MXPA06001814A - Separacion de polipeptidos que comprenden un aminoacido racemizado. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para purificar un polipeptido racemizado por cromatografia de intercambio ionico.

Description

SEPARACION DE PQLIPEPTIDOS QUE COMPRENDEN UN AMINOACIDO RACEMIZADO Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de la purificación de proteínas. En particular, la invención se refiere a un método para la separación de polipéptidos en donde un polipéptido es racemizado. Antecedentes de la invención Los polipéptidos están siendo utilizados crecientemente como medicamentos para el tratamiento de enfermedades dentro de todas las áreas principales de terapia. El tratamiento de la diabetes . por la administración crónica de insulina ha sido practicado durante más de 80 años, y las aplicaciones terapéuticas de los polipéptidos dentro de los trastornos de crecimiento del cáncer también han sido practicadas durante muchos años. Los procesos económicos para una producción a gran escala de polipéptidos con una pureza suficientemente elevada para aplicaciones terapéuticas son cruciales para las terapias a base de polipéptidos, adicionales, para alcanzar el mercado en masa y para que las terapias existentes lleguen a ser utilizadas más am liamente . Los polipéptidos para aplicaciones terapéuticas van a ser altamente purificados para que sean eficaces y para proporcionar certeza de no provocar eventos adversos durante Ref .169438 la administración a los pacientes. Un número de etapas de procesamiento utilizadas en la síntesis y purificación de polipéptidos ya se sabe que provocan la racemización de uno o mas residuos de aminoácidos en el polipéptido objetivó. Típicamente, estas ' condiciones son pHs extremos y temperaturas elevadas, por ejemplo, valores de pH arriba de 12 (Senderoff et al J. Pharm. Sci. 87, 183-189 (1998)). Las variantes de polipéptidos que tienen un residuo de aminoácido racemizado son capaces de separación e identificación por las técnicas analíticas del estado del arte. Estas variantes son indeseables en polipéptidos para uso terapéutico debido a asuntos relacionados con la toxicidad y a causa de que los mismos pueden tener una actividad diferente que el polipéptido deseado. Sin embargo, es un desafío serio separar estos polipéptidos relacionados estrechamente a escala preparativa, es decir, durante la manufactura industrial. La purificación de un polipéptido a partir de una mezcla es una etapa que normalmente es utilizada varias veces durante el proceso de fabricación total para un polipéptido terapéutico. La cromatografía de intercambio iónico es aplicada frecuentemente en las etapas de separación inicial y en crudo, mientras que la cromatografía líquida de alta resolución, de fase inversa (RP-HPLC) (por sus siglas en inglés) es el método preferido para la separación de alta resolución, industrial, de los polipéptidos relacionados en las etapas de purificación final . La RP-HPLC ha probado que es versátil para la purificación a gran escala de muchos polipéptidos pero el proceso es relativamente costoso y tiene una capacidad limitada. Se ha encontrado sorprendentemente que un proceso de intercambio iónico que puede separar las dos variantes del polipéptido como resultado cuando la racemización de un residuo de aminoácido se ha llevado a cabo. El método es capaz de operación a gran escala y proporciona una etapa de purificación económica con capacidad elevada. Breve descripción de las figuras La figura 1 es un cromatograma de AU2eo contra el tiempo (min) desde una separación. EL pico número 1 es la variante D-his, D-His7Arg34Lys26NE (?-Glu (IST-hexadecanoil) ) GLP-1(7-37), el pico número 2 es Arg34Lys2¾P (?-Glu (?s-hexadecanoil) )GLP-l(7-37) . La figura 2 es un cromatograma de AU2so contra el tiempo (min) desde una separación. Tanto la D-His7Arg34Lys26Ne(T-Glu(N°-hexadecanoil) ) GLP-l(7-37) , como la Arg34Lys2SNe (?-Glu (Na-hexadecanoil) ) GLP-l{7-37) eluyen en el pico principal . La variante de D-His está altamente concentrada en el borde delantero en el pico principal y puede ser separada con pérdida baja del rendimiento por fraccionamiento o corte del pico. La figura 3 es un cromatograma de AU2i5 contra el volumen (mi) desde una separación. El pico No. 1 contiene la variante L-His de Exendina-4, el pico número 2 contiene la variante D-His de Exendina-4. Breve Descripción de la Invención Definiciones La siguiente es una definición detallada de los términos utilizados en la especificación. El término "amortiguador" cuando se utiliza aquí, se refiere a un compuesto químico que reduce la tendencia del pH de una solución tal como las soluciones cromatográficas para cambiar durante el transcurso de tiempo como podría ocurrir de otra manera. ¦ Los amortiguadores incluyen los siguientes ejemplos no limitativos: acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato de sodio, glicilglicina, glicina, histidina, lisina, fosfato de sodio, borato, Tris-hidroximetil-aminometano, etanolamina y mezclas de los mismos . El término "modificador orgánico" como se utiliza aquí se refiere a un compuesto orgánico que es agregado a las soluciones cromatográficas . Los modificadores orgánicos pueden ser alcoholes monohídricos , alcoholes polihídricos asi como nitrilos y cetonas. Los ejemplos no limitativos de los modificadores orgánicos son metano, etanol, 1-propanol, 2-propanol, t-butanol, hexilenglicol (4-metil-2,4-pentandiol) , alcohol neopentílico (2,2-dimetil-l,3-propandiol) , acetonitrilo, acetona y urea.

El término "polipéptido" como se utiliza aquí, significa un compuesto comprendido de al menos cinco aminoácidos constituyentes conectados por enlaces de péptidos . Los aminoácidos constituyentes pueden ser del grupo de aminoácidos codificados por el código genético y los mismos pueden ser aminoácidos naturales que no son codificados por el código genético, asi como aminoácidos sintéticos . Los aminoácidos naturales que no son codificados por el código genético son por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alanina y D-glutamina. Los aminoácidos sintéticos comprenden aminoácidos fabricados por síntesis química, es decir D-isómeros de los aminoácidos codificados por el código genético tales como D-alanina, y D-leucina, Aib (ácido s-aminoisobutírico) , Abu (ácido s-aminobutírico) , Tle (terc-butilglicina) , y ß-alanina. Un polipéptido puede comprender una cadena de un solo péptido o puede comprender una cadena de más de un péptido, tal como por ejemplo la insulina humana en donde dos cadenas están conectadas por enlaces de disulfuro. El término "péptido semejante al glucagon" como se utiliza aquí, se refiere a las exendinas y los péptidos homólogos además del glucagon, los cuales son derivados del gen de preproglucagon, es decir el péptido 1 semejante al glucagon (GLP-1) , el péptido 2 semejante al glucagon (GLP-2) , y la oxintomodulina (OXM) así como los análogos y derivados de los mismos . Los péptidos derivados del gen de preproglucagon son el glucagon, el peptido 1 semejante al glucagon (GLP-1) , el péptido 2 semejante al glucagon (GLP-2) , y la oxintomodulina (OXM) . Las exendinas que son encontradas en el monstruo de Gila son homologas a GLP-1 y también ejercen un efecto insulinotrópico . Los ejemplos de exendinas son exendina-4 y exendina-3. Los péptidos semejantes al glucagon tienen las siguientes secuencias (SEC ID Nos. 1-6) : 1 5 10 15 20 25 30 35 Glucagon HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMNT GLP-1 HAEGT FTSDV SSYLE GQAA EFIAW LV GR G GLP-2 HADGS FSDEM NTILD NLAAR DFINW LIQTK ITD Exendina-4 HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEM LKNGG PSSGA PPPS-NH2 Exendina-3 HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2 OXM HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMDTK RNKNN IA El término "análogo" como se utiliza aquí, que se refiere a un péptido, significa un péptido modificado en donde uno o mas residuos de aminoácidos del péptido han sido sustituidos por otros residuos de aminoácidos y/o en donde uno o más residuos de aminoácidos han sido borrados del péptido y/o en donde uno o más residuos de aminoácidos han sido borrados del péptido y/o en donde uno o más residuos de aminoácidos han sido agregados al péptido. Tal adición o deleción de residuos de aminoácidos se puede llevar a cabo en la terminación N del péptido y/o en la terminación C del péptido-. Dos sistemas diferentes y simples son utilizados frecuentemente para describir los análogos: por ejemplo Arg34-GLP-K7-37) o K34 -GLP-1 (7-37) designa un análogo de GLP-1 en donde la lisina que está presente de manera natural en la posición 34 ha sido substituida con arginina (la abreviatura de una sola letra, estándar, para los aminoácidos fue utilizada de acuerdo con la nomenclatura IUPAC-IUB) . El término "derivado" como se utiliza aqui con relación a un péptido original significa una proteína original modificada químicamente o un' análogo de la misma, en donde al menos un substituyente no está presente en la proteína principal o un análogo de la misma, es decir, una proteína original que ha sido modificada covalentemente . Las modificaciones típicas son amidas, carbohidratos, grupos de alquilo, grupos de acilo, ésteres, pegilaciones y semejantes. Un ejemplo de un derivado de GLP-1 (7-37) es Arg34 , Lys26ISP (?- El término "un fragmento del mismo" cuando se utiliza aquí con relación a un péptido, significa cualquier fragmento del péptido que tiene al menos 20 % de los aminoácidos del péptido original. Por consiguiente, para la albúmina del suero humano, un fragmento podría comprender al menos 117 aminoácidos como la albúmina del suero humano que tiene 585 aminoácidos. En una modalidad, el fragmento tiene la menos 35 % de los aminoácidos del péptido original. En otra modalidad, el fragmento tiene al menos 50 % de los aminoácidos del péptido original. En otra modalidad, el fragmento tiene al menos el 75 % de los aminoácidos del péptido original . El término" variante" como es utilizado aquí con relación a un péptido, significa un péptido modificado que es un análogo del péptido original, o un derivado del péptido original o un derivado de una análogo del péptido original. El término "péptido de GLP-1" como se utiliza aquí, significa GLP-1 (7-37), un análogo de GLP-1 (7-37), un derivado de GLP-1 (7-37) o un derivado de un análogo de GLP-1 (7-37) . El término "péptido de GLP-2" cuando se utilice aquí, significa GLP-2 (1-33) , un análogo de GLP-2, un derivado de GLP-2 (1-33) o un derivado de un análogo de GLP-2 (1-33) . El término "péptido de exendina-4" como se utiliza aqui, significa exendina-4 (1-39) , una análogo de exendina-4, un derivado de exendina-4 o un derivado de un análogo de exendina-4. -El término "compuesto de exendida-4 estable" como se utiliza aquí, significa una exendina-4 (1-39) modificada químicamente, es decir un análogo o un derivado que exhibe una vida media de eliminación del plasma in vivo de al menos 10 horas en el hombre, como se determina por el siguiente método. El método para la determinación de la vida media de eliminación del plasma de un compuesto de exendina-4 en el hombre es: el compuesto es disuelto en un amortiguador isotónico, pH 7.4, PBS o cualquier otro amortiguador adecuado. La dosis es inyectada periféricamente, preferentemente en la zona abdominal o en el muslo superior. Las muestras de sangre para la determinación del compuesto activo son tomadas a intervalos frecuentes, y durante una duración suficiente para cubrir la parte de eliminación de la terminal (por ejemplo, pre-dosis, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 (día 2), 36 (día 2), 48 (día 3), 50 (día 3), 72 (día 4) y 84 (día 4) horas post-dosis) . La determinación de la concentración del compuesto activo es efectuada como se describe en Wilken et al Diabetologia 43(51):A143, 2000. Los parámetros farmacocinéticos derivados son calculados a partir de los datos de la concentración-tiempo para cada sujeto individual por el uso de métodos no divididos en partes, utilizando el software WinNonlin Versión 2.1 disponible comeréíalmente (Pharsight, Cary, NC, EUA) . La constante de velocidad de eliminación terminal es estimada por regresión lineal logarítmica sobre la parte logarítmica-lineal terminal de la curva de concentración-tiempo, ? se utilizó para calcular la vida media de eliminación. El término "péptido semejante al glucagon protegido con DPP-IV" como se utiliza aquí, significa un péptido semejante al glucagon el cual está modificado químicamente cuando se compara con el péptido natural para hacer al péptido semejante al glucagon más resistente a la peptidasa dipeptidil aminopeptidasa-4 del plasma (DPP-IV) . El término "compuesto de exéndina-4 inmunomodulada" como se utiliza aquí, significa un péptido de exendina-4 el cual es un análogo o un derivado de exendina-4 (1-39) que tiene una respuesta inmune reducida en seres humanos cuando se compara con exendina-4 (1-39) . EL método para evaluar la respuesta inmune es medir la concentración de los anticuerpos reactivos con respecto al compuesto de exendina-4 después de 4 semanas de tratamiento del paciente. El término "péptido de la insulina" como se utiliza aquí, significa un péptido que es ya sea la insulina humana o una insulina humana modificada químicamente, tal como un análogo o derivado de la misma. El término "insulina humana" como se utiliza aquí, significa la hormona humana cuya estructura y propiedades son bien conocidas. La insulina humana tiene dos cadenas de polipéptidos que están conectadas por puentes de disulfuro entre los residuos de cisteína, especialmente la cadena A y la cadena B. La cadena A es un péptido de 21 aminoácidos y la cadena B es un péptido de 30 aminoácidos, las dos cadenas están conectadas por tres puentes de disulfuro: uno entre las cisteínas en las posiciones 6 y 11 de la cadena A, la segunda entre la cisteína en la posición 7 de la cadena A y la cisteína en la posición 7 de la cadena B, y el tercero entre la cisteína en la posición 20 de la cadena A y la cisteína en la posición 19 de la cadena B. El término "producto de polipéptido" como se utiliza aquí, significa el producto del péptido modificado el cual va a ser utilizado para la manufactura de una composición farmacéutica. Por consiguiente, el producto del polipéptido es obtenido normalmente como el producto de la etapa de purificación, secado o acondicionamiento final . EL producto pueden ser cristales, un precipitado, solución o suspensión. El producto del polipéptido también es conocido en el arte como la substancia del fármaco, es decir el ingrediente farmacéutico activo. El término "punto isoeléctrico" como se utiliza aquí, significa el valor de pH en donde la carga neta total de una macromolecula tal como un polipéptido es cero. En los polipéptidos pueden existir muchos grupos cargados y en el punto isoeléctrico la suma de todas estas cargas es cero. A un pH arriba del punto isoeléctrico la carga neta total del polipéptido será negativa, mientras que a valores de pH abajo del punto isoléctrico la carga neta total del polipéptido será positiva. El término "farmacéuticamente aceptable" como se utiliza aquí, significa adecuado para aplicaciones farmacéuticas normales, es decir, que no ocasiona eventos adversos en los pacientes, etc. El término "excipiente" como se utiliza aquí significa los compuestos químicos que son agregados normalmente a las composiciones farmacéuticas, por ejemplo, amortiguadores, agentes de . tonicidad, conservadores y semejantes . El término "cantidad efectiva" como se utiliza aquí, significa una dosificación que es suficiente para ser efectiva para el tratamiento del paciente comparado con ningún tratamiento. EL término "composición farmacéutica" como se utiliza aquí, significa un producto que comprende un compuesto activo o una sal del mismo junto con excipientes farmacéuticos tales como un amortiguador, conservador y opcionalmente un modificador de la tonicidad y/o estabilizador. Por consiguiente, una composición farmacéutica también es conocida en el arte como una formulación farmacéutic . El término "tratamiento de una enfermedad" como se utiliza aquí, significa el manejo y cuidado de un paciente, que tiene desarrollada la enfermedad, condición o trastorno. El propósito del tratamiento es combatir la enfermedad, condición o trastorno. El tratamiento incluye la administración de los compuestos activos para eliminar o controlar la enfermedad, condición o trastorno así como para aliviar los síntomas o complicaciones asociadas con la enfermedad, condición o trastorno. Descripción detallada de la invención En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para separar las dos formas de un polipéptido que tiene una racemización de un solo aminoácido, caracterizado porque es un proceso de cromatografía de intercambio iónico que comprende la elución por el incremento de la concentración de la sal a un pH que no es mayor que aproximadamente 2 unidades de pH a partir de una pKa del residuo de aminoácido racemizado bajo las condiciones de elución. En otro aspecto la presente invención se refiere a un método para separar las dos formas de un polipéptido que tiene una racemización de un solo aminoácido, caracterizado porque es un proceso de cromatografía de intercambio iónico que comprende la elución por el incremento de la concentración de la sal a un pH que no es mayor que aproximadamente 1 unidad de pH a partir de un pKa del residuo de aminoácido racemizado bajo las condiciones de elución. En otro aspecto la presente invención se refiere a un método para separar las dos formas de un polipéptido que tienen una racemización de un solo aminoácido, caracterizado porque es un proceso de cromatografía de intercambio iónico que comprende la elución por el incremento de la concentración de la sal a un pH que no es mayor que una unidad de pH a partir de una pKa del residuo del aminoácido racemizado bajo las condiciones de elución. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para separar los dos polipéptidos A(X) y (AX*) , en donde X es un L-aminoácido, A (X) es un polipéptido que comprende el aminoácido X, X* es el isómero D de X, A(X*) es un polipéptido que comprende el aminoácido X* pero que de otra manera es idéntico a A(X), el método está caracterizado porque es un proceso de cromatografía de intercambio iónico que comprende la elución por el incremento de la concentración de la sal a un pH que no es mayor que 2 unidades de pH a partir de una pKa de X bajo las condiciones de elución. En otro aspecto de la presente invención, la misma se refiere a un método para separar dos polipéptidos que tienen una racemización de un solo aminoácido, A(X) y A(X*) , en donde X es un L-aminoácido, A(X) es un polipéptido que comprende el aminoácido X, X* es el isómero D de X, A(X*) es un polipeptido que comprende el aminoácido X* pero que de otra manera es idéntico a A(X), el método está caracterizado porque es un proceso de cromatografía de intercambio iónico que comprende la elución por el incremento de la concentración de la sal a un pH que no es mayor que 1 unidad de pH a partir de una pKa de X bajo las condiciones de elución. El polipeptido objetivo y la pureza que comprende un residuo de aminoácido racemizado, son eluídos y separados por un incremento lineal o asintótico, gradual, isocrático, en la concentración de la sal del eluyente, o en combinaciones de estos . La pKa de X puede ser evaluada por los valores de pKa tabulada para los residuos de aminoácidos (véase por ejemplo Creighton T.E. "Proteins, Structure and Molecular Properties" , página 6, 2/a. edición, W.H. Freeman and Company, N.Y. (1993)). La pKa de X puede ser evaluada por algoritmos implementados por computadora conocidos en el arte que tomen en cuenta los efectos de los residuos de aminoácidos próximos sobre la pKa de X. Otra posibilidad para determinar la pKa de X es efectuar estudios de RMN de la proteína en donde X es incorporado . Ya se sabe que los valores de pKa pueden estar influidos por la composición de la solución, por ejemplo la presencia de un modificador orgánico por el cambio de la pKa de un residuo de aminoácido. La cromatografía de intercambio iónico es un proceso de separación aplicado ampliamente en donde la separación es lograda con base en las cargas transportadas por las moléculas del soluto. En la cromatografía de intercambio iónico, el principio de separación principal son las interacciones iónicas entre la fase estacionaria y las moléculas solubles que son separadas. En el modo normal de la cromatografía de intercambio iónico, un ciclo completo comprende: a) el equilibrio con un amortiguador de equilibrio para llevar la columna a un estado en donde está lista para un ciclo, b) aplicación de una muestra de retención del producto, c) una etapa de lavado opcional en donde la fase estacionaria cromatográfica con el producto unido es lavada, d) elución en donde la concentración de sal incrementada provoca que la afinidad de los productos hacia la fase estacionaria de la cromatografía se reduzca y el producto deje la columna en el eluido de la columna cromatográfica, y e) una regeneración opcional en donde se intenta separar la fase estacionaria cromatográfica de las impurezas restantes utilizando una solución de regeneración. Durante la etapa de elución (d) la separación de los diferente polipéptidos es obtenida colectando el eluido de la columna en un número de conjuntos de líquidos. Por la colección apropiada de estos conjuntos de líquidos, por ejemplo por la elución de la AU2so (es decir la absorbancia a 280 mm) o la conductividad, cada uno de estos conjuntos de líquidos contienen predominantemente ciertos polipéptidos . Por consiguiente, la separación es lograda colectando estos conjuntos de líquidos por la parte del eluyente que contiene predominantemente el polipéptido deseado. La solución de equilibrio y la muestra para aplicación pueden contener o no el modificador orgánico. EL modificador orgánico podría ser pero no está limitado a cualquier alcohol alifático monohídrico (metanol, etanol, propanoles y butanoles) o un alcohol polihídrico tal como hexilenglicol o alcohol neopentílico . Los componentes de la sal para cualquier sección de la purificación por cromatografía puede ser cualquier sal incluyendo pero sin estar limitado a: NaCl, KC1, H4Cl, CaCl2, acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio, etc. Cualquier componente del amortiguador puede ser utilizado incluyendo pero sin estar limitado a-. amortiguadores cítricos, amortiguadores de fosfato, amortiguadores de borato, amortiguadores de carbonato, amortiguadores de acetato, amortiguadores de amonio, amortiguadores de glicina, amortiguadores de tri-hidroximetil amino-metano, amortiguadores de ácido 4- (2-hidroxietil)piperazin-l-etanosulfónico, etc. Una amplia gama de resinas de intercambio iónico cromatográfico son aplicables, incluyendo pero sin estar limitado a Mono Q (Amersham Biosciences) , Source Q o 30 Q (Amersham Biosciences) , Poros 20HQ o 50HQ (Perspective Biosystems) , Toyopearl Q650S (Toso Haas) y otros. En una modalidad de la presente invención, el método es para separar los polipéptidos a una escala preparativa. En otra modalidad de la presente invención, la elución es efectuada a un pH que es substancialmente el mismo que el pH utilizado para la aglutinación. Sin embargo, también es posible efectuar la aglutinación, es decir la aplicación de la muestra, a la columna a un pH que no es el mismo que el pH utilizado para la elución. La aglutinación a un pH que es diferente del pH utilizado para la elución, implica asi que un ajuste de pH es efectuado sobre la columna . En otra modalidad de la presente invención, la elución de los polipéptidos es efectuada a un pH que no es mayor que aproximadamente 0.75 unidades de pH a partir de una pKa de X bajo las condiciones de la elución. En otra modalidad de la presente invención, la elución de los polipéptidos es efectuada a un pH que no es mayor que aproximadamente 1.0 unidad de pH a partir de una pKa de X bajo las condiciones de elución. En otra modalidad de la presente invención, la elución de los polipéptidos es efectuada a un pH que no es mayor que aproximadamente 0.5 unidades de pH a partir de una pKa bajo las condiciones de elución. En otra modalidad de la presente invención, la elución de los polipéptidos es efectuada a un pH que no es mayor que aproximadamente 0.25 unidades de pH a partir de una pKa bajo las condiciones de elución. En una modalidad de la presente invención, la elución es efectuada a un pH que es mayor que el punto isoeléctrico de los polipéptidos. En otra modalidad de a presente invención, la elución es efectuada a un pH que es inferior que el punto isoeléctrico de los polipéptidos. En otra modalidad de la presente invención el polipéptido tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 10 kDa. En otra modalidad de la presente invención el polipéptido tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 8 kDa . En otra modalidad de la presente invención, el polipéptido tiene un peso molecular en el intervalo desde aproximadamente 1 kDa hasta aproximadamente 10 kDa. En otra modalidad de la presente invención el eluyente comprende un modificador orgánico. En otra modalidad de la presente invención el eluyente comprende un modificador orgánico en una concentración suficiente pata mantener los polipéptidos solubles.

En otra modalidad de la presente invención el modificador orgánico es el etanol . En otra modalidad de la presente invención, el modificador orgánico es el 2 -propanol. En otra modalidad de la presente invención, el modificador orgánico es acetonitrilo . En otra modalidad de la presente invención, el modificador orgánico es seleccionado del grupo que consiste de metanol, 1-propanol y hexilenglicol . En otra modalidad de la presente invención, el modificador orgánico es alcohol neopentílico . En otra modalidad de la presente invención, la concentración del modificador orgánico es desde aproximadamente 10 % hasta aproximadamente 80 %, tal como desde aproximadamente 20 % hasta aproximadamente 70 %, o desde aproximadamente 30 % hasta aproximadamente 65 %. En otra modalidad de la presente invención, la sal es seleccionada del grupo que consiste de cloruro de sodio, sulfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, y acetato de potasio. En otra modalidad de la presente invención, X es el residuo de aminoácido con terminación de N o con terminación de C. En otra modalidad de la presente invención, X es L-histidina.

