RU2025474C1 - Способ получения s-сульфоната проинсулина - Google Patents
Способ получения s-сульфоната проинсулина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2025474C1 RU2025474C1 SU4946564A RU2025474C1 RU 2025474 C1 RU2025474 C1 RU 2025474C1 SU 4946564 A SU4946564 A SU 4946564A RU 2025474 C1 RU2025474 C1 RU 2025474C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- elution
- acetic acid
- sulfonate
- pss
- carried out
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению генно-инженерных инсулинсодержащих белков с использованием хроматографических методов очистки. Сущность изобретения: разработка способа получения продукта- S-сульфоната проинсулина с более высоким выходом по более простой технологии, что достигается проведением хроматографии на сополимере диметакрилата этиленгликоля с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом, а элюцию - раствором, содержащим уксусную кислоту. 1 з.п. ф-лы, 1 ил, 2 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению генно-инженерных инсулинсодержащих белков с использованием хроматографических методов очистки.
Известны методы выделения инсулинсодержащих белков и их аналогов с помощью методов хроматографии [1-2]. Технология представляет собой многостадийный процесс, включающий продуцирование рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина человека, его переработку и постадийную очистку.
Недостатками известных методов являются сложная технология получения и очистки, многостадийность. низкие выходы промежуточных продуктов и соответственно конечного продукта.
Прототипом [3] изобретения является регламент на способ получения S-сульфоната проинсулина, включающий в себя расщепление бромцианом рекомбинантного белка, сульфотолиз, то есть обработку полученного белка тетратионатом натрия с образованием S-сульфоната проинсулина (ПСС) и выделение последнего в три стадии - 1) гельфильтрацией на сефадексе G-50 в бикарбонатном буферном растворе, 2) ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе FF в трис-буфере с линейным градиентом хлористого натрия и 3) обессоливанием на сефадексе G-25.
Недостатками прототипа являются многостадийность, низкий выход ПСС (около 30% ), плохая гидродинамика, связанная с применением мягкого геля, что затрудняет реализацию процесса в промышленных условиях.
Целью изобретения является разработка способа получения ПСС по более простой технологии и с более высоким выходом.
Это достигается тем, что выделение ПСС из смеси, полученной после обработки белка тетратионатом натрия, проводят на сополимере (30-50 мол.%) диметакрилата этиленгликоля (ДМАЭГ) с (70-50 мол.%) 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакри- латом (ДЭАПМ), получившим название ДЕАП-сферанит-ОН в 0,005-0,015 М уксусной кислоте, а элюцию проводят раствором, содержащим уксусную кислоту с ионной силой μ= 1±0,01. Оптимальный результат был получен при использовании в качестве элюента 1 М раствора уксусной кислоты, содержащего 4 М мочевину и 1 М хлористый натрий ( μ= =1,01).
Существенным отличием заявляемого способа является использование для этих целей ДЕАП-сферанита-ОН, сорбента, ранее применявшегося для выделения рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина, а также новых условий хроматографии, в частности применение для элюции растворов с высокой ионной силой, что позволило получить при использовании данного сорбента целевой продукт с высокой селективностью.
Использование указанных существенных отличий позволяет устранить стадию предварительной очистки на сефадексе G-50 и на 1/3 повысить выход целевого продукта.
На чертеже изображена хроматограмма выделения проинсулин-S-сульфоната на колонке с сорбентом ДЕАП-сферанит-ОН.
П р и м е р 1 (прототип). На колонку (5 х 60 см) объемом 1,2 л с сефадексом G-80, урановешенную 50 мМ буферным раствором бикарбоната аммония, наносят 20 мл раствора, содержащего 760 мг белка (ПСС), и элюируют тем же буферным раствором со скоростью 15 мл/ч. Фракции, содержащие ПСС, собирают, объединяют и получают 120 мл элюата, содержащего 677 мг белка. Его наносят на колонку (2,6 х 40 см), содержащую 160 мл сефарозы - ДЕАЕ, FF, уравновешенную буферным раствором, содержащим 30 мМ трис-гидрохлорида (рН 7,5), со скоростью 5 мл/мин. Колонку промывают тем же буфером 240 мл и элюируют ПСС, вводя в буфер линейный градиент хлористого натрия (0-0,25 М). Получают 10 мл элюата, содержащего 260 мг ПСС. Обессоливание проводят, нанося 10 мл элюата на колонку с сефадексом G-25, уравновешенным буферным раствором, содержащим 50 мМ глицина (рН 10,5), и элюируя тем же раствором. Фракции, содержащие ПСС, собирают и получают 20 мл элюата, содержащего 240 мг ПСС. Выход 31,6%.
П р и м е р 2. Колонку (2,1 х 6 см), содержащую 20 мл ДЕАП-сферанита-ОН, уравновешивают 0,01 М и раствором уксусной кислоты, 2,5 мл раствора, содержащего 0,125 г белка, полученного после расщепления бромцианом с последующим сульфотолизом, разбавляют 10 мл 0,01 М уксусной кислоты и наносят на колонку, промывают 3-4-кратным объемом 0,01 М уксусной кислоты, затем 2-3-кратным объемом 1М уксусной кислоты для удаления примесных белков. Элюцию ПСС проводят 1М раствором уксусной кислоты, содержащим 4 М мочевину и 1М хлористый натрий. После обессоливания элюата на колонке с сефадексом G-25 в буферном растворе 50 мМ бикарбоната аммония и лиофильного высушивания получают 0,058 г (40%) ПСС.
