RU2049793C1 - Способ выделения рекомбинантного проинсулина - Google Patents
Способ выделения рекомбинантного проинсулина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2049793C1 RU2049793C1 SU4946565A RU2049793C1 RU 2049793 C1 RU2049793 C1 RU 2049793C1 SU 4946565 A SU4946565 A SU 4946565A RU 2049793 C1 RU2049793 C1 RU 2049793C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proinsulin
- solution
- acetic acid
- mol
- isolation
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Сущность изобретения: разработка более технологичного способа выделения проинсулина с более высоким выходом конечного продукта. Для достижения цели использовали сорбент ДЕАП-сферанит-ОН и новые условия хроматографии, в частности, для элюции применяли 0,2
0,3 М раствор уксусной кислоты в обратном линейном градиенте хлористого натрия от 1,0 до 0 М. 1 ил. 2 табл.
0,3 М раствор уксусной кислоты в обратном линейном градиенте хлористого натрия от 1,0 до 0 М. 1 ил. 2 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделению генно-инженерных инсулинсодержащих белков и их аналогов с помощью методов хроматографии [1-2]
Технология представляет собой многостадийный процесс, включающий продуцирование рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина человека, его переработку и постадийную очистку.
Технология представляет собой многостадийный процесс, включающий продуцирование рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина человека, его переработку и постадийную очистку.
Недостатками известных методов являются сложная технология выделения, многостадийность, применение импортных дорогих сорбентов, низкие выходы промежуточных продуктов и соответственно конечного продукта.
Прототипом изобретения является способ выделения рекомбинантного проинсулина (ПИ) в процессе получения генно-инженерного инсулина из смеси, получающейся при обработке S-сульфоната проинсулина (ССП) ренатурирующим раствором, содержащим глицин и меркаптоэтанол, путем его пропускания через колонку с ДЕАЕ-сефарозой FF в 30 мМ буферном растворе трис-гидрохлорида с линейным градиентом от 0 до 0,5 М хлористого натрия с последующей ультрафильтрацией и диализом [3]
Недостатком прототипа является низкий выход проинсулина (около 35%) и многостадийность процесса.
Недостатком прототипа является низкий выход проинсулина (около 35%) и многостадийность процесса.
Целью изобретения является разработка более технологичного способа выделения ПИ, позволяющего получить продукт с более высоким выходом.
Указанная цель достигается путем пропускания реакционной смеси, полученной после обработки S-сульфоната проинсулина ренатурирующим раствором через колонну, содержащую сополимер диметакрилата этиленгликоля (30-50 мол.) с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом (70-50 мол.), названного ДЕАП-сферанит-ОН и элюцией ПИ раствором уксусной кислоты с концентрацией не менее 0,2 М в обратном линейном градиенте хлористого натрия.
Существенными отличиями заявленного способа являются использование для выделения ПИ (непосредственно из реакционной смеси) сорбента ДЕПР-сферанита-ОН и новые условия хроматографии, в частности применение для элюции 0,2 М раствора уксусной кислоты в обратном линейном градиенте хлористого натрия. В результате использования существенных отличий удается исключить стадию обессоливания (диализа) и получить целевой продукт с высоким выходом 65,7%
П р и м е р 1 (прототип). Раствор ренатурированного проинсулина v 240 мл доводят до рН 8,0, 240 мг белка вводят в колонку, содержащую 50 мл ДЕАЕ-сефарозы FF, уравновешенную 30 мМ буферным раствором трис-гидрохлорида (рН 7,5), промывают тем же раствором в течение 40 мин и элюируют ПИ линейным градиентом от 0 до 0,5 М хлористого натрия в том же буфере. Фракции, содержащие ПИ (80 мл), концентрируют до 1,2 мл, 84 мг белка с помощью ультрафильтрации на приборе Амикон 8200 (мембрана до 5000). Раствор диализуют против 3-х смен по 300 мл раствора трис-гидрохлорида (рН 7,5) и получают 1,4 мл раствора, содержащего 83 мг (34,6%) ПИ.
П р и м е р 1 (прототип). Раствор ренатурированного проинсулина v 240 мл доводят до рН 8,0, 240 мг белка вводят в колонку, содержащую 50 мл ДЕАЕ-сефарозы FF, уравновешенную 30 мМ буферным раствором трис-гидрохлорида (рН 7,5), промывают тем же раствором в течение 40 мин и элюируют ПИ линейным градиентом от 0 до 0,5 М хлористого натрия в том же буфере. Фракции, содержащие ПИ (80 мл), концентрируют до 1,2 мл, 84 мг белка с помощью ультрафильтрации на приборе Амикон 8200 (мембрана до 5000). Раствор диализуют против 3-х смен по 300 мл раствора трис-гидрохлорида (рН 7,5) и получают 1,4 мл раствора, содержащего 83 мг (34,6%) ПИ.