En otra modalidad de la presente invención, X es un análogo de aminoácido de histidina. En otra modalidad de la presente invención, X es seleccionado del grupo que consiste de desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, s-fluorometil-histidina y s-metil-histidina . En otra modalidad de la presente invención X es el residuo de aminoácido con terminación de N. En otra modalidad de la presente invención X es L-fenilalanina . En otra modalidad de la presente invención X es lilisina. En otra modalidad de la presente invención, X es L-arginina . En otra modalidad de la presente invención X es ácido L-aspártico. En otra modalidad de la presente invención X es L-asparagina . En otra modalidad de la presente invención X es ácido L-glutámico. En otra modalidad de la presente invención X es L-glutamina . En otra modalidad de la presente invención X es el ácido L-y-carboxiglutámico . En otra modalidad de la presente invención el polipéptido es un péptido semejante al glucagon. En otra modalidad de la presente invención el polipéptido es glucagon, un análogo de glucagon, un derivado de glucagon, o un derivado de un análogo de glucagon. En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es GLP-1, una análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1 o un derivado de un análogo de GLP-1. En otra modalidad de la presente invención el análogo de GLP-1 es seleccionado del grupo que consiste de Arg34-GLP-1 (7-37) , Gly8-GLP-1 (7-36) -amida, Gly-GLP-1 (7-37) , Val8-GLP-1 (7-36) -amida, Val8-GLP-1 (7-37) , Val8Asp22-GLP-1 (7- 36) -amida, Val8Asp22-GLP-1 (7-37) , Val8Glu22-GLP-l (7-36) -amida, Val8Glu -GLP-l (7-37) , Val8Lys22-GLP-l (7-36) -amida, Val8Lys22~ GLP-l(7-37), Val8Arg22-GLP-1 (7-36) -amida, Val8Arg22-GLP-1 (7-37), Val8His22-GLP- (1-36) -amida, Val8His2-GLP-l (7-37) , Val8Trp19Glu22~GLP-l (7-37) , Val8Glu22Val25-GLP-l (7-37) , Val8Tyr16Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8TrpieGlu22-GLP-1 (7-37) , Val8LeulsGlu2-GLP-l (7-37) , Val8Tyr18Glu22-GLP-l (7-37) , Val8Glu22His37-GLP-l (7-37) , Val8Glu22Ile33-GLP-l (7-37) , Val8TrplsGlu2Val2sIle33-GLP-1 (7-37) , Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-l (7- 37) , Val8Glu22Val5Ile33-GLp-l (7-37) , Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1 (7-37) , análogos de los mismos y derivados de cualquiera de estos . En otra modalidad de la presente invención el derivado de GLP-1 o un derivado de un análogo de GLP-1 tienen un residuo de lisina, tal como una lisina, en donde un substituyente lipofílico opcionalmente por medio de un espaciador, es fijado a un grupo amino épsilon de la lisina. En otra modalidad de la presente invención, el substituyente lipofilico tiene de 8 hasta 40 átomos de carbono, preferentemente desde 8 hasta 24 átomos de carbono, por ejemplo 12 a 18 átomos de carbono. En otra modalidad de la presente invención, el espaciador está presente y es seleccionado de un aminoácido, por ejemplo ß-Ala, L-Glu, o aminobutiroilo. En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es un péptido semejante al glucagon protegido con DPPIV. En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es un péptido semejante al glucagon estable en el plasma. En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es un derivado de un análogo de GLP-1 el cual es Arg34Lys2S (?e- (?-Glu (Na-hexadecanoil) ) ) GLP-1 (7-37) . En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es un péptido de GLP-1 el cual tiene desde 22 hasta 40 residuos de aminoácidos, preferentemente desde 26 hasta 36 residuos de aminoácidos, aún más preferen emente desde 29 hasta 33 residuos de aminoácidos . En una modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es GLP-2, un análogo de GLP-2, un derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo de GLP-2. En otra modalidad de la presente invención el derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo de GLP-2 tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, en donde un substituyente lipofílico opcionalmente por medio de un espaciador es fijado al grupo amino epsilon de la lisina. En otra modalidad de la presente invención el substituyente lipofílico tiene desde 8 hasta 40 átomos de carbono, preferentemente desde 8 hasta 24 átomos de carbono, por ejemplo 12 a 18 átomos de carbono. En otra modalidad de la presente invención el espaciador está presente y es seleccionado de un aminoácido, por ejemplo beta-Ala, L-Glu, aminobutiroilo . En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon tiene desde 27 hasta 39 residuos de aminoácidos, preferentemente desde 29 hasta 37 residuos de aminoácidos, aún más preferentemente desde 31 hasta 35 residuos de aminoácidos. En otra modalidad de la invención el péptido semejante al glucagon es Lys17Arg30-GLP-2 (1-33 ) o Arg30Lys17Ne(P-Ala(isP-hexadecanoil) ) GLP-2 (1-33) . En otra modalidad de la presente invención, el péptido semejante al glucagon es Gly2-GLP-2 (1-33 ) . En una modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es exendina-4, un análogo de exendina-4, un derivado de exendina-4, o un derivado de un análogo de exendina-4. En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es exendina-4. En otra modalidad de la presente invención el derivado de exendina-4 o derivado de un análogo de exendina-4 es un péptido aislado o un péptido pegilado. En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es un compuesto de exendina-4 estable . En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es un compuesto de exendina-4 protegido con DPP-IV. En otra modalidad de la presente invención el péptido semejante al glucagon es un compuesto de exendina-4 inmunomodulado . En otra modalidad de la presente invención el derivado de exendina-4 o derivado de un análogo de exendina-4 tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, en donde un substituyente lipofílico opcionalmente por medio de un espaciador está fijado al grupo amino epsilon de la lisina. En otra modalidad de la presente invención el susbtituyente lipofílico tiene desde 8 hasta 40 átomos de carbono, preferentemente 8 hasta 24 átomos de carbono, por ejemplo 12 a 18 átomos de carbono. En otra modalidad de la presente invención, el espaciador está presente y es seleccionado de un aminoácido, por ejemplo beta-Ala, L-Glu o aminobutiroilo. En otra modalidad de la presente invención, el péptido semejante al glucagon es un péptido de exendina-4, el cual tiene desde 30 hasta 48 residuos de aminoácidos, desde 33 hasta 45 residuos de aminoácidos, preferentemente desde 35 hasta 43 residuos de aminoácidos, aún más preferentemente desde 37 hasta 41 residuos de aminoácidos. En una modalidad de la invención el péptido de GLP-2 es seleccionado de la lista que consiste de K30R-GLP-2 (1-33) ; S5K-GLP-2 (1-33) ; S7K-GLP-2 (1-33) ; D8K-GLP-2 (1-33 ) ; E9K-GLP-2(1-33); M10K-GLP-2 (1-33) ; N11K-GLP-2 (1-33 ) ; T12K-GLP-2 (1-33); I13K-GLP-2 (1-33) ; L14K-GLP-2 (1-33 ) ; D15K-GLP-2 (1-33 ) ; N16K-GLP-2 (1-33) ; L17K-GLP-2 (1-33) ; A18K-GLP-2 (1-33) ; D21K-GLP-2(l-33); N24K-GLP-2 (1-33 ) ; Q28 -GLP-2 (1-33 ) ; S5K/K30R-GLP-2 (1-33) ; S7K/K30R-GLP-2 (1-33) ; D8K/K30R-GLP-2 (1-33 ) ; E9K/K3OR-GLP-2 (1-33) ; M10K/K3OR-GLP-2 (1-33) ; M11K/K30R-GLP-2(1-33); T12K/K30R-GLP-2 (1-33) ; I13K/K30R-GLP-2 (1-33 ) ; L14K/K3OR-GLP-2 (1-33) ; D15K/K30R-GLP-2 (1-33) ; N16K/K30R-GLP-2(1-33); L17K/K30R-GLP-2 (1-33) ; A18K/K3OR-GLP-2 (1-33 ) ; D21K/K30R-GLP-2 (1-33) ; M24K/K30R-GLP-2 (1-33 ) ; Q28K/K30R-GLP- 2(1-33); K30R/D33K-GLP-2 (1-33) ; D3E/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; . D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33); D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33); D3E/D21 /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/N24K/ 30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33) , y los derivados de los mismos. En una modalidad de la invención, el derivado de GLP-2 es seleccionado del grupo que consiste de: S5K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; S7 (3- (hexadecanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; D8K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; E9K(3- (hexadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; M10K(3- (hexadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; N11K(3- (hexadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; T12K(3- (hexadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; I13K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; L14K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; D15K (3 - (hexadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33 ) ; N16K(3- (hexadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (octanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (nonanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (decanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ,-L17K(3- (undecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (dodecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; L17 (3- (tridecanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; L17 (3- (tetradecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (pentadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (heptadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K (3 - (octadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (nonadecanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (eicosanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4 -carboxi- 4- (octanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4 -carboxi-4- (nonanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4 -carboxi-4- (decanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4 -carboxi-4- (undecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4 -carboxi-4 - (dodecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4 -carboxi- _ (tridecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4 -carboxi-4- (tetradecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1- 33) ; L17K( (S) -4 -carboxi-4 _ (pentadecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1- 33) ; L17 ( (S) -4 -carboxi-4- (hexadecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1- 33) ; L17 ( (S) -4 -carboxi-4- (heptadecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1- 33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (octadecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1- 33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (nonadecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (eicosanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (octanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (nonanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (decanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (undecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K (4- (dodecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (tridecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (tetradecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (pentadecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (hexadecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (heptadecanoilamino) utanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (octadecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (nonadecanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (eicosanoilamino) butanoil) -GLP-2 (1-33) ; A18K(3- (hexadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; D21K(3- (hexadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; N24K(3- (hexadecanoilamino) propionil) -GLP-2 (1-33) ; Q28K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) -GLP-2 (1-33) ; S5K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; S7K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; D8K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; E9K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; M10K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) /K30R-GLP-2 (1-33) N11K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) T12K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) / 30R-GLP-2 (1-33) I13K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) L14K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) D15K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) N16K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) L17K(3- (octanoilamino) ropionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (nonanoilamino) ropionil) / 30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (decanoilamino) propionil ) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17 (3- (undecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (dodecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17 (3 - (tridecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (tetradecanoilamino) ropionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (pentadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (heptadecanoilamino) propionil) / 30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (octadecanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (nonadecanoilamino) ropionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(3- (eicosanoilamino) propionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17 ( (S) -4-carboxi-4- (octanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1 33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (nonanoilamino) butanoil ) / 3 OR-GLP-2 (1 L17K( (S) -4-carboxi-4- (decanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1- 33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (undecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1 33); L17K( (S) -4-carboxi-4- (dodecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1 33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (tridecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (tetradecanoilamino) utanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (pentadecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17 ( (S) -4-carboxi-4- (hexadecanoilamino) butanoil) / 30R-GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4 - (heptadecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17 ( (S) -4-carboxi-4- (octadecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (nonadecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K( (S) -4-carboxi-4- (eicosanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (octanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (nonanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (decanoilamino)butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (undecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (dodecanoilamino)butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (tridecanoilamino)butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (tetradecanoilamino)butanoil) / 30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (pentadecanoílamino) butanoil) / 30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (hexadecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (heptadecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (octadecanoilamino) utanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (nonadecanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; L17K(4- (eicosanoilamino) butanoil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; A18K(3- (hexadecanoilamino) propionil) / 30R-GLP-2 (1-33) ; D21K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; N24K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) /K30R-GLP-2 (1-33) ; Q28K(3- (hexadecanoilamino) propionil) / 30R-GLP-2 (1-33) ; D3E/S5 (3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1- 33) ; D3E/S7K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/D8K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/E9 (3- (hexadecanoilamino) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/M10K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-D3E/N11K(3- ( exadecanoilamino) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/T12K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) / D3E/I13K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L14K(3- (hexadecanoilamino) propionil) / 30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/D15K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/N16K(3- (hexadecanoilamino) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33); D3E/L17K(3- (octanoilamino) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) D3E/L17K(3- (nonanoilamino) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) D3E/L17K(3- (decanoilamino) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) D3E/L17K(3- (undecanoilami o) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(3- (dodecanoilamino) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(3- (tridecanoilamino) propionil) / 30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(3- (tetradecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(3- (pentadecanoilamino) propionil ) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-D3E/L17K(3- (heptadecanoilamino) ropionil ) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33); D3E/L17K(3- (octadecanoilamino) propionil ) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(3- (nonadecanoilamino) propionil) / 30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(3- (eicosanoilamino) propionil ) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (octanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (nonanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (decanoilamino) utanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (undecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (dodecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (tridecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (tetradecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (pentadecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4-(hexadecanoilamino) utanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (heptadecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi~4~ (octadecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (nonadecanoilamino) utanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K( (S) -4-carboxi-4- (eicosanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (octanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (nonanoilaraino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (decanoilamino) butanoil) / 30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (undecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (dodecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (tridecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) D3E/L17K(4- (tetradecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (pentadecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17 (4- (hexadecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (heptadecanoilamino) utanoil) / 30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (octadecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/L17K(4- (nonadecanoilamino) butanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1- 33) ; D3E/L17K(4- (eicosanoilamino) utanoil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/A18 (3- (hexadecanoilamino) ropionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/D21K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; D3E/N24K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ; y D3E/Q28K(3- (hexadecanoilamino) propionil) /K30R/D33E-GLP-2 (1-33) . Los métodos para la preparación de GLP-2, los análogos de los mismos así como los derivados de GLP-2 pueden ser encontrados por ejemplo en WO 99/43361 y WO 00/55119. En una modalidad adicional de la invención, el péptido semejante al glucagon es un análogo insulinotrópico de exendina-4 (1-39) , por ejemplo Ser2Asp3-exendina-4 (1-39) en donde los residuos de aminoácidos en las posiciones 2 y 3 han sido reemplazados con serina y ácido aspártico, respectivamente (este análogo particular también es conocido en el arte como exendina-3) . En una modalidad adicional de la invención el péptido semejante al glucagon es un derivado de exendina-4 en donde el substituyente introducido es seleccionado de amidas, carbohidratos, grupos de alquilo, ésteres y substituyentes lipofílicos. Un ejemplo de un derivado insulinotrópico de exendina-4 (1-39) y los análogos de los mismos es Tyr -exendina-4 (1-31) -amida. En otra modalidad de la invención el péptido semejante al glucagon es un compuesto de exendina-4 estable. En otra modalidad de la invención el péptido semejante al glucagon es un compuesto de exendina-4 protegido con DPP-IV.

En otra modalidad de la invención el péptido semejante al glucagon es un compuesto de exendina-4 inmunomodulado . Los métodos para la preparación de exendina-4, análogos de los mismos asi como derivados de exendina-4 pueden ser encontrados por ejemplo en WO 99/43708, WO 00/41546 y WO 00/55119. El péptido semejante al glucagon, original, puede ser producido por la síntesis del péptido, por ejemplo la síntesis del péptido de una sola fase utilizando la química de Fmoc o Boc u otras técnicas bien establecidas. El péptido semejante al glucagon también puede ser producido por un método que comprende cultivar una célula hospedera que contiene una secuencia de ADN que codifica el polipéptido y capaz de expresar el polipéptido en un medio nutriente adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del péptido, después de lo cual el péptido resultante es recuperado del cultivo. El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer las células hospederas, tal como un medio mínimo o completo que contiene suplementos apropiados. Los medios adecuados están disponibles de los proveedores comerciales o pueden ser preparados de acuerdo con las recetas publicadas (por ejemplo en los catálogos de American Type Culture Collection) . El peptido producido por las células puede ser recuperado entonces del medio de cultivo por procedimientos convencionales incluyendo la separación de las células hospederas del medio por filtración o centrifugación, precipitar los componentes proteináceos del sobrenadante o el filtrado por medio de una sal, por ejemplo sulfato de amonio, purificación por una variedad de métodos cromatográficos , por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración de gel, cromatografía de afinidad, o semejantes, dependiendo del tipo de péptido en cuestión. La secuencia de ADN que codifica el péptido original puede ser adecuadamente de origen genómico o de ADNc por ejemplo obtenida por la preparación de una biblioteca genómica o de ADNc utilizando sondas de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con las técnicas estándares (véase, por ejemplo, Sambrook, J, Fritsch, EF y Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) . La secuencia de ADN que codifica el péptido también puede ser preparada sintéticamente por los métodos estándares establecidos, por ejemplo el método de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981) , 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al, EMBO Journal 3 (1984), 801-805. La secuencia de ADN también puede ser preparada por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando valores específicos, por ejemplo, como se describe en US 4,683,202 o Saiki et al, Science 239 (1988), 487-491. La secuencia de ADN puede ser insertada en cualquier vector que pueda ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula hospedera en la cual el mismo va a ser introducido. Por consiguiente, el vector puede ser un vector que se replique autónomamente, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación de la cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedera, es integrado en el genoma de la célula hospedera y replicado junto con el (los) cromosoma (s) dentro del cual (de los cuales) ha(n) sido integrados (s) . El vector es preferentemente un vector de expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica el péptido está enlazada operativamente a los segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN, tales como un promotor. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula hospedera de elección y puede ser derivada de genes que codifican proteínas ya sea homologas o heterólogas para la célula hospedera. Los ejemplos de los promotores adecuados para dirigir la transcripción del ADN que codifica el peptido de la invención en una variedad de células hospederas, ya son conocidos en el. arte, cotéjese por ejemplo Sambrook et al, supra . La secuencia de ADN que codifica el péptido también puede estar conectada operativamente, si es necesario, a un terminador adecuado, señales de poliadenilación, secuencias mejoradoras transcripcionales, y secuencias mejoradoras translacionales . El vector recombinante de la invención puede comprender además una secuencia de ADN que hace posible que el vector se replique en la célula hospedera en cuestión. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo un gen provisto el producto del cual complemente un defecto en la célula hospedera o uno que confiera resistencia a un fármaco, por ejemplo ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloramfenicol , neomicina, higromicina o metrotexato. Para dirigir un péptido original de la presente invención hacia la ruta secretoria de las células hospederas, una secuencia de la señal secretoria (también conocida como una secuencia lider, preprosecuencia o presecuencia) también puede ser provista en el vector recombinante . La secuencia de la señal secretoria está unida a la secuencia de ADN que codifica el péptido en el marco de lectura corregido. La secuencias de la señal secretoria están colocadas comúnmente 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el péptido. La secuencia de la señal secretoria puede ser aquella asociada normalmente con el péptido o puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada. Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican para el presente péptido, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia de la señal secretoria, respectivamente, y para insertarlas en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por la persona experta en el arte (cotéjese, pro ejemplo, Sambrook et al, supra) . La célula hospedera dentro de la cual la secuencia de ADN o el vector recombinante es introducido, puede ser cualquier célula, la cual es capaz de producir el presente péptido e incluye bacterias, levaduras, hongos y células eucarióticas más elevadas. Los ejemplos de las células hospederas adecuadas bien conocidos y utilizados en el arte son, sin limitación, E. coli, Saccharomyces cerevisiase, o líneas celulares BHK o CHO de mamífero. Las composiciones farmacéuticas que contienen un péptido semejante al glucagon purificado de acuerdo con la presente invención típicamente contienen varios excipientes farmacéuticos, tales como conservadores, agentes isotónicos y agentes tensioactivos . La preparación de las composiciones farmacéuticas es bien conocida para la persona experta. Para una referencia conveniente diríjase a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19/a. edición, 1995. Las composiciones farmacéuticas que contiene un péptido semejante al glucagon, purificado de acuerdo con la presente invención pueden ser administradas parenteralmente a los pacientes que tengan la necesidad de tal tratamiento. La administración parenteral puede ser efectuada por inyección subcutánea, inyección intramuscular o inyección intravenosa por medio de une jeringa, opcionalmente una jeringa semejante a una pluma. Alternativamente la administración puede ser efectuada por infusión, por ejemplo por el uso de una bomba de infusión. La presente invención es ilustrada adicionalmente por los siguientes ejemplos, los cuales, sin embargo, no van a ser interpretados como limitativos del alcance de la protección. Las . características descritas en la descripción precedente y en los siguientes ejemplos, tanto separadamente como en cualquier combinación de las mismas, pueden ser el material para lograr la invención en diversas formas de la misma.

Ej etnplos Ejemplo 1 La Arg3GLP-l (7_37) fue expresada en levadura (S. cerevisiae) por la tecnología recombinante convencional como se describe en otra parte (WO 98/08871) . La Arg3GLP-l (7_37) en el caldo de fermentación fue purificada entonces por cromatografía de fase inversa, convencional, " y subsiguientemente se precipitó al pH isoeléctrico del peptido, es decir al pH de 5.4. El precipitado fue aislado por centrifugación. Después de otra etapa de purificación por P-LC y precipitación isoeléctrica, el péptido de Arg34GLP-1(7_37) fue aislado como se describió en WO 00/55119 para dar el derivado de Arg3LysSNs (?-Glu (Nff-hexadecanoil) ) GLP-1 (7_37) de GLP-1. Una mezcla de 0.5 g/1 de Arg3Lys2¾T (?-Glu (??G-hexadecanoil) ) GLP-1 (v-37) a pH 8.0 fue preparada. La pureza del polipéptido fue de aproximadamente 90 % (aproximadamente 5 % de la variante D-His, D-His7Arg34Lys2Slsr (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7_37) , en donde la histidina en la posición 7, es decir la terminación N del péptido fue racemizada hasta un residuo de D-histidina, y 5% de otras impurezas) . La mezcla es purificada utilizando cromatografía de intercambio aniónico . El volumen de la columna de 0.005 (CV) (por sus siglas en inglés) de la mezcla fue aplicado a una columna de intercambio aniónico Mono Q (Amersham Biosciences) de 1 mi equilibrada con 10 CV 20 mM de Tris-hidroximetil aminometano, 63 % (p/p) de etanol, pH 0.8. La columna se lava con 3 CV de la solución de equilibrio, y la elución se lleva a cabo con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-20 mM de NaCl , 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 20 CV, seguido por el segundo gradiente de 20-50 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 10 CV. El flujo fue de 40 CV/h y la temperatura 25°C en todo el experimento. Durante el experimento el eluyente de la columna fue fraccionado y cada una de las fracciones fueron analizadas para verificar el contenido de D-His7Arg3Lys26NE (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7.37) y Arg34Lys26ISP (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) respectivamente. Los datos mostraron que la variante D-His del péptido se eluyó antes que la Arg34Lys2eNE (?-Glu (ISP-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) y las dos formas del péptido podrían ser separadas asi . Ejemplo 2 Una mezcla de 2.0 g/1 de (?-Glu (N"-hexadecanoil) ) GLP-l(i.37) a pH 8 fue preparado como se describió en el ejemplo 1. 0.6 CV de la mezcla se aplican a una columna de intercambio aniónico Poros 20 HQ (Perseptive Biosystem) de 4.7 mi, equilibrada con 5 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, H 8.0. La columna se lava con una solución de equilibrio de 6 CV, y la elución fue efectuada con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-50 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 12 CV, seguido por el segundo gradiente de 50-80 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 20 CV. El flujo fue de 90 CV/h y la temperatura de 40 °C en todo el experimento. Durante el experimento, el eluyente de la columna fue fraccionado, y cada una de las fracciones fue analizada para verificar los contenidos de D-His7Arg3Lys26Ne (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37¡ y Arg3Lys26 s (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) , respectivamente . Los datos mostraron que la variante D-His del péptido eluyó antes que Arg3Lys2SNE (?-Glu (Na-hexadecanoil) ) GLP-1(7-37) Y las dos formas del péptido podrían ser separadas asi . Ej emplo 3 Una mezcla de 0.5 g/1 de Arg34Lys2¾T (?-Glu (?s-hexadecanoil ) ) GLP-1 (7_37) a pH 8.0 es preparada como se describe en el ejemplo 1. 0.1 CV de la mezcla se aplican a una columna de intercambio aniónico Mono Q (Amersham Biosciences) de 1 mi, equilibrada con 10 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, H 8.0. La columna se lava con una solución de equilibrio de 3 CV, y la elución fue efectuada con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-20 mM de NaCl, 20 mM HEPES, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 20 CV, seguido por el segundo gradiente de 20-50 mM de NaCl, 20 mM HEPES, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0. sobre 10 CV. El flujo fue de 20 CV/h y la temperatura de 25°C en todo el experimento. Durante el experimento, el eluyente de la columna fue fraccionado, y cada una de las fracciones fue analizada para verificar los contenidos de D-His7Arg34Lys26N£ (?-Glu (?s~ exadecanoil) ) GLP-1 ,7_37) y Arg34Lys2¾T (?-Glu (tT-hexadecanoil) ) GLP-1 (7.37) , respectivamente. Los datos mostraron que la variante D-His del péptido eluyó antes que (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1(7-37) , y las dos formas del péptido podrían ser separadas así . Ejemplo 4 Una mezcla de 0.5 g/1 de (?-Glu ( °-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) a pH 8.0 es preparada como se describe en el ejemplo 1. 0.1 CV de la mezcla se aplican a una columna de intercambio aniónico Mono Q (Amersham Biosciences) de 1 mi, equilibrada con 10 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0. La columna se lava con una solución de equilibrio de 3 CV, y la elución fue efectuada con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-20 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 20 CV, seguido por el segundo gradiente de 20-50 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 10 CV. El flujo fue de 80 CV/h y la temperatura de 25°C en todo el experimento. Durante el experimento, el eluyente de la columna fue fraccionado, y cada una de las fracciones fue analizada para verificar los contenidos de D-His7Arg34Lys26I\f (?-Glu (1SF-hexadecanoil) )GLP-1(7-37) y Arg34Lys26 E (?-Glu (N"-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) , respectivamente. Los datos mostraron que la variante D-His del péptido eluyó antes que Arg34Lys26NE (?-Glu (NT-hexadecanoil) ) GLP-1(7-3 ), y las dos formas del péptido podrían ser separadas asi . Ejemplo 5 Una mezcla de 0.5 g/1 de Arg^Lys26!^ (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) a pH 8.0 es preparada como se describe en el ejemplo 1. 0.1 CV de la mezcla se aplican a una columna de intercambio aniónico Mono Q (Amersham Biosciences) de 1 mi, equilibrada con 10 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0. La columna se lava con una solución de equilibrio de 3 CV, y la elución fue efectuada con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-20 mM de acetato de sodio, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 20 CV, seguido por el segundo gradiente de 20-50 mM de CH3COOH, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 10 CV. El flujo fue de 40 CV/h y la temperatura de 25°C en todo el experimento. Durante el experimento, el eluyente de la columna fue fraccionado, y cada una de las fracciones fue analizada para verificar los contenidos de D-His7Arg3Lys26 e (?-Glu (?s-hexadecanoil) )GLP-1(7-37) y Arg3Lys26ISP (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) , respectivamente. Los datos mostraron que la variante D-His del péptido eluyó antes que Arg34Lys26NE (?-Glu ( ^-hexadecanoil) ) GLP-1(7-37) y las dos formas del péptido podrían ser separadas así . Ejemplo 6 Una mezcla de 0.5 g/1 de Arg34Lys26Ne (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) a pH 8.0 es preparada como se describe en el ejemplo 1. 0.1 CV de la mezcla se aplican a una columna de intercambio aniónico Mono Q (Amersham Biosciences) de 1 mi, equilibrada con 10 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0. La columna se lava con una solución de equilibrio de 3 CV, y la elución fue efectuada con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-10 mM de Na2S04í 20 m de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 20 CV, seguido por el segundo gradiente de 10-25 mM de Ma2S0 , 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 10 CV. El flujo fue de 40 CV/h y la temperatura de 25 °C en todo el experimento. Durante el experimento, el eluyente de la columna fue fraccionado, y cada una de las fracciones fue analizada para verificar los contenidos de D-His7Arg34Lys26lSP (?-Glu (N°-hexadecanoil ) ) GLP-1 (7_37) y Arg3 Lys2¾r (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) , respectivamente. Los datos mostraron que la variante D-His del péptido eluyó antes que Arg34Lys2Sl\f (?-Glu (IF-hexadecanoil) ) GLP-1(7-37) Y las dos formas del péptido podrían ser separadas así . Ej emplo 7 Una mezcla de 2.0 g/1 de (?-Glu (N^-hexadecanoil) ) GLP-l(i-37) a pH 8 fue preparada como se describe en el ejemplo 1. La muestra fue apagada subsiguientemente con aproximadamente una tercera parte de D-His7Arg34Lys2¾r (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) ¦ El volumen de la columna (CV) de 0.015 de la mezcla fue aplicado a una columna de intercambio aniónico Mono Q (Amersham Biosciences) de 1 mi equilibrada con 5 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0. La elución fue efectuada con do gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-20 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 12 CV, seguido por el segundo gradiente desde de 20-50 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 8 CV. El flujo fue de 48 CV/h y la temperatura de 25 °c en todo el experimento. El cromatograma es mostrado en la figura 1. Ejemplo 8 Una mezcla de 4.5 g/1 de (?-Glu ) GLP-l(i-37) a pH 8 es preparada como se describe en el ejemplo 1. 0.7 CV de la mezcla se aplican a una columna de intercambio aniónico Source 30 Q (Amersham Biosciences) de 152 mi, equilibrada con 6 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0. La columna se lava con una solución de equilibrio.de 2 CV, y la elución fue efectuada con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-23 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 12 CV, seguido por el segundo gradiente de 23-30 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.0 sobre 20 CV. El flujo fue de 20 CV/h y la temperatura de 25°C en todo el experimento.