П р и м е р 3. Выделение ПСС проводят в условиях примера 2, используя сорбенты (ДЕАП-сфераниты-ОН), полученные при различных соотношениях мономеров. Данные приведены в табл.1.
П р и м е р 4. Выделение ПСС проводят в условиях примера 2, используя в качестве элюента растворы уксусной кислоты с различной ионной силой, с последующим обессоливанием на сефадексе G-25. Данные приведены в табл.2.
Показатели ионизации для уксусной кислоты и мочевины незначительны по сравнению с NaCl и равны соответственно 4,75 и 0,1. Ионная сила раствора определяется концентрацией ионов NaCl и равна для оптимальных условий элюции μ = 1±0,01.
Как следует из приведенных выше примеров, использование предлагаемого способа позволяет повыcить выход ПСС до 40% с одновременным исключением стадии предварительной очистки на сефадексе G-50.
Claims (2)
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ S-СУЛЬФОНАТА ПРОИНСУЛИНА, включающий расщепление бромцианом рекомбинантного белка, сульфитолиз, хроматографическое выделение целевого продукта с элюцией S-сульфоната проинсулина солевым раствором с последующим обессоливанием на сефадексе G-25, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения технологии, хроматографию проводят на сополимере диметакрилата этиленгликоля (30-50 мол.%) с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом (70-50 мол.%), а элюцию - раствором, содержащим уксусную кислоту, с ионной силой μ = 1 ± 0,01 .
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюцию проводят 1 М раствором уксусной кислоты, содержащим 4 М мочевину и 1 М хлористый натрий.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4946564 RU2025474C1 (ru) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | Способ получения s-сульфоната проинсулина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4946564 RU2025474C1 (ru) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | Способ получения s-сульфоната проинсулина |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2025474C1 true RU2025474C1 (ru) | 1994-12-30 |
Family
ID=21579845
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4946564 RU2025474C1 (ru) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | Способ получения s-сульфоната проинсулина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2025474C1 (ru) |
-
1991
- 1991-06-18 RU SU4946564 patent/RU2025474C1/ru active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
1. Обзор НМБП. Современные тенденции развития биотехнологии за рубежом. М., 1988, в.8, с.5. * |
2. Обзор. Состояние и перспективы разработки лекарственных средств с использованием методов биотехнологии в кап. странах. М., в.1-2, с.22-26. * |
3. Лабораторный регламент на производство генно-инженерного инсулина человека ВНИИ антибиотиков. М., 1988. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Jorpes et al. | Further purification of cholecystokinin and pancreozymin | |
Ishibashi et al. | Structures of tremerogens A-9291-I and A-9291-VIII: peptidal sex hormones of Tremella brasiliensis | |
Karlsson et al. | Isolation of the nicotinic acetylcholine receptor by biospecific chromatography on insolubilized Naja naja neurotoxin | |
FI77877B (fi) | Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein. | |
US4683293A (en) | Purification of pichia produced lipophilic proteins | |
US3948875A (en) | Process for the preparation of epidermal growth factor and new derivative using cross-linked polyacrylamide gel at a pH of 1-3 | |
O'Daly et al. | Chemical and physicochemical studies of the component polypeptide chains of rabbit secretory immunoglobulin A | |
Joubert | Hemachatus haemachatus (Ringhals) Venom. Purification, Some Properties and Amino‐Acid Sequence of Phospholipase A (Fraction DE‐I) | |
US5043425A (en) | Thrombin-binding protein substance and process for preparing the same | |
KR20160131113A (ko) | 고나도트로핀의 신규한 정제 방법 | |
Nordenman et al. | Purification of thrombin by affinity chromatography on immobilized heparin | |
RU2025474C1 (ru) | Способ получения s-сульфоната проинсулина | |
JP2573467B2 (ja) | 第ix因子タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物 | |
UA46005C2 (uk) | Спосіб одержання фактора ix із біологічних джерел та фактор, одержаний вказаним способом | |
JPS59231097A (ja) | 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ21kおよびその製造法 | |
Kregar et al. | Purification of cathepsin D by affinity chromatography on pepstatin Sepharose column | |
GB2173803A (en) | Isolating pituitary glycoprotein hormones | |
Tensen et al. | Comparative characterization of hyperglycemic neuropeptides from the lobster Homarus americanus | |
Lundblad | Isolation of fucose-rich glycopeptides from normal urine | |
US3951939A (en) | Polypeptides, process for their manufacture and their use as polyvalent isoinhibitors | |
CN110240628B (zh) | 一种亲水性短肽的纯化方法 | |
RU2049793C1 (ru) | Способ выделения рекомбинантного проинсулина | |
Bloemendal et al. | Isolation of the intermediate filament protein vimentin by chromatofocusing | |
Aubert et al. | Glycosylated proline‐rich peptide of human parotid saliva. Circular dichroism study | |
RU2094077C1 (ru) | Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина |