JP6110312B2 - インスリンの精製 - Google Patents
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Description
a.タンパク質含有溶液をクロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、インスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料からインスリンペプチドを、最大でも8.5のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用したインスリンペプチドの少なくとも75質量%に相当するインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法に関する。
a.インスリン含有溶液をアニオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、目的のインスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料から目的のインスリンペプチドを、最大でも6.8のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用した目的のインスリンペプチドの少なくとも90質量%に相当する目的のインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法に関する。
a.インスリンペプチドと関連のある不純物との最適な分離を得るための二価または多価の金属イオンを使用することによって、ピークの形状を制御する方法であって、
二価の金属イオンが、インスリンペプチドの前側にあるピークの形状を確保するために添加されており、この場合、関連のある不純物は、インスリンペプチドの前に溶出する方法に関する。
a.タンパク質含有溶液をクロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、インスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料からインスリンペプチドを、最大でも8.5のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用したインスリンペプチドの少なくとも75質量%に相当するインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法が提供される。
a.インスリン含有溶液をアニオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、目的のインスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料から目的のインスリンペプチドを、最大でも6.8のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用した目的のインスリンペプチドの少なくとも90質量%に相当する目的のインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法が提供される。
a.インスリンペプチドと関連のある不純物との最適な分離を得るための二価または多価の金属イオンを使用することによって、ピークの形状を制御する方法であって、
二価の金属イオンが、インスリンペプチドの前側にあるピークの形状を確保するために添加されており、この場合、関連のある不純物は、インスリンペプチドの前に溶出する方法が提供される。
- 二価または多価の金属イオン(例えば、Zn2+)は、等温線を上方へ湾曲させようとする(dq/dcが増加しつつある。qは、固相材料に結合しているタンパク質の濃度であり、cは、溶液中のタンパク質の濃度である)。
- 樹脂上への充填の増加は、下方への湾曲を生じさせる(dq/dcが減少しつつある)。
- 等電点に近いpHでは、正味の電荷が小さく、タンパク質間の反発力は小さい。
- 等電点に近付くにつれて、タンパク質の溶解性は通常減少する。しかし、等電点付近では、自己会合により、溶解性の明らかな増加が生じ得る。
用語「タンパク質」は、ペプチド結合により接続される構成要素のアミノ酸残基の少なくとも10個から構成されるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを網羅することを意図する。構成要素のアミノ酸は、遺伝暗号がコードするアミノ酸の群に由来する場合があり、遺伝暗号がコードしない天然のアミノ酸である場合があり、合成のアミノ酸である場合がある。
P-2(1-35); Arg35Lys30(Nε-(ω-カルボキシノナ-デカノイル))GLP-2(1-35);およびArg30Lys34(Nε-(ω-カルボキシノナデカノイル))GLP-2(1-34)が挙げられる。
クロマトグラフィーによる方法ための出発材料は、目的のタンパク質、例として、それらのバリアントを含めて、インスリンペプチド、グルカゴン様ペプチドおよびエキセンディンから選択されるタンパク質(上記を参照されたい)を含む任意のタンパク質含有溶液であり得る。出発材料は、酵母発現系から直接得られる培地もしくは化学的合成から直接得られる培地であり得、または出発材料を、本発明による方法の前に、いくつかの精製または化学的改変のステップに付すことができる。
クロマトグラフィーによる方法の目的は、タンパク質含有溶液のその他の構成要素から、目的のタンパク質を分離すること、または目的のタンパク質を純度のより高い程度で得ること、または少なくとも、1つもしくは複数の不純物の存在を、目的のタンパク質に比して低下させることである。
本発明による方法の第1のステップでは、タンパク質含有溶液を、クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用する。
この方法は典型的には、全プロセスを中断することなく実施し、第2のステップでは、目的のタンパク質を、固相材料から溶離剤により溶出する。
現在好ましい一実施形態では、本発明は、インスリン含有溶液のタンパク質構成成分を分離するためのクロマトグラフィーによる方法を提供し、前記溶液は、亜鉛および二価の亜鉛イオンの存在下で、自己会合することおよび/または構造的に変化することが可能であるインスリンペプチドを含み、前記方法は、
a.インスリン含有溶液をアニオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、目的のインスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料から目的のインスリンペプチドを、最大でも6.8のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用した目的のインスリンペプチドの少なくとも90質量%に相当する目的のインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む。
a.タンパク質含有溶液をクロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、インスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料からインスリンペプチドを、最大でも8.5のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用したインスリンペプチドの少なくとも75質量%に相当するインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法。
-W-X-Y-Z
[式中、Wは、
- 側鎖中にカルボン酸基を有し、そのカルボン酸基のうちの1つを用いて、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってもしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成するα-アミノ酸残基、
- アミド結合を介して一緒になって連結された2、3もしくは4つのα-アミノ酸残基から構成され、アミド結合を介して、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖{Wのアミノ酸残基は、中性の側鎖を有するアミノ酸残基、および側鎖中にカルボン酸基を有する(したがって、Wが、側鎖中にカルボン酸基を有する少なくとも1つのアミノ酸残基を有する)アミノ酸残基の群から選択される}、または
- Xから、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基への共有結合
であり、
Xは、
