KR20140007377A - 인슐린의 정제 - Google Patents

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KR20140007377A
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요르겐 엠. 몰레럽
소렌 손데르가르트 프레데릭센
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노보 노르디스크 에이/에스
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Abstract

본 출원은 단백질-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정을 개시하고, 상기 용액은 인슐린 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 2가 또는 다가 금속 이온을 포함하고, 상기 인슐린 펩티드는 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능하며, 상기 공정은: a) 단백질-함유 용액을 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및 b) 최대 8.5의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 인슐린 펩티드의 적어도 75 중량%에 해당하는 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함한다.

Description

인슐린의 정제{PURIFICATION OF INSULIN}
본 발명은 단백질-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한, 특히 관련된 불순물을 고려하여 인슐린 펩티드를 분리하기 위한 크로마토그래피 공정에 관한 것이다.
약학적 사용을 위한 재조합 단백질 및 펩티드의 정제는 액체 크로마토그래피 방법을 사용하여 주로 수행된다. 크로마토그래피 방법은 그것의 고정상 특성, 예를 들어 소수성 크로마토그래피 수지를 위한 역상 크로마토그래피를 특징으로 하지만, 그러나 수많은 파라미터는 이동상 조성과 같은 분리에 영향을 준다. 이온-교환 크로마토그래피(IEC)는 고정상의 하전된 표면 그리고 이동상 조성을 위한 완충액, 염의 사용 및 pH의 제어를 특징으로 한다. IEC는 관련된 및 관련되지 않은 불순물들 둘 다의 분리에 매우 효율적인 것으로 입증되었지만, 그러나 어떤 불순물은 예를 들어 표적 폴리펩티드 및 불순물의 전하가 같으면 제거하기 매우 어려울 수 있다.
GB 694530 및 GB 729670은 각각 퀴놀린 또는 아크리딘-유사 물질 그리고 페놀성의 존재하에, 또한 아연의 존재하에 인슐린의 결정화를 기재한다.
US 5,504,188은 pH 5.5-6.5에서 (특히) 아연 이온의 존재하에 인슐린 유사체 결정(LysPro)의 제조를 기재한다.
WO 98/34953은 아연 이온을 함유한 용액에서 친유성 치환체(인슐린 디터머)를 지니는 리신 측쇄로 단백질의 결정화를 기재하며, 결정화는 용액 pH를 산성에서 pH 7-10으로 조정함으로써 달성된다.
US 3,907,676은 국내 포유동물의 췌장샘, 특히 돼지 및 소의 췌장샘으로부터 회수된 인슐린의 항원성을 감소시키고, 분자량 약 6,000의 항원성 인슐린-유사 물질을 분자량 6,000 이상의 췌장의 기원(pancreatic origin)의 어떤 항원성 단백질과 함께 함유한 공정을 개시한다. 항원성의 감소는 인슐린을 용리액으로서 물-함유 1수산기 지방족 알콜을 사용하면서 바람직하게는 강염기성인 음이온 교환체 상의 컬럼 크로마토그래피하고, 언급된 불순물이 없거나 본질적으로 없는 인슐린을 함유한 용출액 분획을 수집함으로써 얻어진다.
EP 1 071 703은 이동상에 칼슘 이온의 부가가 종래의 RPC 방법(1가 이온을 사용함)과 비교해 (인슐린에 대해 특이적으로) 글리코실화된 종과 비-글리코실화된 종 사이에 개선된 선택성을 제공함을 나타낸다는 것을 개시한다.
US 3,649,456은 RPC-유사 고정상에서 염화칼슘을 포함한 여러 가지 염이 존재하는 용액을 함유한 수용액부터 유기 용매로 폴리펩티드의 완충액 교환을 기본적으로 기재한다.
US 5,633,350은 이온-교환 수지상에서 칼슘 이온의 존재하에 비-비타민K 의존 단백질로부터 비타민K 의존 단백질의 분리를 기재한다.
GB 2173503A는 약산성 양이온 교환체를 사용하는 인슐린의 정제를 위한, 바람직하게는 소수성 매트릭스가 제공된 공정을 기재한다. 인슐린의 분별은 산성 pH 범위에서 용매의 농도의 단계적 또는 연속적 변경에 의해 얻어진다.
US 4,129,560은 산성 또는 염기성 이온 교환체 상에서 수성 완충된 용매에서 이온 교환체 크로마토그래피에 의해 회합하려는 경향을 갖고, 비이온성 세제를 완충된 용매에 용해시키는 단계를 포함하는, 고분자량 펩티드의 정제 공정을 기재한다.
US 2005-080000A는 더 고분자량 물질이 흐름-통과 모드로 음이온 교환체 상에서 제 1크로마토그래피에 의해 그리고 흡착 모드로 양이온 교환체 상에서 후속 제 2크로마토그래피에 의해 프리프로인슐린의 수용액으로부터 제거되는 프리프로인슐린의 크로마토그래피 정제 방법, 그리고 프리프로인슐린의 제조 방법을 포함한 인슐린의 제조 방법을 개시한다.
US 2006-167221A는 재조합원, 특히 효모에 발현되고 효모에 의해 분비된 것들로부터의 인슐린의 추출 및 분리를 개시한다. 유기 용매는 인슐린 펩티드의 숙주 표면 결합 형태를 추출하기 위해 사용되었다. 게다가, 인슐린의 용해성 형태 및 막 결합 형태의 동시 분리 및 정제를 실행하기 위해, 매질 정화, 용매 추출 및 크로마토그래피 단계들을 조합하기 위한 과정이 개시된다.
US 5,278,284는 가치있는 단백질을 착물 용액으로부터 제거하는 방법을 기재하고 가치있는 단백질을 정제된 형태로 회수하는 단계는 대략 단백질의 분자 크기인 기공 크기를 갖는 실리카겔 흡착제를 단백질을 함유한 용액에 첨가하는 단계, 단백질을 흡착제 상에 흡착되도록 허용하는 단계, 흡착제를 용액으로부터 분리하는 단계, 그 다음 단백질을 흡착제로부터 회수하는 단계로 구성된다.
US 6,451,987은 펩티드 및 관련된 불순물을 함유한 혼합물로부터 펩티드를 정제하기 위한 이온 교환 크로마토그래피 공정, 그리고 이러한 이온 교환 크로마토그래피 공정을 포함하는 공업용 방법을 개시한다.
(종종 관련된) 어떤 불순물은 피크 형태, 예를 들어 피크 프론팅(fronting) 또는 테일링(tailing) 가장자리에서의 불순물 용리로 인하여 제거 또는 감소시키기가 종종 어렵다. 따라서, 관심 단백질의 불충분한 순도가 생길 수 있다.
본 발명은 불순물, 예를 들어 관심 단백질의 높은 로드를 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하였을 때 달리 제거하기 어려운 관련된 불순물의 개선된 제거를 위한 크로마토그래피 피크 형태를 제어하기 위한 수단을 제공한다. 피크 형태는 크로마토그래피 컬럼에 적용된(즉 로딩된) 단백질-함유 용액 중 2가 또는 다가 금속 이온의 존재에 의해, 예를 들어 관심 단백질에 대한 등전점(pI)을 고려하여 용리액의 pH 조정과 조합하여 제어되고, 관심 단백질의 매우 농축된 풀을 정제된 형태로 수집하는 것을 가능하게 한다.
본 발명자(들)에 의해, 제어된 피크 형태는 관심 단백질의 증가된 로딩을 허용할 수 있고, 따라서 주어진 양의 단백질이 정제되는데 용량이 높고 가동이 적을수록, 그만큼 높은 풀 농도가 얻어질 수 있다는 것이 발견되었다.
그래서, 제 1양태에서, 본 발명은 단백질-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정에 관한 것으로, 상기 용액은 인슐린 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 2가 또는 다가 금속 이온을 포함하고, 상기 인슐린 펩티드는 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능하며, 상기 공정은:
a. 단백질-함유 용액을 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
b. 최대 8.5의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 인슐린 펩티드의 적어도 75 중량%에 해당하는 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함한다.
제 2양태에서, 본 발명은 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정에 관한 것으로, 상기 용액은 아연 및 2가 아연 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 인슐린 펩티드를 포함하며, 상기 공정은:
a. 인슐린-함유 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 관심 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
b. 최대 6.8의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 관심 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 관심 인슐린 펩티드의 적어도 90 중량%에 해당하는 관심 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함한다.
제 3양태에서, 본 발명은 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 인슐린 펩티드의 이온-교환 크로마토그래피에서 피크 형태를 제어하는 방법에 관한 것으로, 방법은,
a. 인슐린 펩티드 및 관련된 불순물의 최적의 분리를 얻도록 2가 또는 다가 금속 이온을 사용하며, 여기서 2가 금속 이온은 인슐린 펩티드의 프론팅 피크 형태를 고정하기 위해 첨가된 것이고, 인슐린 펩티드 전에 관련된 불순물이 용리한다.
도 1-3: 이동상 즉 단백질-함유 용액에서 Zn2 +의 존재에 의해 낮은 pH에서 프론팅 피크 프로파일(도 1의 두꺼운 점선 곡선, pH=6.4)에 대한, 설정된 pH 값에서 어느 정도 테일링의 정상적인 Langmurian 프로파일(도 2의 얇은 실선 곡선, pH=6.8)에 대응하는, 높은 pH에서 테일링 피크로부터의 인슐린 피크 프로파일(도 3의 얇은 점선 곡선, pH=7.2)의 변화.
도 4. Zn-균형을 갖는 실험의 크로마토그램.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 단백질-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정과 관련된다. 특히, 관심 단백질이 관련된 불순물로부터 분리되고 동시에 관심 단백질의 높은 회수율을 얻을 수 있는 공업상 적용가능한 공정을 제공하는 것이 목표이다. 이러한 관련된 불순물은 전형적으로 비항원성이다.
한 양태에서 단백질-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정이 제공되며, 상기 용액은 인슐린 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 2가 또는 다가 금속 이온을 포함하고, 상기 인슐린 펩티드는 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능하며, 상기 공정은:
a. 단백질-함유 용액을 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
b. 최대 8.5의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 인슐린 펩티드의 적어도 75 중량%에 해당하는 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정이 제공되며, 상기 용액은 아연 및 2가 아연 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 인슐린 펩티드를 포함하며, 상기 공정은:
a. 인슐린-함유 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 관심 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
b. 최대 6.8의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 관심 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 관심 인슐린 펩티드의 적어도 90 중량%에 해당하는 관심 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 인슐린 펩티드의 이온-교환 크로마토그래피에서 피크 형태를 제어하는 방법이 제공되고, 방법은,
a. 인슐린 펩티드 및 관련된 불순물의 최적의 분리를 얻도록 2가 또는 다가 금속 이온을 사용하며, 여기서 2가 금속 이온은 인슐린 펩티드의 프론팅 피크 형태를 고정하기 위해 첨가된 것이고, 관련된 불순물은 인슐린 펩티드 전에 용리한다.
단백질은 효모 발현 시스템에서 생길 수 있다. 단백질의 제조 공정에서, 크로마토그래피 정제의 사용은 널리 퍼져있다. 단백질은 전형적으로 화학적 변형 및 일련의 크로마토그래피 정제 단계를 받고, 특히 컬럼 크로마토그래피는 역상 크로마토그래피(RPC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및 이온 교환 크로마토그래피(IEC)(예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피(AIEC) 또는 양이온 교환 크로마토그래피(CIEC))와 같은 고성능 액체 크로마토그래피(또는 고압 액체 크로마토그래피, HPLC), 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피, 의사-친화성 크로마토그래피, 및/또는 혼합-모드 크로마토그래피를 포함한다.
컬럼 크로마토그래피를 사용하는 단백질 정제의 원리는 고정상과 단백질이 분리된 이동상 사이에서 평형의 차이에 기초한다. 고정상 및 이동상의 적당한 조합을 사용하면서, 단백질은 다른 간격으로 컬럼을 떠날 것이다. 본 발명의 본문에서, 2가 또는 다가 금속 이온에 의해 컬럼에 먼저 로딩된 이동상의 변형은 피크 형태의 제어 및 이로써 밀접하게 관련된 불순물로부터 관심 단백질의 분리에 대하여 개선을 제공한다는 것이 발견되었다.
크로마토그래피 정제의 중요한 파라미터는 컬럼에 결합될 수 있는 (표적) 단백질의 양에 의해 정의된, 컬럼 용량이다. 컬럼 용량은 이동상 단백질 농도에 의존하고, 이동상 단백질 농도의 함수로서 고정상 단백질 농도의 묘사를 결합 등온선으로 칭한다. 결합 등온선은 오목(크로마토그래피 피크는 프론팅할 것임)하거나 또는 볼록(크로마토그래피 피크는 테일링할 것임)할 수 있다[J.M. Mollerup, Chem. Eng. Technol. 31 (2008) 864-874]. 드문 상황에서, s-형태 등온선은 피크가 낮은 이동상 농도에서 프론팅하고 더 높은 이동상 농도에서 테일링하는 경우에 얻어진다[J.M. Mollerup et al., J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol. 32 (2009) 1577-1597].
Mollerup(J.M. Mollerup, Chem. Eng. Technol. 31 (2008) 864-874)은 한 분자의 흡착이 다른 분자의 흡착을 촉진시킨 경우 협동성이 프론팅 크로마토그램을 가져올 수 있다는 것을 종래에 나타내었다.
크로마토그래피에서, 작은 풀 부피 및 높은 풀 농도를 얻도록 등온선의 초기 기울기에 가까운 고농도를 향하는 기울기를 갖는 것이 매력적이다.
일부 관련 파라미터가 다음과 같이 발견된다:
* 2가 또는 다가 금속 이온(예를 들어 Zn2 +)은 등온선의 위로 향한 곡률을 만들기 위해 노력하고 있다(dq/dc는 증가하고 있음 - q는 고체상 재료에 결합된 단백질의 농도이고 c는 용액 중 단백질의 농도임).
* 수지상에 증가된 로딩은 아래로 항한 곡률을 만들 것이다(dq/dc는 감소하고 있음).
* 등전점에 가까운 pH에서 순 전하는 작고 단백질 사이의 척력은 작다.
* 등전점 가까이에서, 단백질의 용해도는 정상적으로 감소하고 있다. 그러나 자가-회합은 등전점 둘레에서 분명히 증가된 용해도를 가져올 수 있다.
관심 단백질
용어 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 10개의 성분 아미노산 잔기로 구성된 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 망라하는 것을 의도한다. 성분 아미노산은 유전자 코드에 의해 코드화된 아미노산의 군으로부터인 것일 수 있고 그것은 합성 아미노산뿐만 아니라 유전자 코드에 의해 코드화되지 않은 천연 아미노산일 수 있다.
본원에서, 용어 "아미노산 잔기"는 형식적으로 히드록시기가 카르복시기로부터 제거된 및/또는 형식적으로 수소 원자가 아미노기로부터 제거된 아미노산이다.
유전자 코드에 의해 코드화되지 않은 천연 아미노산은 예를 들어, γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민이다. 합성 아미노산은 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산, 즉 D-알라닌 및 D-류신과 같은 유전자 코드에 의해 코드화된 아미노산의 D-이성질체, Aib(α-아미노이소부티르산), Abu(α-아미노부티르산), Tle(tert-부틸글리신), β-알라닌, 3-아미노메틸 벤조산, 안트라닐산을 포함한다.
22개의 단백질성 아미노산은: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 히드록시프롤린, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린이다.
따라서, 비단백질성 아미노산은 펩티드 결합을 통해 펩티드에 포함될 수 있는 모이어티이지만 단백질성 아미노산은 아니다. 예는 γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민과 같은 D-아미노산이다(그러나 이에 제한되지는 않음). 합성 비단백질성 아미노산은 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산, 즉 D-알라닌 및 D-류신과 같은 유전자 코드에 의해 코드화된 아미노산의 D-이성질체, Aib(α-아미노이소부티르산), Abu(α-아미노부티르산), Tle(tert-부틸글리신), 3-아미노메틸 벤조산, 안트라닐산, des-아미노-히스티딘, β-알라닌 등과 같은 아미노산의 베타 유사체, D-히스티딘, des-아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌, (1-아미노시클로프로필) 카르복시산, (1-아미노시클로부틸) 카르복시산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복시산, (1-아미노시클로헥실) 카르복시산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복시산, 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복시산, α-메틸 프롤린, 1-메틸 히스티딘, 3-메틸 히스티딘, 및 4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4, 5-c]피리딘-6-카르복시산 β-(1,2,4-트리아졸-1-일)-알라닌을 포함한다.