Durante el experimento, el eluyente de la columna fue fraccionado, y cada una de las fracciones fue analizada para verificar los contenidos de D-His7Arg34Lys26Ns (?-Glu (?s-hexadecanoil) )GLP-l(7-37) y (?-Glu (IST-hexadecanoil) ) GLP-1 (7.37) , respectivamente. Los datos mostraron que la variante D-His del péptido eluyó antes que Arg34Lys26NE (?-Glu (NP-hexadecanoil) ) GLP-1(7-37) / las dos formas del péptido podrían ser separadas así . Ejemplo 9 Una mezcla de 5.0 g/1 de (?-Glu (Na-hexadecanoil) ) GLP-l(i-37) a pH 8.0 es preparada como se describe en el ejemplo 1. 0.6 CV de la mezcla se aplican a una columna de intercambio aniónico Source 30Q (Amersham Biosciences) de 11.8 mi, equilibrada con 5 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 7.5. La columna se lava con una solución de equilibrio de 1 CV, y la elución fue efectuada con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-20 mM de NaCl , 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 7.5 sobre 12 CV, seguido por el segundo gradiente de 20-40 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 7.5 sobre 20 CV. El flujo fue de 20 CV/h y la temperatura de 25 °C en todo el experimento. Durante el experimento, el eluyente de la columna fue fraccionado, y cada una de las fracciones fue analizada para verificar los contenidos de D-His7Arg3Lys26 E (?-Glu (?G-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) y Arg34Lys2¾P (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) , respectivamente . Los datos mostraron que la variante D-His del péptido eluyó antes que Arg34Lys26Ns (?-Glu (N^- exadecanoil) ) GLP-1(7-37) Y las dos formas del péptido podrían ser separadas así . Ejemplo 10 Una mezcla de 5.0 g/1 de (y-Glu(Na- exadecanoil) ) GLP-1 (7-37) a pH 8.0 es preparada como se describe en el ejemplo 1. 0.6 CV de la mezcla se aplican a una columna de intercambio aniónico Source 30Q (Amersham Biosciences) de 11.8 mi, equilibrada con 5 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 7.0. La columna se lava con una solución de equilibrio de 1 CV, y la elución fue efectuada con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-15 mM de NaCl , 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 7.0 sobre 12 CV, seguido por el segundo gradiente de 15-40 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH ? . 0 sobre 20 CV. El flujo fue de 20 CV/h y la temperatura de 25 °C en todo el experimento. Durante el experimento, el eluyente de la columna fue fraccionado, y cada una de las fracciones fue analizada para verificar los contenidos de D-His7Arg34Lys26lsr!: (?-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7_37) y Arg3Lys2¾T (y-Glu (?s-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) , respectivamente. Los datos mostraron que la variante D-His del péptido eluyó antes que Arg3Lys26N£ (?-Glu (ISF-hexadecanoil) ) GLP-1(7-37) Y las dos formas del péptido podrían ser separadas así . Ejemplo 11 Una mezcla de 5.0 g/1 de (?-Glu (IF-hexadecanoil) ) GLP-l(i-37] a pH 8 es preparada como se describe en el ejemplo 1. 0.6 CV de la mezcla se aplican a una columna de intercambio aniónico Source 30Q (Amersham Biosciences) de 11.8 mi, equilibrada con 5 CV de 20 mM de Tris- idroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.5. La columna se lava con una solución de equilibrio de 1 CV, y la elución fue efectuada con dos gradientes lineales de la sal, el primer gradiente desde 0-20 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.5 sobre 12 CV, seguido por el segundo gradiente de 20-40 mM de NaCl, 20 mM de Tris-hidxoximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 8.5 sobre 20 CV. El flujo fue de 20 CV/h y la temperatura de 25 °C en todo el experimento. Durante el experimento, el eluyente de la columna fue fraccionado, y cada una de las fracciones fue analizada para verificar los contenidos de D~His7Arg34Lys2¾P (?-Glu (IST- exadecanoil) )GLP-1(7_37, y Arg34Lys26NE (?-Glu (W-hexadecanoil) ) GLP-1 (7-37) , respectivamente . Los datos mostraron que la variante D-His del péptido eluyó antes que Arg34Lys26NE (?-Glu (]ST-hexadecanoil) ) GLP-1(7-37) y las dos formas del péptido podrían ser separadas así . Ejemplo 12 La L-His1-Exendina-4 y D-His1-Exendina-4 fue preparada por síntesis en fase sólida. Una mezcla de las dos fue preparada disolviendo los péptidos en 10 mM Tris-hidroximetil amino-metano a pH 9.2 hasta una concentración de 1 g/1- 1 CV de esta mezcla se carga a una columna de intercambio aniónico mono-Q (Amersham Biosciences) de 1 mi equilibrada con 10 CV de 10 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 7.0. La- columna se lava con 1 CV 10 mM Tris-hidroximetil amino-metano 63 % (p/p) de etanol, pH 7.0, y la elución fue efectuada isocráticamente con 10 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 7.0 sobre 20 CV. El flujo fue de 138 CV/h y la temperatura fue de 25 °C en todo el experimento. La elución (figura 3) mostró que la forma L-His de la Exendina-4 eluyó antes que la forma D-His de Exendina-4, y las dos formas del péptido podrían ser separadas así.

Ejemplo 13 L17K, K30R-GLP2 (i-33) fue expresada en levadura (S. Cerevisiae) por tecnología recombinante convencional de una manera semejante a aquella descrita en WO 98/08871 para los péptidos de GLP-1. La L17K, K30R-GLP2 (1-33) en el caldo de fermentación fue purificada entonces por cromatografía de fase inversa y de intercambio aniónico convencional y subsecuentemente se precipita al pH isoeléctrico del peptido, es decir a pH 4. El precipitado fue aislado por centrifugación. La D-His- L17K, K30R-GLP2 (1-33) fue preparada por síntesis de fase sólida. Una mezcla de las dos fue preparada disolviendo los péptidos en 10 mM Tris-hidroximetil amino-metano a pH 9.2 a una concentración de 1 g/1. 1 CV de esta mezcla se carga a una columna de intercambio aniónico mono-Q (Amersham Biosciences) de 1 mi equilibrada con 5 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol, pH 7.0. La columna se lava con 1 CV 20 mM Tris-hidroximetil amino-metano 63 % (p/p) de etanol, pH 7.0, y la elución fue como un gradiente sobre 20 CV desde 0 hasta 63 mM NaCl en 20 mM de Tris-hidroximetil amino-metano, 63 % (p/p) de etanol pH 7.0. El flujo fue de 138 CV/h y la temperatura fue de 25 °c en todo el experimento . La elución muestra que la forma D-His de L17 , K30R-GLP2 (1-33) se eluyó antes que la forma L-his de L17K, 30 -GLP2(i-33) , y las dos formas del péptido pueden ser separadas así . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad · lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para separar las dos formas de un polipéptido que tiene una racemización de un -solo aminoácido, caracterizado porque es un proceso de cromatografía de intercambio iónico que comprende la elución por el incremento de la concentración de la sal a un pH que no es mayor que 1 unidad de pH de una pKa del residuo de aminoácido racemizado bajo las condiciones de elución. 2. Un método para la separación de los dos polipéptidos A(X) y A(X*), en donde: X es un L-aminoácido, A(X) es un polipéptido que comprende el aminoácido X, X* es el isómero D de X, A(X*) es un polipéptido que comprende el aminoácido X* pero que de otra manera es idéntico a A(X), el método está caracterizado porque es un proceso de cromatografía de intercambio iónico que comprende la elución por el incremento de la concentración de la sal a un pH que no es mayor que 1 unidad de pH a partir de una pKa de X bajo las condiciones de elución. 3. Un método para separar los dos polipéptidos que tienen una racemización de un solo aminoácido, A(X) y A(X*), en donde : X es un L-aminoácido, A(X) es un polipéptido que comprende el aminoácido X, X* es el isómero D de X, A(X*) es un polipéptido que comprende el aminoácido X* pero que de otra manera es idéntico a A(X), el método está caracterizado porque es un proceso de cromatografía de intercambio iónico que comprende la elución por el incremento de la concentración de la sal a un pH que no es mayor que 1 unidad de pH a partir de una pKa de X bajo las condiciones de elución. 4. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque el método es para separar los polipéptidos a una escala preparativa. 5. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque la elución es efectuada a un pH que es parcialmente idéntico que el pH utilizado para la aglutinación. 6. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la aglutinación de los polipéptidos es efectuada a un pH que no es mayor que aproximadamente 0.5 unidades de pH desde una pKa de X bajo las condiciones de elución. 7. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la elución es efectuada a un pH que es más elevado que el punto isoeléctrico de los polipéptidos . 8. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque el polipeptxdo tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 10 kDa. 9. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el eluyente comprende un modificador orgánico. 10. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque el eluyente comprende un modificador orgánico en una concentración suficiente para mantener los polipéptidos solubles. 11. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, caracterizado porque el modificador orgánico es etanol . 12. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, caracterizado porque el modificador orgánico es 2 -propanol. 13. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, caracterizado porque el modificador orgánico es acetonitrilo . 1 . Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, caracterizado porque el modificador orgánico es seleccionado del grupo que consiste de metanol, 1-propanol y hexilenglicol . 15. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-14, caracterizado porque la concentración del modificador orgánico es desde aproximadamente 10 % hasta aproximadamente 80 %, tal como desde aproximadamente 20 % hasta aproximadamente 70 %, o desde aproximadamente 30 % hasta aproximadamente 65 %. 16. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sal es seleccionada del grupo que consiste de cloruro de sodio, sulfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio y acetato de potasio. 17. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque X es el residuo de aminoácido de la terminación N o de la terminación C. 18. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque X es L-histidina. 19. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque X es una análogo de aminoácido de la histidina. 20. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicación 19, caracterizado porque X es seleccionado del grupo que consiste de desamino-histidina, 2 -amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, s-fluorometilhistidina y s-metil-histidina . 21. Un método de conformidad con las reivindicaciones 19 ó 20, -caracterizado porque X es el residuo de aminoácido de la terminación N. 22. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque X es L-fenilalanina . 23. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque el polipeptido es un péptido semejante al glucagon. 24. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque el polipéptido es el glucagon, un análogo del glucagon, un derivado del glucagon o un derivado de un análogo de glucagon. 25. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el polipéptido es GLP-1, una análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1 o un derivado de un análogo de GLP-1. 26. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el análogo de GLP-1 es seleccionado del grupo que consiste de: Arg3-GLP-1 (7-37) , Gly8-GLP-1 (7-36) -amida, Gly-GLP-1 (7-37) , Val8-GLP-1 (7-36) -amida, Val8-GLP-1(7-37), Val8Asp22-GLP-l (7-36) -amida, Val8Asp22-GLP-1 (7-37) , Val8Glu -GLP-1 (7-3S) -amida, Val8Glu22-GLP-1 (7-37) , Val8Lys -GLP-1 (7-36) -amida, Val8Lys22-GLP-l (7-37) , Val8Arg22-GLP-l (7-36) -amida, Val8Arg22-GLP-l (7-37) , Val8His22-GLP- (1-36) -amida, Val8His22-GLP-l (7-37) , ValaTrp19Glu2 -GLP-l (7-37) , Val8Glu22Val25-GLP-l (7-37) , Val8Tyr16Glu22-GLP-l (7-37) , Val8Trp16Glu22~GLP-l (7-37) , Val8Leu16Glu2-GLP-l (7-37) , Val8Tyr18Glu22-GLP-l (7-37) , Val8Glu22His37-GLP-l (7-37) , Val8Glu2Ile33-GLP-l (7-37) , Val8TrplsGlu Val25Ile33-GLP-l (7-37) , Val8TrplsGlu22Ile33-GLP-l (7-37) , Val8Glu22Val2SIle33-GLp-l (7-37) , Val8Trp16Glu22Val25-GLP-l (7-37) , análogos de los mismos y derivados de cualquiera de estos . 27. Un método de conformidad con la reivindicación-25, caracterizado porque el derivado de GLP-1 o un derivado de un análogo de GLP-1 tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, en donde un substituyente lipofílico opcionalmente por medio de un espaciador, está fijado al grupo amino epsilon de la lisina. 28. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el substituyente lipofílico tiene desde 8 hasta 40 átomos de carbono, preferentemente 8 a 24 átomos de carbono, por ejemplo 12 a 18 átomos de carbono. 29. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-28, caracterizado porque el espaciador está presente y es seleccionado de un aminoácido, por ejemplo beta-Ala, L-Glu, o aminobutiroilo . 30. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-29, caracterizado porque el péptido semejante al glucagon es un péptido semejante al glucagon protegido con DPPIV. 31. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-30, caracterizado porque el péptido semejante al glucagon es un péptido semejante al glucagon estable en el plasma. 32. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el derivado de un análogo de GLP-1 es Arg3Lys2S (?e (?-Glu (N-hexadecanoil) ) ) GLP-1 (7-37) . 33. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-32, caracterizado porque el péptido semejante al glucagon tiene desde 22 hasta 40 residuos de aminoácidos, preferentemente desde 26 hasta 36 residuos de aminoácidos, aún más preferentemente desde 29 hasta 33 residuos de aminoácidos . 34. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el péptido semejante al glucagon es GLP-2, un análogo de GLP-2, un derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo de GLP-2. 35. Un método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo de GLP-2 tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, en donde un substituyente lipofílico opcionalmente por medio de un espaciador está fijado al grupo amino épsilon de la Usina. 36. Un método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el substituyente lipofílico tiene desde 8 hasta 40 átomos de carbono, preferentemente desde 8 hasta 24 átomos de carbono, por ejemplo 12 a 18 átomos de carbono . 37. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-36, caracterizado porque el espaciador está presente y es seleccionado de un aminoácido, por ejemplo beta-Ala, L-Glu, amonibutiroilo . 38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-37, caracterizado porque el péptido semejante al glucagon tiene desde 27 -hasta 39 residuos de aminoácidos, preferentemente desde 29 hasta 37 residuos de aminoácidos, aún más preferentemente desde 31 hasta 35 residuos de aminoácidos . 39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 34, caracterizado porque el péptido semejante al glucagon es la Lys17Arg30-GLP-2 (1-33) o Arg30Lys17NE( -Ala(N°-hexadecanoil) ) GLP-2 (1-33) . 40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 34, caracterizado porque el péptido semejante al glucagon es Gly2-GLP-2 (1-33) . 41. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el peptido semejante al glucagon es exendina-4, un análogo de exendina-4, un derivado de exendina-4, o un derivado de un análogo de exendina-4. 42. Un método de ' conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el peptido semejante al glucagon es exendina-4. 43. Un método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el peptido semejante al glucagon es ZP10, es decir HGEGT-FTSDLSKQMEEEA LFIEWL WGGPSSGAPPSKI KKK-NH2. 44. Un método de con ormidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el derivado de exendina-4 o un derivado de un análogo de exdnina-4 es un peptido acilado o un péptido pegilado . 45. Un método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el derivado de exendina-4 o el derivado de un análogo de exendina-4 tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, en donde un substituyente lipofílico opcionalmente por medio de un espaciador está fijado al grupo amino épsilon de la lisina. 46. Un método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el substituyente lipofilico tiene desde 8 hasta 40 átomos de carbono, preferentemente de 8 hasta 24 átomos de carbono, por ejemplo 12 a 18 átomos de carbono . 47. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-46, caracterizado porque el espaciador está presente y es seleccionado de un aminoácido, por ejemplo beta-Ala, L-Glu, o aminobutiroilo . 48. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, caracterizado porque el polipeptido es un péptido de insulina. 49. Un método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque' el péptido de insulina es la insulina humana, un análogo de insulina humana, un derivado de insulina humana o un derivado de análogo de insulina humana . 50. Un método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el péptido de insulina es la insulina humana. 51. Un método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el análogo de insulina humana es seleccionado del grupo que consiste de AspB2S-insulina humana, LysB26ProB29-insulina humana, LysB3GluB29-insulina humana, Gly^Arg1332-insulina humana, y des (B30) -insulina humana. 52. Un método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el derivado de la insulina humana o el derivado de un análogo de insulina humana tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, en donde un substituyente lipofílico opcionalmente por medio de un espaciador está fijado al grupo amino épsilon de la lisina. 53. Un método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el substituyente lipofílico tiene desde 8 hasta 40 átomos de carbono, preferentemente desde 8 hasta 24, por ejemplo 12-18. 54. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52-53, caracterizado porque el espaciador está presente y es seleccionado de un aminoácido, por ejemplo beta-Ala, L-Glu, aminobutiroilo . 55. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52-54, caracterizado porque el derivado de un análogo de la insulina humana es sB29-tetradecanoil des(B30) insulina humana o NSB29-litocoloil-y-glutamil des(B30) insulina humana. 56. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48-55, caracterizado porque X es la L-fenil alanina en la posición 1 en la cadena B del péptido de insulina. 57. Un producto del polipéptido, caracterizado porque es fabricado por un proceso que comprende las etapas de : a) purificar un polipéptido utilizando el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-56, y b) aislar el polipéptido para dar el producto de polipéptido resultante. 58. Una composición f rmacéutica, caracterizada porque es preparada por un proceso que comprende las etapas de : a) primero purificar un polipeptido o un precursor del mismo utilizando un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-56, b) luego secar el polipéptido, y c) finalmente mezclarlo con un excipiente farmacéuticamente aceptable.