a)Wが、アミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の鎖である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、W中のアミノ基とアミド結合が形成する、または
b)Wが、共有結合である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、親インスリンのB鎖中のN末端のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基とアミド結合が形成する、
- -CO-;
- -CH(COOH)CO-;
- -N(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-;または
- -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-
であり、
Yは、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2または3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を10〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- 式-(CH2)vC6H4(CH2)w-{式中、vおよびwが整数であるかまたはそれらのうちの1つがゼロであり、vとwとの和が、6〜30の範囲にある}の二価の炭化水素鎖
であり、
Zは、
- -COOH;
- -CO-Asp;
- -CO-Glu;
- -CO-Gly;
- -CO-Sar;
- -CH(COOH)2;
- -N(CH2COOH)2;
- -SO3H;または
- -PO3H;
である]
を有する、パラグラフ1から16のいずれかに記載の方法。
18.インスリンペプチドが、LysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンである、パラグラフ1から17のいずれかに記載の方法。
19.インスリンペプチドが、
式:
Insは、親インスリン部分であり、Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n-X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3-[CH2]n-Q5-[CH2]n-Zは、置換基であり、この場合、Insが、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基またはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と、置換基のQ1またはQ2中のCO基との間のアミド結合を介して、置換基に結合し、
それぞれのnは独立に、0、1、2、3、4、5または6であり、
Q1は、
- アミノ酸と側鎖中のカルボン酸とのアミノ酸アミド、または無電荷の側鎖を有するアミノ酸{このアミノ酸アミドまたはアミノ酸は、そのカルボン酸基を用いて、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってかまたはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成する}、あるいは
- アミド結合を介して一緒になって連結された、前記の2、3または4つのα-アミノ酸アミドまたはアミノ酸の残基から構成され、-アミド結合を介して-InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基またはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖、あるいは
- 結合
であり、
Q2は、
- -COCH(CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)COCH2N(CH2CONH2)
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2OCH2CONH-
- -CO-((CR5R6)1-6 -NH-CO)1-4-;
- -CO-((CR5R6)1-6 -CO-NH)1-4-、{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、または
- 結合
であり、
ただし、
- Q1またはQ2のうちの少なくとも1つは、結合ではなく、
- nが、0または1であり、X 1 が、結合であり、Q 3 が、(CH 2 CH 2 O) 2 -、(CH 2 CH 2 O) 3 -または(CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O)-である場合には、Q 2 は、-CO-(CH2)2-CO-NH-ではなく、
- Q1またはQ2中のアミンが、置換基の残りと結合を形成する場合には、アミンは、カルボニル基を介して、置換基の残りに結合しなければならず、
Q3、Q4およびQ5は相互に独立に、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2もしくは3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を4〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)-、
- -(CO-(CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、
- -CO-(CH2)0-3-Ar-(CH2)0-3-{式中、Arは、アリーレンもしくはヘテロアリーレンであり得、アリーレンもしくはヘテロアリーレンは、-CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2(式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る)からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得る}、
- (CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-もしくは(CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-、-(CH2OCH2)y-{式中、yは、1〜20である}、
- -CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2{式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る}からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得るアリーレンもしくはヘテロアリーレン、
- 式:
-(CH2)s-Y1-(Ar)v1-Y2-(CH2)W-Y3-(Ar)v2-Y4-(CH2)t-Y5-(Ar)v3-Y6-(CH2)Z-
{式中、Arは、上記に従って定義され、Y1〜Y6は相互に独立に、O、S、S=O、SO2もしくは結合であり得、s、w、tおよびzは相互に独立に、ゼロもしくは1〜10の整数であり、したがって、s、w、tおよびzの和は、4〜30の範囲に及び、v1、v2およびv3は相互に独立に、ゼロもしくは1であり得、ただし、Y1〜Y6は、相互に連結せず、構造-O-(CH2)1-O-は生じない}
の鎖、または
- 結合
であり得、
ただし、Q3〜Q5のうちの少なくとも1つは、結合でなく、
X1、X2およびX3は相互に独立に、
- O、
- -C=O、
- 結合、
- NCOR1{式中、R1は、H、-CH3または-(CH)1-6-CH3であり得る}、
-
であり、
ただし、
X1、X2およびX3は、Zに結合し得ず、
X1、X2およびX3がOである場合には、X1、X2およびX3は、Q3、Q4およびQ5中のOには直接結合せず、
Zは、-COOH、-CO-Asp、-CO-Glu、-CO-Gly、-CO-Sar、-CH(COOH)2、-N(CH2COOH)2、-SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-PO3H2、-テトラゾル-5-イルまたは-O-W1、
{式中、W1は、アリーレンまたはヘテロアリーレンであり、アリーレンまたはヘテロアリーレンは、テトラゾル-5-イル(tetrazo-5-lyl)、-COOH、-SO3H、-(CH2)1-6-SO3H、-(CH2)1-6-O-PO3H2、-CONR3R4または-SO2NR3R4(式中、R3およびR4は相互に独立に、H、-(CH2)1-6-SO3Hまたは-(CH2)1-6-O-PO3H2であり得る)からなる群から選択される1つまたは2つの基で置換され得、ただし、Zが、-O-W1である場合には、Q1は、存在しなければならない}
