können die Ausbeute an IGFs erhöhen. Die zugesetzte Thiolmenge kann im Bereich zwischen etwa 0,05 mmol und etwa 50 mmol liegen.
Sobald Zellen und Debris entfernt sind, kann der pH der zellfreien Fermentationsbrühe auf etwa pH 3 bis 7, bevorzugter etwa 3 bis 4, eingestellt werden und die Brühe auf eine Kationenaustauschsäule aufgebracht werden, um die in Fermentationsmedium vorhandenen IGF-Spezies, einschließlich der aberrierenden und authentischen Formen, einzufangen. Kationenaustausch dient auch dazu, einige Hefekontaminanten zu eliminieren. Vor der Kationenaustauschchromatographie kann ein zusätzlicher Filtrationsschritt unter Verwendung z. B. eines Polypropylen-Tiefenfilters angewendet werden.
Geeignete Kationenaustauscher umfassen eine weite Vielzahl von Materialien, die auf dem Gebiet bekannt sind. Besonders bevorzugt sind starke Kationenaustauscher, die fähig sind, IGF-Polypeptide über einen weiten pH-Bereich zu binden. Beispielsweise sind carboxymethylierte und sulfonierte Kationenaustauschermatrices zur Verwendung hierin besonders nützlich. Einsetzbare Matrixmaterialien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Cellulosematrices, wie z. B. faserartige, mikrogranuläre und kugelförmige Matrices; Agarose-, Dextran-, Polyacrylat-, Polyvinyl-, Polystyrol-, Siliciumdioxid- und Polyethermatrices und Verbundstoffe. Besonders bevorzugt hier sind Matrices, die den funktionellen Liganden R-SO₃ ^– enthalten, vorzugsweise Sulfopropylharze. Typische Matrices umfassen TosoHaas Toyopearl SP550C und Merck Fractogel EMD SO₃ ^–650 (m).
Vor Auftragen des Fermentationsmediums kann die Kationenaustauschmatrix äquilibriert werden, indem mehrere Säulen-Volumina einer verdünnten, schwachen Säure (siehe z. B. Säulenvolumina 20 mM Essigsäure, pH 3) verwendet werden. Nach Äquilibrierung wird das Fermentationsmedium zugesetzt und die Säule kann ein- bis mehrmals gewaschen werden, bevorzugt die IGF-Spezies eluiert werden, wobei auch eine schwache Säurelösung, z. B. eine schwache Essigsäure- oder Phosphorsäurelösung, verwendet wird. Beispielsweise können etwa 2 bis 4 Säulenvolumina 20 mM Essigsäure, pH 3, verwendet werden um die Säule zu waschen. Weitere Waschgänge unter Verwendung von z. B. 2 bis 4 Säulenvolumina 0,05 M Natriumacetat, pH 5,5, oder 0,05 M Natriumacetat, vermischt mit 0,1 M Natriumchlorid, pH 5,5, können ebenfalls verwendet werden.
Nach Adsorption der IGF-Moleküle an den Kationenaustauscher werden die IGF-Polypeptide eluiert, indem die Matrix mit einem Puffer in Kontakt gebracht wird, der einen ausreichend hohen pH oder eine ausreichende Ionenstärke hat, um die IGF-Polypeptide von der Matrix zu verdrängen. Beispielsweise kann eine 0,05 M Natriumacetat-, 0,4 M Natriumchlorid-Lösung mit pH 5,5 verwendet werden. Ein anderer beispielhafter Elutionspuffer umfasst einen Puffer, der 0,1 M Kaliumborat, 0,6 M Kaliumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH 8,7, enthält. Allerdings finden auch andere Puffer, die dem Fachmann bekannt sind, hier Anwendung. Die Menge des Elutionspuffers kann in großem Umfang variieren und wird im Allgemeinen im Bereich von etwa 2 bis 10 Säulenvolumina liegen. Nach der Elution kann das Eluat bezüglich der Gesamt-IGF-Konzentration untersucht werden.
Nach dem Kationenaustauschschritt oder fakultativ während oder unmittelbar nach der Fermentation kann ein Rückfaltungsschritt durchgeführt werden um aberrierende multimere IGF-Formen in authentisches IGF umzuwandeln; dadurch wird die Ausbeute an authentischem IGF um das Zwei- bis Dreifache oder mehr erhöht. Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von authentischem, korrekt gefalteten IGF aus aggregierten, nicht korrekt gefalteten Formen über einen Rückfaltungsschritt bekannt. Siehe z. B. Hart et al., Biotechnology Appl. Biochem. (1994) 20:217–234; Chang und Swartz, Protein Folding: in vivo and in vitro (American Chemical Society, 1993), S. 178–188; Miller et al., Biochemistry (1993) 32:5203–5213; Newa et al., Ann. NY Acad. Sci. (1986) 469:31–52; und Meng et al., J. Chromatog. (1988) 443:183–192.
Solche Verfahren umfassen allgemein die Verwendung eines Denaturierungspuffers, z. B. ein Natriumborat- oder Natriumcarbonat-Puffer, der denaturierende Mittel enthält, z. B. Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid und/oder ein Thiol, z. B: DTT, Glutathion, β-Mercaptoethanol, Monothioglycerin und Mercaptoessigsäure um existierende Disulfidbrücken zu reduzieren. Andere Puffer, die einen Disulfidbindungsaustausch anpassen werden, können ebenfalls verwendet werden. Ein Salz, z. B. eine beliebige herkömmliche Salzlösung einschließlich Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw., und ein Alkohol, z. B. Ethanol, Propanol, Butanol usw., werden auch vorliegen.
Dem Rückfaltungsgemisch können ein oder mehrere zweiwertige Metalle, z. B. Cu⁺⁺, Mn⁺⁺, Ni⁺⁺, Zn⁺⁺ und/oder Fe⁺⁺, zugesetzt werden um die Ausbeute an authentischem, korrekt gefaltetem IGF zu erhöhen. Der Zusatz von Cu⁺⁺ ist besonders bevorzugt. Metall wird zur Erzielung einer Endkonzentration von etwa 0,1 μM bis 10 μM, bevorzugter etwa 0,2 μM bis etwa 8 μM und am bevorzugtesten etwa 0,5 μM bis etwa 6 μM zugesetzt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren für die Reduktion von aberrierenden Disulfidbindungen umfasst die Verwendung eines Puffers, der hohe Harnstoffkonzentrationen, z. B. etwa 1 M bis etwa 4 M, vorzugsweise etwa 1,5 M bis etwa 3 M und am bevorzugtesten etwa 2 M, kombiniert mit etwa 1 mM bis etwa 75 μM Natriumborat, bevorzugter etwa 3 bis etwa 50 mM Natriumborat, am bevorzugtesten 50 mM Natriumborat; 0,5 bis etwa 3 M Natriumchlorid, bevorzugter 1 bis etwa 1,5 M Natriumchlorid; 10% bis etwa 30% Ethanol, bevorzugter 15% bis etwa 25% Ethanol; einen etwa 0,5- bis 7-Fachen molaren Überschuss an DTT, bevorzugter eine etwa äquimolare Menge bis einen etwa 6-Fachen molaren Überschuss und vorzugswei se eine etwa äquimolare Menge bis etwa einen 5-Fachen molaren Überschuss an DTT umfasst. Die Menge an Reduktionsmittel ist nicht kritisch, allerdings gilt, je mehr Agens zugesetzt wird, desto länger wird eine Reoxidation benötigen. CuCl₂ kann dem Puffer als Quelle für Cu⁺⁺ zugesetzt werden, derart, dass eine Endkonzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 10 μM, bevorzugter etwa 0,2 μM bis etwa 8 μM und am bevorzugtesten etwa 0,5 μM bis etwa 6 μM erreicht wird.
Der End-pH des Puffers ist etwa 8 bis 12, bevorzugter etwa 9 bis etwa 11. Ein Carbonatpuffer anstelle des Natriumboratpuffers kann ebenfalls verwendet werden. Die Reaktion wird über mehrere Stunden bei Raumtemperatur ablaufen gelassen, z. B. für etwa 8 bis etwa 24 Stunden, bevorzugter für etwa 10 bis etwa 18 Stunden und am bevorzugtesten für etwa 10 bis etwa 12 Stunden oder bis die Rückfaltung komplett ist, was durch CN-HPLC bestimmt wird, wobei während dieser Zeit eine Denaturierung, eine Neuverteilung der Disulfidbrücken und eine Renaturierung auftritt.
Das Produkt kann z. B. unter Anwendung einer Diafiltration dialysiert werden um die Rückfaltungsreagentien zu entfernen und eine Präzipitation zu vermeiden, wenn der pH eingestellt wird, speziell wenn eine Rückfaltung in einem Carbonatpuffer erfolgt. Eine Diafiltration wird normalerweise unter Verwendung von beispielsweise eines Natriumborat- oder Carbonatpuffers durchgeführt. Der pH der Lösung wird auf sauer, beispielsweise unter Verwendung von z. B. HCL auf pH 1,5 bis etwa 5, vorzugsweise 2 bis etwa 4, eingestellt. Nach Rückfaltung (oder nach der Kationenaustauschstufe, wenn die Rückfaltung vor einem Kationenaustausch erfolgt ist) können weitere Ultrafiltrations-, Diafiltrations- und Salzpräzipitationsstufen durchgeführt werden um Kontaminanten mit hohem Molekulargewicht zu entfernen und die Bindungsaffinität von IGF für eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie(HIC)-Matrix zu erhöhen. Eine Salzpräzipitation erfolgt im Allgemeinen unter Verwendung eines beliebigen verschiedener Salze, z. B., allerdings ohne Beschränkung auf, Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat, Kaliumphosphat, Natriumacetat, Ammoniumacetat, Natriumchlorid, Natriumcitrat und dergleichen; dabei wird eine Salzkonzentration von etwa 0,2 M bis etwa 2 M, bevorzugter etwa 0,3 bis 1 M verwendet. Ammoniumsulfat ist bei einer Konzentration von etwa 0,5 M bis etwa 1 M besonders bevorzugt.
Dann wird eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) an dem isolierten Produkt durchgeführt. Dieser Schritt verringert die glycosylierten und oligomeren Spezies und reduziert die Hefekontaminanten wesentlich. Geeignete HIC-Matrices umfassen Alkyl- oder Aryl-substituierte Matrices, z. B. Butyl-, Hexyl-, Octyl- oder Phenyl-substituierte Matrices, einschließlich Agarose-, vernetzte Agarose-, Sepharose-, Cellulose-, Siliciumdioxid-, Dextran-, Polystyrol-, Poly(methacrylat)-Matrices usw. Besonders bevorzugte HIC-Matrices umfassen ein Harz des gemischten Modus, z. B. ein Polyethylenaminharz, z. B. körnige Amicon-Silica-PAE 100L-Matrix aus 50 μm-Perlen, oder eine Butyl- oder Phenyl-substituierte Poly(methacrylat)-Matrix, z. B. TosoHaas Toyopearl Butyl 650M-Matrix bzw. TosoHaas Toyopearl Phenyl 65 μ-Harz.
Vor dem Aufladen wird die Säule unter Verwendung von Standardpuffer, z. B. einer Essigsäure/Natriumchlorid-Lösung oder HEPES, enthaltend Ammoniumsulfat, äquilibriert und die Säule mit der Probe beladen. Diese Säule wird dann unter Verwendung von Standardpuffern und unter Bedingungen, wie z. B. den oben Beschriebenen gewaschen. IGF kann mit etwa 3 bis etwa 10 Säulenvolumina eines Standardpuffers, unter anderen z. B. mit HEPES-Puffer, der EDTA und eine geringere Ammoniumsulfatkonzentration als der Äquilibrierungspuffer enthält, oder einem Essigsäure/Natriumchlorid-Puffer eluiert werden. Ein abnehmender linearer Salzgradient, der z. B. einen Ammoniumsulfatgradienten verwendet, kann ebenfalls eingesetzt werden um die IGF-Moleküle zu eluieren. Das Elutionsmittel wird dann gegebenenfalls, z. B. durch Filtration, wie Diafiltration oder Ultrafiltration, konzentriert. Eine Diafiltration eliminiert Ammoniumsulfat und verringert die Leitfähigkeit.
Dann kann ein zusätzlicher Kationenaustauschchromatographieschritt durchgeführt werden um die Menge an glycosylierter Spezies weiter zu verringern. Allerdings ist dieser Schritt nicht notwendig, speziell wenn der Hefewirt P. pastoris ist. Geeignete Kationenaustauschmatrices sind wie oben beschrieben. Vor einem Auftragen wird die Säule äquilibriert, wie es ebenfalls oben beschrieben wurde. IGF-Spezies werden unter Verwendung von Standardpuffer, z. B. ein Bicinpuffer, der etwa 50 bis etwa 100 mM Bicin, bevorzugter etwa 75 mM Bicin; 25 bis etwa 100 mM Natriumchlorid, vorzugsweise etwa 50 mM Natriumchlorid und etwa 0,05 bis etwa 0,5 EDTA, vorzugsweise etwa 0,1 mM EDTA, pH 7,5, enthält.
Danach wird an dem Gemisch eine reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) durchgeführt um Kontaminanten, wie z. B. met-oxidierte, glycosylierte, geschnittene, abgebaute und fehlgefaltete Spezies, einschließlich einer des2-IGF-Spezies, zu entfernen. Dabei werden mit Siliciumdioxide derivatisierte Harze mit Alkylfunktionalitäten, speziell C₃ bis C₁₀, bevorzugter C₃ bis C₉ und am bevorzugtesten C₃ bis C₈, Verwendung finden. Es kann auch ein polymeres Harz verwendet werden, z. B. das Toso-Haas Amberchrome CG1000sd-Harz, das ein Styrolpolymerharz ist. Die Säule kann mit einem Lösungsmittel, z. B. Ethanol, beispielsweise mit einer Konzentration von 15% bis etwa 25% gewaschen werden.
Ein geeigneter Elutionspuffer, der ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Propanol, Tetrahydrofuran, Acetonitril oder Ethanol enthält, wird zur Elution der au thentischen IGF-Polypeptide Verwendung finden. Eine Elution kann unter Verwendung eines oder mehrerer Gradienten oder isokratischer Bedingungen durchgeführt werden, wobei Gradientenbedingungen bevorzugt sind um die Trennungszeit zu reduzieren und die Auflösung zu verbessern. Im Allgemeinen ist der Gradient von etwa 5% bis etwa 80% (V/V) Lösungsmittel in Wasser, bevorzugter von etwa 5% bis etwa 60% (V/V) und am vorteilhaftesten von etwa 10% bis etwa 50% (V/V) Lösungsmittel in Wasser. Ein besonders bevorzugtes Verfahren beinhaltet die Verwendung von zwei Gradienten, wobei der erste von etwa 10% bis etwa 25% Lösungsmittel, bevorzugter etwa 14% bis etwa 22% Lösungsmittel ist. Der zweite Gradient umfasst etwa 20% bis etwa 30% Lösungsmittel, bevorzugter etwa 22% bis etwa 26% Lösungsmittel. Besonders bevorzugte Elutionspuffer zur Verwendung in diesem Zusammenhang umfassen Ammoniumacetat-, Acetonitril-Lösungen, pH 6,7.
Ein Endfiltrationsschritt, z. B. unter Verwendung der Gelfiltraton, Ultrafiltration und dergleichen, kann mit dem RP-HPLC-Produkt durchgeführt werden um überschüssige Salze zu entfernen und den Puffer durch einen geeigneten Puffer zur Formulierung des endgültigen Arzneimittelproduktes zu ersetzen. Das filtrierte Produkt kann auch unter Verwendung einer Diafiltration, Lyophilisierung, usw. konzentriert werden.
Die Ausbeute an IGF-Polypeptiden, einschließlich authentischem IGF, kann in jedem oben beschriebenen Schritte überwacht werden, wobei eine beliebige verschiedener reverse-phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäulen, z. B. Cyano-RP-HPLC, C₄-RP-HPLC, C₈-RP-HPLC, wie auch Kationenaustausch-HPLC- und Größenausschluss-HPLC, verwendet wird. Die Reinheit kann unter Verwendung von Standardtechniken, z. B. SDS-PAGE oder durch Messen der Nicht-IGF-Proteine unter Verwendung von Western-Blot- und ELISA-Assays bestimmt werden. Beispielsweise können polyklonale Antikörper gegen Proteine erzeugt werden, die aus einer Hefefermentation als negative Kontrolle und der Kationenaustauschgewinnung isoliert wurden. Die Antikörper können verwendet werden um auf das Vorliegen von kontaminierenden Wirtszellproteinen durchzumustern.
Typischerweise wird die Ausbeute an IGF-Polypeptiden in jedem Schritt mindestens etwa 50% oder mehr, bevorzugter etwa 60% bis etwa 80% oder mehr sein. Beispielsweise liefert der erste Kationenaustauschschritt typischerweise etwa 90% Wiedergewinnung, welche alle IGF-Spezies beinhaltet, von denen etwa 10% authentischer, korrekt gefalteter IGF ist. Der Rückfaltungsschritt erhöht die Menge an authentischem IGF typischerweise um das 2- bis 3-Fache. Der hydrophobe Wechselwirkungschromatographieschritt liefert im Allgemeinen etwa 80% bis 90% Wiedergewinnung, der zweite Kationen-austauschschritt liefert etwa 80% Wiedergewinnung und die RP-HPLC-Säule liefert etwa 90% bis 95% Wiedergewinnung.
Sobald der authentische, korrekt gefaltete IGF gereinigt ist, kann er für eine Vielzahl von Zwecken eingesetzt werden. Der IGF kann z. B. eingesetzt werden um das Wachstum von Zellen in vitro bei einer Vielfalt von Geweben und Zelltypen zu stimulieren. Die gereinigten IGFs können auch zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden und beispielsweise zur Knochenreparatur- und Ersatztherapie, zur Behandlung von Osteoporose, zur Hemmung einer inflammatorischen Reaktion, einer ischämischen Verletzung und einer Organabstoßung nach Transplantation und zur Erhöhung der Milchbildung und Fleischproduktion bei Rind und anderen Bauernhoftieren verwendet werden.
Unten sind Beispiele spezifischer Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung angeführt. Die Beispiele dienen nur erläuternden Zwecken und sollen den Rahmen der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beschränken.
Beispiel I
Herstellung von rekombinantem IGF in S. cerevisiae
Rekombinantes humanes IGF-I-Protein (rhIGF-I) wurde in S. cerevisiae, Stamm JSC417, der mit Plasmid pYLUIGF1-24 transformiert war, exprimiert. Der Hefestamm JSC417 war bei der American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 2. August 1994 mit der ATCC-Zugangsnummer 74295 hinterlegt worden. Der Stamm JSC417 war vom Stamm AB110 abgeleitet. JSC417 hat den folgenden Genotyp: Mata, ura 3–52, leu 2, pep 4–3, his 4–580, [cir⁰].
Eine Expression von rhIGF-I in S. cerevisiae, Stamm JSC417, war nicht-konstitutiv und stand unter der Regulierung eines Hybrid-ADH2-GAP-Promotors, der von den Promotorsequenzen von Hefealkoholdehydrogenase, wie in Beier, Nature (1982) 300:724 beschrieben, und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, wie in EP 120 551 beschrieben, abgeleitet worden war. Außerdem wurden die rhIGF-I-Sequenzen an den Hefe-α-Faktor-Leader fusioniert, der für eine Sekretion sorgte, und an den Hefe-α-Faktor-Terminator fusioniert, die beide in Brake, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:4642 beschrieben sind. Die Induktion der rhIGF-I-Expression wurde erreicht, indem niedrige Glucosekonzentrationen im Wachstumsmedium während der Fermentation aufrecht erhalten wurden.
Plasmid pYLUIGF1-24 ist ein Hefeexpressionsvektor, der die Sequenz, die für rhIGF-I codiert, in die BamHI-Stelle von Vektor pAB24 cloniert, wie in Barr, Bio/Technology (1987) 5:486 beschrieben, wie auch pBR322-Sequenzen, einschließlich des Gens für Ampicillinresistenz (ampR), 2-Mikrometer (2 μ)-Sequenzen und die LEU 2- und URA-3-Hefegene enthält. Die Expressionskassette für rhIGF-I besteht aus (5' zu 3') ADH2-Regulationssequenzen, einem GAP-Promotor, einem α-Faktor-Leader, einem synthetischen rhIGF-I-Gen und einem α-Faktorterminator, wie es in EP 123 228 beschrieben ist.
Das rhIGF-I-Gen, das in die Expressionskassette cloniert war, wurde chemisch synthetisiert, indem das Phosphoramiditverfahren, wie es von Urdea, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80:7461 beschrieben wurde, und die Aminosäuresequenzen nach Dayhoff verwendet wurden.
S. cerevisiae-Zellen wurden mit dem Plasmid pYLUIGF1-24 nach einem Standardprotokoll, wie es in Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75:1929 beschrieben wurde, transformiert. Kurz ausgedrückt, das Transformationsgemisch wurde auf Uracil-defiziente selektive Platten plattiert, die eine Hefe-Stickstoff-Grundlage mit Aminosäuren, enthaltend 2% Glucose, darstellten. Die Platten wurden vier Tage bei 30°C inkubiert. Transformantenkolonien wurden in Leucin-defizientes, selektives Mediim mit 8% Glucose transferiert und bei 30°C wachsen gelassen. Die Expression von rhIGF-I wurde durch Wachsenlassen der Hefetransformanten in Uracil-defizientem Medium mit 4% Glucose bei 30°C für 48 Stunden durchgeführt. Eine Expression von rhIGF-I im Medium wurde nach 48 Stunden nach verschiedenen Verfahren, einschließlich RP-HPLC, SDS-PAGE, RIA oder Radiorezeptorassay analysiert.