본원에 언급될 때, 용어 "관심 단백질"은 단백질-함유 용액에 존재하는 단백질과 비교해 분리된, 농축된 또는 정제된 형태로 얻는 것이 바람직한 단백질(또는 단백질들)을 의미하는 것으로 의도한다(아래 참조). 일부 예에서, 관심 단백질은 크로마토그래피 공정의 과정에서 특정 잘-한정된 변화를 당할 수 있고; 물론 이러한 예에서 단백질-함유 용액 및 결과된 형태의 관심 단백질은 화학적으로 또는 구조적으로 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
크로마토그래피 공정은 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 단백질에 특히 적합하다는 것으로 생각된다. 이러한 단백질의 예는 인슐린 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드, 엑세딘, 글루카곤, hGH, 아프로티닌, 인슐린-유사 성장 인자-1, 인슐린-유사 성장 인자-2, 위 억제 펩티드, 성장 호르몬-방출 인자, 뇌하수체 아데닐산고리화효소 활성화 펩티드, 세크레틴, 엔테로가스트린, 소마토스타틴, 소마토트로틴, 소마토메딘, 부갑상선 호르몬, 트롬보포이에틴, 에리트로포이에틴, 시상하부 방출 인자, 프롤락틴, 갑상선 자극 호르몬, 엔도르핀, 엔케팔린, 바소프레신, 옥시토신, 오피오이드, GIP, 펩티드 히스티딘-메티오닌 아미드, 헬로스펙틴, 헬로데르민, 뇌하수체 아데닐산고리화효소 활성화 펩티드-관련 펩티드, 혈관활성 장내 폴리펩티드이며, 그것들의 변이체도 포함한다(아래 비교).
현재 가장 관심있는 관심 단백질은 인슐린 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드, 및 엑세딘으로부터 선택된 것들이며, 그것들의 변이체도 포함한다.
일부 특히 관심있는 구체예에서, 관심 단백질은 인슐린 폴리펩티드로부터 선택되며, 그것들의 변이체도 포함한다.
단백질의 특히 관심있는 군은 Zn2 +와 같은 2가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합이 가능한 것들이 대표적이다.
단백질에 대하여 본원에 사용된 용어 "변이체"는 모단백질(parent protein)의 유사체, 모단백질의 유도체(DPP-IV 보호된 형태 포함) 또는 모단백질의 유사체의 유도체(DPP-IV 보호된 형태 포함)인 변형된 단백질을 의미한다.
단백질을 언급하는 본원에 사용된 용어 "유사체"는 단백질의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 단백질로부터 결실된 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 단백질로부터 결실된 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 단백질에 첨가되어, 변형된 단백질을 의미한다. 이러한 아미노산 잔기의 첨가 또는 결실은 단백질의 N-말단 및/또는 단백질의 C-말단에서 일어날 수 있다. 2개의 다르고 단순한 시스템은 유사체를 설명하기 위해 종종 사용되고: 예를 들어 Arg34-GLP-1(7-37) 또는 K34R-GLP-1(7-37)은 34 위치에서 자연 발생 리신이 아르기닌으로 치환된 GLP-1 유사체를 지칭한다(IUPAC-IUB 명명법에 따라 사용된 아미노산에 대한 표준 단일 글자 약어).
모단백질에 대하여 본원에 사용된 용어 "유도체"는 적어도 하나의 치환체가 모단백질 또는 그것의 유사체 즉 공유결합으로 변형되지 않은 모단백질에 존재하지 않는, 화학적으로 변형된 모단백질 또는 그것의 유사체를 의미한다. 전형적인 변형은 아미드, 탄수화물, 알킬기, 아실기, 에스테르, 페길화(PEGylation) 등이다. GLP-1(7-37)의 유도체의 예는 Arg34,Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-헥사데카노일)))-GLP-1(7-37)이다. 유도체는 문제의 단백질의 DPP-IV 보호된 형태를 또한 포함한다.
단백질을 언급하는 본원에 사용된 용어 "DPP-IV 보호된"은 혈장 펩티다제 디펩티딜 아미노펩티다제-4(DPP-IV)에 저항성인 상기 화합물을 제공하기 위해 화학적으로 변형된 단백질을 의미한다. 혈장 중 DPP-IV 효소는 몇 가지 단백질(예컨대, 펩티드 호르몬), 예를 들어 GLP-1, GLP-2, 엑세딘-4 등의 분해에 포함되는 것으로 알려져 있다. 따라서, DPP-IV에 의한 분해의 속도를 감소시키기 위해 상당한 노력이 DPP-IV 매개 가수분해에 민감한 단백질의 유사체 및 유도체를 개발하도록 행해지고 있다. 한 구체예에서 DPP-IV 보호된 단백질은 GLP-1(7-37) 또는 엑세딘-4(1-39)보다 DPP-IV에 더 저항성이다.
본원에 사용된 용어 "사람 인슐린"은 구조 및 성질이 잘 알려진 사람 인슐린 호르몬을 의미한다. 사람 인슐린은 A-쇄 및 B-쇄라는 2개의 폴리펩티드 쇄를 가진다. A-쇄는 21개의 아미노산 펩티드이고 B-쇄는 30개의 아미노산 펩티드이며, 두 쇄는: A-쇄의 7 위치의 시스테인과 B-쇄의 7 위치의 시스테인 사이의 제 1다리, 그리고 A-쇄의 20 위치의 시스테인과 B-쇄의 19 위치의 시스테인 사이의 2다리의 이황화 다리에 의해 연결된다. 제 3다리는 A-쇄의 6 및 11 위치의 시스테인들 사이에 존재한다.
인체에서, 호르몬은 구조: 프리펩티드-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A에서 24개의 아미노산의 프리펩티드와 이어서 86개의 아미노산을 함유하는 프로인슐린으로 구성된 단일-쇄 전구체 프로인슐린(프리프로인슐린)으로서 합성되고, 여기서 C는 31개의 아미노산의 연결 펩티드이다. Arg-Arg 및 Lys-Arg는 A 및 B쇄로부터 연결 펩티드의 절단을 위한 절단 부위이다.
본원에서 "인슐린"은 사람 인슐린 또는 돼지 또는 소의 인슐린과 같은 다른 종으로부터의 인슐린으로서 이해된다.
본원에 사용된 용어 "인슐린 펩티드"는 인슐린 또는 인슐린 활성을 갖는 그것의 유사체 또는 유도체인 펩티드(단백질)를 의미하고, 즉 그것은 인슐린 수용체를 활성화한다.
본원에 사용된 용어 "인슐린 유사체"는 인슐린의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 인슐린으로부터 결실된 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 인슐린에 첨가된 및/또는 삽입되는, 변형된 인슐린을 의미한다. 아미노산은 바람직하게는 뉴클레오티드의 3중("코돈")에 의해 코드화될 수 있는 아미노산이다(유전공학 참조). 본원에서, 아미노산은 그것의 공통의 3개 글자 코드, 바람직하게는: Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, Glu, Asp, Ser 및 Thr에 의해 주어질 수 있다. 대안으로, 1개의 글자 코드가 사용될 수 있다.
한 구체예에서 인슐린 유사체는 모인슐린(parent insulin)에 대해 8개 미만의 변형(치환, 결실, 첨가(삽입 포함) 및 그것들의 어떤 조합), 대안으로 모인슐린에 대해 7개 미만의 변형, 대안으로 모인슐린에 대해 6개 미만의 변형, 대안으로 모인슐린에 대해 5개 미만의 변형, 대안으로 모인슐린에 대해 4개 미만의 변형, 대안으로 모인슐린에 대해 3개 미만의 변형, 대안으로 모인슐린에 대해 2개 미만의 변형을 포함한다.
인슐린 분자에서의 변형은 쇄(A 또는 B), 위치, 및 본래의 아미노산 잔기를 치환하는 아미노산 잔기에 대한 1개 또는 3개의 글자 코드를 언급하여 표시된다.
"연결 펩티드" 또는 "C-펩티드"는 단일 쇄 프로인슐린-분자의 B-C-A 폴리펩티드 서열의 연결 부분 "C"를 의미한다. 사람 인슐린 쇄에서, C-펩티드는 B쇄의 30 위치와 A쇄의 1 위치를 연결하고 길이가 35개의 아미노산 잔기이다. 연결 펩티드는 2개-쇄 인슐린 분자를 형성하도록 A 및 B쇄로부터 연결 펩티드의 완전 절단을 위한 절단 부위의 역할을 하는 2개의 말단 2염기성 아미노산 서열, 예를 들어 Arg-Arg 및 Lys-Arg를 포함한다.
"desB30" 또는 "B(1-29)"는 B30 아미노산이 없는 천연 인슐린 B쇄 또는 그것의 유사체를 의미하고 "A(1-21)"은 천연 인슐린 A쇄를 의미한다. 따라서, 예를 들어, A21Gly,B28Asp,desB30 사람 인슐린은 A쇄의 21 위치에서 아미노산이 글리신으로 치환되고, B쇄의 28 위치에서 아미노산이 아스파르트산으로 치환되고, B쇄의 30 위치에서 아미노산이 결실된, 사람 인슐린의 유사체이다.
본원에서 "A1", "A2" 및 "A3" 등 같은 용어는 인슐린의 A쇄에서 각각 1, 2 및 3 등의 위치 아미노산을 표시한다(N-말단 단부로부터 계수됨). 마찬가지로, B1, B2 및 B3 등 같은 용어는 인슐린의 B쇄에서 각각 1, 2 및 3 등의 위치 아미노산을 표시한다(N-말단 단부로부터 계수됨). 아미노산에 대한 한 글자 코드를 사용하는, A21A, A21G 및 A21Q 같은 용어는 A21 위치에서의 아미노산이 각각 A, G 및 Q인 것을 지칭한다. 아미노산에 대한 3개 글자 코드를 사용하면, 대응하는 표현은 각각 A21Ala, A21Gly 및 A21Gln이다.
본원에서 용어 "A(0)" 또는 "B(0)"은 각각 A1 또는 B1의 N-말단 방향의 아미노산의 위치를 표시한다. 용어 A(-1) 또는 B(-1)은 각각 A(0) 또는 B(0)의 N-말단 방향으로 첫 번째 아미노산의 위치를 표시한다. 따라서 A(-2) 및 B(-2)는 각각 A(-1) 및 B(-1)의 N-말단 방향의 아미노산의 위치를 표시하고, A(-3) 및 B(-3) 등은 각각 A(-2) 및 B(-2)의 N-말단 방향의 아미노산의 위치 등을 표시한다.
본원에서 용어 A(0) 또는 B(0)은 각각 A1 또는 B1의 N-말단 방향의 아미노산의 위치를 표시한다. 용어 A(-1) 또는 B(-1)은 각각 A(0) 또는 B(0)의 N-말단 방향으로 첫 번째 아미노산의 위치를 표시한다. 따라서 A(-2) 및 B(-2)는 각각 A(-1) 및 B(-1)의 N-말단 방향의 아미노산의 위치를 표시하고, A(-3) 및 B(-3) 등은 각각 A(-2) 및 B(-2)의 N-말단 방향의 아미노산의 위치 등을 표시한다. 용어 A22 또는 B31은 각각 A21 또는 B30의 C-말단 방향의 아미노산의 위치를 표시한다. 용어 A23 또는 B32은 각각 A22 또는 B31의 C-말단 방향으로 첫 번째 아미노산의 위치를 표시한다. 따라서 A24 및 B33 등은 각각 A23 및 B32의 C-말단 방향의 아미노산의 위치 등을 표시한다.
인슐린 유사체의 예는 B쇄의 28 위치에서 Pro가 Asp, Lys, Leu, Val, 또는 Ala로 치환된 및/또는 B29 위치에서 Lys가 Pro, Glu 또는 Asp로 치환된 것이다. 더욱이, B3 위치에서 Asn은 Thr, Lys, Gln, Glu 또는 Asp로 치환될 수 있다. A21 위치에서 아미노산 잔기는 Gly로 치환될 수 있다. 또한 예를 들어 Lys와 같은 하나 또는 그 이상의 아미노산은 A-쇄 및/또는 B-쇄의 C-말단에 첨가될 수 있다. B1 위치에서 아미노산은 Glu로 치환될 수 있다. B16 위치에서 아미노산은 Glu 또는 His로 치환될 수 있다. 인슐린 유사체의 추가 예는 결실 유사체, 예를 들어 사람 인슐린에서 B30 아미노산이 결실된(des(B30) 사람 인슐린) 유사체, 사람 인슐린에서 B1 아미노산이 결실된(des(B1) 사람 인슐린) 인슐린 유사체, des(B28-B30) 사람 인슐린 및 des(B27) 사람 인슐린이다. A-쇄 및/또는 B-쇄가 N-말단 연장을 갖는 인슐린 유사체 그리고 A-쇄 및/또는 B-쇄가 B-쇄의 C-말단에 첨가된 예컨대 2개의 아르기닌 잔기로 C-말단 연장을 갖는, 인슐린 유사체가 또한 인슐린 유사체의 예이다. 추가 예는 언급된 돌연변이의 조합을 포함하는 인슐린 유사체이다. A14 위치에서 아미노산이 Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly 또는 His이고, B25 위치에서 아미노산이 His이고 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가 돌연변이를 더 포함한, 인슐린 유사체가 인슐린 유사체의 추가 예이다. A21 위치에서 아미노산 잔기가 Gly이고 인슐린 유사체가 C-말단에서 2개의 아르기닌 잔기로 더 연장된, 사람 인슐린의 인슐린 유사체가 또한 인슐린 유사체의 예이다.
인슐린 유사체의 추가 예는: DesB30 사람 인슐린; AspB28 사람 인슐린; AspB28,desB30 사람 인슐린; LysB3,GluB29 사람 인슐린; LysB28,ProB29 사람 인슐린; GlyA21,ArgB31,ArgB32 사람 인슐린; GluA14,HisB25 사람 인슐린; HisA14,HisB25 사람 인슐린; GluA14,HisB25,desB30 사람 인슐린; HisA14, HisB25,desB30 사람 인슐린; GluA14,HisB25,desB27,desB28,desB29,desB30 사람 인슐린; GluA14,HisB25,GluB27,desB30 사람 인슐린; GluA14,HisB16,HisB25,desB30 사람 인슐린; HisA14,HisB16,HisB25,desB30 사람 인슐린; HisA8,GluA14,HisB25,GluB27,desB30 사람 인슐린; HisA8,GluA14,GluB1,GluB16,HisB25,GluB27,desB30 사람 인슐린; 및 HisA8,GluA14,GluB16,HisB25,desB30 사람 인슐린을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "인슐린 유도체"는 화학적으로 변형된 모인슐린 또는 그것의 유사체를 의미하며, 여기서 변형(들)은 아미드, 탄수화물, 알킬기, 아실기, 에스테르, 페길화 등의 부착의 형태이다. 사람 인슐린의 유도체의 예는 사람 인슐린 B30 트레오닌 메틸 에스테르, GlyA21,ArgB31,Arg-아미드B32 사람 인슐린, NεB29-테트라데카노일 desB30 사람 인슐린, NεB29-테트라데카노일 사람 인슐린, NεB29-데카노일 desB30 사람 인슐린, NεB29-도데카노일 desB30 사람 인슐린, NεB29-3-(2-{2-(2-메톡시-에톡시)-에톡시}-에톡시)-프로피오닐 사람 인슐린, LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린); NεB29-(Nα-(Sar-OC(CH2)13CO)-γ-Glu) desB30 사람 인슐린, Nε eB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린, NεB29-헥사데칸디오일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린, NεB29-헥사데칸디오일-γ-L-Glu-아미드 desB30 인슐린이다.
