JP2002511484A - Ｃａ＋＋を含有する溶出液を用いたタンパク質の新規な分離方法 - Google Patents

Ｃａ＋＋を含有する溶出液を用いたタンパク質の新規な分離方法

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JP2002511484A JP2000543490A JP2000543490A JP2002511484A JP 2002511484 A JP2002511484 A JP 2002511484A JP 2000543490 A JP2000543490 A JP 2000543490A JP 2000543490 A JP2000543490 A JP 2000543490A JP 2002511484 A JP2002511484 A JP 2002511484A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、グリコシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質を含有する溶液を、Cu++含有溶出液を用いたクロマトグラフィーにかけることにより、非グリコシル化タンパク質からグリコシル化タンパク質をクロマトグラフィーで分離する方法に関する。この方法を用いることにより、非グリコシル化タンパク質を含有し且つ実質的にグリコシル化タンパク質を含まない画分が得られる。この方法は、インスリンのような医薬工業において使用されるタンパク質の分離に適用される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、グリコシル化されたタンパク質またはタンパク質前駆体を、Ca++含
有溶出液を用いて、グリコシル化されていないタンパク質またはタンパク質前駆
体からクロマトグラフィーで分離する方法に関する。
【０００２】
【背景および発明の説明】
タンパク質またはタンパク質前駆体の製造において、グリコシル化タンパク質
を非グリコシル化タンパク質から分離することは独立した研究分野をなしている
。本発明の工業的意味は、タンパク質精製の最適化に関するものである。最適化
された精製の目的は、グリコシル化タンパク質を実質的に含まない非グリコシル
化タンパク質からなり、商業的に使用されるべき最終生成物を得ることである。
【０００３】 タンパク質またはタンパク質前駆体は、酵母発現系を起源とするものであって
もよい。高発現レベルとグリコシル化タンパク質前駆体の増加との間の相関が観
察されている。その結果、グリコシル化タンパク質から非グリコシル化タンパク
質を分離するためのより効率的な方法の必要性が益々明らかになってきている。
【０００４】 酵母発現系において、酵母微生物は、細胞内で合成されたタンパク質またはタ
ンパク質前駆体を産生する。酵母ホスト微生物は、所望のタンパク質をコードす
るDNAを有する発現媒体によって形質転換される。そのプロセスは、形質転換さ
れた酵母ホスト微生物の培養体を調製すること、該培養体を増殖させること、お
よびその培地から前記タンパク質を回収することを包含する。
【０００５】 所望のタンパク質を回収する従来技術は、塩を含有する溶出液が関与するイオ
ン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーのプロセスを用いた、複
数の精製工程を含んでいる。逆送高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）の方
法を使用することにより、非グリコシル化タンパク質をグリコシル化タンパク質
から分離する方法を実施することができる。試験サンプルの溶出のために使用さ
れる溶出液は、好ましくは、KClのような塩を含有する有機溶媒である。従来技
術では種々の塩が有機溶媒に適用されているが、Ca++含有溶出液の効果は開示さ
れていない。
【０００６】 本発明の内容において、溶出液は、溶出に使用される緩衝液と同義である。本
発明は、Ca++含有溶出液を使用することにより、所望のタンパク質の改善された
精製を提供する。
【０００７】
【発明の概要】
本発明は、非グリコシル化タンパク質からグリコシル化タンパク質を分離する
改善された方法を提供する。従って、本発明は、グリコシル化タンパク質および
非グリコシル化タンパク質を含有する溶液を、Cu++含有溶出液を用いたRP-HPLC（
逆送高速液体クロマトグラフィー）にかけ、非グリコシル化タンパク質を含有す
る画分を得ることにより、非グリコシル化タンパク質から実質的にグリコシル化
タンパク質を含まないグリコシル化タンパク質を分離する方法に関する。
【０００８】 本発明において、タンパク質の用語は、全てのタンパク質またはタンパク質前
駆体を意味し、またグリコシル化タンパク質の用語は、グリコシル化されたタン
パク質またはタンパク質前駆体を意味する。好ましい実施例において、該タンパ
ク質はインスリン、またはその類縁体もしくは前駆体である。
【０００９】 本発明のもう一つの目的は、本発明による方法を用いることにより得られる、
グリコシル化タンパク質を実質的に含まない非グリコシル化タンパク質を含有す
る画分である。
【００１０】
【発明の詳細な記述】
タンパク質もしくはタンパク質前駆体およびその類縁体は、酵母発現系から生
じる可能性がある。タンパク質もしくはタンパク質前駆体の製造プロセスにおい
て、クロマトグラフィー精製の使用が広く行われている。タンパク質またはタン
パク質前駆体は、化学修飾、ならびにRP-HPLC、疎水性物質相互作用クロマトグ
ラフィーおよびイオン交換のような一連のクロマトグラフィー精製工程を受ける
ことが多い。本発明は、非グリコシル化タンパク質からのグリコシル化タンパク
質の分離におけるクロマトグラフィーの使用が特にうまく行くことが証明された
精製工程に関する。このプロセスは、グリコシル化タンパク質および非グリコシ
ル化タンパク質を含有する溶液を、Ca++含有溶出液を使用するクロマトグラフィ
ーに掛けることにより、グリコシル化タンパク質を実質的に含まない非グリコシ
ル化タンパク質含有画分を得る工程を具備する。
【００１１】 カラムクロマトグラフィーを使用するタンパク質精製の原理は、分離すべきタ
ンパク質の静止相および移動相の間での平衡の差に基づいている。静止相および
移動相の適切な組合せを用いることにより、タンパク質は異なった間隔でカラム
から出るであろう。
【００１２】 クロマトグラフィー法は如何なるカラムクロマトグラフィーであってもよく、
好ましくは、RP-HPLCまたは疎水性物質相互作用クロマトグラフィーである。
【００１３】 本発明における利点は、非グリコシル化タンパク質画分の増大した純度である
。グリコシル化タンパク質の画分は、モノグリコシル化タンパク質およびポリグ
リコシル化タンパク質からなっていてもよい。本発明は、モノグリコシル化タン
パク質およびポリグリコシル化タンパク質のようなグリコシル化タンパク質の、
非グリコシル化タンパク質からの分離を改善するための手段を提供する。
【００１４】 本発明のもう一つの側面は、グリコシル化タンパク質を含み且つ実質的に非グ
リコシル化タンパク質を含まない追加のフラクションを得ることである。
【００１５】 出発材料の組成に応じて、グリコシル化タンパク質はモノグリコシル化タンパ
ク質であってもよく、グリコシル化タンパク質の少なくとも一部はジグリコシル
化されていてもよく、或いはグリコシル化タンパク質の少なくとも一部はポリグ
リコシル化されていてもよい。
【００１６】 Ca++含有溶出液を使用しない他のクロマトグラフィー法に比較して、本発明は
略50％のカラム負荷の増大に起因した、より高い生産性の利点を有する。精製の
効率は、リガンドおよびマトリックス粒子孔寸法によって影響を受ける。この粒
子孔寸法は、精製すべきタンパク質の性質に応じて変化する可能性がある。タン
パク質がインスリンまたはその類縁体であれば、最適なカラムマトリックスは20
0オングストロームであり、出発物質が下記の所定の組成であるときは、該カラ
ムは150〜250 mg/cm2まで負荷してもよく、また使用するカラムの長さは下記の
通りである。
【００１７】 カラム温度は10〜30℃、好ましくは18〜25℃である。好ましい温度範囲よりも
低い如何なる温度も、プロセスの速度を低下させることによって、精製費用の増
大を生じる可能性がある。
【００１８】 従来技術に記載されている非グリコシル化タンパク質の精製方法を使用するこ
とによっては、このような高生産性を維持しながら、グリコシル化タンパク質を
実質的に含まない画分を達成することは可能ではなかった。しかし、本発明の導
入によって、精製プロセスは顕著に改善され、非グリコシル化タンパク質を含有
する最終画分は実質的にグリコシル化タンパク質を含んでいない。
【００１９】 本発明の手段を使用することによって、非グリコシル化タンパク質を含有する
画分を得ることが可能であり、その際に、前記画分の生産性レベルが増大する一
方、前記画分は実質的にグリコシル化タンパク質を含まない。
【００２０】 本発明は、非グリコシル化インスリンからのグリコシル化インスリンの分離に
おいて特に有利であることが証明された。好ましくは、グリコシル化インスリン
の濃度は0.2％未満、例えば0.1％未満である。これは、出発材料に比較したとき
の、グリコシル化インスリン濃度の10倍の低下である。
【００２１】 分離または生生のための出発材料は、非グリコシル化タンパク質およびグリコ
シル化タンパク質を含む如何なるタンパク質溶液であってもよい。出発材料は、
酵母発現系から直接得られる培地であってもよく、或いは、該出発材料は本発明
による分離に先立って、幾つかの精製工程または化学修飾工程を受けたものであ