Die Produktion von rhIGF-I involvierte die sukzessive Amplifikation der Hefezellen, die im Mutterhefeansatz-Aliquot enthalten waren. Die erste Amplifikationsstufe wurde in Schüttelflaschen bei einer kontrollierten Temperatur von etwa 30°C in einem Drehschüttelinkubator durchgeführt. Etwa 10⁷ Zellen wurden in etwa 500 ml Uracil- und Leucin-defizientem Medium, wie es oben beschrieben wurde, enthaltend 5 bis 8% Glucose, aufgetaut. Nach etwa 35 ± 2 Stunden wurden die Kolbeninhalte in einen kleinen Fermentationsbehälter für die zweite Stufe der Zellamplifikation transferiert. Diese Kultur wurde für etwa 24 ± 4 Stunden unter kontrollierter Temperatur bei Belüftung (1 VVm) und Rühren (400 bis 600 Upm) in 10 l desselben Mediums, das für Stufe I verwendet worden war, wachsen gelassen. 10 bis 30 l der Kultur der Stufe II wurden in einen größeren Fermentationsbehälter im Produktionsmaßstab (10.000 l) für die endgültige Fermentation und rhIGF-I-Expressionsphase des Wachstums transferiert. Stufe III verwendete ein halbdefiniertes Wachstumsmedium, das Caseinhydrolysat, Basissalze, Vitamine, Spurenelemente und Antischaummittel enthielt. Das verwendete Caseinhydrolysat kann ein beliebiges handelsübliches Markenprodukt mit einer Zusammensetzung von mindestens 5% Amino-Stickstoff, mindestens 10% Gesamt-Stickstoff, nicht mehr als 20% Asche sein, wird aber vorzugsweise eine Zusammensetzung haben, die der von N-Z-Amine HD (Quest) vergleichbar ist. Das verwendete Antischaummittel kann ein beliebiges verschiedener im Handel erhältlicher Verbindungen auf Polyalkohol- oder Siliciumbasis sein. Die verwendeten Medien sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 angegeben. Die Fermentation wurde bei einer konstanten Temperatur von 30°C, pH 6 (durch Zusatz von 50% Natriumhydroxid oder 75% Phosphorsäure), Belüftung (0,8 VVm), unter Druck (5 bis 12 psig) und einer Glucose-Zuführungsrate unter konstantem Rühren durchgeführt. Die Fermentation ist dem Fachmann als Betrieb mit Chargenzuführung, sogenannt, weil der Fermentor zu Beginn mit weniger als seiner Kapazität (z. B. etwa 50%) gefüllt wird, wobei für die Zugabe einer geeigneten Menge einer Glucose-Zuführungslösung mit einer Konzentration von etwa 25 bis 50% (G/V) gesorgt wird. Für eine Mediumzusammensetzung, die in den Tabellen 1 und 2 als niedriger Bereich beschrieben ist, wurden 800 bis 900 kg Glucose über die Dauer des Laufs mit einer Zusatzrate, die von der Hefezelldichte und der Rest-Glucosekonzentration abhängt, in den Fermentor gegeben. Typischerweise wurde Glucose mit etwa 500 g/min für etwa die ersten 26 h, mit etwa 1000 g/min für etwa die nächsten 24 h und schließlich mit etwa 500 g/min bis zur Beendigung zugesetzt. Ein Zellwachstum, das mit der Expression einhergeht, tritt auf, sobald das Medium an überschüssigem Glucose verarmt ist und kann sich fortsetzen, bis die Kultur die gewünschte Zelldichte mit etwa 35 gDCW/l (Gramm Trockenzellgewicht pro Liter) hat. Wenn die Mediumzusammensetzung höher als die im niedrigen Bereich der Tabellen 1 und 2 angegebenen ist, kann die Zusatzrate für Glucose beispielsweise auf etwa 1500 g/min nach den ersten 24 Stunden Fermentation erhöht werden. Der hohe Bereich der Mediumzusammensetzung kann höhere Zelldichten von etwa 100 gDCW/l tragen.
Tabelle 1
Tabelle 2
Beispiel II
Produktion von authentischem, korrekt gefalteten IGF-I

A. Rekombinanter IGF-I wurde auch aus S. cerevisiae und P. pastoris unter Verwendung der folgenden Technik gewonnen. IGF-1-Protein wurde wie oben beschrieben in S. cerevisiae, Stamm JSC417, exprimiert. P. pastoris wurde mit einem Plasmid, das für IGF-1 codiert, unter Verwendung von Standardtechniken, wie sie z. B. im U.S. Patent Nr. 5 324 639 beschrieben sind, transformiert. Nach Fermentation wurde das Medium durch Zentrifugieren der Brühe wiedergewonnen und der pH des Überstands wurde auf pH 4 eingestellt und dann wurde mikrofiltriert/diafiltriert. Das resultierende Filtrat wurde auf eine EMD-Fractogel-SO₃-650-Säule (10 bis 20 mg/ml Harz) aufgetragen um die erste Kationenaustauschchromatographie durchzuführen. Die Säule war vorher mit 4 CV (Säulenvolumina) an 20 mM Essigsäure, pH 3, äquilibriert worden. Nachdem die Beladung beendet war, wurde die Säule mit 20 mM Essigsäure, pH 3, gewaschen, bis das A280-Signal zur Grundlinie abfiel (~2 bis 3 CVs).

Die IGF-1-Spezies wurden mit einer Waschlösung aus 0,1 M Kaliumborat, 0,6 M Kaliumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH 8,7, bei einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 120 bis 200 cm/h eluiert. Der Gesamtpeak wurde gesammelt, bis die A280 zur Grundlinie abfiel (~3 bis 4 CVs). Nach der Elution wurde die Säule mit einer 1 M Kaliumhydroxidlösung (2 CVs) gereinigt und für 1 bis 2 Stunden gehalten. Die Säule wurde dann mit 4 bis 6 CVs Wasser gewaschen und mit 20 ml Essigsäure, pH 3, neu äquilibriert. Das Eluat wurde unverzüglich auf die Gesamt-IGF-1-Konzentration untersucht und für die folgende Rückfaltungsreaktion präpariert.
Die Beladung für diese Säule kann auch ein pH-geschockter Zellkulturüberstand mit Standarddichte sein. In diesem Fall wurde der pH-Schock bei pH 10,5 für 2 bis 4 Stunden durchgeführt, wobei 50% Natriumhydroxid verwendet wurde um den pH der Gesamtkultur zu erhöhen. Die gesamte Hefe wurde aus dem das Produkt enthaltenden verbrauchten Medium durch kontinuierliche Zentrifugation abgetrennt. Nach dem Sammeln wurde der pH des Überstands mit etwa 75%iger Phosphorsäure wieder auf pH 4 eingestellt und dann wurde vor dem Auftragen auf die Säule mikrofiltriert/diafiltriert.