본원에 사용된 용어 "글루카곤-유사 펩티드"는 프리프로글루카곤 유전자, 엑세딘뿐만 아니라 그것들의 유사체 및 유도체로부터 유도된 상동의 펩티드 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드 2(GLP-2), 및 옥신토모둘린(OXM)을 의미한다. Gila 몬스터에서 발견되는 엑세딘은 GLP-1에 상동이고 인슐린분비 효과를 또한 발휘한다. 엑세딘의 예는 엑세딘-4 및 엑세딘-3이다.
본원에 사용된 용어 "GLP-1 펩티드"는 종래의 합성 방법뿐만 아니라 종래의 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있는, GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36) 아미드뿐만 아니라 그것들의 유사체 및 유도체를 지칭하는 것을 의도한다. 이러한 GLP-1 펩티드는 본래의 글루카곤-유사 펩티드-1, 예를 들어 WO 87/06941에 개시된 GLP-1 (7-37) 및 그것의 기능적 유도체를 포함하는 펩티드 단편; WO 90/11296에 개시된 GLP-1 (7-36) 및 그것의 기능적 유도체를 포함하는 펩티드 단편; WO 91/11457에 개시된 활성 GLP-1 펩티드 7-34, 7-35, 7-36, 및 7-37의 유사체; 친유성 치환체가 WO 98/08871에 개시된 적어도 하나의 아미노산 잔기에 부착된 GLP-1 유도체; EP 0699686-A2에 개시된 GLP-1의 N-말단 절단 단편; 그리고 EP 0708179-A2에 개시된 N-말단 이미다졸기를 포함한 GLP-1 유사체 및 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "GLP-2 펩티드"는 종래의 합성 방법뿐만 아니라 종래의 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있는, GLP-2 (1-35), GLP-2 (1-34), GLP-2 (1-33)뿐만 아니라 그것들의 유사체 및 유도체를 지칭하는 것을 의도한다. 이러한 GLP-2 펩티드는 본래의 글루카곤-유사 펩티드-2, 친유성 치환체가 WO 98/08872에 개시된 적어도 하나의 아미노산 잔기에 부착된 GLP-2 유도체, 사람 글루카곤-유사 펩티드-2 (hGLP-2), GLP-2(1-30); GLP-2(1-31); GLP-2(1-32); GLP-2(1-33); GLP-2(1-34), GLP-2(1-35), Lys20GLP-2(1-33), Lys20Arg30GLP-2(1-33), Arg30Lys34GLP-2(1-34), Arg30Lys35GLP-2(1-35), Arg30 ,35Lys20GLP-2(1-35), Arg35GLP-2(1-35), Lys20(Nε-테트라데카노일)GLP-2(1-33); Lys20 ,30-비스(Nε-테트라데카노일)GLP-2(1-33); Lys20(Nε-테트라데카노일)Arg30GLP-2(1-33); Arg30Lys35(Nε-테트라데카노일)GLP-2(1-35); Arg30 ,35Lys20(Nε-테트라데카노일)GLP-2(1-35); Arg35Lys30(Nε-테트라데카노일)GLP-2(1-35); Arg30Lys34(Nε-테트라데카노일)GLP-2(1-34); Lys20(Nε-(ω-카르복시노나데카노일))GLP-2(1-33); Lys20 ,30-비스(Nε-(ω-카르복시노나데카노일))GLP-2(1-33); Lys20(Nε-(ω-카르복시노나데카노일))Arg30GLP-2(1-33); Arg30Lys35(Nε-(ω-카르복시노나데카노일))GLP-2(1-35); Lys30(Nε-(γ-글루타밀(Nα-테트라데카노일)))hGLP-2, Lys30(Nε-(γ-글루타밀(Nα-헥사데카노일)))hGLP-2, Arg30,35Lys20(Nε-(ω-카르복시노나데카노일))GLP-2(1-35); Arg35Lys30(Nε-(ω-카르복시노나데카노일))GLP-2(1-35); 및 Arg30Lys34(Nε-(ω-카르복시노나데카노일))GLP-2(1-34)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "엑세딘"은 엑세딘뿐만 아니라 그것의 유사체, 유도체 및 단편, 예를 들어 엑세딘-3 및 -4를 지칭하는 것을 의도한다. 엑세딘뿐만 아니라 그것의 유사체, 유도체 및 단편은 예를 들어 WO 99/43708에 기술되고, 그것의 내용은 그 전체가 참고자료로 본원에 포함된다.
본 발명의 한 목표는 관심 단백질을 고려하여 하나 또는 그 이상의 관련된 불순물을 제거하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "관련된 불순물"은 관심 단백질과 구조적 유사성을 갖는 불순물을 의미한다. 관련된 불순물은 관심 단백질보다 다른 화학적 또는 물리적 구조, 예를 들어 절단된 형태, 연장된 형태(여분의 아미노산, 여러 가지 유도체 등), 탈아미드화된 형태, 부정확하게 접힌 형태, 시알릴화를 포함하는 원하지 않은(예를 들어 과량의, 부정확한 또는 불충분한) 글리코실화를 갖는 형태, 산화된 형태, 라세미화에 따른 형태, 아실화가 원하는 곳보다 다른 잔기에서 일어난 형태 등을 갖는다.
한 구체예에서, 이러한 관련된 불순물은 관심 단백질 전에 용리된다.
그 다음 본원에 사용된 용어 "관련되지 않은 불순물"은 관련된 불순물과 다른 불순물들을 망라하는 것을 의도한다는 것이 이어진다.
관련된 불순물과 대조하여, 관련되지 않은 불순물은 항원성일 수 있다.
단백질-함유 용액
크로마토그래피 공정을 위한 시작 재료는 인슐린 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드, 및 엑세딘으로부터 선택된 단백질과 같은 관심 단백질과, 그것들의 변이체를 포함하는 어떤 단백질-함유 용액일 수 있다(상기 참조). 시작 재료는 효모 발현 시스템로부터 직접 또는 화학적 합성으로 직접 얻어진 매질일 수 있거나, 또는 시작 재료는 본 발명에 따르는 공정에 앞서 몇 가지 정제 또는 화학적 변형 단계를 받을 수 있다.
일부 관심있는 구체예에서, 단백질-함유 용액은 하나 또는 그 이상의 2가 또는 다가 금속 이온을 포함한다. 어떤 특정 이론에 의해 구속되지 않고, 이러한 2가 또는 다가 금속 이온은 관심 단백질의 자가-회합 및/또는 구조 변화를 용이하게 하고 이로써 크로마토그래피 공정에서의 피크 형태는 밀접하게 관련된 불순물 특히 관심 단백질 전에 용리된 것들이 관심 단백질로부터 분리될 수 있도록 변형된다는 것으로 현재 생각된다.
인슐린의 독특한 성질은 육합체로 회합하는 그것의 능력이며, 이러한 형태에서 호르몬은 생합성 및 저장 동안 화학적 및 물리적 분해로부터 보호된다. 인슐린의 X-선 결정학 연구는 육합체가 회전의 3개-습곡축에 의해 관련된 3개의 이합체로 구성된다는 것을 나타낸다. 이들 이합체는 3개-습곡축 상에 위치된 그것의 코어에서 2개의 아연 이온의 상호작용을 통해 거의 회합된다.
전이 금속 이온을 포함하는 2가 또는 다가 금속 이온의 적합한 예는 Zn2 +, Ca2+, Mg2 +, Ni2 +, Cu2 +, Ba2 +, 바람직하게는 Zn2 +로부터 선택된 것들이다. 2가 또는 다가 금속 이온 중 2가지 또는 그 이상의 타입이 단백질-함유 용액에 존재하거나, 또는 단지 1가지 타입일 수 있다.
단백질-함유 용액 중 2가 또는 다가 금속 이온의 농도는 전형적으로, 0.1-100 mM 같은, 예를 들어 0.5-75 mM인, 0.01-200 mM의 범위에 있다.
2가 또는 다가 금속 이온의 전하 등가와 관심 단백질의 전하 등가(즉 관심 단백질의 분자당 등가 전하) 사이의 비율은 전형적으로, 0.3:1 내지 20:1 같은, 예를 들어 0.4:1 내지 15:1, 또는 0.5:1 내지 10:1인, 0.1:1 내지 50:1이다.
관심 단백질이 인슐린 펩티드인 예에서, 2가 또는 다가 금속 이온 예를 들어 Zn2+ 이온의 전하 등가와 인슐린 펩티드의 전하 등가 사이의 비율은 전형적으로, 2:6 내지 15:6 같은, 예를 들어 3:6 내지 10:6, 또는 3:6 내지 5:6, 또는 7:6 내지 9:6인, 1:6 내지 20:6이다. 예시적인 예로서, 인슐린의 분자당 2개의 아연 이온은 4:1(즉 (2 아연 * 아연당 2개의 전하):1)의 2가 또는 다가 금속 이온(Zn2 +)의 전하 등가와 인슐린의 전하 등가 사이의 비율로서 이해된다. Zn2 +의 존재하에서, 인슐린은 육합체, 디-육합체 또는 인슐린 펩티드의 훨씬 더 큰 착물을 형성함으로써 자가-회합할 수 있는데, 이것은 용해성이며 인슐린의 결정화에 이용된다. 이와 같이, 일부 구체예에서, 단백질-함유 용액은 아연으로 결정화된 인슐린 펩티드로부터 얻어진다.
어떤 용매의 농도를 조정하거나 또는 물을 단백질-함유 용액에 첨가함으로써 이온 강도를 감소시키는 것이 더 바람직하거나 또는 필요할 수 있다. pH는 적합한 완충액에 의해 조정될 수 있고, 용매, 예를 들어 에탄올은 관심 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 첨가될 수 있다. 이와 같이, 단백질-함유 용액은 용매, 염, 완충액, 변형제/부형제(유기 또는 무기)를 또한 포함할 수 있다. 유기 용매는 어떤 1수산기 지방족 알콜(메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 예를 들어 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 1-프로판올 및 헥실렌 글리콜일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 크로마토그래피 정제의 어떤 섹션을 위한 선택적인 염 성분은: NaCl, KCl, NH4Cl, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산암모늄 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 어떤 염일 수 있다. 시트르산 완충액, 인산 완충액, TRIS 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 아세트산 완충액, 암모늄 완충액, 글리신 완충액 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 어떤 완충액 성분이 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 용매는 pH 5 내지 pH 9의 범위로 pH-완충된다.
단백질-함유 용액의 25℃에서의 전도도로서 표시된 이온 강도가 또한 역할을 할 수 있다. 이와 같이, 일부 구체예에서, 단백질-함유 용액의 전도도는 0-50 mS/cm 같은, 예를 들어 0-30 mS/cm인, 0-100 mS/cm, 또는 0.05-50 mS/cm 같은, 예를 들어 0.1-30 mS/cm인, 0.01-100 mS/cm의 범위에 있다.
단백질-함유 용액의 pH는 전형적으로 0-14, 1-13, 2-12, 3-11, 또는 4-10의 범위에서 유지된다. 그러나, 많은 예에서, 단백질-함유 용액의 pH는 용리액의 pH와 대략 같다.
크로마토그래피 공정
크로마토그래피 공정의 목표는 관심 단백질을 단백질-함유 용액의 다른 성분으로부터 분리하거나, 또는 관심 단백질을 더 높은 정도의 순도로 얻거나, 또는 관심 단백질에 대해 하나 또는 그 이상의 불순물의 존재를 적어도 감소시키는 것이다.
크로마토그래피 공정은 하기에 상세히 기재된다.
단계 (a)
본 발명에 따르는 공정의 제 1단계에서, 단백질-함유 용액이 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용된다.
고체상 재료는 크로마토그래피 공정의 타입, 예를 들어 역상 크로마토그래피(RPC), 음이온-교환 크로마토그래피(AIEC) 또는 양이온-교환 크로마토그래피(CIEC)와 같은 이온-교환 크로마토그래피(IEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피, 의사-친화성 크로마토그래피, 혼합-모드 크로마토그래피 등에 따라서 선택된다. 이와 같이, 고체상 재료는 이온 교환 크로마토그래피 재료(IEC), 역상 크로마토그래피 재료(RPC), 소수성-상호작용 크로마토그래피 재료(HIC) 등으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피 재료, 특히 음이온 교환 크로마토그래피 재료가 사용된다.
이온-교환 크로마토그래피 공정이 바람직하다는 한에 있어서, 고체상 재료는 당업자에게 알려진 정제되는 특정 펩티드 그리고 pH, 완충액, 이온 강도 등과 같은 사용된 조건(즉, 전형적으로, 양이온 교환 수지를 위한 펩티드의 등전점(pI) 아래의 pH 및 음이온 교환 수지를 위한 펩티드의 pI 이상의 pH, 원하는 pH를 유지시키기 위한 충분한 완충액 강도, 그리고 염 농도에 의해 가능하게 유도된 충분히 낮은 이온 강도)에 따라 선택될 수 있다. 적합한 고체상 재료의 비제한 예는 Amersham-Pharmacia Biotech로부터의 Sepharose 수지, Sephadex 수지, Streamline 수지, 및 Source 수지, BioSepra로부터의 HyperD 수지, Trisacryl 수지, 및 Spherosil 수지, TosoHaas로부터의 TSKgel 수지 및 Toyopearl 수지, Merck로부터의 Fractogel EMD 수지, Perseptive Biosystems로 부터의 Poros 수지, BioRAD로부터의 Macro-Prep 수지, Whatman으로부터의 Express-ion 수지 등이다.
역상 크로마토그래피 공정을 위한 고체상 재료는 선택적으로 어떤 종류의 치환을 갖는 크로마토그래피 역상 수지의 어떤 선택이며: Kromasil 100 C18과 같은 실리카 기반 수지, Amersham Biosciences로부터의 Source와 같은 중합체 기반 수지, Applied Biosystems로부터의 Poros 재료, 예를 들어 Poros R1, R2 및 R3 역상 수지, Ciphergen으로부터의 세라믹 기반 수지, 금속 산화물 기반 수지 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 실리카 기반 수지가 사용된다. 평형 용액(단계 (a) 전에 고체상 재료를 평형화시키기 위한 용액) 및 적용을 위한 단백질-함유 용액은 유기 용매를 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 유기 용매는 어떤 1수산기 지방족 알콜(메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 예를 들어 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 1-프로판올 및 헥실렌 글리콜일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 크로마토그래피 정제의 어떤 섹션을 위한 선택적인 염 성분은: NaCl, KCl, NH4Cl, CaCl2, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산암모늄 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 어떤 염일 수 있다. 시트르산 완충액, 인산 완충액, TRIS 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 아세트산 완충액, 암모늄 완충액, 글리신 완충액 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 어떤 완충액 성분이 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 용매는 pH 5 내지 pH 9의 범위로 pH-완충된다.
한 구체예에서, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 공정은 실리카 기반 크로마토그래피 수지, 예를 들어 C4-, C6-, C8-, C12-, C16-, C18-, C20-, 페닐- 또는 벤젠-치환 실리카겔과 같은 치환된 실리카겔을 사용하여 수행된다. 다른 구체예에서, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 공정은 중합체 기반 재료인 크로마토그래피 수지를 사용하여 수행된다.
소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한, 고체상 재료는 에틸, 부틸, 페닐 또는 헥실(단백질을 결합하는데 원인이 있는 것으로 나타남)과 같은 소수성 리간드로 치환된 매트릭스이다. 바람직한 재료는 부틸 및/또는 페닐 리간드로 치환된 것이다.
사용된 고체상 재료는 0.1-1000 ㎛의 범위, 예를 들어 1-100 ㎛의 범위의 평균 직경을 갖는 비드, 예를 들어 미립자 재료의 형태로 대부분 종종 제공된다. 고체상 재료는 펌프 등과 함께 배열된 HPLC 컬럼에 적합하게 배열되며 이것은 당업자에게 분명할 것이다.
크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 단백질-함유 용액의 적용은 전형적으로 종래의 프로토콜에 따라 수행되고, 즉 단백질-함유 용액의 농도, 온도, 이온 강도 등은 평소와 같을 수 있고(본원에 제안된 변형을 가짐) , 소수성 상호작용 크로마토그래피 재료는 평소와 같이 적용 전에 세척되고 평형화될 수 있다.