ってもよい。
【００２２】 理論に拘束されるものではないが、一般的には、タンパク質とCa++との相互作
用はタンパク質の疎水性における変化を導くと思われる。非グリコシル化タンパ
ク質または修飾タンパク質からのグリコシル化タンパク質の分離において、その
背後にある原理の中心をなすと思われるのは、糖またはエステル基のようなマイ
ナーな分子的相違によって生じる疎水性の変化である。Ca++が存在する場合のタ
ンパク質の疎水性における変化の程度は、グリコシル基および／またはエステル
基の存在のような、タンパク質の性質に依存する。
【００２３】 従って、本発明による方法は、溶出液中にCa++を添加することによる疎水性の
変化が異なる如何なるタンパク質の変種を分離するためにも使用することができ
る。
【００２４】 有機溶媒ベースの溶出液に対するCa++の添加は、K+、Na+またはNH4 +を単独で
または組合わせて含有する溶出液に比較して、非グリコシル化タンパク質からの
グリコシル化タンパク質の分離を大幅に増大させる。この事実は、非グリコシル
化タンパク質の疎水性の増大に対するCa++の選択的効果によるものである。Ca++ に加えて、溶出液はK+および／またはNa+および／またはNH4 +イオンのような陽
イオンを含有してもよい。Ca++イオンは、CaCl2のような如何なる可溶性供給源
によって供給されてもよい。
【００２５】 本発明は、溶出液中におけるCa++イオンおよびK+イオンの組合せは、クロマト
グラフィーの特性を改善させる。本発明において、溶出液の好ましい組成はKCl
およびCaCl2の混合物であり、溶出液におけるそのCa++濃度は300 mM未満（例え
ば200 mM未満）、好ましくは略100 mM未満、より好ましくは略5〜50 mMであり、
K+イオンの濃度は100〜300 mM（例えば略200 mM）である。所定の濃度範囲内で
あれば、溶出液中のKCl濃度は溶出液のCaCl2濃度を超えるのが好ましい。
【００２６】 Na+イオンおよび／またはNH4 +イオンが存在するとき、溶出液中のNa+イオンお
よび／またはNH4 +イオンの濃度は100〜300 mM（例えば略200 mM）である。
【００２７】 溶出液の好ましいpH値は、分離すべきタンパク質およびその類縁体の等電点よ
りも高い。インスリンについて言えば、殆どのインスリンはpH5.0以上の等電点
を有している。
【００２８】 本発明において、保持容積はアイソクラチック溶出で5〜10 CV（カラム容積）
である。
【００２９】 溶出液は、原理的には如何なる有機溶媒からなっていてもよい。有機溶媒はエ
タノール、メタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルであることがで
きる。本発明において、好ましい有機溶媒は20〜30重量％の濃度を有するエタノ
ールである。
【００３０】 本発明は更に、本発明によるプロセスを使用することにより得ることができる
非グリコシル化タンパク質を含有し、グリコシル化タンパク質を実質的に含まな
い画分に関する。本発明はインスリンを分離するために有利に使用され、ここで
前記画分は0.2重量％未満のグリコシル化インスリン濃度を有していてもよい。
【００３１】 精製された非グリコシル化タンパク質、特にインスリンは、例えば糖尿病の治
療等の医療分野のような、如何なる技術分野で応用してもよい。
【００３２】
【実験】
以下は、グリコシル化されたインシュリンからのグリコシル化されていないイ
ンシュリンの分離を改善するために行った実験についての記述である。Ｃａ＋＋ イオンを含有する溶出液を用いることによって、分離が大幅に増大し、より純粋
なグリコシル化されていないインシュリンの最終産物が得られることが見出され
た。
【００３３】 ＜材料および方法＞ 一般的な方法： 全ての実験は、グリコシル化された、及びグリコシル化されていない形態のイ
ンシュリン類縁体Ｘ１４又はインシュリン類縁体ＤｅｓＢ３を含有するプールに
対して行った。Ｘ１４は、ヒトインシュリンと同様に、同一のａおよびｂ鎖を有
しており、唯一の違いは、ヒトインシュリン中のｂ２８位のプロリンがＸ１４で
は、アスパラギン酸に置換されていることである。ＤｅｓＢ３０は、ヒトインシ
ュリンと同様に、同一のａ及びｂ鎖を有しており、唯一の違いは、ｂ３０位のト
レオニンが欠如していることである。
【００３４】 全てのパーセントは重量パーセントとして表されている。
【００３５】 例１〜３は、Ｘ１４を用いて行い、例４は、ＤｅｓＢ３０を用いて行った。
【００３６】 分析： 選択したプールを分画し、ＲＰ−ＨＰＬＣ上で分析した。該プールの主産物と
グリコシル化した変異体について分析を行った。Ｘ１４の画分もエチルエステル
について分析を行った。
【００３７】 クロマトグラフィー： クロマトグラフィーは、６又は３ｍｍのフローセルを備えたＰｅｒＳｅｐｔｉ