П р и м е р 2. Раствор ПИ v 30 мл с рН 10,0, который соответствует рН реакционной среды при ренатурации, содержащий 30 мг белка, наносят на колонку (2,5 х 5 см), содержащую ДЕАП-сферанит-ОН (образец 3), уравновешенную 30 мМ буферным раствором трис-гидрохлорида (рН 7,5), промывают тем же буфером, затем уравновешивают раствором 0,2 М уксусной кислоты с 1 М хлористым натрием. ПИ элюируют обратным линейным градиентом хлористого натрия от 1 М до 0 в 0,2 М растворе уксусной кислоты. Фракции, содержание ПИ, объединяют и получают 50 мл раствора, содержащего 19,7 мл (65,7%) белка.
П р и м е р 3. Выделение ПИ проводят в условиях примера 2, используя сорбенты (ДЕАП-сферанит-ОН) с различным соотношением мономеров.
Данные сведены в табл.1.
П р и м е р 4. Выделение ПИ проводят в условиях примера 2, используя в качестве элюента растворы уксусной кислоты различной концентрации.
Данные сведены в табл.2.
Как следует из приведенных выше примеров, использование предлагаемого способа выделения ПИ позволяет повысить выход почти в 2 раза от 35 до 65,7% с исключением стадии обессоливания. Стадия обессоливания не нужна, так как белок выходит с колонки практически в отсутствии NaCl (см. чертеж).
Claims (1)
- СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОИНСУЛИНА из смеси, образующейся при ренатурации проинсулина из S-сульфоната проинсулина при получении инсулина методом генной инженерии, включающий сорбцию его на сорбенте и элюцию растворителем, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии и повышения выхода целевого продукта, реакционную смесь, содержащую ренатурированный проинсулин, пропускают через колонку с сополимером диметилакрилата этиленгликоля (30 50 мол.) с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом (70 50 мол. ), а элюцию проводят раствором уксусной кислоты с концентрацией 0,2-0,3 М в обратном линейном градиенте хлористого натрия от 1,0 М до 0.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4946565 RU2049793C1 (ru) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | Способ выделения рекомбинантного проинсулина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4946565 RU2049793C1 (ru) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | Способ выделения рекомбинантного проинсулина |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2049793C1 true RU2049793C1 (ru) | 1995-12-10 |
Family
ID=21579846
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4946565 RU2049793C1 (ru) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | Способ выделения рекомбинантного проинсулина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2049793C1 (ru) |
-
1991
- 1991-06-18 RU SU4946565 patent/RU2049793C1/ru active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
1. Обз.инф.ММБП. Современные тенденции развития биотехнологии за рубежом. М.: 1988, в.8, с.5. * |
2. Обз.инф. Состояние и перспективы разработки лекарственных средств с использованием методов биотехнологии в капиталистических странах. М.: 1989, в.1 - 2, с.22 - 26. * |
3. Лабораторный регламент на производство генно-инженерного инсулина человека. М.: ВНИИ антибиотиков. 1988. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Vahlquist et al. | Isolation of the human retinol binding protein by affinity chromatography | |
US4667016A (en) | Erythropoietin purification | |
Hancock et al. | Use of mixed-mode, high-performance liquid chromatography for the separation of peptide and protein mixtures | |
JP4559216B2 (ja) | 液体中の夾雑物からアルブミンを分離する方法、使用及びキット | |
Paradkar et al. | Affinity-based reverse micellar extraction and separation (ARMES): a facile technique for the purification of peroxidase from soybean hulls | |
KR930003665B1 (ko) | 에리스로포이에틴의 정제방법 | |
Dotimas et al. | Isolation and structure analysis of bee venom mast cell degranulating peptide | |
JP2005225889A (ja) | 精製血清アルブミン | |
EP1071703B1 (en) | NOVEL PROCESS FOR THE SEPARATION OF PROTEINS USING A Ca++ CONTAINING ELUANT | |
EP0263518A2 (en) | Purification of recombinant tumor necrosis factor | |
US5849874A (en) | Process for the purification of serum albumin | |
EP0245222A2 (en) | Nitrilophoric Electron-Donor-Acceptor-adsorbents | |
US4617378A (en) | Purification of biologically active human immune interferon | |
RU2049793C1 (ru) | Способ выделения рекомбинантного проинсулина | |
Lehman et al. | A novel process for the large-scale purification of recombinant tick anticoagulant peptide using perfusion chromatography | |
US5179199A (en) | Protein purification | |
RU2025474C1 (ru) | Способ получения s-сульфоната проинсулина | |
Wilson | Purification of proteins/peptides for structural studies | |
US5698104A (en) | Purification process for hirudin using affinity chromatography | |
US4308204A (en) | Process for preparing the third component of the complement from human blood plasma | |
Aubert et al. | Glycosylated proline‐rich peptide of human parotid saliva. Circular dichroism study | |
CA1065305A (en) | PROCESS FOR THE ENRICHMENT OF THE PREGNANCY-SPECIFIC .beta.1-GLYCOPROTEIN | |
RU2081122C1 (ru) | Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников | |
CA2227318C (en) | Process for protein refolding by means of buffer exchange using a continuous stationary phase capable of separating proteins from salt | |
Aboagye-Mathiesen et al. | Purification of human placental trophoblast interferon by two-dimensional high performance liquid chromatography |