관심 단백질의 로딩은 예를 들어 컬럼 부피의 리터당 관심 단백질의 적어도 6.0 g(g/LCV)로 상당히 높을 수 있고, 공정의 개선된 피크 형태로 인하여, 풀 부피는 종래의 공정과 비교해 어느 정도 감소된다고 발견되었다. 일부 구체예에서, 관심 단백질의 로딩은 적어도 7.0 g/LCV, 또는 적어도 8.0 g/LCV, 또는 적어도 8.5 g/LCV, 또는 6.0-50 g/LCV, 또는 7.0-40 g/LCV, 또는 8.0-30 g/LCV, 예컨대 8.5-25 g/LCV, 예컨대 9.0-20g/LCV, 또는 9.5-15 g/LCV이다. 관심 단백질의 로딩은 최대 컬럼의 용량까지 로딩될 수 있다. 컬럼 부피는 전형적으로 채워진 팽윤된 크로마토그래피 고체상 재료의 부피에 해당한다.
그것으로 제한되지는 않지만, 본 발명의 공정은 "대규모-스케일"(또는 "공업용-스케일") 목적을 위해 특히 실행가능하다. 이와 같이, 일부 중요한 구체예에서, 공정은 컬럼 부피가 적어도 500 L 같은, 예를 들어 적어도 1000 L, 또는 적어도 5000 L인, 적어도 1 L, 또는 적어도 10 L, 또는 적어도 20 L, 또는 적어도 50 L, 또는 적어도 100 L인 대규모-스케일 공정이다.
특별히 중요하지는 않지만, 피크 형태를 더 개선시키기 위해 컬럼 및 단백질-함유 용액의 온도를 조정하는 것이 바람직할 수 있다. 전형적으로, 온도는 2-30℃와 같은 0-70℃, 0-50℃이다. 컬럼의 온도는 냉각 재킷 및 제어된 온도의 용액을 사용함으로써 명시된 범위 내에서 유지될 수 있다.
단계 (b)
전체 공정의 방해 없이 전형적으로 수행되는, 공정의 제 2단계에서, 관심 단백질은 용리액에 의해 고체상 재료로부터 용리된다.
공업용 정제 공정의 이온-교환 크로마토그래피에서 용리의 전형적인 원리는 단계 또는 선형 구배로서 일정한 pH에서 수성 완충액 용액의 염 성분 구배이다. 등용매 용리가 또한 가능하다. 유기 용매 또는 변형제가 원하는 형태로 단백질을 유지하기 위해 용리액에 첨가되거나 또는 단지 용액으로 있을 수 있다. 또한, pH의 변화는 때때로 관심 단백질을 용리하는데 사용될 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 공정을 위한, 용리의 타입은 특별히 중요하지는 않고, 따라서, 예를 들어 염 및/또는 양쪽성 이온의 단계적 감소 구배를 포함하는 용리 완충액으로 용리시키거나, 염(또는 구배-유지-구배 프로파일, 또는 다른 변이체)의 선형 감소 구배로 용리시키거나, 또는 pH 구배를 사용하거나, 또는 온도 구배 또는 이전에 언급된 것들의 조합을 사용하는 것이 가능하다. 대안으로, 칼슘 킬레이팅 화합물(예를 들어 EDTA, 시트르산염, 말론산염 등)의 구배 또는 물보다 덜 극성인 용매(예를 들어 에탄올, PEG, 2-프로판올 등을 포함하는 수용액)가 용리 완충액으로서 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 용리 완충액은 0.7-2.2 M 범위의 초기 농도의 염을 포함한다. 이와 같이, 한 구체예에서, 용리 완충액은 암모늄염에 대하여 구배 완충액이며, 구배 완충액 중 암모늄염의 초기 농도는 1.7-2.2 M의 범위에 있고, 구배 완충액 중 암모늄염의 최종 농도는 0.0-1.6 M의 범위에 있다. 최종 용리 완충액의 전도도는 바람직하게는 단계 (a)에서 단백질-함유 용액의 전도도보다 낮다. 많은 예에서, 단계 (b)의 용리 완충액은 단계 (a) 만큼의 pH를 가진다.
역상 고성능 액체 크로마토그래피 공정을 위해, 용리를 위해 사용된 용매는 전형적으로 pH 4 내지 pH 10의 범위로 pH-완충된다. 용리액은 10 %w/w 내지 80 %w/w의 농도의 알콜을 포함할 수 있다. 관심 단백질 및 불순물은 단계, 점근선 또는 선형 변화 구배 또는 유기 용매의 등용매로, 또는 이것들의 조합에 의해 용리되고 분리될 수 있다. 유기 용매 성분 구배는 낮은 농도부터 높은 농도로 된다. 용리는 용리 섹션에서 pH 및/또는 온도를 변화시킴으로써 또한 가능할 수 있다.
시작 pH, 완충액 및 이온 강도의 선택은 종래의 시험관 방법과 같은 잘 알려진 기술에 따라 수행된다. 예를 들어 Handbooks from Amersham-Pharmacia Biotech, 또는 Fundamentals of preparative and nonlinear chromatography, Georges Guiochon, Dean G. Shirazi, Attila Felinger, Anita M. Katti, Academic Press, 2006 비교.
한 구체예에서, 용리액은 어떤 유기 또는 무기 염으로부터, 바람직하게는 NaCl, KCl, NH4Cl, CaCl2, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산암모늄, 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 시트르산암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산암모늄, 아세트산칼슘 또는 그것들의 혼합물로부터, 가장 바람직하게는 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산암모늄, NaCl, NH4Cl, KCl로부터 선택된 염 성분을 포함한다.
염 성분은 전형적으로 0.1 mM 내지 3000 mM, 바람직하게는 1 mM 내지 1000 mM, 더 바람직하게는 5 mM 내지 500 mM, 가장 바람직하게는 20 mM 내지 300 mM의 농도로 존재한다.
용리액은 예를 들어 시트르산 완충액, 인산 완충액, TRIS 완충액, 붕산 완충액, 락트산 완충액, 글리실 글리신 완충액, 아르기닌 완충액, 탄산 완충액, 아세트산 완충액, 글루탐산 완충액, 암모늄 완충액, 글리신 완충액, 알킬아민 완충액, 아미노에틸 알콜 완충액, 에틸렌디아민 완충액, 트리에탄올 아민, 이미다졸 완충액, 피리딘 완충액 및 바르비투르산 완충액 및 그것들의 혼합물, 바람직하게는 시트르산, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 인산, 글루탐산, 글루탐산나트륨, 글리신, 탄산나트륨, 시트르산칼륨, 인산칼륨, 글루탐산칼륨, 탄산칼륨, tris-히드록시메틸 아미노 메탄 및 붕산 및 그것들의 혼합물로부터 선택된 완충액을 또한 포함할 수 있다.
완충액은 전형적으로 0.1 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 1 mM 내지 200 mM, 더 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 50 mM의 농도로 존재한다.
용리액의 pH는 전형적으로, 4.6-8.0, 또는 4.6-7.5, 또는 4.6-7.0, 또는 4.6-6.9, 또는 4.7-7.5, 또는 4.7-7.0, 또는 4.7-6.7, 또는 4.8-7.5, 또는 4.8-7.0, 또는 4.8-6.6, 또는 4.9-6.5, 또는 5.0-6.4 같은, 예를 들어 4.5-8.5, 또는 4.5-8.0, 또는 4.5-7.5, 또는 4.5-7.0의 범위인, 최대 8.0, 또는 최대 7.5, 또는 최대 7.0, 또는 최대 6.9, 또는 적어도 6.8, 또는 적어도 6.7, 또는 적어도 6.6, 또는 적어도 6.5 같은 최대 8.5이다.
용리액의 pH가 관심 단백질의 pI보다 최대 1.7 유닛 같은, 예를 들어 최대 1.9 유닛인, 최대 2.1 유닛이 더 높으면 공정은 훨씬 더 개선될 수 있다는 것이 발견되었다.
본원에 사용된 용어 "pI" 또는 "등전점"은 단백질의 전체 순 전하가 제로인 pH 값을 의미한다.
일부 구체예에서, 용리액은 단백질-함유 용액을 위해 상기에 더 언급된 것들과 같은, 하나 또는 그 이상의 2가 또는 다가 금속 이온을 포함할 수 있다.
어떤 특정 이론에 의해 구속되지 않고, 용리액에서 이러한 2가 또는 다가 금속 이온의 존재는 단계 (a)에서 유도된 관심 단백질의 자가-회합 및/또는 구조 변화를 보존하고 이로써 크로마토그래피 공정에서 피크 형태는 밀접하게 관련된 불순물 특히 관심 단백질 전에 용리하는 것들이 관심 단백질로부터 분리될 수 있도록 변형된다는 것으로 현재 생각된다.
전이 금속 이온을 포함하는, 2가 또는 다가 금속 이온의 적합한 예는 Zn2 +, Ca2+, Mg2 +, Ni2 +, Cu2 +, Ba2 +, 바람직하게는 Zn2 +로부터 선택된 것들이다. 2가 또는 다가 금속 이온의 2가지 또는 그 이상의 타입이거나, 또는 단지 1가지 타입이 용리액에 존재할 수 있다.
존재할 때, 용리액 중 2가 또는 다가 금속 이온의 농도는 바람직하게는 0.5-100 mM 또는 1.0-60 mM 같은, 0.1-200 mM의 범위에 있다.
한 특정 구체예에서, 용리액은 예를 들어 0.1-100 mM 같은, 예를 들어 0.5-75 mM인, 0.01-200 mM 범위의 농도의 Zn2 +이온을 포함한다.
용리액 중 2가 또는 다가 금속 이온의 전하 등가와 관심 단백질의 전하 등가(즉 관심 단백질의 분자당 등가 전하) 사이의 비율은 전형적으로, 0.3:1 내지 20:1 같은, 예를 들어 0.4:1 내지 15:1, 또는 0.5:1 내지 10:1인, 0.1:1 내지 50:1이다.
관심 단백질이 인슐린 펩티드인 예에서, 용리액 중 2가 또는 다가 금속 이온 예를 들어 Zn2 + 이온의 전하 등가와 인슐린 펩티드의 전하 등가 사이의 비율은 전형적으로, 2:6 내지 15:6 같은, 예를 들어 3:6 내지 10:6, 또는 3:6 내지 5:6, 또는 7:6 내지 9:6인, 1:6 내지 20:6이다.
용리와 관련하여, 관심 단백질이 수집된다. 이와 같이, 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 관심 단백질의 적어도 75 중량%에 해당하는 관심 단백질의 풀을 수집하는 것이 본 발명의 특징이다. 일부 구체예에서, 단계 (b)에서 수집된 관심 단백질의 풀은 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 단백질의 적어도 85 중량%, 또는 적어도 90 중량%, 또는 적어도 91 중량%, 또는 적어도 92 중량%, 또는 적어도 93 중량%, 또는 적어도 94 중량%, 또는 적어도 95 중량%, 또는 적어도 96 중량%와 같은 적어도 80 중량%에 해당한다.
본 발명의 공정에 의해, 관심 단백질의 풀로부터 여하의 밀접하게 관련된 단백질은 제외하는 것이 바람직하다.
용리 단계(단계 (b))에 앞서 단계 (a) 후에, 그러나 단계 (b) 전에 세척 완충액을 사용하는 세척 단계를 포함하는 것이 바람직할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 세척 완충액은 전형적으로 완충제를 포함하는 수용액, 전형적으로 MES, PIPES, ACES, BES, TES, HEPES, TRIS, 히스티딘, 이미다졸, 글리신, 글리실글리신, 글리신아미드, 인산, 아세트산(예를 들어 아세트산나트륨), 락트산, 글루타르산, 시트르산, 타르타르산, 말산, 말레산, 및 숙신산의 산 및 염으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 완충제이다. 완충제는 혼합물이 명시된 범위의 pH 값을 제공할 수 있는, 2가지 또는 그 이상의 성분의 혼합물을 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예는 아세트산 및 아세트산나트륨 등으로 언급될 수 있다. 세척 단계 (b)는 1가지, 2가지 또는 몇 가지 다른 세척 완충액을 사용함으로써, 또는 구배 세척 완충액의 적용에 의해 수행될 수 있다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 세척 단계 및 용리 단계가 별도의 단계일 필요는 없지만, 특히 구배 용리 완충액이 용리 단계에 이용되면 조합될 수 있다는 것이 또한 주목되어야 한다.
본 발명의 공정(단계 (a) 및 (b))으로부터 얻어진 생성물은 바람직하면 추가 종래의 정제 및 분리 단계를 당할 수 있다.
본 발명의 현재 바람직한 구체예
하나의 현재 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정을 제공하며, 상기 용액은 아연 및 2가 아연 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 인슐린 펩티드를 포함하며, 상기 공정은:
a. 인슐린-함유 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 관심 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
b. 최대 6.8의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 관심 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 관심 인슐린 펩티드의 적어도 90 중량%에 해당하는 관심 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함한다.
상기 중 하나의 구체예에서, 2가 또는 다가 금속 이온 예를 들어 Zn2 + 이온의 전하 등가와 인슐린 펩티드의 전하 등가 사이의 비율은 전형적으로, 2:6 내지 15:6 같은, 예를 들어 3:6 내지 10:6, 또는 3:6 내지 5:6, 또는 7:6 내지 9:6인, 1:6 내지 20:6이다.
본 발명은 하기 단락에서 요약된다:
1. 단백질-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정으로서, 상기 용액은 인슐린 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 2가 또는 다가 금속 이온을 포함하고, 상기 인슐린 펩티드는 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능하며, 상기 공정은:
a. 단백질-함유 용액을 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
b. 최대 8.5의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 인슐린 펩티드의 적어도 75 중량%에 해당하는 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 단백질-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정.
2. 제 1단락에 있어서, 2가 또는 다가 금속 이온은 Zn2 +, Ca2 +, Mg2 +, Ni2 +, Cu2+, Ba2 +, 바람직하게는 Zn2 +로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
3. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용액 중 2가 또는 다가 금속 이온의 농도는 0.1-100 mM 같은, 예를 들어 0.5-75 mM인, 0.01-200 mM의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 공정.
4. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 2가 또는 다가 금속 이온의 전하 등가와 인슐린 펩티드의 전하 등가 사이의 비율은 전형적으로, 0.3:1 내지 20:1 같은, 예를 들어 0.4:1 내지 15:1, 또는 0.5:1 내지 10:1인, 0.1:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 공정.
5. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 단백질-함유 용액의 전도도는 0-50 mS/cm 같은, 예를 들어 0-30 mS/cm인, 0-100 mS/cm, 또는 0.05-50 mS/cm 같은, 예를 들어 0.1-30 mS/cm인, 0.01-100 mS/cm의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 공정.
6. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 고체상 재료는 이온 교환 크로마토그래피 재료(IEC), 역상 크로마토그래피 재료(RPC), 이온 교환 크로마토그래피 재료와 같은 소수성-상호작용 크로마토그래피 재료(HIC), 특히 음이온 교환 크로마토그래피 재료로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
7. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드의 로딩은 적어도 7.0 g/LCV, 또는 적어도 8.0g/LCV, 또는 적어도 8.5 g/LCV, 또는 6.0-50 g/LCV, 또는 7.0-40 g/LCV, 또는 8.0-30 g/LCV, 예컨대 8.5-25 g/LCV, 예컨대 9.0-20 g/LCV, 또는 9.5-15g/LCV인 것을 특징으로 하는 공정.
8. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액의 pH는 4.6-8.0, 또는 4.6-7.5, 또는 4.6-7.0, 또는 4.6-6.9, 또는 4.7-7.5, 또는 4.7-7.0, 또는 4.7-6.7, 또는 4.8-7.5, 또는 4.8-7.0, 또는 4.8-6.6, 또는 4.9-6.5, 또는 5.0-6.4 같은, 예를 들어 4.5-8.5, 또는 4.5-8.0, 또는 4.5-7.5, 또는 4.5-7.0의 범위인, 최대 8.0, 또는 최대 7.5, 또는 최대 7.0, 또는 최대 6.9 같은 최대 8.5, 또는 적어도 6.8, 또는 적어도 6.7, 또는 적어도 6.6, 또는 적어도 6.5인 것을 특징으로 하는 공정.
9. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액의 pH는 인슐린 펩티드의 pI보다 최대 1.7 유닛 같은, 예를 들어 최대 1.9 유닛인, 최대 2.1 유닛이 더 높은 것을 특징으로 하는 공정.
10. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (b)에서 수집된 인슐린 펩티드의 풀은 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 인슐린 펩티드의 적어도 85 중량%, 또는 적어도 90 중량%, 또는 적어도 91 중량%, 또는 적어도 92 중량%, 또는 적어도 93 중량%, 또는 적어도 94 중량%, 또는 적어도 95 중량%, 또는 적어도 96 중량%와 같은 적어도 80 중량%인 것을 특징으로 하는 공정.
11. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액 중 2가 또는 다가 금속 이온의 농도는 0.5-100 mM, 또는 1.0-60 mM와 같은 0.1-200 mM의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 공정.
12. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액 중 2가 또는 다가 금속 이온의 전하 등가와 인슐린 펩티드의 전하 등가 사이의 비율은 0.3:1 내지 20:1 같은, 예를 들어 0.4:1 내지 15:1, 또는 0.5:1 내지 10:1인, 0.1:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 공정.
13. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액은 예를 들어 0.1-100 mM 같은, 예를 들어 0.5-75 mM인, 0.01-200 mM의 범위의 Zn2 + 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
14. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 그것들의 변이체를 포함하는 인슐린 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드, 및 엑세딘으로부터, 특히 그것들의 변이체를 포함하는 인슐린 펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
15. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 단백질-함유 용액은 아연으로 결정화된 인슐린 펩티드로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 공정.
16. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 컬럼 부피는 적어도 500 L 같은, 예를 들어 적어도 1000 L, 또는 적어도 5000 L인, 적어도 1 L, 또는 적어도 10 L, 또는 적어도 20 L, 또는 적어도 50 L, 또는 적어도 100 L인 대규모-스케일 공정인 것을 특징으로 하는 공정.
17. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 자연 발생 인슐린이거나 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기에 부착된 측쇄 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 부착된 측쇄를 갖는 인슐린 유사체인 인슐린 유도체 및 그 여하의 Zn2 + 착물로부터 선택되고, 측쇄는 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 공정:
-W-X-Y-Z
여기서 W는:
* 측쇄에 카르복시산기를 갖는 α-아미노산 잔기(여기서 잔기는 그것의 카르복시산기 중 하나와, B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기와 함께 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 함께 아미드기를 형성한다);
* 아미드 결합을 통해 함께 연결된 2, 3 또는 4개의 α-아미노산 잔기로 구성된 쇄(이 쇄는 - 아미드 결합을 통해 - B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 연결되고, W의 아미노산 잔기는 W가 측쇄에 카르복시산기를 갖는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖도록 중성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 및 측쇄에 카르복시산기를 갖는 아미노산 잔기의 기로부터 선택된다); 또는
* X로부터 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기로 또는 X로부터 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기로의 공유결합이며,
X는:
* -CO-;
* -CH(COOH)CO-;
* -N(CH2COOH)CH2 CO-;
* -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
* -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
* -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
* -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
* -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-; 또는
* -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-이고,
이것은
a) W가 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 쇄일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 W의 아미노기와 아미드 결합을 형성하거나, 또는
b) W가 공유결합일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 B쇄의 N-말단 α-아미노기와 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하며,
Y는:
* -(CH2)m-(여기서 m은 6 내지 32 범위의 정수이다);
* 1, 2 또는 3개의 -CH=CH-기 및 쇄에서 탄소 원자의 총수가 10 내지 32개의 범위로 되기에 충분한 복수의 -CH2-기를 포함하는 2가 탄화수소 쇄; 또는
* 식 -(CH2)vC6H4(CH2)W-의 2가 탄화수소 쇄이며(여기서 v 및 w는 v와 w의 합이 6 내지 30의 범위에 있도록, 정수이거나 또는 그것들 중 하나는 제로이다),
Z는:
* -COOH;
* -CO-Asp;
* -CO-Glu;
* -CO-Gly;
* -CO-Sar;
* -CH(COOH)2;
* -N(CH2COOH)2;
* -SO3H; 또는
* -PO3H이다.
18. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린인 것을 특징으로 하는 공정.
19. 제 1단락 내지 제 16단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 하기 식을 갖는 인슐린 유도체 및 그것의 여하의 Zn2 + 착물인 것을 특징으로 하는 공정:
Figure pct00001
여기서 Ins는 모인슐린 부분이고 Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n-X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3-[CH2]n-Q5-[CH2]n-Z는 치환체이고, Ins는 Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 치환체의 Q1 또는 Q2의 CO기 사이의 아미드 결합을 통해 치환체에 부착되고;
각 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
Q1은:
* 측쇄에 카르복시산을 갖는 아미노산 또는 비하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 아미노산 아미드(여기서 아미드의 잔기는 그것의 카르복시산기와, Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기와 함께 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 함께 아미드기를 형성한다), 또는
* 아미드 결합을 통해 함께 연결된 상기 명시된 2, 3 또는 4개의 α-아미노산 아미드 또는 아미노산 잔기로 구성된 쇄(여기서 이 쇄는 - 아미드 결합을 통해 - Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 연결된다), 또는
* 결합이고;
Q2는:
* -COCH(CONH2)-
* -COCH2N(CH2CONH2)-
* -COCH2N(CH2CONH2)COCH2N(CH2CONH2)
* -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
* -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
* -COCH2N(CH2CH2CONH2)-
* -COCH2CH2N(CH2CONH2)-
* -COCH2OCH2CONH-
* -CO((CR5R6)1-6-NH-CO)1-4-;
* -CO((CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-(여기서 R5는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3 또는 -CONH2일 수 있고, R6는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3일 수 있다); 또는
* 결합이고,
다만,
* Q1 또는 Q2 중 적어도 하나는 결합이 아니고,
* n이 0 또는 1이고, X1이 결합이고 Q3가 (CH2CH2O)2-, (CH2CH2O)3- 또는 (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)-일 때 Q2는 -CO-(CH2)2-CO-NH-가 아니고,
* Q1 또는 Q2의 아민이 치환체의 나머지와 결합을 형성하면, 아민은 카르보닐기를 통해 치환체의 나머지와 연결되어야 하며,
Q3, Q4, 및 Q5는 서로 독립적으로
* -(CH2)m-(여기서 m은 6 내지 32 범위의 정수이다);
* 1, 2 또는 3개의 -CH=CH-기 및 쇄에서 탄소 원자의 총수가 4 내지 32의 범위로 되기에 충분한 복수의 -CH2-기를 포함하는 2가 탄화수소 쇄;
* -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)-;
* -(CO-(CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-(여기서 R5는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3 또는 -CONH2일 수 있고, R6는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3일 수 있다);
* -CO-(CH2)0-3-Ar-(CH2)0-3-(여기서 Ar은 아릴렌 또는 헤테로아릴렌일 수 있는데, 이것은 -CH3, -(CH)1-6-CH3, -CONR1R2 또는 -SO2NR1R2로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, R1 및 R2는 서로 독립적으로 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다);
* (CH2CH2O)y-; (CH2CH2CH2O)y-; (CH2CH2CH2CH2O)y-; (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y- 또는 (CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-; (CH2OCH2)y-(여기서 y는 1-20이다);
* 아릴렌 또는 헤테로아릴렌(이것은 -CH3, -(CH)1-6-CH3, -CONR1R2 또는 -SO2NR1R2로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, 여기서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다);
* 하기 식의 쇄:
-(CH2)s-Y1-(Ar)v1-Y2-(CH2)w-Y3-(Ar)v2-Y4-(CH2)t-Y5-(Ar)v3-Y6-(CH2)z-(여기서 Ar은 상기와 같이 정의되고, Y1-Y6는 서로 독립적으로 O, S, S=O, SO2 또는 결합일 수 있고; s, w, t 및 z는 s, w, t 및 z의 합이 4 내지 30의 범위에 있도록 서로 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고, v1, v2, 및 v3는 Y1-Y6가 서로 연결되지 않고 구조 -O-(CH2)1-O-가 일어나지 않는다는 조건하에서 서로 독립적으로 0 또는 1일 수 있다); 또는
* 결합이고;
다만 Q3-Q5 중 적어도 하나는 결합이 아니며;
X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로
* O;
* -C=O;
* 결합;
* NCOR1(여기서 R1은 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다); 또는
*
Figure pct00002
(여기서 R은 수소, C1 -3-알킬, C2 -3-알케닐 또는 C2 -3-알키닐일 수 있다)이고;
다만,
* X1, X2 및 X3는 Z에 결합할 수 없고
* X1, X2 및 X3가 O이면, X1, X2 및 X3는 Q3, Q4, 및 Q5의 O에 직접 결합하지 않으며;
그리고
Z는: -COOH; -CO-Asp; -CO-Glu; -CO-Gly; -CO-Sar; -CH(COOH)2; -N(CH2COOH)2; -SO3H; -OSO3H; -OPO3H2; -PO3H2; -테트라졸-5-일 또는 -O-W1이다(여기서 W1은 아릴렌 또는 헤테로아릴렌인데, 이것은 테트라조-5-릴, -COOH, -SO3H, -(CH2)1-6-SO3H, -(CH2)1-6-O-PO3H2, -CONR3R4 또는 -SO2NR3R4로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, R3 및 R4는 Z가 -O-W1이면 Q1은 반드시 존재해야 한다는 조건하에 서로 독립적으로 H, -(CH2)1-6-SO3H, 또는 -(CH2)1-6-O-PO3H2일 수 있다).
20. 제 1단락 내지 제 16단락 및 제 19단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정:
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-테트라데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-트리데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-β-알라닐 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-L-아스파르틸아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-ε-아미노헥사노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-δ-아미노펜타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-10-(4-카르복시페녹시)-데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-4-[11-(4-카르복시페닐)운데카노일아미노] 부티릴 desB30 사람 인슐린,
NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-카르복시헵타노일아미노)프로폭시]부톡시}프로필카르바모일)-프로피오닐-γ-글루타밀아미드) desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-트리데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-운데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-테트라데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-{4-[10-(4-카르복시-페녹시)-데카노일아미노]-부티릴} desB30 인슐린,
NεB29-{4-[(14-카르복시-테트라데카노일아미노)-메틸]-벤조일} desB30 인슐린,
NεB29-[16-(4-카르복시-페녹시)-헥사데카노일] desB30 인슐린,
NeB29-{4-[(15-카르복시펜타데카노일아미노)벤조일]-desB30 사람 인슐린, 및
NεB29-{4-[(15-카르복시-펜타데카노일아미노)-메틸]-벤조일}-desB30 인슐린.
21. 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정으로서, 상기 용액은 아연 및 2가 아연 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 인슐린 펩티드를 포함하며, 상기 공정은:
a. 인슐린-함유 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 관심 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
b. 최대 6.8의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 관심 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 관심 인슐린 펩티드의 적어도 90 중량%에 해당하는 관심 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정.
22. 제 21단락에 있어서, 용액 중 아연 이온의 농도는 0.1-100 mM 같은, 예를 들어 0.5-75 mM인, 0.01-200 mM의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 공정.
23. 제 21단락 또는 제 22단락에 있어서, 아연 이온과 인슐린 펩티드의 전하 등가 사이의 비율은 전형적으로 0.3:1 내지 20:1 같은, 예를 들어 0.4:1 내지 15:1, 또는 0.5:1 내지 10:1인, 0.1:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 공정.
24. 제 21단락 내지 제 23단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린-함유 용액의 전도도는 0-50 mS/cm 같은, 예를 들어 0-30 mS/cm인, 0-100 mS/cm 또는 0.05-50 mS/cm 같은, 예를 들어 0.1-30 mS/cm인, 0.01-100 mS/cm의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 공정.
25. 제 21단락 내지 제 24단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드의 로딩은 적어도 7.0 g/LCV, 또는 적어도 8.0 g/LCV, 또는 적어도 8.5 g/LCV, 또는 6.0-50 g/LCV, 또는 7.0-40 g/LCV, 또는 8.0-30 g/LCV, 예컨대 8.5-25 g/LCV, 예컨대 9.0-20 g/LCV, 또는 9.5-15 g/LCV인 것을 특징으로 하는 공정.
26. 제 21단락 내지 제 25단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액의 pH는 4.0-6.6, 또는 4.0-6.4, 또는 4.0-6.2, 또는 4.0-6.0, 또는 4.4-6.8, 또는 4.4-6.6, 또는 4.4-6.4, 또는 4.8-6.8, 또는 4.8-6.6, 또는 4.8-6.2, 또는 5.0-6.8, 또는 5.0-6.6 같은, 예를 들어 4.0-6.8, 또는 4.4-6.8, 또는 4.8-6.8, 또는 5.0-6.8의 범위인, 최대 6.6, 또는 최대 6.4, 또는 최대 6.2, 또는 최대 6.0과 같은 최대 6.8이거나, 적어도 4.0, 또는 적어도 4.4, 또는 적어도 4.8, 또는 적어도 5.0인 것을 특징으로 하는 공정.
27. 제 21단락 내지 제 26단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액의 pH는 관심 단백질의 pI보다 최대 1.7 유닛 같은, 예를 들어 최대 1.9 유닛인, 최대 2.1 유닛이 더 높은 것을 특징으로 하는 공정.
28. 제 21단락 내지 제 27단락 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (b)에서 수집된 인슐린 펩티드의 풀은 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 인슐린 펩티드의 적어도 91 중량%, 또는 적어도 92 중량%, 또는 적어도 93 중량%, 또는 적어도 94 중량%, 또는 적어도 95 중량%, 또는 적어도 96 중량%인 것을 특징으로 하는 공정.
29. 제 21단락 내지 제 28단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액 중 아연 이온의 농도는 0.5-100 mM, 또는 1.0-60 mM와 같은 0.1-200 mM의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 공정.
30. 제 21단락 내지 제 29단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액 중 아연 이온과 인슐린 펩티드의 전하 등가 사이의 비율은 0.3:1 내지 20:1 같은, 예를 들어 0.4:1 내지 15:1, 또는 0.5:1 내지 10:1인, 0.1:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 공정.
31. 제 21단락 내지 제 30단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액은 예를 들어 0.1-100 mM 같은, 예를 들어 0.5-75 mM인, 0.01-200 mM의 범위의 Zn2 + 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
32. 제 21단락 내지 제 31단락 중 어느 한 단락에 있어서, 컬럼 부피가 적어도 500 L 같은, 예를 들어 적어도 1000 L, 또는 적어도 5000 L인, 적어도 1 L, 또는 적어도 10 L, 또는 적어도 20 L, 또는 적어도 50 L, 또는 적어도 100 L인 대규모-스케일 공정인 것을 특징으로 하는 공정.
33. 제 21단락 내지 제 32단락 중 어느 한 단락에 있어서, 세척 단계는 단계 (a) 후에 그리고 용리 단계 (b) 전에 1가지, 2가지 또는 몇 가지 세척 완충액을 사용하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 공정.
34. 제 21단락 내지 제 33단락 중 어느 한 단락에 있어서, 세척 완충액은 MES, PIPES, ACES, BES, TES, HEPES, TRIS, 히스티딘, 이미다졸, 글리신, 글리실글리신, 글리신아미드, 인산, 아세트산(예를 들어 아세트산나트륨), 락트산, 글루타르산, 시트르산, 타르타르산, 말산, 말레산, 및 숙신산의 산 및 염으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 완충제를 포함하는 수용액인 것을 특징으로 하는 공정.
35. 제 21단락 내지 제 34단락 중 어느 한 단락에 있어서, 완충제는 2가지 또는 그 이상의 성분의 혼합물을 포함하며, 혼합물은 예를 들어 아세트산 및/또는 아세트산나트륨과의 혼합물에 의해 명시된 범위의 pH 값을 제공할 수 있는 것을 특징으로 하는 공정.
36. 제 21단락 내지 제 35단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 자연 발생 인슐린이거나 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기에 부착된 측쇄 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 부착된 측쇄를 갖는 인슐린 유사체인 인슐린 유도체 및 그 여하의 Zn2 + 착물로부터 선택되고, 측쇄는 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 공정:
-W-X-Y-Z
여기서 W는:
* 측쇄에 카르복시산기를 갖는 α-아미노산 잔기(여기서 잔기는 그것의 카르복시산기 중 하나와, B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기와 함께 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 함께 아미드기를 형성한다);
* 아미드 결합을 통해 함께 연결된 2, 3 또는 4개의 α-아미노산 잔기로 구성된 쇄(이 쇄는 - 아미드 결합을 통해 - B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 연결되고, W의 아미노산 잔기는 W가 측쇄에 카르복시산기를 갖는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖도록 중성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 및 측쇄에 카르복시산기를 갖는 아미노산 잔기의 기로부터 선택된다); 또는
* X로부터 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기로 또는 X로부터 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기로의 공유결합이며,
X는:
* -CO-;
* -CH(COOH)CO-;
* -N(CH2COOH)CH2 CO-;
* -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
* -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
* -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
* -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
* -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-; 또는
* -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-이고,
이것은
a) W가 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 쇄일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 W의 아미노기와 아미드 결합을 형성하거나, 또는
b) W가 공유결합일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 B쇄의 N-말단 α-아미노기와 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하며,
Y는:
* -(CH2)m-(여기서 m은 6 내지 32 범위의 정수이다);
* 1, 2 또는 3개의 -CH=CH-기 및 쇄에서 탄소 원자의 총수가 10 내지 32개의 범위로 되기에 충분한 복수의 -CH2-기를 포함하는 2가 탄화수소 쇄; 또는
* 식 -(CH2)vC6H4(CH2)W-의 2가 탄화수소 쇄이며(여기서 v 및 w는 v와 w의 합이 6 내지 30의 범위에 있도록, 정수이거나 또는 그것들 중 하나는 제로이다),
Z는:
* -COOH;
* -CO-Asp;
* -CO-Glu;
* -CO-Gly;
* -CO-Sar;
* -CH(COOH)2;
* -N(CH2COOH)2;
* -SO3H; 또는
* -PO3H이다.
37. 제 21단락 내지 제 36단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린인 것을 특징으로 하는 공정.
38. 제 21단락 내지 제 37단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정으로서, 상기 용액은 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린 및 2가 아연 이온을 포함하며, 상기 공정은:
a. 인슐린-함유 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 관심 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
b. 6.4 내지 6.8 범위의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 관심 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린의 적어도 90 중량%에 해당하는 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린의 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정.
39. 제 1단락 내지 제 38단락 중 어느 한 단락에 있어서, 세척 단계는 단계 (a) 후에 그리고 용리 단계 (b) 전에 에탄올 및 트리에탄올아민을 포함하는 세척 완충액을 사용하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 공정.
40. 제 21단락 내지 제 35단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 하기 식을 갖는 인슐린 유도체 및 그것의 여하의 Zn2 + 착물인 것을 특징으로 하는 공정:
Figure pct00003
여기서 Ins는 모인슐린 부분이고 Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n-X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3-[CH2]n-Q5-[CH2]n-Z는 치환체이고, Ins는 Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 치환체의 Q1 또는 Q2의 CO기 사이의 아미드 결합을 통해 치환체에 부착되고;
각 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
Q1은:
* 측쇄에 카르복시산을 갖는 아미노산 또는 비하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 아미노산 아미드(여기서 아미드의 잔기는 그것의 카르복시산기와, Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기와 함께 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 함께 아미드기를 형성한다), 또는
* 아미드 결합을 통해 함께 연결된 상기 명시된 2, 3 또는 4개의 α-아미노산 아미드 또는 아미노산 잔기로 구성된 쇄(여기서 이 쇄는 - 아미드 결합을 통해 - Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 연결된다), 또는
* 결합이고;
Q2는:
* -COCH(CONH2)-
* -COCH2N(CH2CONH2)-
* -COCH2N(CH2CONH2)COCH2N(CH2CONH2)
* -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
* -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
* -COCH2N(CH2CH2CONH2)-
* -COCH2CH2N(CH2CONH2)-
* -COCH2OCH2CONH-
* -CO((CR5R6)1-6-NH-CO)1-4-;
* -CO((CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-(여기서 R5는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3 또는 -CONH2일 수 있고, R6는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3일 수 있다); 또는
* 결합이고,
다만,
* Q1 또는 Q2 중 적어도 하나는 결합이 아니고,
* n이 0 또는 1이고, X1이 결합이고 Q3가 (CH2CH2O)2-, (CH2CH2O)3- 또는 (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)-일 때 Q2는 -CO-(CH2)2-CO-NH-가 아니고,
* Q1 또는 Q2의 아민이 치환체의 나머지와 결합을 형성하면, 아민은 카르보닐기를 통해 치환체의 나머지와 연결되어야 하며,
Q3, Q4, 및 Q5는 서로 독립적으로
* -(CH2)m-(여기서 m은 6 내지 32 범위의 정수이다);
* 1, 2 또는 3개의 -CH=CH-기 및 쇄에서 탄소 원자의 총수가 4 내지 32의 범위로 되기에 충분한 복수의 -CH2-기를 포함하는 2가 탄화수소 쇄;
* -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)-;
* -(CO-(CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-(여기서 R5는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3 또는 -CONH2일 수 있고, R6는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3일 수 있다);
* -CO-(CH2)0-3-Ar-(CH2)0-3-(여기서 Ar은 아릴렌 또는 헤테로아릴렌일 수 있는데, 이것은 -CH3, -(CH)1-6-CH3, -CONR1R2 또는 -SO2NR1R2로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, R1 및 R2는 서로 독립적으로 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다);
* (CH2CH2O)y-; (CH2CH2CH2O)y-; (CH2CH2CH2CH2O)y-; (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y- 또는 (CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-; (CH2OCH2)y-(여기서 y는 1-20이다);
* 아릴렌 또는 헤테로아릴렌(이것은 -CH3, -(CH)1-6-CH3, -CONR1R2 또는 -SO2NR1R2로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, 여기서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다);
* 하기 식의 쇄:
-(CH2)s-Y1-(Ar)v1-Y2-(CH2)w-Y3-(Ar)v2-Y4-(CH2)t-Y5-(Ar)v3-Y6-(CH2)z-(여기서 Ar은 상기와 같이 정의되고, Y1-Y6는 서로 독립적으로 O, S, S=O, SO2 또는 결합일 수 있고; s, w, t 및 z는 s, w, t 및 z의 합이 4 내지 30의 범위에 있도록 서로 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고, v1, v2, 및 v3는 Y1-Y6가 서로 연결되지 않고 구조 -O-(CH2)1-O-가 일어나지 않는다는 조건하에서 서로 독립적으로 0 또는 1일 수 있다); 또는
* 결합이고;
다만 Q3-Q5 중 적어도 하나는 결합이 아니며;
X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로
* O;
* -C=O;
* 결합;
* NCOR1(여기서 R1은 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다); 또는
*
Figure pct00004
(여기서 R은 수소, C1 -3-알킬, C2 -3-알케닐 또는 C2 -3-알키닐일 수 있다)이고;
다만,
* X1, X2 및 X3는 Z에 결합할 수 없고
* X1, X2 및 X3가 O이면, X1, X2 및 X3는 Q3, Q4, 및 Q5의 O에 직접 결합하지 않으며;
그리고
Z는: -COOH; -CO-Asp; -CO-Glu; -CO-Gly; -CO-Sar; -CH(COOH)2; -N(CH2COOH)2; -SO3H; -OSO3H; -OPO3H2; -PO3H2; -테트라졸-5-일 또는 -O-W1이다(여기서 W1은 아릴렌 또는 헤테로아릴렌인데, 이것은 테트라조-5-릴, -COOH, -SO3H, -(CH2)1-6-SO3H, -(CH2)1-6-O-PO3H2, -CONR3R4 또는 -SO2NR3R4로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, R3 및 R4는 Z가 -O-W1이면 Q1은 반드시 존재해야 한다는 조건하에 서로 독립적으로 H, -(CH2)1-6-SO3H, 또는 -(CH2)1-6-O-PO3H2일 수 있다).
41. 제 21단락 내지 제 35단락 및 제 40단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는: NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-테트라데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-트리데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-β-알라닐 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-L-아스파르틸아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-ε-아미노헥사노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-δ-아미노펜타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-10-(4-카르복시페녹시)-데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-4-[11-(4-카르복시페닐)운데카노일아미노] 부티릴 desB30 사람 인슐린,
NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-카르복시헵타노일아미노)프로폭시]부톡시}프로필카르바모일)-프로피오닐-γ-글루타밀아미드) desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-트리데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-운데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-테트라데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-{4-[10-(4-카르복시-페녹시)-데카노일아미노]-부티릴} desB30 인슐린,
NεB29-{4-[(14-카르복시-테트라데카노일아미노)-메틸]-벤조일} desB30 인슐린,
NεB29-[16-(4-카르복시-페녹시)-헥사데카노일] desB30 인슐린,
NεB29-{4-[(15-카르복시펜타데카노일아미노)벤조일]-desB30 사람 인슐린, 및
NεB29-{4-[(15-카르복시-펜타데카노일아미노)-메틸]-벤조일}-desB30 인슐린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 공정.
42. 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 인슐린 펩티드의 이온-교환 크로마토그래피에서 피크 형태를 제어하는 방법으로서,
a. 인슐린 펩티드 및 관련된 불순물의 최적의 분리를 얻도록 2가 또는 다가 금속 이온을 사용하며, 여기서 2가 금속 이온은 인슐린 펩티드의 프론팅 피크 형태를 고정하기 위해 첨가된 것이고, 관련된 불순물은 인슐린 펩티드 전에 용리하는 방법.
43. 제 42단락에 있어서, 2가 또는 다가 금속 이온은 Zn2 +, Ca2 +, Mg2 +, Ni2 +, Cu2+, Ba2 +, 바람직하게는 Zn2 +로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제 42단락 또는 제 33단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 4.0-6.6, 또는 4.0-6.4, 또는 4.0-6.2, 또는 4.0-6.0, 또는 4.4-6.8, 또는 4.4-6.6, 또는 4.4-6.4, 또는 4.8-6.8, 또는 4.8-6.6, 또는 4.8-6.2, 또는 5.0-6.8, 또는 5.0-6.6 같은, 예를 들어 4.0-6.8, 또는 4.4-6.8, 또는 4.8-6.8, 또는 5.0-6.8 범위인, 최대 6.6, 또는 최대 6.4, 또는 최대 6.2, 또는 최대 6.0과 같은 최대 6.8이거나, 적어도 4.0, 또는 적어도 4.4, 또는 적어도 4.8, 또는 적어도 5.0의 pH를 갖는 용리액으로 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제 42단락 내지 제 44단락 중 어느 한 단락에 있어서, 2가 또는 다가 금속 이온의 수는 6개 분자의 인슐린 펩티드당 4개 이상의 금속 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제 42단락 내지 제 45단락 중 어느 한 단락에 있어서, 2가 또는 다가 금속 이온의 수는 6개 분자의 인슐린 펩티드당 4.5개의 금속 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제 42단락 내지 제 46단락 중 어느 한 단락에 있어서, 2가 또는 다가 금속 이온의 수는 6개 분자의 인슐린 펩티드당 5개 이상의 금속 이온, 6개 분자의 인슐린 펩티드당 5.5개 이상의 금속 이온, 6개 분자의 인슐린 펩티드당 6개 이상의 금속 이온 또는 6개 분자의 인슐린 펩티드당 6.5개 이상의 금속 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제 42단락 내지 제 47단락 중 어느 한 단락에 있어서, 2가 또는 다가 금속 이온의 수는 6개 분자의 인슐린 펩티드당 12개 이하의 금속 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 42단락 내지 제 48단락 중 어느 한 단락에 있어서, 2가 또는 다가 금속 이온의 전하 등가와 인슐린 펩티드의 전하 등가 사이의 비율은 전형적으로 0.3:1 내지 20:1 같은, 예를 들어 0.4:1 내지 15:1, 또는 0.5:1 내지 10:1인, 0.1:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 방법.
50. 제 42단락 내지 제 49단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린-함유 용액의 전도도는 0-50 mS/cm 같은, 예를 들어 0-30 mS/cm인, 0-100 mS/cm 또는 0.05-50 mS/cm 같은, 예를 들어 0.1-30 mS/cm인, 0.01-100 mS/cm의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제 42단락 내지 제 50단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액의 pH는 관심 단백질의 pI보다 최대 1.7 유닛 같은, 예를 들어 최대 1.9 유닛인, 최대 2.1 유닛이 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제 42단락 내지 제 51단락 중 어느 한 단락에 있어서, 프론팅 피크 형태는 인슐린 펩티드의 적어도 90 중량%, 또는 적어도 91 중량%, 또는 적어도 92 중량%, 또는 적어도 93 중량%, 또는 적어도 94 중량%, 또는 적어도 95 중량%, 또는 적어도 96 중량%가 관련된 불순물로부터 분리되도록 제어되는 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제 42단락 내지 제 52단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액 중 2가 또는 다가 금속 이온의 농도는 0.5-100 mM, 또는 1.0-60 mM와 같은 0.1-200 mM의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 42단락 내지 제 53단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액 중 2가 또는 다가 금속 이온의 전하 등가와 관심 단백질의 전하 등가 사이의 비율은 0.3:1 내지 20:1 같은, 예를 들어 0.4:1 내지 15:1, 또는 0.5:1 내지 10:1인, 0.1:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제 42단락 내지 제 54단락 중 어느 한 단락에 있어서, 용리액은 예를 들어 0.1-100 mM 같은, 예를 들어 0.5-75 mM인, 0.01-200 mM의 범위의 Zn2 + 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
56. 제 42단락 내지 제 55단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 아연 이온으로 자가-회합되는 것을 특징으로 하는 방법.
57. 제 42단락 내지 제 56단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 자연 발생 인슐린이거나 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기에 부착된 측쇄 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 부착된 측쇄를 갖는 인슐린 유사체인 인슐린 유도체 및 그 여하의 Zn2 + 착물로부터 선택되고, 측쇄는 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
-W-X-Y-Z
여기서 W는:
* 측쇄에 카르복시산기를 갖는 α-아미노산 잔기(여기서 잔기는 그것의 카르복시산기 중 하나와, B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기와 함께 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 함께 아미드기를 형성한다);
* 아미드 결합을 통해 함께 연결된 2, 3 또는 4개의 α-아미노산 잔기로 구성된 쇄(이 쇄는 - 아미드 결합을 통해 - B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 연결되고, W의 아미노산 잔기는 W가 측쇄에 카르복시산기를 갖는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖도록 중성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 및 측쇄에 카르복시산기를 갖는 아미노산 잔기의 기로부터 선택된다); 또는
* X로부터 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기로 또는 X로부터 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기로의 공유결합이며,
X는:
* -CO-;
* -CH(COOH)CO-;
* -N(CH2COOH)CH2 CO-;
* -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
* -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
* -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
* -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
* -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-; 또는
* -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-이고,
이것은
a) W가 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 쇄일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 W의 아미노기와 아미드 결합을 형성하거나, 또는
b) W가 공유결합일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 B쇄의 N-말단 α-아미노기와 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하며,
Y는:
* -(CH2)m-(여기서 m은 6 내지 32 범위의 정수이다);
* 1, 2 또는 3개의 -CH=CH-기 및 쇄에서 탄소 원자의 총수가 10 내지 32개의 범위로 되기에 충분한 복수의 -CH2-기를 포함하는 2가 탄화수소 쇄; 또는
* 식 -(CH2)vC6H4(CH2)W-의 2가 탄화수소 쇄이며(여기서 v 및 w는 v와 w의 합이 6 내지 30의 범위에 있도록, 정수이거나 또는 그것들 중 하나는 제로이다),
Z는:
* -COOH;
* -CO-Asp;
* -CO-Glu;
* -CO-Gly;
* -CO-Sar;
* -CH(COOH)2;
* -N(CH2COOH)2;
* -SO3H; 또는
* -PO3H이다.