ｖｅ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＢｉｏＣＡＤ ＨＰＬＣシステムで行った。以下の
データは、実験の中で一定しないことが明記されている場合を除いて、全ての実
験で一定であった。
【００３８】 基質 ＦＤ＊２００Ａ Ｃ１８ １５μｍ逆相粒子 温度 ２５℃ カラム ２５０ｍｍ×Ｉ．Ｄ． １０ｍｍ（０．７８５ｃｍ２）、カラム容 積＝１９．８ｍＬ 流速 ２．５ｃｍ／分 再生緩衝液 ７０％エタノール＋１Ｍ 酢酸＊ ＦＤ： Ｆｕｊｉ Ｄａｖｉｓｏｎ ＜緩衝液の組成＞ 一般的な実験条件： 緩衝液に使用した全ての化学物質は、分析用グレードであった。水は、ＷＦＩ
（water for injection）の品質であった。全ての緩衝液は、ＨＣｌでｐＨ７．
０に調整された。
【００３９】 プロセスのパラメーター カラムの操作： 平衡化 １６％エタノール ５ＣＶ＊ アプライ 一定でない 洗浄 １６％エタノール １ＣＶ 溶出 ＜１２ＣＶ 再生 ５ＣＶ＊ （ＣＶ＝カラム容積）。
【００４０】 例 １： ＣａＣｌ２を含有する緩衝液系を用いた精製
【００４１】
【表（例１）】 結果と考察： ＣａＣｌ２は、テストした他の全ての塩とは劇的に異なっていた（比較につい
ては例２を参照）。１００ｍＭでは（図３）、グリコシル化された形態のＸ１４
に相当するピークは、ほぼベースライン分離された。Ｘ１４のピークは幅広く、
極めて低い前側部（ｐｒｅｆｌａｎｋ）スロープを有していたのに対して、後側
は極めて急峻であった。５０ｍＭを用いた操作では（図４）、操作中、エタノー
ル濃度は、手動で調整した。それ故、直接比較することはできないが、極めて似
通った結果を示している。
【００４２】 Ｘ１４の溶出に必要なエタノール濃度がより高くなったことによって実証され
たように、ＫＣｌのみと比べて、Ｘ１４の疎水性が、ＣａＣｌ２によって選択的
に増加したことは注目すべきことであった（比較のためには、例２参照）。グリ
コシル化された形態のＸ１４及びエチルエステルは、ＣａＣｌ２による影響を受
けにくいようにみえた。
【００４３】 このように、本実験は、ＣａＣｌ２緩衝液が、Ｘ１４の疎水性を選択的に増加
させ、グリコシル化された形態のＸ１４の完全な分離をもたらすことを示してい
る。
【００４４】 例 ２（比較）： ＫＣｌを含有する緩衝液系を用いた精製 これらのテストは、ＣａＣｌ２なしのＫＣｌを用いたプロセスの精製プロフィ
ールを示すために行った。
【００４５】
【表（例２）】 結果と考察： ５０ｍＭのＫＣｌ濃度を用いると（図５）、溶出ピークの前側部は、急峻なス
ロープとともに開始し、より急峻なスロープが続いた。これは、より小さな近接
した溶出ピークが存在することを示している。ＫＣｌの濃度を２００ｍＭまで増
加させると（図６）、分離が改善されたが、Ｃａ＋＋を含有した溶離液を用いた
分離のレベルまでには改善されなかった。これらの観察は、画分の分析によって
確認された。
【００４６】 例 ３： ＫＣｌとＣａＣｌ２を共に含有する緩衝液系を用いた精製 これらの試験は、エチルエステルとグリコシル化された形態のＸ１４の同時分
離に対するＫＣｌとＣａＣｌ２が混在する緩衝液系の影響を調べるために行った
。
【００４７】 試験１：
【００４８】
【表（例３、試験１）】 結果と考察１： ＫＣｌとＣａＣｌ２（１００／２５ｍＭ）の混合物は、ＣａＣｌ２緩衝液のみ
を用いた場合と比べて、エチルエステルのよりよい分離をもたらした（図７）。
１５０ｍＭ／１２．５ｍＭの組合せは、エチルエステルのさらに良好な分離を与
えた（図８）。しかしながら、同時に、グリコシル化された形態のＸ１４に相当
するピークの分離は劣っていたが、それでもＫＣｌのみに比べてはずっと良好で
あった。前側部スロープの遅い上昇は、顕著でなくなっていた。
【００４９】 本実験は、ＫＣｌとＣａＣｌ２が共に重要な緩衝液成分であることを示してい
る。本実験は、緩衝液中のＣａ＋＋の存在が、精製プロセスを非常に改善するこ
とを示している。Ｃａ２＋濃度を増加させると、エチルエステル及びグリコシル
化された形態のＸ１４に比べて、Ｘ１４の疎水性が選択的に増加した。
【００５０】 試験２： 本実験は、以下のパラメーターを変えたことを除いて、試験１と同様に行った
：１８０ｍＭ ＫＣｌ、及び５ｍＭ ＣａＣｌ２、エタノール２７．４％（溶出
液）、ロードは１５０ｍｇ／ｃｍ２であった。プールのプロフィールは、精製の
前と後に調べた。
【００５１】 結果と考察２： この精製によって、グリコシル化されたＸ１４が実質的に存在しないグリコシ
ル化されていないＸ１４の画分を得ることができる。図１は、精製前のプールの
プロフィールを示している。示されているように、プール中に存在するＸ１４の
含量は、８９．９８％であった。図２は、精製後のプールのプロフィールを示し