Die Rückfaltung wurde dann wie folgt durchgeführt. Der Pool aus der Fractogel-Säule wurde im folgenden Puffer auf 1,5 mg/ml Gesamt-IGF (0,067 mM), basierend auf dem reduzierten HPLC-Assay, verdünnt: 50 mM Natriumborat, pH 10,5, 2 M Harnstff, 1 M Natriumchlorid, 10 mM EDTA, 20% Ethanol, und DTT im 5-molaren Überschuss (0,335 mM). Das Reaktionsgemisch wurde für 15 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur sehr mäßig gerührt. Ein geringerer molarer DTT-Überschuss kann für das reinere P. pastoris-Material verwendet werden.
Nach der Rückfaltung wurde eine Diafiltration durchgeführt um Rückfaltungssalze zu eliminieren und eine Präzipitation nach pH-Abfall zu vermeiden. Eine Diafiltration erfolgte unter Verwendung einer Filtron-Membrananordnung, 3 × 0,75 ft², 1 K MWCO. (Anstelle einer 1K-Membran kann eine 3K-Membran verwendet werden, allerdings mit einer leichten Verringerung der Ausbeute (5 bis 10%)). Der Rückfaltungpool wurde 10-fach konzentriert. Der Pool wurde mit 4 Volumenäquivalenten in 50 mM Natriumborat, pH 10 bis 10,5 diafiltriert. Der pH wurde mit 6 N HCl auf 2,5 bis 3,0 eingestellt und der Pool wurde dann unter Verwendung von 4 Volumenäquivalenten in 100 mM Essigsäure, pH 4, diafiltriert. Der endgültige diafiltrierte Pool kann bei 4°C als stabiler Haltepool gelagert werden oder kann alternativ als Beladung für den HIC-Schritt präpariert werden.
Der Diafiltrationspool (100 mM Essigsäure, pH 4) wurde mit 1 Teil 200 mM HEPES, 10 mM EDTA, pH 8, und 2 Teilen Wasser für eine 1-in-4-Endverdünnung des Pools mit einer Endkonzentration von 50 mM HEPES kombiniert. (Die diafiltrierte Poolbeladung kann 1-in-3 anstatt 1-in-4 vor Zugabe des Ammoniumsulfats verdünnt werden und hat noch eine ähnliche Bindung an das Säulenbett). Ammoniumsulfat wurde zu einer Endkonzentration von 1 M zugesetzt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur mindestens 1 Stunde gerührt. Präzipitate wurden durch Zentrifugation entfernt.
Es wurde dann eine HIC-Chromatographie mit dem Überstand durchgeführt, wobei körniges Amicon-Silica-PAE-1000L als 50 μm-Perlen verwendet wurde (Beladung war 5 bis 15 mg/ml Harz). (Andere Variationen des Harzes einschließlich 300L-40-μm-Kügelchen und Hochdruck-10-μm-1000L wurden ebenfalls versucht). Die Säule wurde mit 50 mM HEPES, 2,5 mM EDTA, 1 M Ammoniumsulfat, pH 8, äquilibriert (6 CVs). Die Säule wurde mit 10 CVs Äquilibrationspuffer gewaschen. Die lineare Strömungsrate war 100 bis 150 cm/h. Das Produkt wurde mit 5 bis 7 CVs (bis A280 auf die Grundlinie abfiel) 50 mM HEPES, 2,5 mM EDTA, 0,5 M Ammoniumsulfat, pH 8, eluiert. Die Säule wurde mit 4 CVs Wasser gewaschen und die Säule wurde mit 2 M NaCl in pH 8-Puffer (50 mM Tris oder HEPES) gestrippt. Die Säule kann auch mit 0,1 M Natriumhydroxid gestrippt werden, allerdings ist der Zusatz von 5 mM Aluminiumnitrat oder Aluminiumchlorid zum Schutz der Silica-Hauptkette notwendig.
Variationen im Protokoll wurden notwendig um höhere Druckabfälle, höhere Selektivitäten oder höhere Bindungskapazitäten für verschiedene Fälle anzupassen. Für eine höhere Abtrennung der glycosylierten Spezies vom nativen IGF-1 wurde ein Gradient laufen gelassen, anstatt die Stufenelution anzuwenden. Dies erforderte eine höhere Pufferverwendung, eine längere Bearbeitungszeit und ein aufwändigeres Verfahren.
Das Produkt kann auch mit dem Ladepuffer des nächsten Säulenschritts (100 mM Essigsure, 0,1 mM EDTA) eluiert werden um die folgende Diafiltration zu vermeiden, allerdings ist die Reinheit des Eluats dann reduziert.
Der PAE-Pool von oben wurde unter Verwendung einer Filtron-Membrananordnung, 3 × 0,75 ft², 1K MWCO, mit 4 Volumenäquivalenten in 100 mM Essigsäue, 0,1 mM EDTA diafiltriert. Dieser Schritt kann eliminiert werden, wenn die PAE-Säule mit dem SP-650S-Ladepuffer (siehe unten) anstatt mit dem 0,5 M Ammoniumsulfatpuffer eluiert wird.
Nach der Diafiltration wurde eine zweite Kationenaustauschsäule mit dem S. cerevisiae-Produkt laufen gelassen. Dieser Schritt wurde bei dem P. pastoris-Produkt nicht angewendet. Das eingesetzte Harz war Toyopearl SP-650S, Perlen mit 35 μm, und die lineare Strömungsgeschwindigkeit war 77 cm/h. Die Beladung war 16 mg/ml. Vor der Beladung wurde die Säule mit 10 CVs 100 mM Essigsäure, 0,1 mM EDTA äquilibriert. Die Säule wurde mit 5 CVs 100 mM Essigsäure, 0,1 mM EDTA (bis die Leitfähigkeit zur Basislinie abfiel) gewaschen. Ein pH-Waschgang wurde mit 5 CVs 75 mM Bicin, 0,1 mM EDTA, pH 7,5, durchgeführt und IGF-1 wurde unter Verwendung von 10 CVs 75 mM Bicin, 50 mM Natriumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH 7,5 eluiert. Die Salzkonzentration im Elutionspuffer (50 mM Natriumchlorid) kann mit einer gleichermaßen wirksamen Trennung auf 25 mM gesenkt werden). Fraktionen mit 0,25 CV wurden gesammelt und durch Cyano-RP-HPLC auf Reinheit analysiert (Fraktionen wurden so gesammelt, dass die resultierende Konzentration von gesamtem glycosyliertem IGF-1 8% oder weniger war). Die Säule wurde mit 5 CVs 75 mM Bicin, 1 M Natriumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH 7,5, gewaschen und die Säule wurde mit 5 CVs 0,15 N Natriumhydroxid, gefolgt von 5 CVs Wasser, gereinigt.
Die Sammlungskriterien können so modifiziert werden, dass die Konzentrationen an glycosylierten Spezies im Pool erhöht oder verringert werden, was mit einer gleichzeitigen Erhöhung bzw. Verringerung der Ausbeute in diesem Schritt einhergeht.