58. 제 42단락 내지 제 57단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린인 것을 특징으로 하는 방법.
59. 제 42단락 내지 제 56단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 하기 식을 갖는 인슐린 유도체 및 그것의 여하의 Zn2 + 착물인 것을 특징으로 하는 방법:
Figure pct00005
여기서 Ins는 모인슐린 부분이고 Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n-X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3-[CH2]n-Q5-[CH2]n-Z는 치환체이고, Ins는 Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 치환체의 Q1 또는 Q2의 CO기 사이의 아미드 결합을 통해 치환체에 부착되고;
각 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
Q1은:
* 측쇄에서 카르복시산을 갖는 아미노산 또는 비하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 아미노산 아미드(여기서 아미드의 잔기는 그것의 카르복시산기와, Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기와 함께 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 함께 아미드기를 형성한다), 또는
* 아미드 결합을 통해 함께 연결된 상기 명시된 2, 3 또는 4개의 α-아미노산 아미드 또는 아미노산 잔기로 구성된 쇄(여기서 이 쇄는 - 아미드 결합을 통해 - Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 연결된다), 또는
* 결합이고;
Q2는:
* -COCH(CONH2)-
* -COCH2N(CH2CONH2)-
* -COCH2N(CH2CONH2)COCH2N(CH2CONH2)
* -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
* -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
* -COCH2N(CH2CH2CONH2)-
* -COCH2CH2N(CH2CONH2)-
* -COCH2OCH2CONH-
* -CO((CR5R6)1-6-NH-CO)1-4-;
* -CO((CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-(여기서 R5는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3 또는 -CONH2일 수 있고, R6는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3일 수 있다); 또는
* 결합이고,
다만,
* Q1 또는 Q2 중 적어도 하나는 결합이 아니고,
* n이 0 또는 1이고, X1이 결합이고 Q3가 (CH2CH2O)2-, (CH2CH2O)3- 또는 (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)-일 때 Q2는 -CO-(CH2)2-CO-NH-가 아니고,
* Q1 또는 Q2의 아민이 치환체의 나머지와 결합을 형성하면, 아민은 카르보닐기를 통해 치환체의 나머지와 연결되어야 하며;
Q3, Q4, 및 Q5는 서로 독립적으로
* -(CH2)m-(여기서 m은 6 내지 32 범위의 정수이다);
* 1, 2 또는 3개의 -CH=CH-기 및 쇄에서 탄소 원자의 총수가 4 내지 32의 범위로 되기에 충분한 복수의 -CH2-기를 포함하는 2가 탄화수소 쇄;
* -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)-;
* -(CO-(CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-(여기서 R5는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3 또는 -CONH2일 수 있고, R6는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3일 수 있다);
* -CO-(CH2)0-3-Ar-(CH2)0-3-(여기서 Ar은 아릴렌 또는 헤테로아릴렌일 수 있는데, 이것은 -CH3, -(CH)1-6-CH3, -CONR1R2 또는 -SO2NR1R2로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, R1 및 R2는 서로 독립적으로 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다);
* (CH2CH2O)y-; (CH2CH2CH2O)y-; (CH2CH2CH2CH2O)y-; (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y- 또는 (CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-; (CH2OCH2)y-(여기서 y는 1-20이다);
* 아릴렌 또는 헤테로아릴렌(이것은 -CH3, -(CH)1-6-CH3, -CONR1R2 또는 -SO2NR1R2로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, 여기서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다);
* 하기 식의 쇄:
-(CH2)s-Y1-(Ar)v1-Y2-(CH2)w-Y3-(Ar)v2-Y4-(CH2)t-Y5-(Ar)v3-Y6-(CH2)z-(여기서 Ar은 상기와 같이 정의되고, Y1-Y6는 서로 독립적으로 O, S, S=O, SO2 또는 결합일 수 있고; s, w, t 및 z는 s, w, t 및 z의 합이 4 내지 30의 범위에 있도록 서로 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고, v1, v2, 및 v3는 Y1-Y6가 서로 연결되지 않고 구조 -O-(CH2)1-O-가 일어나지 않는다는 조건하에서 서로 독립적으로 0 또는 1일 수 있다); 또는
* 결합이고;
다만 Q3-Q5 중 적어도 하나는 결합이 아니며;
X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로
* O;
* -C=O;
* 결합;
* NCOR1(여기서 R1은 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다); 또는
*
Figure pct00006
(여기서 R은 수소, C1 -3-알킬, C2 -3-알케닐 또는 C2 -3-알키닐일 수 있다)이고;
다만,
* X1, X2 및 X3는 Z에 결합할 수 없고
* X1, X2 및 X3가 O이면, X1, X2 및 X3는 Q3, Q4, 및 Q5의 O에 직접 결합하지 않으며;
그리고
Z는: -COOH; -CO-Asp; -CO-Glu; -CO-Gly; -CO-Sar; -CH(COOH)2; -N(CH2COOH)2; -SO3H; -OSO3H; -OPO3H2; -PO3H2; -테트라졸-5-일 또는 -O-W1이다(여기서 W1은 아릴렌 또는 헤테로아릴렌인데, 이것은 테트라조-5-릴, -COOH, -SO3H, -(CH2)1-6-SO3H, -(CH2)1-6-O-PO3H2, -CONR3R4 또는 -SO2NR3R4로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, R3 및 R4는 Z가 -O-W1이면 Q1은 반드시 존재해야 한다는 조건하에 서로 독립적으로 H, -(CH2)1-6-SO3H, 또는 -(CH2)1-6-O-PO3H2일 수 있다).
60. 제 42단락 내지 제 56단락 및 제 59단락 중 어느 한 단락에 있어서, 인슐린 펩티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-테트라데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-트리데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-β-알라닐 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-γ-L-아스파르틸아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-ε-아미노헥사노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-펜타데카노일-δ-아미노펜타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-10-(4-카르복시페녹시)-데카노일-γ-L-글루타밀아미드 desB30 사람 인슐린,
NεB29-4-[11-(4-카르복시페닐)운데카노일아미노] 부티릴 desB30 사람 인슐린,
NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-카르복시헵타노일아미노)프로폭시]부톡시}프로필카르바모일)-프로피오닐-γ-글루타밀아미드) desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-트리데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-운데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-ω-카르복시-테트라데카노일-γ-아미노-부타노일 desB30 사람 인슐린,
NεB29-{4-[10-(4-카르복시-페녹시)-데카노일아미노]-부티릴} desB30 인슐린,
NεB29-{4-[(14-카르복시-테트라데카노일아미노)-메틸]-벤조일} desB30 인슐린,
NεB29-[16-(4-카르복시-페녹시)-헥사데카노일] desB30 인슐린,
NεB29-{4-[(15-카르복시펜타데카노일아미노)벤조일]-desB30 사람 인슐린, 및
NεB29-{4-[(15-카르복시-펜타데카노일아미노)-메틸]-벤조일}-desB30 인슐린.
61. 상기 단락 중 어느 한 단락의 공정 또는 방법에 의해 제조된 정제된 인슐린 펩티드.
실시예 1
치수 d = 1 cm 및 L = 25 cm를 갖는 컬럼에 GE Healthcare로부터의 Source 30Q를 채운다.
전도도 <3 mS/cm를 갖는 pH=7.5의 30% EtOH 중 12 g/L 인슐린 펩티드(LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γGlu) des(B30) 사람 인슐린)(pI = 4.7)를 함유하는 단백질-함유 용액을 컬럼에 8, 10, 및 12 g/LCV의 로드로 적용한다. 단백질-함유 용액은 6개의 인슐린 분자당 2개의 아연 원자의 양의 Zn-이온을 함유한다.
0 mM 및 300 mM NH4Ac(아세트산암모늄)를 함유하는, pH = 6.4, 6.8 및 7.2의 42.5% 에탄올 및 20 mM 트리에탄올아민을 함유하는 2개의 완충액을 용리를 위해 사용한다. 단백질-함유 용액의 적용 후, 0 mM NH4Ac를 함유하는 1 컬럼 부피의 용매를 사용하여 컬럼을 세척하고 이후에 15 컬럼 부피 이상의 30 mM 내지 180 mM NH4Ac의 염 구배를 사용하여 단백질을 용리한다(도 1 참고). 모든 실험에 대한 수율은 90% 이상이었다.
결과를 도 1-3에 나타내고 하기에 더 설명한다.
도 1: pH 6.4에서 주요 피크 전에 불순물 용리는 (V-VReg
Figure pct00007
-80 ㎖에서) 낮은 및 높은 로드(8 및 12 g/L) 둘 다에서 주요 피크로부터 분명히 분리된다. 약 -70 및 -60 ㎖부터 0 ㎖에 수집된 풀 부피는 작고 풀에서의 생성물 농도는 높다.
도 2: pH 6.8에서 주요 피크 전에 불순물 용리는 (V-VReg
Figure pct00008
-80 ㎖에서) 10 g/L의 로드에서 주요 피크로부터 분리된다. 약 -80부터 수집된 풀 부피는 더 크고 생성물 농도는 pH 6.4에서보다 작다.
도 3: pH 7.2에서 주요 피크 전에 불순물 용리는 (V-VReg
Figure pct00009
-85 ㎖에서) 8 g/L의 로드에서 용리되지만, pH 6.4에서 낮은 로드에서 나타낸 베이스라인 분리는 없다. 로드가 12g/L로 증가될 때 불순물은 생성물로부터 더이상 분리되지 않지만 생성물이 (V-VReg
Figure pct00010
-120 ㎖에서) 변위된다. 풀 부피는 크고 이와 같이 농도는 더 낮은 pH-값에서 보여지는 것보다 낮다.
실시예 2
샘플이 각각의 분획에서 Zn2 +의 함량을 분석하도록 취해지는 실험을 행하였다(도 4 참고). 이들 샘플은 Zn이 함께 용리되고 있다는 것을 나타낸다.
샘플 수집된 분획 중 Zn의 함량
Zn2 +[mg/L]
1. 관련된 불순물 전에 수집된 분획(분획 번호. 12-23) 0.2
2. 주요 피크 전에 관련된 불순물 용리에서 수집된 분획
(분획 번호. 45-47)		 1.2
3. 풀 6
4. 풀 후에 수집된 분획(분획 번호. 1-4) 0.54
상기 표에서 분획들의 번호는 도 4에 나타낸 분획들에 해당한다.
Zn2 +는 생성물과 함께 용리되고 있다는 것을 분명히 나타낸다.
Zn2 +가 용리액이 아닌 공급물에 존재한 크로마토그래피 가동으로부터 취해진 샘플(샘플 1-4)은 Zn2 +가 생성물을 함유하는 풀에서 훨씬 더 높은 농도로 존재하고, 인슐린 유사체의 농도는 풀 둘레에서 취한 샘플과 비교해 가장 높다는 것을 나타낸다. 이것은 인슐린과 Zn2 + 사이의 강한 상호작용/협동성을 나타낸다.
도 4의 크로마토그램을 전통적인 Langmurian 크로마토그램과 비교하면 크로마토그램의 뒷부분이 오목하게 아래로 항한 반면, 전통적인 Langmurian 크로마토그램은 오목하게 위로 향하는 것이 나타난다. 이것은 이들 pH-값에서 또한 피크 형태가 Zn2 +에 의해 영향을 받는다는 것을 표시한다.
인력 및 척력의 균형을 잡고 이로써 더 높은 농도에 선형인 등온선을 만들도록 용리액 중 pH 조정과 조합하는, 단백질-함유 용액에서 2가 또는 다가 금속 이온의 존재는 작은 풀 부피 및 높은 풀 농도를 가져온다.
협동성은 주요 피크가 프론팅하고 주요 피크 전에 불순물 용리에서 벗어나는 크로마토그램에서 보여질 수 있다.
이동상 즉 단백질-함유 용액에서 Zn2 +의 존재에 의해 낮은 pH에서 프론팅 피크 프로파일(도 1의 두꺼운 점선 곡선, pH=6.4)에 대한, 설정된 pH 값에서 어느 정도 테일링의 정상적인 Langmurian 프로파일(도 2의 얇은 실선 곡선, pH=6.8)의 거동과 유사한, 높은 pH에서 테일링 피크로부터의 인슐린 피크 프로파일(도 3의 얇은 점선 곡선, pH=7.2)의 변화(도 1-3). 높은 및 낮은 pH 실험은 곡선 아래 영역으로부터 관찰될 수 있는 높은 및 낮은 로드에서 수행된 반면, pH=6.8에서의 실험은 다른 실험들의 로드 사이의 로드에서 가동되었다. 모든 실험은 발견을 확인하도록 반복되었고 모든 크로마토그램은 그것들을 비교하기 쉽게 하기 위해 풀 수집의 단부에 정렬된다. 제거된 중요한 불순물은 주요 피크 전에 용리되고 있고 예를 들어 pH=6.8에서 이것은 -90 ㎖ 둘레에서 용리되고 있다. 이 pH에서 그리고 높은 pH에서 피크는 분명히 테일링(가파른 프론팅 및 평평한 테일링)한다는 것이 나타난다. 높은 pH에서 생성물과 불순물 사이의 분리는 매우 약하게 나타나며, 특히 높은 로드에서, 어떤 분명한 피크도 주요 피크 전에 용리되지 않는다. 낮은 pH에서 피크는 프론팅(평평한 프론팅 및 가파른 테일링)하고, 베이스라인 분리가 불순물과 생성물 피크 사이에 나타난다. 이 프론팅은 이 경우에 복수의 이점을 가진다: (a) 생성물 피크가 불순물에서 벗어나고 있고; (b) 풀 농도가 더 높은데, 이것은 더 높은 UV-신호로부터 보여질 수 있고; (c) 컬럼상에서 로드를 증가하는 것은 불순물을 제거하면서 가능하다.
실시예 3
SEC 방법에 의한 인슐린의 자가-회합의 분석:
인슐린 펩티드의 자가-회합하는 능력은 SEC 방법에 의해 분석될 수 있다. Superose 6 PC 컬럼(0.32*30 cm) 상에서 등장성 10 mM tris-완충 식염수를 사용하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 분석은 선택적으로 37℃에서 pH 7.3에서 2 mM 페놀을 첨가하였고, 주입 부피 20 ㎕, 흐름 0.05 ㎖/분 그리고 가동 시간 130분이었다. 제 1기준은 블루 덱스트란(≫ 5 MDa, KAV 0.0), 티로글로불린(669 kDa, KAV 0.28), 페리틴(440 kDa, KAV 0.39), 오브알부민(44.5 kDa, KAV 0.56), 리보핵산분해효소(13.7 kDa, KAV 0.69)이고 제 2기준은 알부민(66 kDa, KAV 0.53), Co(III)인슐린-육합체(35 kDa, KAV 0.61), 및 단량체 인슐린 X2(6 kDa, KAV 0.73)이었다. 블루 덱스트란의 체류 시간은 17.9분(t0)이고 컬럼 없이(td)는 0.74분이고, 알부민(HSA)의 체류 시간은 약 34.1분이었다.
KAV=(t-t0)/(V/f+td-t0)
t: 체류 시간(분)
t0: 블루 덱스트란의 체류 시간(제한 제외)
td: 컬럼 없이 블루 덱스트란의 체류 시간(보이드 부피)
Vt: 총 컬럼 부피(㎖)
f: 흐름(㎖/분)
데이터 형식:
KAV 피크1 x.xx
영역 피크1(%) xxx
KAV 피크2 x.xx
영역 피크2(%) xxx
KAV 영역 피크1은 알부민보다 큰 자가 회합에 해당하는 KAV <0.46에 대한 총 영역의 비교 영역 %로서 KAV=0부터 KAV=0.46(32분)으로 측정된다. KAV 피크1을 위해 약 0.56(알부민 크기) 통합 절단은 알부민 크기와 인슐린 육합체 크기 사이이다.