ている。ここでは、Ｘ１４の含量が、精製後には、９８．３８％まで増加し、モ
ノグリコシル化されたＸ１４の含量は、０．５０％から０．０２％まで有意に減
少することが実証されている。
【００５２】 例 ４： ＣａＣｌ２あり又はなしの緩衝液系を用いたＤｅｓＢ３０の精製 これらの試験は、インシュリン類縁体ＤｅｓＢ３０の溶出プロフィールに対す
るＣａ＋＋の影響を実証するために行った。全ての実験は、ｐＨ７．２で行った
。以下のデータを使用した： 基質 ＦＤ＊２００Ａ Ｃ１８ １５μｍ逆相粒子 温度 ２２℃ カラム ２５０ｍｍ×Ｉ．Ｄ． １０ｍｍ（０．７８５ｃｍ２）、カラム容 積＝１９．６ｍＬ 流速 ３．０ｃｍ／分 再生緩衝液 １６％エタノール、０．１Ｍクエン酸で平衡化＊ ＦＤ： Ｆｕｊｉ Ｄａｖｉｓｏｎ プロセスのパラメーター カラムの操作： 平衡化 １６％エタノール ２．５ＣＶ＊ アプライ 一定でない 洗浄 １６％エタノール １ＣＶ 溶出 ＜１２ＣＶ再生 ２ＣＶ＊ （ＣＶ＝カラム容積）。
【００５３】 試験１
【００５４】
【表（例４、試験１）】 図９は、ＣａＣｌ２を全く含有していない溶出液を用いた場合と比較した、２
０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶出液を用いたときのＤｅｓＢ３０の溶出プロフ
ィールの差を示している。溶出液中にＣａ＋＋が存在すると、グリコシル化され
たインシュリンからのグリコシル化されていないインシュリンの分離が改善され
ることは明瞭である。
【００５５】 試験２
【００５６】
【表（例４、試験２）】 同様の保持を得るために、試験１と比べてエタノール濃度（溶出）を変えた。
【００５７】 図１０は、ＣａＣｌ２を全く含有していない溶出液を用いたときのプロフィー
ルと比較した、２０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶出液を用いたときのＤｅｓＢ
３０の溶出プロフィールの差を示している。溶出液中にＣａ＋＋が存在すると、
グリコシル化されたインシュリンからのグリコシル化されていないインシュリン
の分離が改善されることは明瞭である。
【００５８】 プールの含量は、溶出前と後に調べた。
【００５９】 溶出前では、溶出プール中には、１．２２％のモノグリコシル化されたＤｅｓ
Ｂ３０が存在していた。Ｃａ＋＋を含有する溶出液を用いた精製後には、モノグ
リコシル化されたＤｅｓＢ３０の量は、約５倍、０．２１％まで減少していた。
Ｃａ＋＋を全く含有していない溶出液を用いた溶出後に残存した１．１０％のモ
ノグリコシル化されたＤｅｓＢ３０に比べると、溶出液中にＣａ＋＋が存在する
と、グリコシル化されたインシュリンからのグリコシル化されていないインシュ
リンの分離が改善されることが明瞭である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、RP-HPLCを使用した精製の前の、加水分解プールのプロファイルを示
している。
【図２】 図２は、RP-HPLCを使用した精製後の、加水分解プールのプロファイルを示し
ている。
【図３】 図３は、100 mM CaCl2を含む緩衝液系を使用したRP-HPLCランの分離プロファ
イルを示している。グリコシル化X14形を表すピークは、殆どの分離された基底
ラインである。
【図４】 図４は、50 mM CaCl2を含む緩衝液系を使用したRP-HPLCランの分離プロファイ
ルを示している。
【図５】 図５は、50 mM KClを含む緩衝液系を使用したRP-HPLCランの分離プロファイル
を示している。
【図６】 図６は、200 mM KClを含む緩衝液系を使用したRP-HPLCランの分離プロファイ
ルを示している。
【図７】 図７は、100 mM KClおよび25 mM CaCl2を含む緩衝液系を使用したRP-HPLCラン
の分離プロファイルを示している。
【図８】 図８は、150 mM KClおよび12.5 mM CaCl2を含む緩衝液系を使用したRP-HPLCラ
ンの分離プロファイルを示している。
【図９】 図９は、CaCl2を含まない一つの緩衝液系および20 mM CaCl2を含むもう一つの
緩衝液系を使用した、インスリン類縁体DesB30の精製のためのRP-HPLCランの分
離プロファイルを示している。
【図１０】 図１０は、CaCl2を含まない一つの緩衝液系および20 mM CaCl2を含むもう一つ
の緩衝液系を使用した、インスリン類縁体DesB30の精製のための分析RP-HPLCラ
ンの分離プロファイルを示している。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年７月２５日（２０００．７．２５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 グリコシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質を