Der SP-650S-Pool (oder im Fall des durch P. pastoris produzierten Produktes, der diafiltrierte PAE-Pool) wurden dann zur RP-HPLC präpariert, indem durch ein 0,2 μm-Filter filtriert wurde und die Beladung mit einem gleichen Volumen an Puffer A verdünnt wurde (Puffer A ist 0,18 M Ammoniumacetat, 10% Acetonitril, pH 6,7). Der Puffer wurde vor organischer Zugabe im pH eingestellt. Die Beladung wurde mit dem organischen Lösungsmittel zwei Stunden lang bei Raumtemperatur äquilibrieren gelassen. Das verwendete Harz war Eka Nobel Kromasil C8, Perlen mit 10 μm. Die Beladung war 15 mg/ml.
Die Säule wurde mit 1,5 bis 2 CVs Puffer A und dann mit 90% Puffer A/10% Puffer B (Puffer B ist 0,10 M Ammoniumacetat, 50% Acetonitril, pH 6,7) über 3 bis 4 CVs äquilibriert. Puffer B wurde vor organischer Zugabe im pH eingestellt. Der End-pH des Puffers B war typischerweise höher als 6,7. Der SP-650S-Pool wurde aufgebracht. Die Beladungslinie wurde mit Puffer A und dem folgenden Gradientenlauf gespült, wobei 0,25 CV-Fraktionen gesammelt wurden:

– von 10% B bis NMT 30% 8 in NMT 25 Minuten;
– Aufrechterhalten der %B für 5 Minuten;
– Erhöhen der %B um 0,1%/min für 100 Minuten;
– Nach Elution der Peaks Erhöhung auf 80% B; und
– Halten für 5 bis 10 Minuten.

Fraktionen wurden, basierend auf der Reinheit, wie sie durch Cyano-RP-HPLC errechnet wurde (Ziel > 95% Gesamtreinheit) gesammelt. Die Säule wurde durch Waschen mit 2 bis 4 CVs aus 80%igem Acetonitril gereinigt.
Die Konzentration an met-oxidierten/glycosylierten Spezies in der Beladung beeinträchtigt die endgültige Gesamtreinheit des Pools und die Kapazität der Säule. Kapazitäten mit bis 50 mg/ml wurden beobachtet, wenn die Konzentration dieser Spezies bis etwa 5% gesenkt war.
Der Gesamt-IGF-Titer nach Fermentation war 150 bis 200 mg/l bei Verwendung von S. cerevisiae und 800 bis 1200 mg/l bei Verwendung von P. pastoris. Die Endausbeute an authentischem IGF-1 unter Verwendung dieses Verfahrens war etwa 40 mg/l Fermentationsmedium für das mit S. cerevisiae isolierte Produkt und etwa 100 bis 120 mg/l Fermentations medium für das mit P. pastoris isolierte Produkt. Die Gesamtreinheit (authentisches IGF-1/Gesamt-IGF-1-Spezies) war 95 bis 97%.

B. Authentischer IGF-1 wurde auch aus P. pastoris unter Verwendung des Verfahrens, das oben beschrieben wurde, mit den folgenden Modifikationen gewonnen.

Nach der Fermentation wurde das Filtrat in einer ersten Kationenaustauschreaktion verwendet, die an einem TosoHaas Toyopearl SP500C-Harz durchgeführt wurde. Nach der Beladung wurde die Säule mit etwa 3,5 CVs 0,02 M Essigsäure und dann mit 3, 5 CVs 0, 05 M Natriumacetat, 0, 1 M Natriumchlorid, pH 5,5, gewaschen. Das Produkt wurde unter Verwendung von etwa 4 CVs 0,05 M Natriumacetat, pH 5,5, eluiert.
Eine Rückfaltung erfolgte durch Verdünnen des durch Kationenaustausch gewonnenen Pools in einem Puffer unter Erhalt einer Endkonzentration von 2 M Harnstoff, 1,5 M Natriumchlorid, 15% Ethanol, 5 mM Natriumborat und 0,2 mM DTT, pH 9 bis 9,5. Die Rückfaltung wurde bei Raumtemperatur über 15 bis 20 Stunden durchgeführt.
HIC wurde unter Verwendung einer TosoHaas Toyopearl Butyl 650 M-Säule ohne Ammoniumsulfat durchgeführt um potentielle Probleme, die durch eine Präzipitation verursacht werden könnten, zu vermeiden. Der pH des Rückfaltungspools wurde mit Essigsäure auf etwa 4,2 reduziert und es wurde mit einem gleichen Volumen an 1 M Natriumchlorid vor der Beladung verdünnt. Nach der Beladung wurde die Säule mit etwa 3 CVs 0,2 M Essigsäure, 0,5 M Natriumchlorid, pH 3,0, gewaschen. Die Säule wurde dann mit etwa 10 CVs 0,2 M Essigsäure, 0,25 M Natriumchlorid, pH 3,0, gewaschen. Die Säule wurde mit etwa 4 CVs 0,2 M Essigsäure, 0,2 M Natrium chlorid, pH 3,0, eluiert.
Der zweite Kationenaustauschschritt wurde unter Verwendung eines TosoHaas Toyopearl SP550C-Harzes durchgeführt. Die Säule wurde mit 0,05 M Natriumacetat-Puffer mit pH 5,5 äquilibriert. Nach der Beladung wurde die Säule mit etwa 1 CV 0,05 M Natriumacetat-Puffer mit pH 5,5 und dann mit etwa 7 CVs-Puffer aus 0,05 M Natriumacetat, 0,1 M Natriumchlorid, pH 5,5, gewaschen. Das Produkt wurde mit etwa 7 CVs 0,05 M Natriumacetat, 0,4 M Natriumchlorid, pH 5,5-Puffer, eluiert.
RP-HPCL wurde unter Verwendung eines TosoHaas Amberchrome CG1000sd-Harzes durchgeführt. Das Produkt wurde unter wässrigen Bedingungen auf die Säule aufgebracht und mit 0,2 M Essigsäurepuffer gewaschen. Das Produkt wurde unter Verwendung eines isokratischen Waschens mit 19% Ethanol, gefolgt von einem Gradienten bis 25% Ethanol, eluiert. Die Abtrennung von weniger hydrophoben IGF-Formen (d. h. oxidierten, glycosylierten und einigen abgebauten IGF-Formen) von authentischem IGF erfolgt während des Waschens mit 19% Ethanol und der Rest des Produktes wird in Gradienten aus der Säule eluiert, während hydrophobere Formen (d. h. Multimere und andere abgebaute IGF-Formen) an der Säule zurückgehalten werden. Die Säule wird dann mit einer hohen Konzentration an Ethanol (70 bis 100%) gestrippt.
Das Produkt wurde dann unter Verwendung einer Filtron 1000 MW-Polysulfon-Flachmembran und 0,1 M Essigsäure konzentriert. Das Produkt kann auch unter Verwendung einer AG Technology 5000 MW-Polysulfon-Hohlfasermembran konzentriert werden. Solche Membranen haben eine höhere Strömungsgeschwindigkeit und ein besseres IGF-Retentionsvermögen als die Flachmembranen.
Der Gesamt-IGF-Titer unter Verwendung dieses Verfahrens war 800 bis 1200 mg/l. Die Endausbeute an authentischem IGF-1 unter Verwendung dieses Verfahrens war etwa 100 mg/l Fermentationsmedium. Die Gesamtreinheit (authentischer IGF-1-/gesamte IGF-Spezies) war etwa 94%.