である]
を有するインスリン誘導体および任意のそのZn2+複合体である、パラグラフ1から16に記載の方法。
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-テトラデカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-トリデカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-β-アラニルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-L-アスパルチルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-ε-アミノヘキサノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-δ-アミノペンタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-10-(4-カルボキシフェノキシ)-デカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-4-[11-(4-カルボキシフェニル)ウンデカノイルアミノ]ブチリルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミルアミド)desB30ヒトインスリン、
ΝεB29-ω-カルボキシ-トリデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ウンデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-テトラデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-{4-[10-(4-カルボキシ-フェノキシ)-デカノイルアミノ]-ブチリル}desB30インスリン、
NεB29-{4-[(14-カルボキシ-テトラデカノイルアミノ)-メチル]-ベンゾイル}desB30インスリン、
NεB29-[16-(4-カルボキシ-フェノキシ)-ヘキサデカノイル]desB30インスリン、
NεB29-{4-[(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ベンゾイル]-desB30ヒトインスリンおよびNεB29-{4-[(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-メチル]-ベンゾイル}-desB30インスリンからなる群から選択される、パラグラフ1から16および19に記載の方法。
a.インスリン含有溶液をアニオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、目的のインスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料から目的のインスリンペプチドを、最大でも6.8のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用した目的のインスリンペプチドの少なくとも90質量%に相当する目的のインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法。
-W-X-Y-Z
[式中、Wは、
- 側鎖中にカルボン酸基を有し、そのカルボン酸基のうちの1つを用いて、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってもしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成するα-アミノ酸残基、
- アミド結合を介して一緒になって連結された2、3もしくは4つのα-アミノ酸残基から構成され、アミド結合を介して、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖{Wのアミノ酸残基は、中性の側鎖を有するアミノ酸残基、および側鎖中にカルボン酸基を有する(したがって、Wが、側鎖中にカルボン酸基を有する少なくとも1つのアミノ酸残基を有する)アミノ酸残基の群から選択される}、または
- Xから、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基への共有結合
であり、
Xは、
a)Wが、アミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の鎖である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、W中のアミノ基とアミド結合を形成する、または
b)Wが、共有結合である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、親インスリンのB鎖中のN末端のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基とアミド結合を形成する、
- -CO-;
- -CH(COOH)CO-;
- -N(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-;または
- -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-
であり、
Yは、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2または3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を10〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- 式-(CH2)vC6H4(CH2)w-{式中、vおよびwが整数であるかまたはそれらのうちの1つがゼロであり、したがって、vとwとの和が、6〜30の範囲にある}の二価の炭化水素鎖
であり、
Zは、
- -COOH;
- -CO-Asp;
- -CO-Glu;
- -CO-Gly;
- -CO-Sar;
- -CH(COOH)2;
- -N(CH2COOH)2;
- -SO3H;または
- -PO3H;
である]
を有する、パラグラフ21から35のいずれかに記載の方法。
a.インスリン含有溶液をアニオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、目的のインスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料から目的のインスリンペプチドを、6.4〜6.8の範囲のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用したLysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンの少なくとも90質量%に相当するLysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンのプールを収集するステップと
を含む方法。
式:
Insは、親インスリン部分であり、Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n-X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3-[CH2]n-Q5-[CH2]n-Zは、置換基であり、この場合、Insが、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基またはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と、置換基のQ1またはQ2中のCO基との間のアミド結合を介して、置換基に結合し、
それぞれのnは独立に、0、1、2、3、4、5または6であり、
Q1は、
- アミノ酸と側鎖中のカルボン酸とのアミノ酸アミド、または無電荷の側鎖を有するアミノ酸{このアミノ酸アミドまたはアミノ酸は、そのカルボン酸基を用いて、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってかまたはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成する}、あるいは