    含む溶液をCa++含有溶出液を用いたクロマトグラフィーに掛けて、非グリコシル
    化タンパク質を含有し且つグリコシル化タンパク質を実質的に含まない画分を得
    ることにより、非グリコシル化タンパク質からグリコシル化タンパク質を分離す
    る方法
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記クロマトグラフィーの
    形態はRP-HPLC（逆相高速液体クロマトグラフィー）である方法。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の方法であって、グリコシル化タン
    パク質を含有し且つグリコシル化タンパク質を実質的に含まない追加の画分が得
    られる方法。
  4. 【請求項４】 請求項１、２または３に記載の方法であって、前記グリコシ
    ル化タンパク質がモノグリコシル化されている方法。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、前記グリ
    コシル化タンパク質の少なくとも一部はポリグリコシル化されている方法。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記タン
    パク質はインスリンまたはインスリン類縁体である方法。
  7. 【請求項７】 請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記溶出
    液はNH4 +および／またはK+および／またはNa+のような陽イオンを含有する方法
    。
  8. 【請求項８】 請求項１〜７の何れか１項に記載の方法であって、前記溶出
    溶液はCaCl2または酢酸Caを含有する方法。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記溶出
    溶液中のCa++濃度は略300 mM未満（例えば200 mM未満）、好ましくは略100 mM未
    満、より好ましくは略5〜50 mMである方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９の何れか１項に記載の方法であって、前記溶
    出液中のNH4 +濃度は100〜300 mM（例えば略200 mM）である方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法であって、前記
    溶出液中のK+濃度は100〜300 mM（例えば略200 mM）である方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法であって、前記
    溶出液中のNa+濃度は100〜300 mM（例えば略200 mM）である方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法であって、前記
    溶出液は前記タンパク質またはタンパク質前駆体の等電点よりも高いpH値を有す
    る方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法であって、前記
    温度は10〜30℃、好ましくは18〜25℃である方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法であって、前記
    溶出液有機溶媒を含む方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、前記有機溶媒はエタノ
    ール、メタノール、イソプロパノールおよびアセトニトリルから選択される方法
    。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法であって、前記溶出液は20〜30重
    量％のエタノール濃度を有する方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜１７に記載の方法を用いて得られる、非グリコ
    シル化タンパク質を含有し且つグリコシル化タンパク質を実質的に含まない画分
    。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の画分であって、前記タンパク質はイン
    スリンまたはインスリン類縁体である画分。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の画分であって、0.2重量％未満のグリ
    コシル化インスリン濃度を有する画分。
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