C. Authentischer IGF-1 wurde auch aus P. pastoris unter Verwendung des in Beispiel IIB oben beschriebenen Verfahrens, außer dass CuCl₂ zu dem Rückfaltungspuffer unter Erhalt einer Endkonzentration von 2 μM Cu⁺⁺ während der Rückfaltungsreaktion gegeben wurden, gewonnen. Die Reaktion wurde 10 bis 12 Stunden oder bis die Rückfaltung vollständig war, was durch CN-HPLC gemessen wurde, ablaufen gelassen. Die Zugabe von Cu⁺⁺ verstärkte das Rückfaltungsverhältnis um das 2- bis 3-Fache oder mehr.
D. Authentischer IGF-1 wurde auch aus S. cerevisiae unter Verwendung des folgenden Verfahrens, das keinen Rückfaltungsschritt umfasst, gewonnen. IGF-I-Protein wurde in S. cerevisiae, Stamm JSC417, exprimiert, wie es oben beschrieben wurde. Die Fermentation und die pH-Schockreaktion wurden durchgeführt, wie es oben in Beispiel IIA beschrieben ist. Nach Sammlung wurde der pH des Überstandes mit etwa 75%iger Phosphorsäure wieder eingestellt und unter Verwendung einer mikroporösen tangentialen Strömungsfiltration filtriert, bevor er an einem Kationenaustauschharz adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit 20 mM Essigsäure- und 100 mM Kaliumborat/0,1 mM EDTA-Puffer gewaschen und mit 100 mM Kaliumborat/0,1 mM EDTA/300 mM Kaliumchlorid-Puffer mit pH 8,7 eluiert.

Nach dem Kationenaustauschschritt wurde der pH des Eluats auf pH 4 eingestellt und eine Salzpräzipitation zur Entfernung von Kontaminanten mit höherem Molekulargewicht durchgeführt. Die Präzipitation wurde in der Kälte unter Verwendung von 0,5 M Ammoniumsulfat, 5% Acetonitril, 2,5 mM EDTA über 4 bis 24 Stunden durchgeführt. Eine Filtration erfolgte unter Verwendung eines AG Tech-Hohlfaserfilters mit 23 ft², 0,22 μm in Verbindung mit einer Waukesha-Pumpe. Das Permeat wurde in einem Tank gesammelt, wobei das präzipitierte Material in dem ursprünglichen Tank zurückblieb. Es wurde ein abschließender Salzwaschgang durchgeführt, wobei etwa 10 1 einer Lösung von 0,5 M Ammoniumsulfat, 50 mM Natriumacetat, 2,5 mM EDTA, pH 4, verwendet wurden.
Dann wurde eine HIC unter Verwendung der Probe aus dem vorherigen Präzipitationsschritt an einer Sepragen 50 1 Superflow Radial Flow-Säule und TosoHaas, Phenyl-HIC-Harz mit 65 μm bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 l/min wie folgt durchgeführt. Eine Elution wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0,9 M Ammoniumsulfat bis 0,5 M Ammoniumsulfat durchgeführt.
Mit dem Pool aus der obigen Säule wurden eine Ultrafiltration und eine Diafiltration durchgeführt. Zur Ultrafiltration wurde das Ausgangsmaterial in 0,7 M Ammoniumsulfat, pH 6,7, verdünnt. Die Beladung wurde durch Titrieren mit Eisessig auf einen pH unter 4 präpariert. Das verwendete Filtrationssystem war ein AG-Tech-5000 MWCO-Hohlfaserfilter mit 36 ft² in Verbindung mit einer Waukesha-Pumpe und einer Stickstoffdeckschicht. Das maximale Prozessumlaufvolumen war acht Liter. Typischerweise wurden sechs Liter verwendet. Die Diafiltration wurde mit etwa 20 Liter Wirt zur Injektion (WFI), gefolgt von 20 mM Essigsäure, bis der pH des Permeats 3,5 war (etwa 30 Liter), durchgeführt.
Danach wurde eine RP-HPLC unter Verwendung einer Prochrom LC150-Hochdrucksäule, die einen Durchmesser von 15 Zentimetern, ein Volumen von sechs Litern hatte, und Kromasil-C₈-10 μM-Harz enthielt. Die Durchflussgeschwindigkeit war 1 Liter pro Minute. Die Säule wurde in 14% Acetonitril äquilibriert, indem Puffer A, der aus 0,18 M Ammoniumacetat, 10% Acetonitril bestand, pH 6,7, und Puffer B, der aus 0,10 M Ammoniumacetat, 50% Acetonitril bestand, pH 6,7, gemischt wurden. Die Beladung wurde präpariert, indem 1 : 1 mit Puffer A verdünnt wurde. Die Elution wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von Pufferlösungen mit 14% bis 22% Acetonitril durchgeführt. Die Säule wurde bei 22% konstant gehalten, bevor ein zweiter linearer Gradient von 22% bis 26% Acetontril laufen gelassen wurde, der das Produkt eluierte.
Schließlich wurde ein weiterer Ultrafiltrations/Diafiltrations-Schritt durchgeführt. Die Ultrafiltration wurde mit einem RR-HPLC-Pool unter Verwendung eines Hoescht-50-4000-MWCO-Hohlfaserfilters mit 50 ft² in Kombination mit einer Waukesha-Pumpe und einer Stickstoffdeckschicht durchgeführt. Das maximale Prozessumlaufvolumen war acht Liter. Typischerweise wurden sechs Liter verwendet. Die Beladung wurde durch Verdünnung mit 3 Teilen 20 mM Essigsäure präpariert. Die Diafiltration erfolgte unter Verwendung von etwa 40 Litern 20 mM Essigsäure.
Der Gesamt-IGF-Titer unter Verwendung dieses Prozesses war 25 bis 40 mg/l. Die Endausbeute an authentischem IGF-1 unter Verwendung dieses Prozesses war etwa 5 mg/l Fermentationsmedium.
Somit werden Verfahren zur Reinigung von authentischen, korrekt gefalteten IGF-Polypeptiden aus Hefewirten offenbart. Obgleich bevorzugte Ausführungsformen des Gegenstands der Erfindung detailliert beschrieben wurden, ist einzusehen, dass verschiedene Variationen durchgeführt werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung, wie sie durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, abzuweichen.