- アミド結合を介して一緒になって連結された、前記の2、3または4つのα-アミノ酸アミドまたはアミノ酸の残基から構成され、-アミド結合を介して-InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基にかまたはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖、あるいは
- 結合
であり、
Q2は、
- -COCH(CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)COCH2N(CH2CONH2)
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2OCH2CONH-
- -CO-((CR5R6)1-6 -NH-CO)1-4-;
- -CO-((CR5R6)1-6 -CO-NH)1-4-、{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、または
- 結合
であり、
ただし、
- Q1またはQ2のうちの少なくとも1つは、結合ではなく、
- nが、0または1であり、X 1 が、結合であり、Q 3 が、(CH 2 CH 2 O) 2 -、(CH 2 CH 2 O) 3 -または(CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O)-である場合には、Q 2 は、-CO-(CH2)2-CO-NH-ではなく、
- Q1またはQ2中のアミンが、置換基の残りと結合を形成する場合には、アミンは、カルボニル基を介して、置換基の残りに結合しなければならず、
Q3、Q4およびQ5は相互に独立に、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2もしくは3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を4〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)-、
- -(CO-(CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、
- -CO-(CH2)0-3-Ar-(CH2)0-3-{式中、Arは、アリーレンもしくはヘテロアリーレンであり得、アリーレンもしくはヘテロアリーレンは、-CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2(式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る)からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得る}、
- (CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-もしくは(CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-、-(CH2OCH2)y-{式中、yは、1〜20である}、
- -CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2{式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る}からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得るアリーレンもしくはヘテロアリーレン、
- 式:
-(CH2)s-Y1-(Ar)v1-Y2-(CH2)W-Y3-(Ar)v2-Y4-(CH2)t-Y5-(Ar)v3-Y6-(CH2)Z-
{式中、Arは、上記に従って定義され、Y1〜Y6は相互に独立に、O、S、S=O、SO2もしくは結合であり得、s、w、tおよびzは相互に独立に、ゼロもしくは1〜10の整数であり、したがって、s、w、tおよびzの和は、4〜30の範囲に及び、v1、v2およびv3は相互に独立に、ゼロもしくは1であり得、ただし、Y1〜Y6は、相互に連結せず、構造-O-(CH2)1-O-は生じない}
の鎖、または
- 結合
であり得、
ただし、Q3〜Q5のうちの少なくとも1つは、結合でなく、
X1、X2およびX3は相互に独立に、
- O、
- -C=O、
- 結合、
- NCOR1{式中、R1は、H、-CH3または-(CH)1-6-CH3であり得る}、または
-
であり、
ただし、
X1、X2およびX3は、Zに結合し得ず、
X1、X2およびX3がOである場合には、X1、X2およびX3は、Q3、Q4およびQ5中のOには直接結合せず、
Zは、-COOH、-CO-Asp、-CO-Glu、-CO-Gly、-CO-Sar、-CH(COOH)2、-N(CH2COOH)2、-SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-PO3H2、-テトラゾル-5-イルまたは-O-W1、
{式中、W1は、アリーレンまたはヘテロアリーレンであり、アリーレンまたはヘテロアリーレンは、テトラゾル-5-イル、-COOH、-SO3H、-(CH2)1-6-SO3H、-(CH2)1-6-O-PO3H2、-CONR3R4または-SO2NR3R4(式中、R3およびR4は相互に独立に、H、-(CH2)1-6-SO3Hまたは-(CH2)1-6-O-PO3H2であり得る)からなる群から選択される1つまたは2つの基で置換され得、ただし、Zが、-O-W1である場合には、Q1は、存在しなければならない}
である]
を有するインスリン誘導体および任意のそのZn2+複合体である、パラグラフ21から35に記載の方法。
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-テトラデカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-トリデカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-β-アラニルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-L-アスパルチルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-ε-アミノヘキサノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-δ-アミノペンタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-10-(4-カルボキシフェノキシ)-デカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-4-[11-(4-カルボキシフェニル)ウンデカノイルアミノ]ブチリルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミルアミド)desB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-トリデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ウンデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-テトラデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-{4-[10-(4-カルボキシ-フェノキシ)-デカノイルアミノ]-ブチリル}desB30インスリン、
NεB29-{4-[(14-カルボキシ-テトラデカノイルアミノ)-メチル]-ベンゾイル}desB30インスリン、
NεB29-[16-(4-カルボキシ-フェノキシ)-ヘキサデカノイル]desB30インスリン、
NεB29-{4-[(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ベンゾイル]-desB30ヒトインスリンおよびNεB29-{4-[(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-メチル]-ベンゾイル}-desB30インスリンからなる群から選択される、パラグラフ21〜35および40に記載の方法。
a.インスリンペプチドと関連のある不純物との最適な分離を得るための二価または多価の金属イオンを使用することによって、ピークの形状を制御する方法であって、
二価の金属イオンが、インスリンペプチドのフロンティングピークの形状を確保するために添加されており、この場合、関連のある不純物は、インスリンペプチドの前に溶出する方法。
-W-X-Y-Z
[式中、Wは、