실시예 4
인슐린 수용체 결합의 분석
사람 인슐린 수용체에 대한 인슐린 펩티드의 친화성을 SPA 어세이(Scintillation Proximity Assay) 마이크로티터플레이트 항체 포획 어세이에 의해 측정하였다. SPA-PVT 항체-결합 비드, 항-마우스 시약(Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017)을 25 ㎖의 결합 완충액(100 mM HEPES pH 7.8; 100 mM 염화나트륨, 10 mM MgSO4, 0.025% Tween-20)과 혼합하였다. 단일 Packard Optiplate(Packard No. 6005190)를 위한 시약 혼합은 2.4 ㎕의 1:5000 희석된 정제된 재조합 사람 인슐린 수용체 엑손 11, 시약 혼합의 100 ㎕당 5000 cpm에 해당하는 A14 Tyr[125I]-사람 인슐린의 상당한 원액, 12 ㎕의 1:1000 희석된 F12 항체, 3 ㎖의 SPA-비드 및 결합 완충액으로 구성된 총 12 ㎖이다. 그 다음 총 100 ㎕를 첨가하고 희석 시리즈를 적당한 샘플로부터 만들었다. 그 다음 희석 시리즈에 100 ㎕의 시약 혼합을 첨가하고 샘플을 부드럽게 진탕하면서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 상을 원심분리에 의해 1분 동안 분리하고 플레이트를 Topcounter로 계수하였다. 결합 데이터를 GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego, CA)에서 비선형 회귀 알고리즘을 사용하여 맞추었다.

Claims (15)

  1. 단백질-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정으로서, 상기 용액은 인슐린 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 2가 또는 다가 금속 이온을 포함하고, 상기 인슐린 펩티드는 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능하며, 상기 공정은:
    a. 단백질-함유 용액을 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
    b. 최대 8.5의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 인슐린 펩티드의 적어도 75 중량%에 해당하는 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 단백질-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정.
  2. 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정으로서, 상기 용액은 아연 및 2가 아연 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 인슐린 펩티드를 포함하며, 상기 공정은:
    a. 인슐린-함유 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 관심 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
    b. 최대 6.8의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 관심 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 관심 인슐린 펩티드의 적어도 90 중량%에 해당하는 관심 인슐린 펩티드의 풀을 수집하는 단계를 포함하는, 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 크로마토그래피 공정.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 2가 금속 이온은 Zn2 +이고 용액 중 아연 이온의 농도는 0.1-100 mM 같은, 예를 들어 0.5-75 mM인, 0.01-200 mM의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 공정.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 아연 이온과 인슐린 펩티드의 전하 등가 사이의 비율은 전형적으로, 0.3:1 내지 20:1 같은, 예를 들어 0.4:1 내지 15:1, 또는 0.5:1 내지 10:1인, 0.1:1 내지 50:1인 것을 특징으로 하는 공정.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 용리액의 pH는 4.0-6.6, 또는 4.0-6.4, 또는 4.0-6.2, 또는 4.0-6.0, 또는 4.4-6.8, 또는 4.4-6.6, 또는 4.4-6.4, 또는 4.8-6.8, 또는 4.8-6.6, 또는 4.8-6.2, 또는 5.0-6.8, 또는 5.0-6.6 같은, 예를 들어 4.0-6.8, 또는 4.4-6.8, 또는 4.8-6.8, 또는 5.0-6.8의 범위인, 최대 6.6, 또는 최대 6.4, 또는 최대 6.2, 또는 최대 6.0과 같은 최대 6.8이거나, 적어도 4.0, 또는 적어도 4.4, 또는 적어도 4.8, 또는 적어도 5.0인 것을 특징으로 하는 공정.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 수집된 인슐린 펩티드의 풀은 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 인슐린 펩티드의 적어도 91 중량%, 또는 적어도 92 중량%, 또는 적어도 93 중량%, 또는 적어도 94 중량%, 또는 적어도 95 중량%, 또는 적어도 96 중량%인 것을 특징으로 하는 공정.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 펩티드는 자연 발생 인슐린이거나 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기에 부착된 측쇄 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 부착된 측쇄를 갖는 인슐린 유사체인 인슐린 유도체 및 그 여하의 Zn2 + 착물로부터 선택되고, 측쇄는 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 공정:
    -W-X-Y-Z
    여기서 W는:
    * 측쇄에 카르복시산기를 갖는 α-아미노산 잔기(여기서 잔기는 그것의 카르복시산기 중 하나와, B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기와 함께 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 함께 아미드기를 형성한다);
    * 아미드 결합을 통해 함께 연결된 2, 3 또는 4개의 α-아미노산 잔기로 구성된 쇄(이 쇄는 - 아미드 결합을 통해 - B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 연결되고, W의 아미노산 잔기는 W가 측쇄에 카르복시산기를 갖는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖도록 중성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 및 측쇄에 카르복시산기를 갖는 아미노산 잔기의 기로부터 선택된다); 또는
    * X로부터 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기로 또는 X로부터 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기로의 공유결합이며,
    X는:
    * -CO-;
    * -CH(COOH)CO-;
    * -N(CH2COOH)CH2 CO-;
    * -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
    * -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
    * -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
    * -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
    * -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-; 또는
    * -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-이고,
    이것은
    a) W가 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 쇄일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 W의 아미노기와 아미드 결합을 형성하거나, 또는
    b) W가 공유결합일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 B쇄의 N-말단 α-아미노기와 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하며,
    Y는:
    * -(CH2)m-(여기서 m은 6 내지 32 범위의 정수이다);
    * 1, 2 또는 3개의 -CH=CH-기 및 쇄에서 탄소 원자의 총수가 10 내지 32개의 범위로 되기에 충분한 복수의 -CH2-기를 포함하는 2가 탄화수소 쇄; 또는
    * 식 -(CH2)vC6H4(CH2)W-의 2가 탄화수소 쇄이며(여기서 v 및 w는 v와 w의 합이 6 내지 30의 범위에 있도록, 정수이거나 또는 그것들 중 하나는 제로이다),
    Z는:
    * -COOH;
    * -CO-Asp;
    * -CO-Glu;
    * -CO-Gly;
    * -CO-Sar;
    * -CH(COOH)2;
    * -N(CH2COOH)2;
    * -SO3H; 또는
    * -PO3H이다.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 펩티드는 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린인 것을 특징으로 하는 공정.
  9. 인슐린-함유 용액의 단백질 성분을 분리하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따르는 크로마토그래피 공정으로서, 상기 용액은 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린 및 2가 아연 이온을 포함하고, 상기 공정은:
    a. 인슐린-함유 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 고체상 재료의 컬럼에 적용하고, 여기서 관심 인슐린 펩티드의 로딩은 컬럼 부피의 리터당 적어도 6.0 g(g/LCV)인 단계; 및
    b. 6.4 내지 6.8의 pH를 갖는 용리액에 의해 상기 고체상 재료로부터 관심 인슐린 펩티드를 용리하고; 단계 (a)에서 컬럼에 적용된 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린의 적어도 90 중량%에 해당하는 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린의 풀을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 공정.
  10. 제 1항, 제 2항 및 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 단계는 단계 (a) 후에 그리고 용리 단계 (b) 전에 에탄올 및 트리에탄올아민을 포함하는 세척 완충액을 사용하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 공정.
  11. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 펩티드는 하기 식을 갖는 인슐린 유도체 및 그것의 여하의 Zn2 + 착물인 것을 특징으로 하는 공정:
    Figure pct00011

    여기서 Ins는 모인슐린 부분이고 Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n-X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3-[CH2]n-Q5-[CH2]n-Z는 치환체이고, Ins는 Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 치환체의 Q1 또는 Q2의 CO기 사이의 아미드 결합을 통해 치환체에 부착되고;
    각 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
    Q1은:
    * 측쇄에 카르복시산을 갖는 아미노산 또는 비하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 아미노산 아미드(여기서 아미드의 잔기는 그것의 카르복시산기와, Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기와 함께 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 함께 아미드기를 형성한다), 또는
    * 아미드 결합을 통해 함께 연결된 상기 명시된 2, 3 또는 4개의 α-아미노산 아미드 또는 아미노산 잔기로 구성된 쇄(여기서 이 쇄는 - 아미드 결합을 통해 - Ins의 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 Ins의 A 또는 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 연결된다), 또는
    * 결합이고;
    Q2는:
    * -COCH(CONH2)-
    * -COCH2N(CH2CONH2)-
    * -COCH2N(CH2CONH2)COCH2N(CH2CONH2)
    * -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
    * -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
    * -COCH2N(CH2CH2CONH2)-
    * -COCH2CH2N(CH2CONH2)-
    * -COCH2OCH2CONH-
    * -CO((CR5R6)1-6-NH-CO)1-4-;
    * -CO((CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-(여기서 R5는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3 또는 -CONH2일 수 있고, R6는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3일 수 있다); 또는
    * 결합이고,
    다만,
    * Q1 또는 Q2 중 적어도 하나는 결합이 아니고,
    * n이 0 또는 1이고, X1이 결합이고 Q3가 (CH2CH2O)2-, (CH2CH2O)3- 또는 (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)-일 때 Q2는 -CO-(CH2)2-CO-NH-가 아니고,
    * Q1 또는 Q2의 아민이 치환체의 나머지와 결합을 형성하면, 아민은 카르보닐기를 통해 치환체의 나머지와 연결되어야 하며,
    Q3, Q4, 및 Q5는 서로 독립적으로
    * -(CH2)m-(여기서 m은 6 내지 32 범위의 정수이다);
    * 1, 2 또는 3개의 -CH=CH-기 및 쇄에서 탄소 원자의 총수가 4 내지 32의 범위로 되기에 충분한 복수의 -CH2-기를 포함하는 2가 탄화수소 쇄;
    * -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)-;
    * -(CO-(CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-(여기서 R5는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3 또는 -CONH2일 수 있고, R6는 독립적으로 H, -CH3,-(CH2)1-6CH3일 수 있다);
    * -CO-(CH2)0-3-Ar-(CH2)0-3-(여기서 Ar은 아릴렌 또는 헤테로아릴렌일 수 있는데, 이것은 -CH3, -(CH)1-6-CH3, -CONR1R2 또는 -SO2NR1R2로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, R1 및 R2는 서로 독립적으로 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다);
    * (CH2CH2O)y-; (CH2CH2CH2O)y-; (CH2CH2CH2CH2O)y-; (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y- 또는 (CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-; (CH2OCH2)y-(여기서 y는 1-20이다);
    * 아릴렌 또는 헤테로아릴렌(이것은 -CH3, -(CH)1-6-CH3, -CONR1R2 또는 -SO2NR1R2로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, 여기서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다);
    * 하기 식의 쇄:
    -(CH2)s-Y1-(Ar)v1-Y2-(CH2)w-Y3-(Ar)v2-Y4-(CH2)t-Y5-(Ar)v3-Y6-(CH2)z-(여기서 Ar은 상기와 같이 정의되고, Y1-Y6는 서로 독립적으로 O, S, S=O, SO2 또는 결합일 수 있고; s, w, t 및 z는 s, w, t 및 z의 합이 4 내지 30의 범위에 있도록 서로 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고, v1, v2, 및 v3는 Y1-Y6가 서로 연결되지 않고 구조 -O-(CH2)1-O-가 일어나지 않는다는 조건하에서 서로 독립적으로 0 또는 1일 수 있다); 또는
    * 결합이고;
    다만 Q3-Q5 중 적어도 하나는 결합이 아니며;
    X1, X2 및 X3는 서로 독립적으로
    * O;
    * -C=O;
    * 결합;
    * NCOR1(여기서 R1은 H, -CH3 또는 -(CH)1-6-CH3일 수 있다); 또는
    *
    Figure pct00012

    (여기서 R은 수소, C1 -3-알킬, C2 -3-알케닐 또는 C2 -3-알키닐일 수 있다)이고;
    다만,
    * X1, X2 및 X3는 Z에 결합할 수 없고
    * X1, X2 및 X3가 O이면, X1, X2 및 X3는 Q3, Q4, 및 Q5의 O에 직접 결합하지 않으며;
    그리고
    Z는: -COOH; -CO-Asp; -CO-Glu; -CO-Gly; -CO-Sar; -CH(COOH)2; -N(CH2COOH)2; -SO3H; -OSO3H; -OPO3H2; -PO3H2; -테트라졸-5-일 또는 -O-W1이다(여기서 W1은 아릴렌 또는 헤테로아릴렌인데, 이것은 테트라조-5-릴, -COOH, -SO3H, -(CH2)1-6-SO3H, -(CH2)1-6-O-PO3H2, -CONR3R4 또는 -SO2NR3R4로 구성된 기로부터 선택된 1개 또는 2개의 기로 치환될 수 있고, R3 및 R4는 Z가 -O-W1이면 Q1은 반드시 존재해야 한다는 조건하에 서로 독립적으로 H, -(CH2)1-6-SO3H, 또는 -(CH2)1-6-O-PO3H2일 수 있다).
  12. 2가 또는 다가 금속 이온의 존재하에서 자가-회합 및/또는 구조 변화가 가능한 인슐린 펩티드의 이온-교환 크로마토그래피에서 피크 형태를 제어하는 방법으로서,
    a. 인슐린 펩티드 및 관련된 불순물의 최적의 분리를 얻도록 2가 또는 다가 금속 이온을 사용하며, 여기서 2가 금속 이온은 인슐린 펩티드의 프론팅 피크 형태를 고정하기 위해 첨가된 것이고, 관련된 불순물은 인슐린 펩티드 전에 용리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 인슐린 펩티드는 자연 발생 인슐린이거나 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기에 부착된 측쇄 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 부착된 측쇄를 갖는 인슐린 유사체인 인슐린 유도체 및 그 여하의 Zn2 + 착물로부터 선택되고, 측쇄는 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    -W-X-Y-Z
    여기서 W는:
    * 측쇄에 카르복시산기를 갖는 α-아미노산 잔기(여기서 잔기는 그것의 카르복시산기 중 하나와, B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기와 함께 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 함께 아미드기를 형성한다);
    * 아미드 결합을 통해 함께 연결된 2, 3 또는 4개의 α-아미노산 잔기로 구성된 쇄(이 쇄는 - 아미드 결합을 통해 - B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기에 연결되고, W의 아미노산 잔기는 W가 측쇄에 카르복시산기를 갖는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖도록 중성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 및 측쇄에 카르복시산기를 갖는 아미노산 잔기의 기로부터 선택된다); 또는
    * X로부터 B쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-아미노기로 또는 X로부터 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기로의 공유결합이며,
    X는:
    * -CO-;
    * -CH(COOH)CO-;
    * -N(CH2COOH)CH2 CO-;
    * -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
    * -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
    * -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
    * -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
    * -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-; 또는
    * -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-이고,
    이것은
    a) W가 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 쇄일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 W의 아미노기와 아미드 결합을 형성하거나, 또는
    b) W가 공유결합일 때, 밑줄친 카르보닐 탄소로부터의 결합을 통해 B쇄의 N-말단 α-아미노기와 또는 모인슐린의 B쇄에 존재하는 Lys 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하며,
    Y는:
    * -(CH2)m-(여기서 m은 6 내지 32 범위의 정수이다);
    * 1, 2 또는 3개의 -CH=CH-기 및 쇄에서 탄소 원자의 총수가 10 내지 32개의 범위로 되기에 충분한 복수의 -CH2-기를 포함하는 2가 탄화수소 쇄; 또는
    * 식 -(CH2)vC6H4(CH2)W-의 2가 탄화수소 쇄이며(여기서 v 및 w는 v와 w의 합이 6 내지 30의 범위에 있도록, 정수이거나 또는 그것들 중 하나는 제로이다),
    Z는:
    * -COOH;
    * -CO-Asp;
    * -CO-Glu;
    * -CO-Gly;
    * -CO-Sar;
    * -CH(COOH)2;
    * -N(CH2COOH)2;
    * -SO3H; 또는
    * -PO3H이다.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 인슐린 펩티드는 LysB29(Nε-헥사데칸디오일-γ-Glu) des(B30) 사람 인슐린인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 공정 또는 방법에 의해 생산되는 정제된 인슐린 펩티드.
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