Claims

Verfahren zur Reinigung eines authentischen, korrekt gefalteten Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF)-Polypeptids aus einem Medium, in das IGF-Polypeptid durch Pichia sp.-Zellen sezerniert wurde, wobei das Verfahren umfasst: (a) Durchführen einer Kationenaustauschchromatographie mit dem Medium unter Erhalt eines partiell gereinigten IGF-Gemisches; (b) Denaturieren und Renaturieren von IGF-Spezies aus dem partiell gereinigten IGF-Gemisch; (c) Unterwerfen renaturierter IGF-Spezies einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie und (d) Durchführen einer Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Erhalt eines weiter gereinigten IGF-Gemisches, wobei das weiter gereinigte IGF-Gemisch eine größere Menge an authentischem, korrekt gefaltetem IGF als das partiell gereinigte IGF-Gemisch hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren außerdem Erhöhen des pHs des Zellmediums vor der Kationenaustauschchromatographie auf etwa pH 8 bis etwa pH 12 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Verfahren Erhöhen des pHs des Zellmediums vor der Kationenaustauschchromatographie auf etwa pH 10 bis etwa pH 11 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung einer sulfopropylierten Matrix durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Denaturierungs- und Renaturierungsstufen zusammen unter Verwendung eines Denaturierungspuffers, der Harnstoff, Dithiothreitol, Alkohol und Salz umfasst, in ausreichenden Mengen und unter Bedingungen, die für die Reduktion und die anschließende Oxidation von Disulfidbrücken sorgen, durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Denaturierungspuffer etwa 1 bis etwa 4 M Harnstoff, etwa 1 mM bis etwa 75 mM Natriumborat, etwa 0,5 M bis etwa 3 M Natriumchlorid, etwa 10% bis etwa 30% Ethanol und einen etwa 0,5- bis etwa 7-fachen molaren Überschuss an Dithiothreitol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Denaturierungspuffer etwa 1,5 M bis etwa 3 M Harnstoff, etwa 3 bis etwa 50 mM Natriumborat, etwa 1 M bis etwa 1,5 M Natriumchlorid, etwa 15% bis etwa 25% Ethanol und etwa einen äquimolaren bis etwa 5-fachen molaren Überschuss an Dithiothreitol umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie unter Verwendung einer Polyethylenamin-Matrix durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie unter Verwendung einer Butyl- oder Phenyl-substituierten Poly(methacrylat)-Matrix durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines C₃- bis C₈-Siliciumdioxid-derivatisierten Harzes durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Styrolpolymerharzes durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das lösliche TGF-Polypeptid durch Pichia pastoris-Zellen sezerniert worden ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das IGF IGF-I ist.
Verfahren zur Reinigung eines authentischen, korrekt gefalteten Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF)-Polypeptids aus einem Medium, in das IGF-Polypeptid durch Pichia sp.-Zellen sezerniert wurde, wobei das Verfahren umfasst: (a) Durchführen einer Kationenaustauschchromatographie mit dem Medium unter Erhalt eines ersten IGF-Gemisches; (b) Denaturieren und Renaturieren von IGF-Spezies, die im ersten IGF-Gemisch vorhanden sind, unter Erhalt eines zweiten IGF-Gemisches; (c) Unterwerfen des zweiten IGF-Gemisches einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unter Erhalt eines dritten IGF-Gemisches und (d) Durchführen einer Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie an dem dritten IGF-Gemisch unter Erhalt eines vierten IGF-Gemisches, wobei das vierte IGF-Gemisch eine höhere Menge an authentischem, korrekt gefaltetem IGF als das erste IGF-Gemisch hat.
Verfahren zur Isolierung eines authentischen, korrekt gefalteten Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF)-Polypeptids aus einem Medium, in das das IGF-Polypeptid durch Pichia pastoris-Zellen, die das IGF-Polypeptid exprimieren, sezerniert wurde, wobei das Verfahren umfasst: (a) Durchführen einer Kationenaustauschchromatographie mit dem Medium unter Erhalt eines ersten IGF-Gemisches; (b) Denaturieren und Renaturieren von IGF-Spezies, die in dem ersten IGF-Gemisch vorliegen, unter Verwendung eines Denaturierungspuffers, der etwa 1,5 M bis etwa 3 M Harnstoff, etwa 3 bis etwa 50 mM Natriumborat, etwa 1 M bis etwa 1,5 M Natriumchlorid, etwa 15% bis etwa 25% Ethanol, etwa einen äquimolaren bis etwa 5-fachen molaren Überschuss an Dithiothreitol und etwa 0,5 bis 6 μM Cu⁺⁺ umfasst, unter Bedingungen, die für die Reduktion und anschließende Oxidation von Disulfidbrücken sorgen, unter Erhalt eines zweiten IGF-Gemisches; (c) Unterwerfen des zweiten IGF-Gemisches einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unter Erhalt eines dritten IGF-Gemisches und (d) Durchführen einer Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie an dem dritten IGF-Gemisch unter Erhalt eines vierten IGF-Gemisches, wobei das vierte IGF-Gemisch einen hö heren Prozentgehalt an authentischem, korrekt gefaltetem IGF als das erste IGF-Gemisch hat.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das IGF IGF-I ist.
Verfahren zur Isolierung eines authentischen, korrekt gefalteten Insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF)-Polypeptids aus einem Medium, in das das IGF-Polypeptid durch Pichia pastoris-Zellen, die das IGF-Polypeptid exprimieren, sezerniert wurde, wobei das Verfahren umfasst: (a) Durchführen einer Kationenaustauschchromatographie mit dem Medium unter Erhalt eines partiell gereinigten IGF-Gemisches; (b) Denaturieren und Renaturieren von partiell gereinigter IGF-Spezies unter Verwendung eines Denaturierungspuffers, der Harnstoff, Dithiothreitol, Alkohol, Salz und ein zweiwertiges Metall oder mehrere zweiwertige Metalle umfasst, in ausreichenden Mengen und unter Bedingungen, die für die Reduktion und anschließende Oxidation von Disulfidbrücken sorgen; (c) Unterwerfen renaturierter IGF-Spezies einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unter Erhalt eines weiter gereinigten IGF-Gemisches und (d) Durchführen einer Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie an dem weiter gereinigten IGF-Gemisch unter Erhalt eines IGF-Produktes mit einem höheren Prozentgehalt an authentischem, korrekt gefaltetem IGF als das partiell gereinigte IGF-Gemisch.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das eine zweiwertige Metall oder die mehreren zweiwertigen Metalle aus der Gruppe bestehend aus Cu⁺⁺, Mn⁺⁺, Ni⁺⁺, Zn⁺⁺ und Fe⁺⁺ ausgewählt ist/sind.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Denaturierungspuffer etwa 0,5 bis 6 μM Cu⁺⁺ umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Denaturierungspuffer etwa 1 bis etwa 4 M Harnstoff, etwa 1 mM bis etwa 75 mM Natriumborat, etwa 0,5 M bis etwa 3 M Natriumchlorid, etwa 10% bis etwa 30% Ethanol und einen etwa 0,5- bis etwa 7-fachen molaren Überschuss an Dithiothreitol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Denaturierungspuffer etwa 1,5 M bis etwa 3 M Harnstoff, etwa 3 bis etwa 50 mM Natriumborat, etwa 1 M bis etwa 1,5 M Natriumchlorid, etwa 15% bis etwa 25% Ethanol und einen etwa äquimolaren bis etwa 5-fachen molaren Überschuss an Dithiothreitol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Denaturierung und die Renaturierung zusammen durchgeführt werden und für etwa 8 bis etwa 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Denaturierung und die Renaturierung für etwa 10 bis etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung einer sulfopropylierten Matrix durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie unter Verwendung einer Polyethylenaminmatrix durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie unter Verwendung einer Butyl- oder Phenyl-substituierten Poly(methacrylat)-Matrix durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines C₃- bis C₈-Siliciumdioxid-derivatisierten Harzes durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Styrolpolymerharzes durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der IGF IGF-I oder ein Analogon davon ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der IGF IGF-I ist.