- 側鎖中にカルボン酸基を有し、そのカルボン酸基のうちの1つを用いて、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってもしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成するα-アミノ酸残基、
- アミド結合を介して一緒になって連結された2、3もしくは4つのα-アミノ酸残基から構成され、アミド結合を介して、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖{Wのアミノ酸残基は、中性の側鎖を有するアミノ酸残基、および側鎖中にカルボン酸基を有する(したがって、Wが、側鎖中にカルボン酸基を有する少なくとも1つのアミノ酸残基を有する)アミノ酸残基の群から選択される}、または
- Xから、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基への共有結合
であり、
Xは、
a)Wが、アミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の鎖である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、W中のアミノ基とアミド結合を形成する、または
b)Wが、共有結合である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、親インスリンのB鎖中のN末端のα-アミノ基ともしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基とアミド結合を形成する、
- -CO-;
- -CH(COOH)CO-;
- -N(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-;または
- -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-
であり、
Yは、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2または3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を10〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- 式-(CH2)vC6H4(CH2)w-{式中、vおよびwが整数であるかまたはそれらのうちの1つがゼロであり、したがって、vとwとの和が、6〜30の範囲にある}の二価の炭化水素鎖
であり、
Zは、
- -COOH;
- -CO-Asp;
- -CO-Glu;
- -CO-Gly;
- -CO-Sar;
- -CH(COOH)2;
- -N(CH2COOH)2;
- -SO3H;または
- -PO3H;
である]
を有する、パラグラフ42から56のいずれか1つに記載の方法。
式:
Insは、親インスリン部分であり、Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n-X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3-[CH2]n-Q5-[CH2]n-Zは、置換基であり、この場合、Insが、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基またはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と、置換基のQ1またはQ2中のCO基との間のアミド結合を介して、置換基に結合し、
それぞれのnは独立に、0、1、2、3、4、5または6であり、
Q1は、
- アミノ酸と側鎖中のカルボン酸とのアミノ酸アミド、または無電荷の側鎖を有するアミノ酸{このアミノ酸アミドまたはアミノ酸は、そのカルボン酸基を用いて、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってかまたはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成する}、あるいは
- アミド結合を介して一緒になって連結された、前記の2、3または4つのα-アミノ酸アミドまたはアミノ酸の残基から構成され、-アミド結合を介して-InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基またはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖、あるいは
- 結合
であり、
Q2は、
- -COCH(CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)COCH2N(CH2CONH2)
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2OCH2CONH-
- -CO-((CR5R6)1-6 -NH-CO)1-4-;
- -CO-((CR5R6)1-6 -CO-NH)1-4-、{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、または
- 結合
であり、
ただし、
- Q1またはQ2のうちの少なくとも1つは、結合ではなく、
- nが、0または1であり、X 1 が、結合であり、Q 3 が、(CH 2 CH 2 O) 2 -、(CH 2 CH 2 O) 3 -または(CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O)-である場合には、Q 2 は、-CO-(CH2)2-CO-NH-ではなく、
- Q1またはQ2中のアミンが、置換基の残りと結合を形成する場合には、アミンは、カルボニル基を介して、置換基の残りに結合しなければならず、
Q3、Q4およびQ5は相互に独立に、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2もしくは3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を4〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)-、
- -(CO-(CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、
- -CO-(CH2)0-3-Ar-(CH2)0-3-{式中、Arは、アリーレンもしくはヘテロアリーレンであり得、アリーレンもしくはヘテロアリーレンは、-CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2(式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る)からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得る}、
- (CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-もしくは(CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-、-(CH2OCH2)y-{式中、yは、1〜20である}、
- -CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2{式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る}からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得るアリーレンもしくはヘテロアリーレン、
- 式:
-(CH2)s-Y1-(Ar)v1-Y2-(CH2)W-Y3-(Ar)v2-Y4-(CH2)t-Y5-(Ar)v3-Y6-(CH2)Z-
{式中、Arは、上記に従って定義され、Y1〜Y6は相互に独立に、O、S、S=O、SO2もしくは結合であり得、s、w、tおよびzは相互に独立に、ゼロもしくは1〜10の整数であり、したがって、s、w、tおよびzの和は、4〜30の範囲に及び、v1、v2およびv3は相互に独立に、ゼロもしくは1であり得、ただし、Y1〜Y6は、相互に連結せず、構造-O-(CH2)1-O-は生じない}
の鎖、または
- 結合
であり得、
ただし、Q3〜Q5のうちの少なくとも1つは、結合でなく、
X1、X2およびX3は相互に独立に、
- O、
- -C=O、
- 結合、
- NCOR1{式中、R1は、H、-CH3または-(CH)1-6-CH3であり得る}、
-
であり、
ただし、
X1、X2およびX3は、Zに結合し得ず、
X1、X2およびX3がOである場合には、X1、X2およびX3は、Q3、Q4およびQ5中のOには直接結合せず、
Zは、-COOH、-CO-Asp、-CO-Glu、-CO-Gly、-CO-Sar、-CH(COOH)2、-N(CH2COOH)2、-SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-PO3H2、-テトラゾル-5-イルまたは-O-W1、
{式中、W1は、アリーレンまたはヘテロアリーレンであり、アリーレンまたはヘテロアリーレンは、テトラゾル-5-イル、-COOH、-SO3H、-(CH2)1-6-SO3H、-(CH2)1-6-O-PO3H2、-CONR3R4または-SO2NR3R4(式中、R3およびR4は相互に独立に、H、-(CH2)1-6-SO3Hまたは-(CH2)1-6-O-PO3H2であり得る)からなる群から選択される1つまたは2つの基で置換され得、ただし、Zが、-O-W1である場合には、Q1は、存在しなければならない}
である]
を有するインスリン誘導体および任意のそのZn2+複合体である、パラグラフ42から56に記載の方法。
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-テトラデカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-トリデカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-β-アラニルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-L-アスパルチルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-ε-アミノヘキサノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-δ-アミノペンタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-10-(4-カルボキシフェノキシ)-デカノイル-γ-L-グルタミルアミドdesB30ヒトインスリン、
NεB29-4-[11-(4-カルボキシフェニル)ウンデカノイルアミノ]ブチリルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミルアミド)desB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-トリデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-ウンデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-ω-カルボキシ-テトラデカノイル-γ-アミノ-ブタノイルdesB30ヒトインスリン、
NεB29-{4-[10-(4-カルボキシ-フェノキシ)-デカノイルアミノ]-ブチリル}desB30インスリン、
NεB29-{4-[(14-カルボキシ-テトラデカノイルアミノ)-メチル]-ベンゾイル}desB30インスリン、
NεB29-[16-(4-カルボキシ-フェノキシ)-ヘキサデカノイル]desB30インスリン、
NεB29-{4-[(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ベンゾイル]-desB30ヒトインスリンおよびNεB29-{4-[(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-メチル]-ベンゾイル}-desB30インスリンからなる群から選択される、パラグラフ42から56および59に記載の方法。
インスリンペプチドの自己会合する能力は、SEC法により解析することができる。解析:Superose 6 PCカラム(0.32×30cm)上の分子ふるいクロマトグラフィー(SEC)により、2mMフェノールを場合により添加した等張10mM tris緩衝生理食塩水を37℃およびpH7.3で使用する;注入体積:20μL;流速:0.05mL/分;ならびに運転時間:130分。第1の基準:ブルーデキストラン(≫5メガダルトン、KAV 0.0)、サイログロブリン(669キロダルトン、KAV 0.28)、フェリチン(440キロダルトン、KAV 0.39)、卵白アルブミン(44.5キロダルトン、KAV 0.56)、リボヌクレアーゼ(13.7キロダルトン、KAV 0.69)、ならびに第2の基準:アルブミン(66キロダルトン、KAV 0.53)、Co(III)インスリン-六量体(35キロダルトン、KAV 0.61)、および単量体インスリン×2(6キロダルトン、KAV 0.73)。ブルーデキストランの保持時間は、17.9分(t0)であり、カラムなしの場合、0.74分(td)であり、アルブミン(HSA)の保持時間は、約34.1分であった。
KAV=(t-to)/(V/f+td-t0)、式中
t:保持時間(分)
t0:ブルーデキストランの保持時間(排除限界)
td;カラムなしの場合のブルーデキストランの保持時間(空体積)
Vt:総カラム体積(mL)
f:流速(mL/分)
データフォーマット:
KAVピーク1 x.xx
面積ピーク1(%) xxx
KAVピーク2 x.xx
面積ピーク2(%) xxx
インスリンペプチドのヒトインスリン受容体に対する親和性を、SPAアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより決定した。SPA-PVT抗体結合ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号PRNQ0017)を、25mlの結合用緩衝液(100mM HEPES、pH7.8;100mM塩化ナトリウム、10mM MgS04、0.025%Tween-20)と混合した。単一のPackard Optiplate(Packard、番号6005190)のための試薬ミックスは、2.4μlの1:5000希釈、精製組換えヒトインスリン受容体-エクソン11;5000cpm/試薬ミックス100μlに相当する量のA14Tyr[125I]-ヒトインスリンのストック溶液;12μlのF12抗体の1:1000希釈物;3mlのSPA-ビーズ;および結合用緩衝液から構成され、計12mlをなす。次いで、計100μlを添加し、希釈系列を、適切な試料から作製する。次いで、希釈系列に、100μlの試薬ミックスを添加し、試料を穏やかに振とうしながら16時間インキュベートした。次いで、相を、1分間の遠心分離により分離し、プレートを、Topcounter中で計数した。GraphPad Prism2.01(GraphPad Software、San Diego、CA)において非線形回帰アルゴリズムを使用して、結合データを適合させた。
Claims (13)
- タンパク質含有溶液のタンパク質構成成分を分離するためのクロマトグラフィーによる方法であって、前記溶液が、インスリンペプチド、1つまたは複数の二価または多価の金属イオン、および不純物を含み、前記インスリンペプチドが、二価または多価の金属イオンの存在下で、自己会合することおよび/または構造的に変化することが可能であり、前記方法が、
a.タンパク質含有溶液をイオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、インスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料からインスリンペプチドを、最大でも6.8のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用したインスリンペプチドの少なくとも75質量%に相当するインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法。 - インスリン含有溶液のタンパク質構成成分を分離するためのクロマトグラフィーによる方法であって、前記溶液が、亜鉛および二価の亜鉛イオンの存在下で、自己会合することおよび/または構造的に変化することが可能であるインスリンペプチドならびに不純物を含み、前記方法が、
a.インスリン含有溶液をアニオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、目的のインスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料から目的のインスリンペプチドを、最大でも6.8のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用した目的のインスリンペプチドの少なくとも90質量%に相当する目的のインスリンペプチドのプールを収集するステップと
を含む方法。 - 二価の金属イオンが、Zn2+であり、溶液中の亜鉛イオンの濃度が、0.01〜200mMの範囲である、請求項1または2に記載の方法。
- 亜鉛イオンとインスリンペプチドとの電荷当量の比が、0.1:1〜50:1である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)において収集したインスリンペプチドのプールが、ステップ(a)においてカラムに適用したインスリンペプチドの少なくとも91質量%、または少なくとも92質量%、または少なくとも93質量%、または少なくとも94質量%、または少なくとも95質量%、または少なくとも96質量%に相当する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- インスリンペプチドが、天然に存在するインスリンまたはその類似体であるインスリン誘導体およびそのZn2+複合体から選択され、
前記類似体が、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基または親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に結合された側鎖を有し、
前記側鎖が、一般式:
-W-X-Y-Z
[式中、Wは、
- 側鎖中にカルボン酸基を有し、そのカルボン酸基のうちの1つを用いて、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってもしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成するα-アミノ酸残基、
- アミド結合を介して一緒になって連結された2、3もしくは4つのα-アミノ酸残基から構成され、アミド結合を介して、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖{Wのアミノ酸残基は、中性の側鎖を有するアミノ酸残基、および側鎖中にカルボン酸基を有する(したがって、Wが、側鎖中にカルボン酸基を有する少なくとも1つのアミノ酸残基を有する)アミノ酸残基の群から選択される}、または
- Xから、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基への共有結合であり、
Xは、
a)Wが、アミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の鎖である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、W中のアミノ基とアミド結合を形成する、または
b)Wが、共有結合である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、親インスリンのB鎖中のN末端のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基とアミド結合を形成する、
- -CO-;
- -CH(COOH)CO-;
- -N(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-;または
- -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-
であり、
Yは、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2または3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を10〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- 式-(CH2)vC6H4(CH2)w-{式中、vおよびwが整数であるかまたはそれらのうちの1つがゼロであり、vとwとの和が、6〜30の範囲にある}の二価の炭化水素鎖
であり、
Zは、
- -COOH;
- -CO-Asp;
- -CO-Glu;
- -CO-Gly;
- -CO-Sar;
- -CH(COOH)2;
- -N(CH2COOH)2;
- -SO3H;または
- -PO3H;
である]
を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。 - インスリンペプチドが、LysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- インスリン含有溶液のタンパク質構成成分を分離するための請求項1から7のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーによる方法であって、前記溶液が、LysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンおよび二価の亜鉛イオンを含み、前記方法が、
a.インスリン含有溶液をアニオン交換クロマトグラフィーの固相材料のカラムに適用するステップであって、目的のインスリンペプチドの充填が、1リットルのカラム体積当たり少なくとも6.0g(g/Lcv)であるステップと、
b.前記固相材料から目的のインスリンペプチドを、6.4〜6.8の範囲のpHを有する溶離剤により溶出し、ステップ(a)においてカラムに適用したLysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンの少なくとも90質量%に相当するLysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンのプールを収集するステップと
を含む方法。 - エタノールおよびトリエタノールアミンを含む洗浄用緩衝液を使用する洗浄ステップが、ステップ(a)の後かつ溶出ステップ(b)の前に含まれる、請求項1、2または8に記載の方法。
- インスリンペプチドが、
式:
Insは、親インスリン部分であり、Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n-X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3-[CH2]n-Q5-[CH2]n-Zは、置換基であり、この場合、Insが、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基またはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と、置換基のQ1またはQ2中のCO基との間のアミド結合を介して、置換基に結合しており、
それぞれのnは独立に、0、1、2、3、4、5または6であり、
Q1は、
- アミノ酸と側鎖中のカルボン酸とのアミノ酸アミド、または無電荷の側鎖を有するアミノ酸{このアミノ酸アミドまたはアミノ酸は、そのカルボン酸基を用いて、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってまたはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成する}、あるいは
- アミド結合を介して一緒になって連結された、前記の2、3または4つのα-アミノ酸アミドまたはアミノ酸の残基から構成され、アミド結合を介して、InsのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基またはInsのA鎖もしくはB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖、あるいは
- 結合
であり、
Q2は、
- -COCH(CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CONH2)COCH2N(CH2CONH2)
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-COCH2CH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2N(CH2CH2CONH2)-
- -COCH2CH2N(CH2CONH2)-
- -COCH2OCH2CONH-
- -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)1-4-;
- -CO-((CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-、{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、または
- 結合
であり、
ただし、
- Q1またはQ2のうちの少なくとも1つは、結合ではなく、
- nが0または1であり、X1が結合であり、Q3が(CH2CH2O)2-、(CH2CH2O)3-または(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)-である場合には、Q2は、-CO-(CH2)2-CO-NH-ではなく、
- Q1またはQ2中のアミンが、置換基の残りと結合を形成する場合には、アミンは、カルボニル基を介して、置換基の残りに結合しなければならず、
Q3、Q4およびQ5は相互に独立に、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2もしくは3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を4〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- -CO-((CR5R6)1-6-NH-CO)-、
- -(CO-(CR5R6)1-6-CO-NH)1-4-{式中、R5は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3もしくは-CONH2であり得、R6は独立に、H、-CH3、-(CH2)1-6CH3であり得る}、
- -CO-(CH2)0-3-Ar-(CH2)0-3-{式中、Arは、アリーレンもしくはヘテロアリーレンであり得、アリーレンもしくはヘテロアリーレンは、-CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2(式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る)からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得る}、
- (CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2CH2CH2O)y-、(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-もしくは(CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)y-、-(CH2OCH2)y-{式中、yは、1〜20である}、
- -CH3、-(CH)1-6-CH3、-CONR1R2もしくは-SO2NR1R2{式中、R1およびR2は相互に独立に、H、-CH3もしくは-(CH)1-6-CH3であり得る}からなる群から選択される1つもしくは2つの基で置換され得るアリーレンもしくはヘテロアリーレン、
-式
-(CH2)s-Y1-(Ar)v1-Y2-(CH2)W-Y3-(Ar)v2-Y4-(CH2)t-Y5-(Ar)v3-Y6-(CH2)Z-
{式中、Arは、上記の通り定義され、Y1〜Y6は相互に独立に、O、S、S=O、SO2もしくは結合であり得、s、w、tおよびzは相互に独立に、ゼロもしくは1〜10の整数であり、s、w、tおよびzの和は、4〜30の範囲に及び、v1、v2およびv3は相互に独立に、ゼロもしくは1であり得、ただし、Y1〜Y6は、相互に連結せず、構造-O-(CH2)1-O-は生じない}
の鎖、または
- 結合
であり得、
ただし、Q3〜Q5のうちの少なくとも1つは、結合でなく、
X1、X2およびX3は相互に独立に、
- O、
- -C=O、
- 結合、
- NCOR1{式中、R1は、H、-CH3または-(CH)1-6-CH3であり得る}、または、
-
ただし、
X1、X2およびX3は、Zに結合し得ず、
X1、X2およびX3がOである場合には、X1、X2およびX3は、Q3、Q4およびQ5中のOには直接結合せず、
Zは、-COOH、-CO-Asp、-CO-Glu、-CO-Gly、-CO-Sar、-CH(COOH)2、-N(CH2COOH)2、SO3H、
-OSO3H、-OPO3H2、-PO3H2、-テトラゾル-5-イルまたは-O-W1、
{式中、W1は、アリーレンまたはヘテロアリーレンであり、アリーレンまたはヘテロアリーレンは、テトラゾル-5-イル、-COOH、-SO3H、-(CH2)1-6-SO3H、-(CH2)1-6-O-PO3H2、-CONR3R4または-SO2NR3R4(式中、R3およびR4は相互に独立に、H、-(CH2)1-6-SO3Hまたは-(CH2)1-6-O-PO3H2であり得る)からなる群から選択される1つまたは2つの基で置換され得、
ただし、Zが、-O-W1である場合には、Q1は、存在しなければならない}
である]
を有するインスリン誘導体
およびそのZn2+複合体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。 - 二価または多価の金属イオンの存在下で、自己会合することおよび/または構造的に変化することが可能であるインスリンペプチドのイオン交換クロマトグラフィーにおいて、インスリンペプチドと関連のある不純物との最適な分離を得るための二価または多価の金属イオンを使用することによって、ピークの形状を制御する方法であって、
二価の金属イオンが、インスリンペプチドのフロンティングピークの形状を確保するために添加されており、この場合、関連のある不純物は、インスリンペプチドの前に溶出し、
イオン交換クロマトグラフィーが、最大でも6.8のpHを有する溶離剤を使用して実施される、方法。 - インスリンペプチドが、天然に存在するインスリンまたはその類似体であるインスリン誘導体およびそのZn2+複合体から選択され、
前記類似体が、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基または親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に結合した側鎖を有し、
前記側鎖が、一般式:
-W-X-Y-Z
[式中、Wは、
- 側鎖中にカルボン酸基を有し、そのカルボン酸基のうちの1つを用いて、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基と一緒になってもしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基と一緒になって、アミド基を形成するα-アミノ酸残基、
- アミド結合を介して一緒になって連結された2、3もしくは4つのα-アミノ酸残基から構成され、アミド結合を介して、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基に連結される鎖{Wのアミノ酸残基は、中性の側鎖を有するアミノ酸残基、および側鎖中にカルボン酸基を有する(したがって、Wが、側鎖中にカルボン酸基を有する少なくとも1つのアミノ酸残基を有する)アミノ酸残基の群から選択される}、または
- Xから、親インスリンのB鎖のN末端のアミノ酸残基のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基への共有結合
であり、
Xは、
a)Wが、アミノ酸残基もしくはアミノ酸残基の鎖である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、W中のアミノ基とアミド結合を形成する、または
b)Wが、共有結合である場合、下線を引いたカルボニル炭素からの結合を介して、親インスリンのB鎖中のN末端のα-アミノ基もしくは親インスリンのB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基とアミド結合を形成する、
- -CO-;
- -CH(COOH)CO-;
- -N(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2 CO-;
- -NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-;
- -N(CH2CH2COOH)CH2 CO-;または
- -N(CH2COOH)CH2CH2 CO-
であり、
Yは、
- -(CH2)m-{式中、mは、6〜32の範囲の整数である}、
- 1、2または3つの-CH=CH-基および鎖中の炭素原子の総数を10〜32の範囲になすのに十分な数の-CH2-基を含む二価の炭化水素鎖、
- 式-(CH2)vC6H4(CH2)w-{式中、vおよびwが整数であるかまたはそれらのうちの1つがゼロであり、vとwとの和が、6〜30の範囲にある}の二価の炭化水素鎖
であり、
Zは、
- -COOH;
- -CO-Asp;
- -CO-Glu;
- -CO-Gly;
- -CO-Sar;
- -CH(COOH)2;
- -N(CH2COOH)2;
- -SO3H;または
- -PO3H;
である]
を有する、請求項11に記載の方法。 - インスリンペプチドが、LysB29(Nε-ヘキサデカンジオイル-γ-Glu)des(B30)ヒトインスリンである、請求項11または12に記載の方法。
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